JP6118560B2 - 共役反応 - Google Patents
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Description
この発明は、カルボキシル基またはリン酸基(特にリン酸(V)基)を含む反応物と、アミン基を含む反応物との間の共役反応に関し、このような反応において用いられる試薬に関する。
ゼロ長架橋剤として作用するカルボジイミド(R1N=C=NR2)のようなカルボキシル基活性化試薬を用いて、カルボキシル基を含む反応物とアミン基を含む反応物とを共役させる方法が公知である。
たとえば、EDCは非常に変化しやすい分子として広く特徴付けられており、新たに調製されたEDCの溶液をバイオコンジュゲーション反応において用いることの必要性について多くの警告的な注意が先行技術において存在する。
a)i)カルボキシル基含有部分またはリン酸基含有部分上に作用して、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合の形成を促進するか、またはリン酸基とアミン基との間のホスホロアミド酸結合の形成を促進することが可能なカルボキシル基活性化またはリン酸基活性化非酵素物質と、
ii)第1の反応物または第2の反応物との溶液または懸濁液を形成するステップと、
b)上記溶液または上記懸濁液を乾燥するステップとを含む。
活性化物質は、当該技術において公知であり、カルボジイミド、ウッドワード試薬K(WRK)、およびさまざまな他の材料を含む。
他の好ましくかつ随意の特徴は上記に記載している。
このキットは、たとえばベータ−メルカプトエタノールといった失活剤試薬の供給を随意で含む。
当該ヒドロキシ物質は好ましくは、糖であり、その多くの例が先行技術において公知である。多くの糖は、凍結乾燥プロセスにおいて安定剤として用いられている。
抗体のようなタンパク質は多量のアミンおよび多量のカルボキシル基を含むが、EDCはこのような分子を粒子または他の表面に結合させるように広く用いられる。このような状況では明らかに、抗体の生物活性を変更および/または損ない得る自己重合の危険性が存在する。この危険性は抗体またはEDCの濃度の増加に従って増加する。
pH6.0の0.5MのMESにおいて、BSAが100mg/mlの濃度で調整された。水中のEDCのサンプル(Fluka社;製品コード03449)(1M)が1:1の比率でさまざまな試験緩衝液または溶液(各100mM)と混合された。EDC/緩衝混合液は、25℃でプレインキュベートされ、100ulのアリコートが、異なる時点で採取され、0.4mlのBSA溶液に加えられる。これにより、100mMの最終EDC濃度(インキュベート段階の間に分解はないとする)が与えられた。約10秒ごとにチューブを反転させ、各々の場合においてゲルが形成される時間(すなわち反転の際に流体の動きがない時点)を判定した。
軽微な修正をしてWilliamsら(Anal. Biochem. 114, 173-176 [1981])によって本質的に説明されたようにアニリン分析を行った。EDC(100ul)を含有するサンプルを100ulのアニリン塩酸塩(1M)に加え、1分間25℃でインキュベートした。当該混合物の50ulのアリコートを1.20mlの2MのHClを加え、(EDCのない)コントロールに対して吸収度を読み取ると230nmであった。
デキストラン(最終濃度100mg/ml)が、2MのNaOHにおける1Mのブロモ酢酸との反応によりCM(カルボキシメチル)デキストランに変換された。25℃で48時間後、濃縮したHClの小さいアリコートを注意深く添加することにより、当該溶液はpH〜7.5に中和された。pH6.0の50mMのMESと平衡するSephadex G25(PD10カラム;GE Biosciences社)上で1.5mlだけ脱塩することにより過剰な反応物質および副産物からCM−デキストランが分離された。CM−デキストランは2mlの量で溶離され、pH6.0の0.5MのMESにおいて、エチレンジアミンの2Mのストックが400ul、添加された。1Mのストックから100mMの最終濃度までEDCが添加され、当該混合物が25℃にて一晩インキュベートされた。100mMの濃度までEDCをさらに添加し、上記のようにインキュベーションを繰り返した。Sephadex G25上にて、AM−デキストラン混合物が1mlだけ脱塩され、pH6.0の50mMのMESとなった。これにより、最終濃度が〜25mg/mlとなった。この処置は、平均サイズが500kDa、150kDa、40kDa(Pharmacosmos社;製品コード5510 0500 4006、5510 0150 4006、5510 0040 4006)であるデキストランポリマーとともに用いられた。
