CZ34293A3 - Preparation for treating tumorous diseases - Google Patents
Preparation for treating tumorous diseases Download PDFInfo
- Publication number
- CZ34293A3 CZ34293A3 CZ93342A CZ34293A CZ34293A3 CZ 34293 A3 CZ34293 A3 CZ 34293A3 CZ 93342 A CZ93342 A CZ 93342A CZ 34293 A CZ34293 A CZ 34293A CZ 34293 A3 CZ34293 A3 CZ 34293A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- antigen
- mice
- lymphocytes
- specific
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 79
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 37
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 113
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 108010026590 Q surface antigens Proteins 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 24
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 24
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 23
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 11
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 101710139410 1-phosphatidylinositol phosphodiesterase Proteins 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 10
- 102100037097 Protein disulfide-isomerase A3 Human genes 0.000 description 10
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical class O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 5
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011640 AKR mouse Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 3
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 108010031650 Thy-1 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035695 Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001001372 Homo sapiens Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 2
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101000605589 Arabidopsis thaliana Phosphoinositide phospholipase C 1 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 235000011960 Brassica ruvo Nutrition 0.000 description 1
- ORQNZQUFOVCFOV-UHFFFAOYSA-N C1=CC=C2C(CC)(S(O)(=O)=O)NSC2=C1 Chemical compound C1=CC=C2C(CC)(S(O)(=O)=O)NSC2=C1 ORQNZQUFOVCFOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101150014361 Delta gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 241001562081 Ikeda Species 0.000 description 1
- XVOKUMIPKHGGTN-UHFFFAOYSA-N Imazethapyr Chemical compound OC(=O)C1=CC(CC)=CN=C1C1=NC(C)(C(C)C)C(=O)N1 XVOKUMIPKHGGTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001031571 Mus musculus H-2 class I histocompatibility antigen, Q7 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101100294034 Mus musculus Nefl gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001195348 Nusa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000006486 Phosphoinositide Phospholipase C Human genes 0.000 description 1
- 108010044302 Phosphoinositide phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 101150064691 Q gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003091 anti-genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150016491 chsA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102220047090 rs6152 Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000001323 two-dimensional chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká metody léčení nádorových onemocnění a prostředku pro léčení nádorových onemocnění. V obou případech se využívá imunoreakce, která je specifická k nádorovým antigenům, které jsou produkovány na povrchu nádorových buněk.
Dosavadní stav techniky
V japonském patentovém spisu č. 2-48532 se popisuje způsob získávání fyziologicky účinného prostředku s protinádorovým účinkem z výpotku (ascitu) peritoneální dutiny zvířat postižených nádorem.
Při tomto způsobu jsou nádorové buňky transplantovány do peritoneální dutiny savců. Po přidání protinádorové látky a normálních syngenních savčích buněk, izolovaných ze sleziny (splenocytů) se po určitém časovém intervalu získává z ascitu peritoneální dutiny fyziologicky účinná látka. Fyziologicky účinná látka se získává ze supernatantu ascitu peritoneálních dutin pacientů postižených rakovinou, jejichž stav se zlepšil po zavedení terapie imunitního dozoru.
Dosud však nebyl dostatečně vysvětlen imunologický mechanismus eliminace nádorových buněk u zvířat s nádorovým onemocněním.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je metoda pro léčení nádorových onemocnění využívající specifickou imunoreakci s nádorovým antigenem.Při této metodě se podává neklasický histokompatibilní antigen třídy 1, protilátka zmíněného antigenu nebo cytotoxické buňky, izolované ze sleziny (cytotoxické splenocyty).
Předmětem předloženého vynálezu je dále protinádorový prostředek, který obsahuje jako účinnou látku neklasický histokompatibilní antigen třídy 1.
Jako metody poskytující neklasický histokompatibilní antigen třídy 1, lze použít například následujících postupů:
1) získávání allogenních lymfocytů, které mají zkříženou reaktivitu s neklasickým histokompatibilním antigenem 1. třídy, který je specificky vylučován nádorovými buňkami;
2) získávání neklasického histokompatibilního antigenu 1. třídy, který byl připraven metodou genetického inženýrství;
3) zavedení izolovaného neklasického cDNA histokompatibilního antigenu 1. třídy do pěstovaných lymfocytů za účelem vyvolávání tvorby tohoto neklasického histokompatibilního antigenu 1. třídy na povrchu lymfocytních buněk a další pomnožení lymfocytů in vitro pro následnou další potřebu.
