CZ390592A3

CZ390592A3 - Process for preparing 4,5-dihydrogendanamycin and hydroquinone thereof and the use of such compounds

Info

Publication number: CZ390592A3
Application number: CS923905A
Authority: CZ
Inventors: Walter P Cullen; Mark T Jefferson; Mikel P Moyer
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1992-01-06
Filing date: 1992-12-28
Publication date: 1993-08-11
Also published as: FI943207A0; KR940703923A; PT101169A; MX9300011A; FI943207A; NO942532D0; CA2127457A1; HU9401936D0; BR9207024A; CN1074937A; JPH06510913A; ZA9333B; IL104289A0; NO942532L; WO1993014215A1; AU3225693A

Description

a použití, těchto látek

Oblast techniky

Vynález: se týká; nového způsobu přípravy

4.5- dihydrogeldanamycinu a. jeho hydrochinonu fermentací mikroorganizmu Streptomyces hygroscopicus, který je. uložen ve. sbírce, kultur Pfizer pod. označením FD 29068, což-je derivát subkultury NRRL. 3602.,. nyní uložený jako ATCC 55256, za. použití, standardních fěrmentačních metod a. podmínek, přičemž potom následuje isolování sloučenin: podle vynálezu za. použití běžných, oddělovacích.· metod. Hydrochinon je možno rovněž připravit chemickou, syntézou, ze 4,5-dihydrogeldanamycinu.

Dosavadní stav techniky

Jak. uvedený 4,5-dihydrogeldanamycin. tak i jeho hydrochinon představují chemické sloučeniny,, které náleží ke; skupině ansamycinbenzochinonových antibiotik.. Tento

4.5- dihydrogeldanamycin a. jeho hydrochinon se považují za deriváty geldanamycinu, což. je všeobecně, velice dobře známá látka z této skupiny ansamycinbenzochinonových látek. Geldanamycin jako takový se? získá fermentací mikroorganizmu Streptomyces hygroscopicus NRRL 3602 a oddělením této látky z fermentaóního prostředí. Geldanamycin představuje známou látku, která se používá proti určitým druhům mikroorganizmů, zejména proti kvasinkám a plísním. Postupy přípravy těchto geldanamycinů. a použiti, těchto látek je uvedeno v patentu Spojených států amerických c. 3 595 955'. 4,5-Dihydrogeldanamycin byl rovněž, předtím připraven syntetickým způsobem katalytickou hydrogenací geldanamycinu. odkaz na semisyntézu 4,5-dihydrogeldanamycinu je možno nalézt v Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Chemistry of the Ansamycin Antibiotics, 33, 1976, str. 278. Až dosud nebylo uváděno v publikacích podle- dosavadního stavu, techniky žádné použití tohoto 4,5-dihydrogeldanamycinu.

Semisyntetické deriváty geldanamycinu a jejich použití jako protinádorových látek ja. popisováno v Derwént abstracts82-98300E, 81-70796D, 80-72383C a 80-62760C.

Podstata vynálezu

Vynález se týká postupu přípravy 4,5-dihydrO“ geldanamycinu, který má dále. uvedený vzorec I, a hydrochinonu tohoto . 4,5-dihydrogeldanamyciňu, který má dále uvedený vzorec II :

•!W

Tento postup podle vynálezu zahrnuje submerzní aerobní propagací, mikroorganizmu Streptomyces hygroscopicus, ATCC 55256, ve vodném živném prostředí, přičemž, potom následuje isolování sloučenin výše uvedeného vzorce I a II. Podle uvedeného vynálezu bylo zjištěno, že 4,5-dihydrogeldanamycin a jeho hydrochinon je možno získat' fermentaci Streptomyces hygroscopicus, ATCC 55256, což je mikroorganizmus, o kterém předtím nebylo známo, že. produkuje, sloučeniny podle uvedeného vynálezu. U tohoto