ブルーラテックスミクロスフィア(270nm直径;パーキングエリア(parking area)61、Seradyn社、製品コード83100670020350)(1ml)が4mlの150kDaのAM−デキストラン(実施例3)への希釈によりコーティングされた。25℃で30分間インキュベートした後、EDCが100mMの最終濃度まで添加され、微粒子が25℃で24時間穏やかに撹拌された。
実施例4に記載されるように製造されたデキストランコーティング粒子に、2MのストックからpH7.5にて400mMのHepes緩衝液が加えられ、100mMの最終濃度まで無水コハク酸(DMSOにおいて1M)が添加された。当該反応混合物は穏やかに撹拌され、5MのNaOHの少ないアリコートの周期的な追加によりpH6とpH7との間で保持された。ひとたびpHが安定化すると(通常約10分後)、当該懸濁液はセルロースエステル透析バッグ(100万ダルトンカットオフ;Spectrum社、製品コード131486)に運ばれ、pH6.0の25mMのMESに対して広く透析された。各バッチの希釈は、側方流動分析において調整され、バルク材料は25mMのMES緩衝液で好適な作用濃度に希釈された。
実施例4および5に記載されるように調製されるさまざまなデキストランコーティングラテックス微粒子により、同じ基本的な処置が用いられた。当該微粒子はまず、1−10mMの濃度の緩衝液へと脱塩または透析のいずれかを行うことにより、緩衝液交換された。代替的には、緩衝濃縮液(少なくとも0.5M)が、水に懸濁された微粒子に添加され、必要な最終緩衝液濃度が与えられる。用いられる緩衝液タイプには、pH9のEPPS、pH8.5のEPPS、pH7.2のMOPS、pH7のMOPS、pH7.0のHepes、pH6のMES、およびpH5のMESが含まれる。緩衝されたコーティング微粒子溶液の0.8mlに、100ulのトレハロースストック(1gが2mlの水に溶解される)と、100ulのEDCストック(必要な最終濃度に依存して0〜100mMの範囲)とが加えられる。多くの場合、最終濃度は1.5mMまたは10mMであった。必要に応じて、体積を増加または減少させて、凍結乾燥に必要な量の材料を提供する。微粒子を50ulまたは100ulだけ混合および供給し、液体窒素中で凍結し、Virtis Advantage凍結乾燥器において以下のプログラムに従って凍結乾燥された。すなわち、ステップ1:温度−40℃、継続時間1320分;ステップ2:温度−10℃、継続時間60分;ステップ3:温度+20℃、継続時間60分である。これらのチューブは、1回または2回の側方流動試験を行うのに十分な材料を提供した。増加は、より多くの体積を凍結乾燥するか、またはさらに濃縮した微粒子(実施例20)を用いることにより達成された。
ニトロセルロース膜(約4cm×0.4cm)を、150mMのNaClに5%メタノールを加えたものの中に0.5ulの精製されたrabbit IgG(2mg/ml)を有するストリップに沿った約1/3の距離に配置した。ストリップは室温で、通常は2〜24時間であるが少なくとも60分間乾かされ、次いで、pH8のTBS中またはpH7.2の50mMのリン酸ナトリウム中の0.1%BSAで30分間ブロックされた。ストリップを水の中で0.5%のトレハロースで洗浄し、大気乾燥した。goat anti-rabbit IgGでコーティングされた微粒子を検査するために、配置されたrabbit IgGの位置にもっとも近い当該ストリップの端部を50ulの微粒子懸濁液に浸し、他方の端部には吸湿紙のパッドを適用した。当該ストリップは、サンプル全体がニトロセルロース膜の中へ入るまで通す。いくつかの場合、ストリップを50ulの緩衝液にさらに4〜5分移すことにより、バックグラウンドをクリアにした。他の場合では、緩衝液は、変動され得るとともに、特定の緩衝液条件が与えられる。
凍結乾燥された微粒子は、pH6のMES緩衝液(50−200mM)において最終体積50ulで、goat anti-rabbit IgG(1−50ug)を含む溶液により戻された。好適な期間(2.5分〜1時間)の間インキュベートした後、サンプルをpH8.0の1mlのTBSでの希釈により失活した。当該サンプルを15分間18000xgで遠心分離した。上澄みを注意深く廃棄し、そのペレットは、0.1%のTween20を含む50ulのTBS中に再懸濁された。図4は、ブルーラテックスの270nmのデキストランコーティングされたサクシニル化微粒子を、10mMのEDCが存在する状態または存在しない状態で、pH8.5の10mMのEPPS緩衝液を凍結乾燥して得られた典型例を示す図である。