Tyto techniky jsou dobře známy ze stavu techniky. Tak například k produkci výše uvedeného antigenu metodou 2) a 3) lze použít postupu sestávajícího z následujících stupňů:
a) příprava mRNA z nádorových buněk, které vylučují neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy;
b) příprava cDNA odpovídající této mRNA použitím reverzní transkriptázy;
c) vytvoření cDNA genové banky z cDNA použitím lambda-fágu;
d) selekce lambda-fágu, který obsahuje žádanou neklasickou cDNA histokompatibilní 1. třídy z cDNA genové banky, za použití plagové hybridizační metody;
e) zavedení této cDNA do expresního vektoru pro produkci molekuly proteinu neklasického histokompatibilního antigenu 1 . třídy ve velkém množství využitím E. coli, a.
f) zavedení cDNA, získané podle stupně d), do kultury lymfocytů^oužitím DNA transfekční metody, spočívající v kultivování těchto lymfocytů v přítomnosti interleukinu 2 a v tvorbě buněčných klonů, které při použití limitní zřeďovací metody silně exprimují žádaný antigen.
Také pro přípravu protilátky, identifikující neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy je známa celá řada metod, které mohou být použity:
) příprava hybridomů fúzí splenocytů, získaných ze zvířat imunizovaných molekulami antigenu a připravených podle shora uvedeného postupu e), nebo lymfocytů, získaných z periferní krve jedinců s nádorem a stimulovaných kultivací in vitro v přítomnosti molekul antigenu, získaného podle shora uvedeného postupu e), nebo
2) ze získaných hybridomů se vyselektuje jeden hybridom, který produkuje protilátku schopnou identifikovat žádaný neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy, za použití limitní zřečíovací metody. Pro tuto selekci testem ELISA se používá mikrotitrační plotny.
Také cytotoxické lymfocyty, které identifikují neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy, mohou být připraveny již popsanými metodami. Tak lze použít například následujících metod:
) příprava žádaných cytotoxických lymfocytů kultivováním splenocytů, získaných ze zvířat imunizovaných lymfocyty, vylučujícími neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy, které byly připraveny postupem popsaným v odst. f), nebo lymfocytů získaných z periferní krve jedinců s nádorem in vitro v přítomnosti lymfocytů, získaných ve výše uvedeném postupu f);
2) vyselektování žádaných cytotoxických klonů získaných z těchto lymfocytů použitím limitní zředovací metody;
3) potvrzení specificity identifikace měřením cytotoxicity oproti lymfocytům připraveným podle shora uvedeného postupu
f) a kontrolním lymfocytům, do kterých nebyla vnesena cDNA.
Předložený vynález je blíže popsán v následujících příkladech. Tyto příklady však rozsah vynálezu v žádném směru neome-zu jí.
Popis obrázků na připojených výkresech:
Obr. 1 znázorňuje výskyt Qa-2 antigenu na nádorových buňkách kmenů pocházejících z H-2 myší. Křivky znázorněné plnou čarou se týkají monoklonální protilátky (mAb) 141-15,8 specifické vůči antigenu Qa-2. Křivky znázorněné přerušovanou čarou se týkají monoklonální protilátky (mAb) specifické vůči bakteriální složce (negativní kontrola).
Na obr. 2 je graf znázorňující výsledky testů cytotoxické účinnosti monoklonální protilátky (mAb) v závislosti na koncentraci proteinu, jakož i materiálu předčištěného rychlou kapalinovou chromatografií (FPLC). Na ose x je vynesena koncentrace proteinu (^ug/inkubace) a na ose y je vynesena míra specifické lyse (v %). Křivka vyznačená znaménkem · se vztahuje na monoklonální protilátku mAb (proti antigenu Qa-2)
Křivka vyznačená zneménkem a se týká materiálu předčištěného rychlou kapalinovou chromatografií.
Na obr. 3 jsou uvedeny výsledky autoradiografie materiálu,.
který byl předčištěn rychlou kapalinovou chromatografií 125 (FPLC) a značeného radioaktivním jodem J.
Na obr. 4 je znázorněn graf ukazující účinnost adsorpce regresorového sera(RS) na koloně plněné anti-IgD-sepharosou. Na ose x je v části A vynesena dávka (^ug/inkubace) a v části B (číslo frakce). Na ose y je míra specifické lyse v %.
Na obr. 5 je znázorněn graf udávající výskyt IgD specifického vůči antigenu Qa-2 v regresorovém séru (RS) při enzymatickém imunosorbentovém testu (ELISA). Na Qs^x je vynesen stupeň zředění sera a na osey je vynesena absorbance při 410 nm.
Obr. 6 znázorňuje specifičnosti oligonukleotidů, použitých jako primerů při polymerázové řetězové reakci (PCR).
Obr. 7 znázorňuje výsledky analýzy hybridizace DNA-DNA.
Obr. 8 znázorňuje výsledky analýzy hybridizace DNA-RNA.
Obr. 9 znázorňuje amplifikaci desoxyribonukleové kyseliny (cDNA č. BW 5147) polymerázovou řetězovou reakcí (PCR).
4a
Obr. 10 ukazuje reaktivitu monoklonální, vůči antigenu Qa-2 specifické protilátky (mAb) fúzovaného proteinu pocházejícího z E. coli.