4,5-dihydrogeldanamycinu bylo rovněž prokázáno·, že představuje velice vhodnou látku pro léčení proliferačních poruch, zejména rakoviny, u savců a zejména u lidi. U tohoto

4,5-dihydrogeldanamycinu se rovněž předpokládá, že představuje vhodnou látku pro léčení určitých gram-positivních a gram-negativních bakteriálních infekci, a dále ža představuje vhodný viricidní prostředek a rovněž herbicidni prostředek'projevující antifungální a antiprotozoální. vlastnosti. Vzhledem k tomu, že tato sloučenina rovněž projevuje imunosupresivní vlastnosti, je *í možno předpokládat, že je vhodná pro léčení různých autoimunitních onemocnění, včetně revmatické artritidy a onemocnění z reakce štěpu proti hostiteli, přičemž ovšem použiti, výše uvedené látky není omezeno těmito příkladnými aplikacemi.

Uvedený hydrochinon 4,5-dihydrogeldanamycinu představuje novou sloučeninu, kterou je. možno isolovat z přírodních, zdrojů nebo je možno ji připravit chemickým syntetickým postupem. Uvedený hydrochinon je možno isolovat z fermentačního prostředí Streptomyces hygroscopicus v podstatě stejným způsobem jako je isolován geldanamýcin a

4.5- dihydrogeldanamycin. Tento hydrochinon je možno rovněž chemicky připravit syntetickým způsobem redukci

4.5- dihydrogeldanamycinu chemickým redukčním; činidlem. Předpokládá se, že tento hydrochinon 4,5-dihydrogeldanamycinu představuje- vhodnou látku použitelnou proti stejným; všem uvedeným onemocněním uvedeným výše v souvislosti se 4,5-dihydrogeldanamycinem. Uvedený vynález se týká, nového postupu přípravy 4,5-dihydrogeldanamycinu a 4,5-dihydrogeldanamycinhydrochinonu z- přírodního zdroje, zejména za- použití Streptomyces hygroscopicus·, ATCC 55256, přičemž do rozsahu uvedeného vynálezu rovněž náleží nová možnost použití těchto sloučenin podle vynálezu. Do rozsahu uvedeného vynálezu rovněž náleží nový chemický syntetický způsob přípravy uvedeného hydrochinonu ze 4,5-dihydrogeldanamycinu .

Streptomyces hygroscopicus, MRRL 3602, který je rovněž označován číslem FD 29068 ve sbírce kultur Pfizer, byl uložen podle Budapešťské dohody ve sbírce. American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, což je mezinárodně uznaná sbírka, pro permanentní, ukládání kultur a jejich přístup pro veřejnost,, v případě, že. je na přihlášku vynálezu udělen patent.. Tento mikroorganizmus zde byl· uložen pod. označením’ATCC 55256. Tento uložený mikroorganizmus je zde. přístupný' veřejnosti během řízení o této přihlášce i vynálezu tomu, kdo je k tomu oprávněn zmocněncem patentového úřadu Spojených států amerických (Commissioner of. the United States. Patent, and Trademark. Office) podle 37 CFR 1.14 a 35 USC 122: a podle ustanovení zahraničních patentových zákonů, v zemích, ve kterých byly podány analogické patentové přihlášky nebo jejich následné patentové přihlášky. Veškeré překážky týkající se přístupnosti, tohoto uloženého mikroorganizmu veřejnosti, budou neodvolatelně, odstraněny

2. června 1993 nebo po. udělení patentu, jestliže nastane, dříve.