Qドット(Crystalplex社、20nm、製品コードNCC−665、カルボキシル化ナノクラスタ、発光最大665nm;28mg/ml)をpH7.0の50mMのMOPSにおいて1/10に希釈し、pH7.0の50mMのMOPSにおいて100ulの懸濁液を400ulの150kDaのAM−デキストラン(実施例3)と組み合わせ、Spiramix上にて30分間25℃でインキュベートした。EDC(26ul)を2Mのストックから添加して100mMの最終濃度を与えた。5〜16時間のインキュベートの後、pH7.5の160ulの2MのHEPES/10mMのEDTA、およびpH7.0の40ulの50mMのMOPSとともに、DMSO中の80ulの1Mの無水コハク酸が懸濁液に添加された。Spiramix上での30分のインキュベーションの後、当該サンプルは、水で平衡化されたPD10カラム上で脱塩された。サクシニル化されたナノクラスタは、微量遠心管において15分間12000rpmでスピンされ、ペレットが400ulの水に再懸濁された。
実施例9に記載されるように調製されたQドット懸濁液の一部(50ul)を5ulのトレハロースストック(1g+2mlの水)と、pH8.5の2.5ulの200mMのEPPSと、3ulの100mMのEDC(最終濃度5mM)または水と混合した。サンプルは、実施例6に概説された手順書を用いて凍結および凍結乾燥され、次いで−20℃で2日間格納された。goat anti-rabbit IgG(2.3mg/mlのうち13ul)と、pH7.0の60ulの0.5MのMOPSと、77ulの水とを含む混合物を調整した。その50ul(10ugの抗体)を、凍結乾燥されたQドットの各チューブに加えた。実施例8に記載されるように共役および洗浄を行った。側方流動試験を実施例7に記載されるように行った。50ulの緩衝液がストリップを通過することによりバックグラウンドをクリアにし、50ulのTBSにおいてblack 96-well plateで、固定化されたrabbit IgGの領域に対応するエリアを切り取り、読み取った(励起350nm/発光665nm)。EDCを用いるまたは用いないで調製される複合体に対して、図5に示されるように、蛍光読取値はそれぞれ43552および5034であった。
(実施例4に記載されるように調製される)デキストランコーティングされた微粒子(200ul)を、NAP−5カラムを用いて350ulの水へと脱塩した。ウッドワード試薬K(WRK)のストックを水において1M、100mM、および10mM調製した。40ulの微粒子を、3ulの1mg/mlのgoat anti-rabbit IgG(3ug)と、10ulの水と、6ulのWRKストックと混合し、100mM、10mM、および1mMの最終濃度を与えた。25℃で30分間保った後、950ulのTBSを加え、サンプルを微量遠心機で15分間スピンした。ペレットを60ulのTBS/0.1%のTween20中に再懸濁し、サンプルを側方流動試験(実施例7)において試験した。視覚的な評価により、100mMのWRKを有するサンプルは、遠心分離の前には明らかに凝集物を含んでいた。これは、図6に示されるように、側方流動ストリップの底部での材料の堆積によって確認された。
水中における40ulのサクシニル化された270nmのブルーラテックス微粒子(実施例5に記載されるように調製された)を3ulの1mg/mlのgoat anti-rabbit IgG(3ug)と、6ulの100mMのWRK(10mMの最終濃度)と混合し、pH6.0の1MのMESと、pH7.0の1MのMOPSと、pH5.0の1MのMESとから10ulの緩衝液を選択した。30分間の共役、TBSでの洗浄、および遠心分離の後、各ペレットは60ulのTBS/0.1%のTween20中に再懸濁された。サンプルを側方流動試験において試験した(実施例7)。結果を図7に示す。もっとも大きなスポット強度は、pH5.0での反応の後、見られた。
実施例4に記載されるように調製された200ulのサクシニル化された270nmのブルーのデキストランコーティングされた微粒子を、400ulのpH5の25mMのMESへと脱塩する。脱塩された微粒子の40ulを、5ulのトレハロースストック(2mlの水において1g)および5ulの100mMのWRKと混合し、液体窒素で凍結した。冷凍乾燥は、実施例6におけるプログラムに従って行われた。