Obr. 11 znázorňuje nukleotidovou amplifikaci cDNA, získá-
| ných z kmenů lidských nádorových ukazatelem velikosti DNA*pro: 1, | buněk, přičemžfaa ose x je | |
| 2: | HL60 | |
| 3, | 4: | U937 |
| 5, | 6: | Hmy2C1R |
| 7, | 8: | SKW-3 |
| 9: | pozitivní kontrola (buňky z myši BW5147). |
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 (Materiál a metody) (1) Zvířata
Bylo užito 13 syngenních myších kmenfl, se známými fenotypy Qa, TL a Ly (viz tabulka 1) (KLEIN.J. , FIGUEROA.E., DAVID,C.S.: H-2 Haplotypes, gene and antigens: Second listing,
Immunogenetics, 1983, 17553,/Haplotypy, geny a antigeny: Druhý seznam/, MCKENYIE, IFC. , POTTER.T.: Murine lymphocyte surface antigens, Adv Immunol. 1979,27:179)./Myší lymfocitni povrchové antigeny/.
eýk
B6, B6.K1 a B6-K2 jsou sourodé vzhlede/k Qa-1, Qa-2 aQa-3 antigenům (STANTON, TH. locus 1976, oblasti myši/).
BOYSE.EA.: A new serologically defined
Qa-1, in the Tla-region of the mouše, Immunogenet i cs, 3=525. / Nový, serologicky definovaný lokus Qa-1 v Tla C3H/He a C3H-Ly6.2 jsou sourodé s allotypy Ly6 antigenu. B6.K1, B6.K2 a C3H-Ly6.2 kmeny byly získány od Dr. TTakahashi z Aichi Cancer center Research Institute a udržovány autory vynálezu.
Tabulka 1
H-2, Qa. TL a Ly fenotypy myších kmenů
Kmen
| Ly | Ly | Ly | Ly | Ly | Ly | Ly | TL Qa | QA | QA |
| -1 | -2 | -3 | -4 | -5 | -6 | -7 | -1 | -2 | -3 |
C3H/He k
C3H-Ly6.2 k CBA k
CE k
AKR k
C58 K
BALB/c d
DBA/2 d
DBA/1 q
A/J a
C57BL/6 b
B6.K1 b
B6.K2 b
1
1 1 1 2 1 2 1
1 2 2
1 1 1
2 2 2 2 2 2 2
1
1
1
1
1 í
1
1
1
1
2
2
2
¢2) Nádorové buňky
Byl použit ascitový typ nádorových buněk , MM2, MM46,
MM48. MM102D, FM3A, MH125F, MH125P a X5563 získaný z myší C3H/He, ascitový typ nádorových buněk, Meth A získaný z myší BALB/c, ascitový typ nádorových buněk, EL-4 získaný z myší B6, kultivované nádorové buňky. BW5147 získané z myší AKR.
¢3) Monoklonální protilátky a doplňky
Qa-2-speeifleká monoklonální protilátka CmAb) 141-15-8 byta získána z Australian Monoclonal Development. NSW. Ovčí antiserum monospecifické ke každé z myších imunoglobulinových podtříd, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM a IgA byly získány od Binding Site Ltd., Birmingham, U-K.
Ovčí antiserum monospecifické k myšímu IgD bylo získáno od
ICN ImmunoBiologicals, ILL. Krysí mAb specifické k myšímu IgG2b a k IgD a peroxidázový derivát IgD, byly získány z Mel li Institute of Health Science, Kanarawa, JapanMyši mAb (IgG2b třída) specifická k antíbakteriální složce CNusA protein E.coli) byla získána od Dr. Y. Nakamury z Meiii Institute of Health Science a byla použita jako mAb, nevztahující se k antigenům povrchu nádorové buňky.
FCab·)2 kozí protilátka, specifická k myšímu immunoglobulinu a její fluoresceinisothiokyanátový derivát byly získány od Tágo, Inc., Burlengane, Calif. Fragment Fab- kozí protilátky byl připraven redukcí FCab-)2 s 2-merkaptoetylaminem a separací na Sephacryl S-200 chromatografické koloně.
Preadsorbované králičí sérum, užité jako doplňkový zdroj, bylo získáno z Ceder Lané Laboratories, Vestbury, N.Y.
¢4) Regresorové sérum CRS)
Bylo uvedeno, že u C3H/He myší s transplantovanými MM2 nádorovými buňkami dochází k regresi nádoru ve značném rozsahu, pokud jsou mezi 12. a 14. dnem po intraperitoneální inokuláci odstraněny nádorové buňky společně s ascitem CKIMURA, Y. , TANINO-KOMAIJI,T. Survival of hosts mice and induced resistence to transplantable ascites tumors, Japan J-Exp- Med.,
1966 36=371). / Přežití hostitelských myší a indukovaná resistence trasplantovaných nádorových ascitň/.
Dva týdny po odstranění nádorových buněk byla myši, vykazující kompletní regresi, odebrána při eterové anestezii krev ze srdce. Sérum C dále nazývané regresorové sérum,RS) bylo z krve separováno a až do použití uchováváno při -6Q°C.