Sloučeniny vzorce I a. Ii: představují přírodní, produkty, které je možno isolovat, r fermentačního; prostředí Streptomyces hygroscopicus ATCC' 55256.. Způsob propagaceStreptomyces hygroscopicus ATCC 55256 za účelem získání

4,5-dihydrogeldanamycinu a jeho hydrochinonu je stejný jako způsob propagace tohoto mikroorganizmu při získávání geldanamycinu. Tato metoda propagace představuje standardní metodu, která je popisována například v patentu Spojených státu amerických; č. 3' 595 955, který je zde uváděn pouze jako odkazový materiál. Tento mikroorganizmus Streptomyces hygroscopicus, ATCC 55256, představuje kulturu, kterou je možno pěstovat, při teplotě v rozmezí od 24 do 36 ‘Ca za submeržních podmínek za míchání a aerace v prostředí, obsahujícím zdroje uhlíkatých látek, jako jsou například cukry, škroby a glycerol, dála zdroje organického dusíku, jako„je.například sojová moučka, kasaminové kyseliny— a kvasnicový extrakt, dále růstové látky, jako je například obilní extrakt, rybí. moučka, moučka, z bavlníkových semen, a dále minerální, soli obsahující stopové prvky, jako jsou například železo, kobalt, zinek, atd. Inokulum se připraví, stíráním'vegetativních buněk, ze šikmého agaru inokulovaného kulturou ATCC 55256. Vhodným pevným-médiem pro. počáteční růst na šikmém agaru je ATCC Č. 172, jehož komponenty jsou uvedeny dále :

ATCC & 172 gramy/litr glukóza 10 rozpustný Škrob 20 kvasnicový extrakt. 5 ⁺NZ Amine A 5 uhličitan vápenatý 1 agar 20 * přídavek destilované vody do 1000 mililitrů a úprava pH na

7,0 za pomoci hydroxidu, draselného KOH;

⁺NZ. Amine: A představuje chráněnou, značku výrobku firmy Kraft/ lne. Product of Quesť íntemationál ’ (Shěffíeld ' Products).. .

Kultivace Streptomyces hygroscopicus, ATCC 55256, a isolování, sloučenin vzorce I a XI se provádí, podobným způsobem jako je postup, používaný u předchozích fermentací podle dosavadního stavu techniky, při kterých se^ připravuje geldanamycin. V tomto směru je možno poukázat na. patent Spojených států amerických-č. 3 595 955. Kultivace ve výhodném provedení probíhá ve vodném živném prostředí za submerzních aerobních podmínek a za míchání při teplotě 24 *C až 36 ’C. Vhodné živné médium pro kultivaci obsahuje zdroj asimilovatelného uhlíku, jako jsou například cukry, 'í škroby a glycérol, dále zdroj organického dusíku, jako je například sojová moučka, kasaminové kyseliny a kvasnicový extrakt, a dále zdroj růstových. látek, jako je například obilní, extrakt, rybí moučka a moučka z bavlníkových semen, ι

a rovněž tak i minerální soli, jako je například chlorid sodný a stopové- prvky, jako je například železo, kobalt, méd a zinek.. Rovněž, se, používají pro tyto účely pufry, jako je uhličitan vápenatý a fosfáty., V případě, že- během fermentace dochází k nadměrnému pěnění., je možno do fermentačního prostředí přidávat, protípěnící. přísady a., rovněž tak rostlinné oleje nebo silikony. Aerace tohoto média v submerzních* fermentorech se, ve výhodném provedení, podle vynálezu provádí, za podmínek zahrnujících asi 1/2. objemu až objemy, sterilního volného vzduchu na jeden objem fermentačního média*, za minutu, který je vháněn do. tohoto prostředí pomocí- rozptylovacího zařízení. Míchání, je možno provádět za. pomoci, běžných míchadel, které jsou obecně známy pracovníkům zběhlým* v oboru, fermentační, techniky.. Rychlost* míchání závisí na* typu. použitého míchadla. Při použití třepaček se obvykle* používá. 150. až 200 cyklů za minutu,, přičemž; v případě, fermentorů se. obvykle: používá’ 300 až 1700, otáček, za. minutu. Během, přenosu mikroorganizmu, a*, při jeho pěstování je nutno samozřejmě udržovat aseptické podmínky.