カルボキシフルオレスセイン(Sigma C7153)をpH9.0の25mMのEppsに溶解し、pHが〜4.0である10mMのストックを与えた。0.5mlのサンプルを希釈し、0.5mlのpH9.0の100mMのEPPSと100ulのトレハロースストック(1gプラス2mlの水)とを加えた。pHは7.71であると計測された。EDC(11ulの1Mのストック)を10mMの最終濃度まで加え、100ulのアリコートを実施例6に記載されるように凍結乾燥した。凍結乾燥されたサンプル(2つのチューブ;両者ともポジティブコントロール)を(実施例3に記載されるように調製された)pH6.0の50mMのMESにおいて1時間、100ulの500kDaのAM−デキストランと反応させ、その後、100ulの14.3mMのメルカプトエタノールを加え、さらに1時間、反応を継続させた。上記の反応と並行して、乾燥したカルボキシフルオレスセイン/EDC混合物の2つのチューブ(両者ともネガティブコントロール)の各々を100ulの失活剤(14.3mMのメルカプトエタノール)で戻した。1時間後、pH5.0の50mMのMES中の100ulの500kDaのAM−デキストランを加え、さらに1時間、インキュベーションを継続させた。ポジティブおよびネガティブコントロールのチューブの内容物を貯留し、別個のNAP−5カラム上で脱塩することにより500ulのTBSへと交換した。1/100希釈されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロールについての蛍光値(励起490nm/発光535)はそれぞれ、44129および229(平均値、n=3)であった。
25℃で4時間、9mlのpH6の0.5MのMES/2Mのエチレンジアミンと、1mlのEDC(1M)とによる反応によりBSA(1mlの10%溶液)を陽イオン化させた。1mlの反応混合をPD10カラム上でpH8.5の1.25mlの10mMのEPPSに脱塩し、それに125ulのトレハロースストック(2mlの水において1g)を加えた。2つの600ulのアリコートを別個のチューブに供給した。一方のチューブ(タイプA)には6ulの1MのEDCが補充され、他方のチューブ(タイプB)には6ulの水が補充された。各タイプから100ulのアリコートを実施例6におけるプログラムに従って凍結乾燥した。カルボキシフルオレスセインを100mMのpH6のMESに取り込み、100ulのアリコートを各タイプのチューブの1つに加えた。30分後、等しい体積の10X TBSを加え、当該チューブを一晩放置した。サンプルは、NAP−5カラム上でTBSに脱塩された。実施例14でのように計測された、タイプAおよびタイプBの1/100希釈されたサンプルの蛍光値はそれぞれ33200および103蛍光単位であった。
金粒子(200ulの15 OD材料;20nmまたは40nmのネイキッドゴールド;Bioassay Works社)を、水中において1mlの10mg/mlのBSAに加えた。20℃での一晩のインキュベーションの後、チュービングにおいて(Spectrum社、製品コード131486)サンプルを1Lの水の2回交換に対して透析した(透析一回当たり3h)。透析された金は、pH9の100mMのストックの追加により、10mMのEPPSにされる。10mMのストックからEDCが1mMまで加えられる。最後に、トレハロースが3.33%w/vまで加えられる。サンプルは、実施例6におけるプログラムに従って液体窒素で凍結され、凍結乾燥された。
CM−デキストラン(500kDa)1mlを、pH6.0の0.5MのMES中の2MのシスタミンとpH6の0.5MのMES中の2Mのエチレンジアミンの溶液とを20:80の体積比で組み合せることにより調製された200ulの混合ジアミン溶液およびEDCを1Mストックから100mMの最終濃度になるまで混合した。25℃での一晩のインキュベーションの後、サンプルはpH8.0の0.1Mのリン酸緩衝液へと脱塩され、200mMのストックから20mMの最終濃度までDTTが加えられた。25℃で1時間のインキュベーションの後、サンプルをpH6の100mMのMES緩衝液に脱塩し、実施例18に記載されるように、金粒子のコーティングのために直ちに用いた。
金粒子(15 OD)は、実施例17に記載されるように調製されたチオール/アミノデキストランで1/10に希釈され、25℃で一晩インキュベートされた。粒子1mlにつき、100ulの2MのHepesが加えられ、その後、無水コハク酸が(DMSO中の1Mストックから)100mMの最終濃度まで加えられた。30分後、当該材料は、遠心分離と、pH7.2の20mMのMOPS緩衝液での洗浄との2サイクルで洗浄された。粒子1mlにつき、100ulのトレハロースストック(2mlの水中1g)を加え、その後、EDCを(水中の1Mストックから)10mMの濃度まで加えた。これらのサンプルを実施例6に記載されるプログラムに従って凍結乾燥した。