(5) Adsorpce RS
Pro užití RS v adsorpčním testu byly z RS odstraněny x-globulíny srážením síranem amonným při saturaci 0,35 a zonovou elektroforézou na škrobovém gelu, viz dále.Získaný materiál byl použit jako RS zbavený x-globulinu, ačkoliv nějaké x-globuliny ještě obsahoval.
x-globulinu zbavený RS byl zředěn 100 krát RPMI-1640 mediem, doplněným 7¾ fetálním telecím sérem CFTS). 1 ml tohoto roztoku byl smíchán s 2 . 107 lymfocytů C splenocytů nebo se směsí splenocytů a meseteriálních lymfatických buněk), které byly zbaveny erytrocytů účinkem chloridu amonného podle metody (BOYLE, W.= An extension of cytotoxins, Transplatlon 1968, 6=761)/ Extense cytotoxinfl/ a třikrát promyty Eagle minimálním základním mediem CMEM), nebo s <4 - 6)x 106 ascitovýph nádorových buněk promytých tímtéž zpflsobem.
Směs byla inkubována při 25°C 30 min a dále 60 min při 0°CBuňky byly odseparovány 5 min centrifugací při 1.000 rpmV případě adsorpce lymfocytfl byl proces proveden dvakrát. Získaný supernatant byl použit jako adsorbovaný RS.
(6) Zkouška cytotoxicity
Splenocyty C3H/He myši, získané 3 dny po intraperitoneální transplantaci MM2 buněk byly použity jako efektorové RS dependentní buňky v in vitro cytotoxické reakci (TANINI T. EGAVA K= Regressor sérum factor-dependent nonspecific killers in tumor-bearing mice) / Represorové sérum nespecifických faktor-závislých zabíječů u myší s nádorovým onemocněním /. Efektorové buňky ClxlO6) byly smíchány s lxlO4 51Cr-značenými cílovými buňkami v 0,5 ml RPMI-1640 mediu doplněném 7% FTS.
V adsorpčním testu bylo před a po adsorpei přidáno τ-globulinu zbavené RS v konečné koncentraci 500x zředěného původního RS. MM2 buňky, různé lymfoblasty a transformované L buňky byly užity jako cílové buňky. Směs byla inkubována 18 h v případě nádorových buněk, 5 až 7 h v případě lymfoblastů a 10 h v případě transformovaných L buněk při 37°C v COa inkubátoru.
Po inkubaci byla určena radioaktivita uvolněná z buněk do supernatantu a zbylá radioaktivita buněk, cytotoxicita byla vyjádřená v procentech specifické lyže. Všechna stanovení byla opakována. V adsorpčních testech byly výsledky zreprodukovaných či rozdílných experimentů normalizovány vyjádřením v procentech snížení RS aktivity.
Lymfoblasty byly připraveny kultivací splenocytů z různých myší při hustotě buněk lxlO6 buněk/ml 2 dny v RPMI-1640 mediu doplněním 10¾ FTS a pak 3 dny v mediu , obsahujícím 5 ug/rnl Concananal1 inu A (Sigma, St. Louis).
LQ7b/Kb a j_Kb buňky byly vytvořeny transfekci Q7b/Kb hybridního genu DNK a H-2Kb genu DNA do LtR- buněk. LQ7b/Kb buňky obsahují ala a 2 oblasti genového produktu Q7b a a 3 oblast 2Kb molekuly. α 1 a a 2 oblasti odpovídali za immunologicky definovanou Qa-2 specifitu H-2b myších lymfocytfl (WANECK, G.L.. SHERMAN. D.H., CLAVIN, S. , ALLEN. H., a FLAVELL, R.A.: Tissue-specific expression of cell-surface Qa-2 antigen from a transfered Qb7 gene C578L/10 mice. J.Exp.Med.. 1987, 165=1358)./ Tkáňově specifická exprese Qa-2 antigenů buněčného povrchu z transferovaného Qb7 genu C57BL/10 myši/. LKb buňky na svém povrchu nesou H-2b molekulu.
Na komplementu séra závislá cytotoxická aktivita byla měřena vylučovací metodou s cílovými buňkami mesenteriálních lymfatických uzlin. Buňky (5xl05) byly suspendovány v 100 jul MEM obsahujícím 5% FHS a příslušnou protilátku. Suspenze byla inkubována 90 min při pokojové teplotě. Buňky byly dvakrát promyty MEM. inkubovány ve 100 μΐ MEM s komplementem 45 min při 37°C. opět dvakrát promyty MEM, a po přidání fyziologického roztoku. obsahujícího 0.2 % tryptofánové modři měřeny pod mikroskopem. Bylo vypočítáno procento lyže a hodnota v nepřítomnosti protilátky byla odečtena jako pozadí (blank).
(7) Frakcionace proteinového séra
Subfrakce proteinového séra vysrážená mezi 0,35 a 0,50 saturací síranu amonného při 4°C byla frakcionována zonovou elektroforézou na škrobovém gelu, použitím bloku škrobu o rozměru 10x40x1,5 cm pufrovaního 0,07 M verona1ovým pufrem (pH 8.6).