Ihokulum*- pro přípravu, těchto* antibiotik, podle uvedeného vynálezu je* možno získat za použití, narostlých buněk ze šikmého agaru. této kultury nebo z Rouxových lahví inokulovaných touto kulturou. Pevným médiem, které. je. vhodné pro počáteční růst tohoto mitaroorganizmu na šikmém agaru a v Rouxových lahvích je ATCC médium č. 172. Tento nárůst je možno použít k inokulování. jak třepaček tak i inokulačních fermentorů nebo je možno tyto inokulační fermentory zaočkovat z uvedených třepaček. Nárůst v těchto třepačkách je možno všeobecně dosáhnout* během maximálně 4 až 5 dnu, přičemž nejvýhodnéjší 'perioda’ pro’ inokulum'v submerzních »1 ’ 4** ' fermentorech. je obvykle v rožmeží*'^,2 až 3 dnů..

Ve fermentačním médiu se společné s uvedenými látkami produkuje nigercin a elaiophilin, které jsou aktivní vůči . gram-pozitivním a negativním mikroorganizmům, přičemž produkce těchto látek je dobrým indikátorem růstu souvisícího s produkcí 4,5-dihydrogeldanamycinu. Vzhledem k výše uvedenému je tedy možno biologickou aktivitu fermentačního prostředí monitorovat biologickým testem média, při kterém se používá sensitivní druh Staphylococcus aureus ATCC 6538P nebo Bacillus subtilis ATCC 6633. Pro tyto účely je možno použít standardní destičkovou testovací metodu, při které je zóna inhibice obklopena kotoučem filtračního papíru nasyceného médiem, které, se používá pro měření antibiotické účinnosti. Pro detekci uvedených antibiotik produkovaných ve fermentačním médiu a. pro analýzu , směsi surových a vyčištěných látek extrahovaných z tohoto f.ermentačního média je možno rovněž vhodně použít chromatograf ickou analýzu v tenké vrstvě, při které se----- použije silikagelu. K vyvolání chromatogramů se použije ethylesteru kyseliny octové, přičemž sloučeniny představující, uvedená antibiotika je možno vizuálně prokázat postřikem vanilinovým reakčním činidlem a zahřátím- na - — chromatografické desce v tenké vrstvě při teplotě 80 ’C. Vyvolanou desku je možno překrýt agarem naočkovaným bud to S. aureus nebo B. subtilis a potom inkubovat při teplotě 37 ’C po dobu 16 hodin, čímž se vizuálně prokáže přítomnost uvedených antibiotik.

Sloučeniny vzorce I a II vyrobené podle uvedeného vynálezu fermentací Streptomyces hygroscopicus ATCC 55256, je. možno oddělit a získat běžnými metodami známými, z dosavadního stavu techniky, jako je například extrakce celého podílu nefiltrovaného fermentačního média organickým rozpouštědlem, jako je například chloroform, ethylester

Kyseliny octové, methylisobutylketon nebo butanol při přirozeně se vyskytující hodnotě pH. V alternativním provedení je možno mycelium oddělit po dokončení nárůstu a toto mycelium potom extrahovat organickým rozpouštědlem. Takto získaný rozpouštědlový extrakt je potom možno, zkoncentrovat na řídký sirup, přičemž čisté antibiotikum se získá, chromatograf ickým postupem..

Typický postup oddělování, a získávání, sloučenin vzorce

I. a, II; je. možno· provést následujícím způsobem. Celý podíl, živného média z fermentace Streptomyces hygroscopicus ATCC. 55256 se extrahuje methylisobútylketonem. Použité rozpouštědlo se odpaří, přičemž se získá řídký sirup. Tento sirup, se potom rozpustí v methylenchloridu, a potom se nanese na silikagel jako. náplň kolony a provede se eluování. s gradientem od čistého methylenchloridu k čistému ethylesteru kyseliny octové. Takto získané eluáty se analyzují chromatografickou metodou v tenké- vrstvě. Frakce obsahujíc! sloučeninu I se spojí a odpaří do sucha. Rovněž frakce obsahující sloučeninu II se spojí a odpaří, do. suchaTakto· získané produkty je možno dále přečistit-v případě, potřeby krystalizaci. nebo chromatografickým postupem v koloně.

sloučeninách vzorce I a II je možno předpokládat, že jsou vhodné proti určitému druhu plísnových patogenů na rostlinách, proti gram-positivním a negativním bakteriím a proti určitým druhům parasitických mikroorganizmů.