8.5の0.5MのEPPSと、pH7.2の1MのMOPSと、pH7.5の1MのHepesと、pH6の1MのMESと、pH9.3の0.5MのCHESといった緩衝液濃縮物が調製された。1MのEDCを水に調製した。さまざまな緩衝液/EDC混合物をストック物質の適切な希釈により調製し、10mMの緩衝液中に0mM、1mM、または10mMのEDCを与えた。これらのさまざまな溶液のpH値は以下のとおりである(緩衝液;0mMのEDCの場合のpH;1mMのEDCの場合のpH;10mMのEDCの場合のpH)。すなわち、EPPS、7.59、7.67、7.73;MOPS、6.18、6.25、6.34;Hepes、6.58、6.64、6.73;MES、5.22、5.29、5.35;CHES、8.64、8.74、8.82である。これらのデータから、pH7とpH8との間のpKa値を有するEPPS以外の緩衝液(たとえばMOPS、Hepes)は、pH8〜pH8.5の範囲の濃縮物としても調製され得、これによりpH7とpH8との間の最終pH値を達成するということが分かり得る。
150kDaのAMデキストラン(実施例3)の1mlを0.11mlのトレハロース(2mlの水において1g)に混合し、液体窒素で凍結し、実施例6において与えられたプログラムを用いて凍結乾燥した。乾燥粉末は、1mlのストックブルー270nmカルボキシル化ラテックス粒子(Seradyn社、製品コード83100670020350)で戻され、100ulの1MのEDCを加える前に室温で24時間インキュベートされた。18時間のインキュベーションの後、2MのHepes/10mMのEDTAを200ul添加し、その後DMSO中の100ulの無水コハク酸(1M)を添加した。25℃で30分放置した後、当該材料を1LのpH6.0の25mMのMES緩衝液の3回の交換に対して透析した。次いで、1mlの透析されたサンプルを、PD10カラムを用いて1.5mlの10mMのEPPS緩衝液に緩衝液交換した。EPPS緩衝液中の微粒子1mlにつき、100ulのトレハロースを加え、その後、EDCを1Mストックから10mMの最終濃度を与えるよう加えた。サンプルは、適切なサイズのガラスバイアルを用いて、さまざまなサイズのアリコートにおいて凍結乾燥された。たとえば、10ulのサンプルをX−バイアル(Cronus社、VZM-0309CF-100)に供給し、40ulのサンプルをガラスシャンペンバイアル(Cronus社、VZM-1509CC-100)に供給し、0.4mlの体積を2mlの血清バイアル(Voigt社7010.90.0540)において凍結乾燥し、1mlの体積を10mlの血清バイアルへ供給した(Wheaton社、223686)。
500ulの20mMのADP一カリウム塩(Fluka社;製品コード01899)を、200ulのpH8.5の0.5MのEPPSと、100ulのトレハロース(2mlの水において1g)と、200ulの水と、5ulの2MのEDC(最終濃度10mM)または水と混合した。100ulのアリコートを、実施例6で与えられた乾燥プログラムを用いて凍結乾燥した。2つのタイプの乾燥粉末(すなわちEDCを有するものと有さないもの)を、実施例15に記載されるように調製された(が、EPPS緩衝液の代わりに水に脱塩された)100ulの陽イオン化BSAと100ulのpH6.2の0.5MのMESとで戻した。25℃で18時間の反応の後、0.15MのNaClで平衡化されたNAP−5カラム(GE Healthcare社)上で脱塩することにより、遊離したADPが取り除かれた。タンパク質を含む留分を貯蔵し(0.3ml)、100℃で5分間、無機リン酸塩のための75ulのPiColorlock Gold比色検出試薬(Innova Biosciences社、製品コード303−0030)を用いて酸水解を行った。EDCを用いてまたは用いずに調製された加水分解されたBSA−ADP複合体の200ulのサンプルについての、ブランクを差し引いた吸収値(A650)はそれぞれ1.22および0.08であった。
Claims (14)
- カルボキシル基またはリン酸基を含む第1の反応物と、アミン基を含む第2の反応物との間の共役反応での使用のための混合物を製造する方法であって、
a)i)カルボキシル基含有部分またはリン酸基含有部分上に作用して、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合の形成を促進するか、またはリン酸基とアミン基との間のホスホロアミド酸結合の形成を促進することが可能なカルボキシル基活性化またはリン酸基活性化非酵素物質と、ii)第1の反応物または第2の反応物とを含む均質な溶液または懸濁液を形成するステップと、
b)前記溶液または前記懸濁液を乾燥するステップとを含み、