Hydrolyžovaný škrob, používaný pro gelovou elektroforézu byl získán od Connaught Laboratories, Willovdale, Ontario.
Po 24 h elektroforéze při 4°C a 35 mA byl gel nakrájen na lem bloky a každá část gelu byla eluována 10 ml vody. Získaná frakce β-globulinu byla dialyzována proti 0,01 M TRIS-HC1 pufru (pH 8,6) na 1 ml Mono-Q koloně proteinové kapalinové chromatofle (FPLC) na přístroji (Pharmacia. Upssala) a byla eluována lineárním gradientem 0 až 0,5 M NaCl v tomtéž pufru (ΤΟΜΟΝΟ, T., IKEDA.H-, TOKUNAGA.E.: High-performence ion-exchange chromatography of plasma proteins. J Chromatography, 1983,
266:39)./ Vysokotlaká iontoměničová chromatografie plasmatických a eluovány kysel inu proteinů/. Po rechromatografi i se symetrickým elučním profilem byla získána aktivní frakce.
Sepharose 4B kon jugovaruí s ovčím antisérem monospecif ickým ke každému z myších IgGl, IgG2a, IgGš, igA, IgM a IgD byla připravena použitím kyanbromidem aktivované Sepharose 4B CPharmacia, Upssala) a příslušných protilátek. FPLC purifikovaný materiál byl ve všech případech aplikován na 0,4 ml kolony při 4°C. Kolony byly promyty fyziologickým roztokem fyziologickým roztokem. obsahujícím 5 mM chlorovodíkovou. Eluáty C0,2ml frakce) byly přímo nakapány do 0,4 ml RPMI-1640 media, doplněného 10¾ FTS a používaného pro měření aktivity.
<8) Rádiojodizace proteinu a elektroforéza na polyakrylovém gelu
FPLC purifikovaný materiál CIO ug) byl označen 12^I chloramin T metodou CGREENWOOD. HC., HUNTER WM. , GLOVER.
The preparatlon of 131I-labelled human grovth hormone of specific radioactlvity, Blochem J, 1963, 89=114) /Příprava 131I značeného lidského růstového hormonu s vysokou specifickou radioaktivitou/, používající 1 mCi beznosiČového 125I jodidu sodného CNEN). Značený materiál byl separován od volného jodidu na koloně Sephadex G-50.
Dvourozměrná PAGE C elektroforéza na polyakrylovém gelu) byla vyvíjena nerovnovážným pH gradientem elektrofořezy CNEPHGE) v jednom směru a SDS Cdodecylsulfát sodný)-PAGE po redukci materiálu ve směru druhém CO-FARRELL, PZ. , GOODMAN, HM, High resolution two-dimentional electrophoresis velí as acidic proteis. Cel 1. 1977, 12=1233),/ rozlišení zásaditých i kyselých proteinů
JS. = high
0·FARRELL of basic Vysoký
PH.
as stupeň dvourozměrnou chromatografií/.
C9) Detekce Qa-2 antigenu průtokovou cytometrií
Byla užita T buňkami obohacená frakce myších splenocytŮ, myších ascitových nádorových buněk a BW5147 buněk. T buňkanji obohacená frakce byla získána z myších splenocytŮ adsorpcí na nylonová vlákna.CJURIUS.MH., SIMPSON, Ε., HERZENBERG, LA.= A rapid method for isolation of functional thymus-derived murine lymphocytes. Eur J Immunol, 1973, 3=645)./Rychlá metoda izolace funkčních thymus odvozených myších lymfocytů/.
Buňky byly dvakrát promyty MEM. Imunoglobuliny buněčného povrchu kontaminující B buňky byly blokovány působením Fab- frakce, získané z kozí anti-Cmyší immunoglobulin) protilátky po dobu 60 min při pokojové teplotě.
Buňky pak reagovaly s Qa-2-specifickou mAb 141-15.8 C200x zředěnou). Jako kontroly bylo použito normální B6.K1 myšší sérum nebo mAb proti bakteriální složce. Buňky byly inkubovány s mAb 90 min a pak s FITC (fluorescein isothiokyanáti-značenou FCab- )2 frakcí kozí protilátky specifické k myšímu imunoglobulinu 60 min při pokojové teplotě.
Všechna činidla byla ředěna MEM, obsahujícím 10 % kozího séra a i % hovězího sérum albuminu CHSA). Inkubace byly prováděny v 50-μ1 objemech a buňky byly po každé inkubaci fyziologickým roztokem CFPE) 2 5 000 rpm v mikrocentrifuze.
fixovány 1 % paraformaldehydem promyty fosfátem pufrovaným minutovou centrifugaeí při FITC-značení buňky byly a analyzovány na FACSIII přístroji CBecton Dickinson, Mountain Viev. Calf.).