4,5-Dihydrogeldanamycin a jeho hydrochinon je možno testovat pokud se týče použití na účinek vůči výše uvedeným mikroorganizmům za použití metody uvedené v_ patentu.

Spojených států amerických č. 3 595 955.

1U

Sloučenina vzorce I rovněž inhibuje růst určitých lidských rakovinných, buněk. Účinnost in vitro tohoto

4,5-dihydrogeldanamycinu byla provedena metodou podle M.C. Alleye a kol. Cancer Research 48, 589-601, l.únor 1989, a za použití buněčných linií SKBR3 a MCF7. 2 těchto testů vyplývá, že 4,5-dihydrogeldanamycin je částečně vhodný pro léčení rakoviny u lidí, a zejména rakoviny prsu, vaječníku a žaludku. O sloučenině vzorce II se rovněž předpokládá, že je vhodná pro stejné účely.

4,5-Dihydrogeldanamycin má rovněž silný imunosupresivni účinek, což bylo, zjištěno a potvrzeno za použití, metod běžně známých z dosavadního stavu techniky. Tuto účinnost je možno běžným způsobem stanovit, odhadem inhibice prolíf erace’Τ-bůněk stimulované IL-2 a forbol-12-myristát-13-acetátem (PMA),' což se stanoví na základě zmenšení absorpce tritiem zpracovaného thymidiriu v porovnání s kontrolními vzorky neošetřenými tímto léčivem. 0 sloučenině vzorce II še rovněž předpokládá, že má imunosupresivni účinky.

V případě, že se sloučeniny vzorce I nebo. II použijí' jako antiproliferační. činidla, například jako pr o tir ako vínová činidla,, potom, je možno je podávat lidskému jedinci buďto samotná nebo ve výhodném provedení podle vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosičovými látkami nebo ředidly ve- formě farmaceutických prostředků, připravených podle standardní farmaceutické praxe. Tyto sloučeniny je možno podávat orálně nebo parenterálně. Do parenterálního podávání náleží intravenózní, intramuskulámí, intraperitoneálni, subkutánní a místní podávání.

V případě orálního použití je možno sloučeniny vzorce Γ nebo ΙΓ podle uvedeného, vynálezu podávat, ve formě tablet nebo kapslí nebo jako vodné roztoky nebo suspenze. V případě tablet: pro- orální použiti se obvykle používají nosičové materiály, mezi které je možno zařadit laktózu a kukuřičný škrob, a¹ dále: maziva,, jako je= například stearát hořečnatý. V případě' orálního, podávání, těchto- látek ve formě kapslí jsou. vhodnými ředícími: látkami, laktóza a sušený kukuřičný' škrob.

V případě,, že· se. pro orální použití používají suspenze, potom se účinná látka kombinuje s emulgačními a suspendačními. činidly. V případě potřeby je možno- přidávat sladidla, a/nebo aroma ti začni přísady.- V případě intramúskulámiho, intraperitoneálního, subkutánního a, intravenózního podávání, se obvykle připraví, sterilní roztoky účinné látky, přičemž se vhodně upraví hodnota pH tohoto roztoku a dále se provede: úprava pufrem., V případě intravenózního- podávání se celková koncentrace rozpuštěných, látek kontroluje-v. tom smyslu, aby bylo dosaženo isotonického přípravku.

V případě farmaceutického prostředku obsahujícího sloučeninu vzorce. I nebo II se hmotnostní, poměr nosičové látky k účinné látce obvykle pohybuje v rozmezí od 1 : 10 do 10 : 1. Ovšem v daném konkrétním případě bude zvolený poměr záviset na, takových faktorech jako je rozpustnost* účinné· látky, uvažovaná dávka, a přesný způsob podávání.