前記溶液または前記懸濁液に含まれる少なくとも前記第1の反応物または前記第2の反応物は、ポリマーコーティングを有する粒子を含み、
前記カルボキシル基活性化または前記リン酸基活性化非酵素物質は、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド.HCl(EDC)、N−エチル−5−フェニルイソオキサゾリウム−3´−スルホナート(ウッドワード試薬K)、N−シクロヘキシル−N´−(β−[N−メチルモルホリノ]エチル)カルボジイミド(CMC)、4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミド(EAC)、2,2−ジクロロ−5−(2−フェニルエチル)−4−トリメチルシリル)−3−フラノンおよび4−(4−6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドからなる群から選択されるいずれかの活性化物質である、方法。 - 前記カルボキシル基活性化またはリン酸基活性化物質および前記第1または第2の反応物は溶液の形態、好ましくは水溶液の形態で混合される、請求項1に記載の方法。
- 前記カルボキシル基活性化またはリン酸基活性化物質はカルボジイミドまたはウッドワード試薬K(WRK)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記カルボキシル基活性化またはリン酸基活性化物質はEDCまたはCMCを含む、請求項3に記載の方法。
- ステップb)は凍結乾燥を含む、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液または懸濁液は、カルボキシル基またはリン酸基を含む第1の反応物を含む、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液または懸濁液における第1または第2の反応物は、着色、蛍光、酵素、磁気、または粒子標識を含む、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液または懸濁液はポリヒドロキシ材料を含む、請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液または懸濁液は緩衝液を含む、請求項1〜請求項8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液または懸濁液のpHは4より大きい、請求項1〜請求項9のいずれか1項に記載の方法。
- カルボキシル基またはリン酸基を含む第1の反応物とアミン基を含む第2の反応物との間の共役反応での使用のための乾燥された混合物であって、i)カルボキシル基含有部分またはリン酸基含有部分上に作用して、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合の形成を促進するか、またはリン酸基とアミン基との間のホスホロアミド酸結合の形成を促進することが可能なカルボキシル基活性化またはリン酸基活性化非酵素物質と、ii)第1の反応物または第2の反応物との均質な混合物を含み、
前記乾燥された混合物に含まれる少なくとも前記第1の反応物または前記第2の反応物は、ポリマーコーティングを有する粒子を含み、
前記カルボキシル基活性化または前記リン酸基活性化非酵素物質は、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド.HCl(EDC)、N−エチル−5−フェニルイソオキサゾリウム−3´−スルホナート(ウッドワード試薬K)、N−シクロヘキシル−N´−(β−[N−メチルモルホリノ]エチル)カルボジイミド(CMC)、4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミド(EAC)、2,2−ジクロロ−5−(2−フェニルエチル)−4−トリメチルシリル)−3−フラノンおよび4−(4−6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリドからなる群から選択されるいずれかの活性化物質である、乾燥された混合物。 - 容器中にある、請求項11に記載の混合物。
- 請求項11、または12に記載の混合物の供給と、使用のための指示とを含む、コンジュゲーションキット。
- 共役反応を行う方法であって、前記方法は、請求項11、もしくは12のいずれか1項に記載の混合物の使用、または請求項13に記載のコンジュゲーションキットの使用を含む、方法。
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