CIO) Detekce sérového IgD enzymatickým imunosorbentním testem CELISA)
Pro detekci Qa-2-specifického IgD byl užit Qa-2-lacZ fúzovaný protein , který bude popsán v Příkladu 2. Po indukci produkce fúzovaného proteinu v E.coli isopropylgalaktozidem CIPTG). buňky, získané po indukci, lyžovaly v 50 % kyselině octové. Poté byla nerozpustná složka odstředěna. Po dialýze proti FPF, obsahujícím 1 % HSA získaný fúzovaný protein byl užit pro enzymatický imunosorbentní test CELISA).
Kultivační desky 96 typu P CImmunoplate, Nunc) byly pokryty extraktem E. coli nebo ovčím anti-Cmyší IgD) sérem v obou případech zředěným uhličitanovým pufrem CpH 9,0) a dále převrstveny 3 % HSA. Do každé převrstvené a promyté jamky bylo přidáno 50 μ 1 vzorku séra, sériově zředěného v EPE a ponecháno 2 h při pokojové teplotě. Roztok byl slit a jamky byly třikrát promyty FPF.
Poté bylo přidáno 50 μ1 roztoku peroxidázou značené krysí mAb specifické k myšímu IgD, zředěné 1 % HSA. Po 1 h stání při pokojové teplotě byl roztok slit a jamky byly čtyřikrát promyty FPF.
Poté bylo přidáno do jamek 100 ul směsi roztoku peroxidu vodíku a 2.2·-azino-di-(3-ethylbenzthiazollne sulfonátu?, ((Kirkegaard and Perry Laboratories. MD? a ponecháno 5 min při pokojové teplotě. Reakce byla ukončena přidáním 100 ul 1 % roztoku SDS. Byla určena absorbance roztoku při 410 nm.
(Výsledky?
(1? Rozpoznání specifi ty RS faktorů
Bylo uvedeno, že splenocyty, získané z C3H/He myši nesoucí ascity nádorových buněk 3 dny po inokuláci . lyžují různé syngenní (MM2, MM46 a.j.? a allogenní (Meth A, EL-4 a.j.? nádorové buňky na RS závislou buněčnou cytotoxickou reakcí. Některé syngenní nádorové buňky (MM48, X5563 a.j.? byly reakcí lyžovány slaběji (TANINO. T., EGAWA.K.: Regressor sérum factor-dependent nonspecifíc killers ln tumor-bearing nice). /Regresorové sérum na faktoru závislého nespecifického žabí ječe u myší s nádorovým onemocněním./
Aktivita RS byla v různé míře adsorbována těmi nádorovými buňkami,které byly citlivé k reakci. Avšak, aktivita RS nebyla adsorbována těmi nádorovými buňkami, které byly k reakci rezistentní. Citlivost allogenních nádorových buněk obecně vede k možnosti, že aktivní složky RS (nazvané RS-faktory? rozpoznají allogenní antigeny, které mohou být náhodně přítomny na povrchu nádorových buněk. K prověření této možnosti bylo RS adsorbováno lymfocyty z myší různých kmenů. Výsledky ukazuje Tabulka 2
Tabulka 2
| Adsorpce RS aktivity | lymfocyty, | získaných z ri | Qzných kmenů | myš í |
| Původ lymfocytů | H-2 | Cílové buňky | ||
| použitých | ||||
| ridpiOCyp — — — | ||||
| k adsorpci | MM2 | Meth | A | |
| % snížení RS | aktivityx | |||
| C3H/He | k | 3,4 ± 2,0 | 6,5 ± | 4.3 |
| CBA | k | 2,1 ± 1,8 | 5,5 ± | 4.1 |
| CE | k | 23,5 ± 1,4 | 3,6 ± | 0,0 |
| AKR | k | 40,5 ± 2,7 | 6,5 ± | 6,5 |
| C58 | k | 47,0 ± 2,7 | 24,2 ± | 8,2 |
| C57BL/6 | b | 68,7 ±16,1 | 74,3 ± | 12,8 |
| BALB/c | d | 41,8 ± 9,7 | 43,3 ± | 3,1 |
| DBA/2 | d | 67,9 ±11,3 | 79,6 ± | 8,7 |
| DBA/1 | q | 46,8 ±14.8 | 68,9 ± | 12,2 |
| A/J | a | 49,8 ± 6,5 | 84,5 ± | 9,9 |
χ průměrná hodnota ± střední odchylku výsledků z 2 pokusů. Procenta specifické lyže MM2 a Meth A buněk v přítomnosti neadsorbovaného materiálu byla 33,2 ± 4,4 a 28,4 ± 4,0.
Jak ukazuje Tabulka 2, aktivita RS, určena pomocí MM2 cílových buněk byla v různé míře adsorbována lymfocyty s H-2 haplotypy k(CE, AKR a C58) a lymfocyty s H-2 haplotypy jiné než k CB6, BALB/c, DBA/2, DBA/1 a A/J), ale ne lymfocyty z C3H/He a CBA myší (oba H-2k). Podobný, ale ne identický vzor adsorpce byl pozorován, když byly použity Meth A buňky jako cílové buňky cytotoxické reakce. Výsledky ukázaly, že adsorpce RS faktorů probíhá, když jeden antigen nebo nějaké antigeny v Ly skupině lymfocytů se lišily od antigenů C3H/He, nebo když jeden nebo některé z Qa/TL antigenů byly přítomny na splenocytech. Potvrzující výsledky byly získány pokusy s dvojnásobnou absorpcí a uvedeny v Tabulce 3.