V případě, že se sloučenina vzorce I nebo II použije u lidí, potom, se denní dávka určí obvyklým způsobem lékařem. Tato dávka se mění. podle stáří, hmotnosti a reakce na

- - podávané léčivo podlez konkrétního' pacienta¹; á krčmě toho je třeba brát v úvahu intenzitu symptomů onemocnění projevující se. u daného pacienta a účinnost jednotlivé podávané sloučeniny. V mnoha případech se ovšem účinná dávka bude pohybovat podle potřeby v rozmezí od 0,01 gramu do 0,5 gramu (jako například každé čtyři hodiny až šest hodin). V případě chronického podávání se ve většině případů bude účinná dávka pohybovat v rozmezí oď 0,01 do 1,0 gramu za den, a ve výhodném provedení podle vynálezu v rozmezí od 20 do 250 miligramů za den, ve. formě jednotlivé dávky nebo ve formě rozdělených dávek. Na druhé straně' může být v některých případech nezbytné použit dávek, které leží mimo uvedené rozmezí.

Příklady provedeni vynálezu

V následujícím jsou uvedeny konkrétní příklady postupu podle uvedeného vynálezu a použiti..těchto sloučenin podle vynálezu, přičemž tyto příklady jsou uvedeny pouze z ilustrativních.důvodů a nijak neomezují rozsah uvedeného vynálezu.

Přikladl

1. Příprava inokula.

Podle tohoto provedení bylo jako pevného média, vhodného pro počáteční růst na šikmém agaru a v Rouxových lahvích, použito média ATCC č. 172. Do 300 mililitrových třepaček bylo vloženo 100 mililitrů média, přičemž potom byly tyto láhve sterilizovány při teplotě 120 ’C a tlaku 103,425 kPa po dobu 30 minut. Po ochlazeni bylo toto médium inokulováno suspenzí vegetativních buněk streptomyces hygroscopicus ATCC 55256, přičemž tato kultura narostla na médiu ATCC agar č. 172. Tyto lahve byly potom pretřepáváný při teplotě 28 *C na třepačce s posunem 3,81 centimetru až

1J 6,35 centimetru a se 150 až 200 cykly za minutu (CPM) po dobu 3 až 5 dní..

Protřepávací lahve byly připraveny za použití následujícího média :

JDYTT gramy/litr cereloza kukuřičný škrob kukuřičný výluh.

NZ Amine· YTT chlorid, kobaltnatý uhličitan vápenatý

C.·

0,002 úprava pH na 6,9-7,1.

gramy/litr cereloza 10 sojová moučka 10.

kukuřičné fermentační produkty 5 kukuřičný škrob 10 chlorid sodný 5' chlorid kobaltnatý 0,002 uhličitan vápenatý 1 úprava pH na 7,0-7,2

2. Fermentace a isolování 4,5-dihydrogeldanamycinu.

K inokulování pětilitrové fermentační nádoby * obsahující tři.“litry·'jednoho^-z“ dále uvedených médii byla použita jedna protřepávací nádoba. !

HERB-F gramy/litr cereloza síran amonný sojová moučka kvasničný extrakt chlorid draselný masný extrakt chlorid kobaltnatný uhličitan vápenatý

HERB-F2

2,5

1.

0,002 , úprava pH na 7,1-7,3 gramy/litr cereloza kukuřičný škrob moučka z bavlněných semen chlorid kobaltnatý uhličitan vápenatý pivovarské kvasnice^ chlorid sodný síran hořečnatý . 7H₂O dusičnan amonný ¹ 4

0,002

0,5

MACB.-M gramy/litr glycerol.

kvasničný extrakt.

dusičnan sodný chlorid kobaltnatý síran hořečnatý .. 7H₂O dihydrogenfosforečnan draselný chlorid draselný síran železnatý

0,002.

0,50

0,5

0,01 úprava pH na 6,9-7,2

Do· každé- nádoby bylo. potom přidán 1 mililitr P2000 (silikon), což je protipěnící přísada, přičemž potom byly nádoby utěsněny a. sterilizovány při teplotě 120 ’C a tlaku 103:,425 kPa: po dobu jedné hoáiny. Potom byly nádoby inokulovány jednou lahví (asi 3 % inokula),. přičemž fermentování bylo prováděno po. dobu. 72-120 hodin při teplotě 28 *C a potom bylo prováděno promíchávání při 1.700 otáčkách za* minutu a za použití, přívodu vháněného vzduchu odpovídajícímu množství, jeden objem vzduchu, na jeden objem kapaliny za minutu.

Bioaktivita média a; následných získaných podílů byla stanovena, za použití senzitivního kmene- Bacillus subtilis ATCC 6633 nebo Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Složky média a oddělených podílů byly vizuálně vyhodnoceny zapoužití silikagelových destiček a následujícího systému : čistý ethylester kyseliny octové. Vyvolané destičky byly postříkány vanilinovým reakčním činidlem (3 gramy vanilinu rozpuštěné..v. .75-mililitrech ,ethanolu,, načež, bylo provedeno zředění na 100 mililitrů pomocí 85 %-ní kyseliny fosforečné) a potom byly zahřátý na. teplotu 80 ’C. Stanovovaná antibiotika se projevila svým tmavě modrým až purpurovým zabarvením. Vyvolané chromatografické destičky s tenkou vrstvou (TLC-destičky} byly rovněž vizuálně vyhodnoceny pozorováním v tmavém boxu pod světlem o -vlnové délce 254 μπι. Po dokončeni fermentace byly fermentory zastaveny. Celý podíl média byl potom extrahován 1/3 objemu methylisobutylketonu při dané hodnotě .pH média, potom bylo provedeno oddělení na DeLavalově separátoru a rozpouštědlová fáze byla zkoncentrována za použití vakua 2a vzniku oleje. Tento olej byl potom podroben protiproudému zpracování ve třech trubicích za použití hexanu a acetonitrilu. v poměru 10 : 1. Spodní fáze (CH₃CN)obsahující 4,5-dihydrogeldanamycin a jeho hydrochinon byla oddělena, spojena a zkoncentrována za použití vakua. Takto získaný zbytek byl. potom opětné rozpuštěn v methyienchloridu, zpracován za použití látky Darco G50 (což je aktivní uhlík), zfiltrován a zkoncentrován. Takto získaný koncentrát v methyienchloridu byl potom nanesen do kolony Waters Prep 500 na náplň silikagelu, načež potom bylo provedeno zpracovávání gradientovou elucí od čistého methyienchloridu- k čistému.-ethylesteru kyseliny octové. Frakce: obohacené

4.5- dihydrogeldanamycinem, R^=2.,5-3 při poměru CHCl₃/aceton 9:1, byly spojeny a podrobeny opakovanému chromatografickému zpracovávání dokud nebyl isolován čistý,

4.5- dihydrogeldanamycin. Takto získaný

4.5- dihydrogeldanamycin byl potom krystalován z horkého isopropyláteru a potom byl sušen ve vakuové peci při teplotě 50 ‘C po dobu přes noc. Teplota táni tohoto produktu byla v rozmezí od 221 do 222 C.

Frakce obohacené na hydrochinon, R^=l-1,5 při poměru CHCl₃/aceton 9 : 1, to znamená sloučeninu vzorce ΙΓ, byly_spojeny a podrobeny opakovanému chromatografickému zpracováni, dokud nebyl získán, čistý hydrochinon.

Příklad 2

Chemická syntéza 4,5-dihydrogeldanamycinhydrochinonu.