Tabu 1ka 3
Dvojnásobná adsorpce RS aktivity lymfocyty různých myšších kme nfl
Původ použitých lymfocytů
Cílové buňky
1. adsorpce 2.adsorpce
MM2
Meth A
Snížení RS aktivity
| A | C58 | C3H/He | 37.8 | 11,5 | 34,4 | 5,2 | ||
| C58 | C57BL/6 | 97.4 | ~fr* | 2.6 | 97,2 | ± | 1,7 | |
| C58 | B6.K1 | 33,1 | ± | 2.2 | 45.1 | 4,2 | ||
| C58 | B6.K2 | 94.1 | ± | 14,4 | 93,7 | 4,2 | ||
| C58 | DBA/1 | 9,6 | 6,3 | 94.1 | í | 0.3 | ||
| C58 | BALB/c | 50.7 | 6,8 | 38,6 | ± | 3,11 | ||
| B | C57BL/6 | C3H/He | 57,5· | ± | 4,3 | |||
| C57BL/6 | A/J | 95.7 | ± | 1.1 | ||||
| C | A/J | C3H/He | 38,4 | ± | 5.6 | 99,3 | 1.0 | |
| A/J | C57BL/6 | 92,4 | 0,8 | 103,5 | 0,7 | |||
| A/J | DBA/2 | 96,0 | ± | 2,8 | 103,9 | + | 8,8 | |
| A/J | DBA/1 | 42,8 | ± | 0,4 | 106,7 | 1, í | ||
| A/J | BALB/c | 55,2 | 0,4 | 103,5 | 2,8 |
χ průměrné hodnoty ± střední odchylka výsledků 2 pokusů.
RS dvojnásobně adsorbované C3H/He lymfocyty bylo užito v kontrolních pokusech.
Procentické hodnoty specifické lyže MM2 a Meth A buněk byly
27.0 ± 3.0 a 28.2 ± 5,4 v případě A a 25.4 ± 1.0 v B a
25.0 ± 1.3 a 28,2 ± 2.0 v případě CČást aktivity RS byla adsorbována C58 lymfocyty. Snížení aktivity touto adsorpcí svědčí o tom. že RS obsahuje faktoríy), které váží jeden nebo více z Lyl.2, Ly3.1, Ly6.2, Ly7.1, Qa-1 nebo TL antigenů, předpokládajíce, že antigeny Qa/TL nebo Ly skupiny jsou vazebnými cíli RS faktorů.
Faktory, vážící se k Ly2.2, Ly4.2. Ly5.2. Qa-2 nebo Qa-3, pokud jsou v séru obsažené, zůstávají neadsorbovány. Zůstatková aktivita byla téměř kompletně adsorbováma B6. B6.K2 nebo DBA/1 lymfocyty. B6.K1 ani BALB/c lymfocyty významně neadsorbovaly aktivní faktor preadsorbovaného RS. Tyto výsledky svědčí o tom, že Qa-2 antigen adsorbuje některé aktivní faktory.
Podobně při adsorpci RS B6 lymfocyty a dále A/J lymfocyty autoři sledovali příspěvek Qa-1 a TL antigenů k reakci. Ačkoliv výsledek nebyl vzhledem k nízké aktivitě preadsorbovaného RS jednoznačný, zdá se, že jeden nebo více antigenů Qa-1 a TL může adsorbovat část aktivity.
Aktivita RS, preadsorbovaného A/J splenocyty sledována MMS cíli, byla téměř kompletně adsorbována DBA/2 nebo B6 lymfocyty, ale ne DBA/1 nebo BALB/c lymfocyty. To svědčí o tom, že Ly6.2 antigen adsorbuje část RS aktivity. Když byly Meth A užity jako cílové buňky, pak A/J splenocyty adsorbovaly aktivitu beze zbytku.
Tyto výsledky, hromadně posouzené, svědčí o tom, že RS obsahuje mnoho faktorů, vážících Qa-2, Ly6.2 antigeny a jeden nebo více faktorů, vážících Qa-1 a TL antigeny. Fenotypy všech těchto antigenů jsou allogenní k C3H/He. Mezi nimi patří Qa-1, Qa-2 a TL antigeny do neklasické histokompatibilní třídy 1 antigenové skupiny.
Zdá se, že výsledky také ukazují, že MM2 buňky exprimují Qa-2, Ly6.2 a jeden nebo více z Qa-1 a TL antigenů. Některé z Qa-1, Qa-2 a TL antigenů mohou být také exprimovány Meth A buňkami.