Podle tohoto provedení, byl. reakční postup proveden tak, že bylo smícháno- 10 gramů hydrosiřičitanu sodného, rozpuštěného, ve 100 mililitrech, vody se 100 mililitry ethylesteru. kyseliny octové, přičemž k takto získanému roztoku bylo přidáno 200 gramů 4,5-dihydrogeldanamycinu. Získaná reakční směs: byla chromatograficky zpracována v tenké; vrstvě na použití, silikagelových destiček’ Analtech a. jako, elučniho systému bylo použito čistého ethylesteru kyseliny octové. Reakce byla potom pozorována pod. ultrafialovým, světlem (254 μΐ) a. produkt byl postříkán vanilinem. Reakce byla téměř kompletní v intervalu 20 minut.

Vodná; vrstva, byla^ potom, extrahována dvakrát ethylesterem· kyseliny octové. Potom byla rozpouátědlová vrstva, zpětné, extrahována fosfátovým pufrem o hodnotě. pH.

7,0. Použitá; rozpouštédlová fáze byla potom usušena za použití, bezvodého síranu sodného Na₂SO₄ a potom bylo provedeno zkoncentrováni na pryskyřicovitý materiál.

Získaný zbytek byl potom vložen do isopropyléteru (IPE), roztok byl zahřát k varu a potom bylo prováděno mícháni, po dobu 3 hodin. Isopropyléterový roztok byl zfiltrován a pevná látka byla usušena na filtru. Usušený

4,5-dihydrogeldanamycin byl udržován v pouzdru pod vakuem

Claims

i!$d,

AA3racv , AZ31VMnA oad _t (I) vyznačující se tím, že zahrnuje stupně :

(a) propagace mikroorganizmu Streptomyces hygroscopicus ATCC 55256 ve vodném živném médiu za submerzních aerobních podmínek, přičemž toto. živné médium obsahuje zdroj uhlíkatých látek, zdroj organického dusíku, růstové látky a minerální soli obsahující stopové prvky, a (b) isolováni sloučeniny vzorce I.
2. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení proliferačních poruch u savců, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku nebo ředidlo a a jako účinnou složku sloučeninu obecného vzorce I v množství k léčení, této- proliferační poruchy..
3. Farmaceutický prostředek podle nároku, 2, vyznačující se tím,, že uvedenou proliferační. poruchou je rakovina prsu, vaječníku. nebo- žaludku u lidí ,.
4. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení autoimunitních- onemocnění u savců, vyznačující, se tím, že > ' obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku, nebo ředidlo a. jako účinnou složku sloučeninu vzorce I ύ u v množství k léčení tohoto autoimunitního onemocnění.
5.. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení bakteriálních, virových, fungálních nebo protozoálních infekcí u lidí, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku nebo ředidlo a jako účinnou látku sloučeninu vzorce I v množství, k léčení této bakteriální, virové, fungální nebo protozoální infekce.
6. Sloučenina vzorce XI

OH
7. Způsob přípravy sloučeniny vzorce II podle nároku.

6, vyznačující, se tím, že zahrnuje stupně :

(a) propagace, mikroorganizmu Streptomyces hygroscopicus ATCC 55256 ve vodném- živném médiu za: submerzních aerobních podmínek, přičemž toto živné médium obsahuje· zdroj uhlíkatých látek¹, zdroj, organického dusíku, růstové látky

a. minerální, soli. obsahující stopové prvky, a.

(b) isolování, sloučeniny vzorce II..
8. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení proliferačních poruch u savců, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku nebo ředidlo a sloučeninu, podle nároku 6 v množství k léčení této proliferační. poruchy.
9. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení auto imunitních, onemocněni u savců, vyznačující se tím, Že______ obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku nebo ředidlo a. sloučeninu podle nároku 6 v množství k léčení.

tohoto autoimunitního onemocnění.
10. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení bakteriálních, virových, fungálních nebo protozoálních infekcí v savců, vyznačující se tím, Že obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosičovou látku nebo ředidlo a sloučeninu podle nároku 6 v množství k léčení teto bakteriální, virové, fungálni nebo protozoálni infekce

-Zastupuje—:

Dr. Pavel Zelený