V souhlasu s tímto pozorováním , různé z allogenních lymfoblastů které exprimovaly jeden nebo více těchto antigenů (CE, C58, C57BL/6, B6.K2, DBA/1, DBA/2, A/J a C3H-Ly6.2), ale ne C3H/He a AKR lymfoblasty, byly lyžovány na RS závislou buňkami zprostředkovanou reakcí. (Tabulka 4). Lyže C3H-Ly6.2 ne C3H/He lymfoblastů přímo ukazuje příspěvek lymfoblastů, ale Ly6.2 antigenu. Přítomnost
Qa-2-specifického faktoru byla potvrzena proběhnutím na RS závislých lyží u lymfoblastů Qa-2,3 kongenních myší a L buněk transformantů (tabulka 5).
Aktivita RS, podporující lyži B6 a B6.K1 lymfoblastfi byla pouze částečně adsorbována B6.K1 lymfocyty B6 a B6.K2 (Tabulka s LQ,7b/Kb a LKbbuňkami ukázaly, že s rekongnantní specií itou k al/ lymfocyty, ale beze zbytku 5-A). Podobné experimenty RS obsahuje aktivní složku a2 oblasti Q7b genového produktu, nesoucího šerologickou Qa-2-specifi tu (Tabulka 5-B).
Tabulka 4
RS-dependentní buňkami zprostředkované lyže různých lymfoblastů
| Původ lymfoblastů | cíl | RS | ||
| C3H/He | % 0.3 ± | Spec 1.2 | if ické | lyže x 4.2 ± 5.2 |
| C3H-Ly6.2 | 0,0 ± | 0,6 | 30,5 ± 12,5 | |
| CE | 0,4 ± | 0,3 | 20.1 ± 3,5 | |
| C58 | 0,2 ± | 0,4 | 31.6 ± 5,1 | |
| C57BL/6 | 5,2 ± | 4,8 | 37.5 ± 12,0 | |
| B6.K1 | 0,1 ± | 0.2 | 33,2 ± 4,9 | |
| B6-K2 | 0.1 ± | 0,3 . | 37,1 ± 7,0 | |
| DBA/1 | 4.8 ± | 5,3 | 32,8 ± 2,7 | |
| DBA/2 | 2.3 ± | 3,2 | 31.4 ± 1,5 | |
| A/J | 0.3 ± | 0,2 | 36.7 ± 1,2 |
x průměrné hodnoty ± střední odchylka výsledků 2 pokusů. Ig zbavené RS bylo přidáno v konečné koncentraci zředěné 500x.
Tabulka 5
Důkaz Qa-2- specifi ty RS aktivity adsorpěními testy
Buňky, užité k adsorpci Cílové buňky
A. Lyrafoblasty
Lymfocyty -----------------------B6.K1 B6.K2
C3H/He
B6.K1
B6.K2
| Snížení | RS aktivity | (%) | X | |
| 0,0 + | 1,0 | -1,9 | 11,9 | |
| 95,8 + | 8.1 | 11,6 | 17,8 | |
| 95,1 ± | 3,9 | 96,9 | 1,4 |
B.
Transformanty L buněk
Transformanty L buněk
LQ7b/Kfo LKb LKt>
LQ7b/Kb
Snížení RS aktivity (%) χ 59.0 + 1,6 90,7 + 4,5
93,1 ± 2,4 96,0+2,2 χ průměrné hodnoty ± střední odchylka výsledků 2 pokusů. Ig zbavené RS bylo adsorbovámo lymfocyty nebo transformanty L buněk a přidány k reakční směsi v 500x zředěné konečné koncentraci. Procentické hodnoty specifické lyže B6, B6.K1 a B6.K2 lymfoblastů v přítomnosti neadsorbovaného RS byly 30,3 + 4,2,
28,3 + 1,2 a 35,4 + 2,2. V případě LQ7b/Kb a LKb buněk byly tyto hodnoty 45.0 ± 1,7 a 33,8 + 1,3 v přítomnosti neadsorbovaného RS a 16,3 ± 2.7 a 10,1 + 1,2.
¢21 Důkaz Qa-2 antigenu průtokovou cytometrií
Přítomnost Qa-2 antigenu na povrchu MM22 a několika jiných linií nádorových buněk odvozenách z H-2K myší CQa-2) byla snadněji prokázána membránovou imunofluorescenční metodou užitím
Qa-2-specifické mAb 141-15.8. Jak ukazuje Obr. 1 signifikantní Qa-2- specifická fluorescence byla reprodukovatelnž prokázána v sedni z devíti testovaných buněčných linií. CMH134 <A). MH125F CB), MH125P CC), MM2 CD), FM3A CE). MM102D CF),MM146 CG), MM148 CH). MH125P Cl). Tyto výsledky ukazují, že účinek Qa-2 allo-antigenu na nádorové buňky není v žádném případě specifický na MM2, ale je obecný mezi různými lymfomatickými a nelymfomatickýmim buněčnýhi liniemi, pravděpodobně částečně díky široké cílové selektivitě RS-dependentní reakce.
C3) Charakteristika Qa-2-specifického RS faktoru
Mezi multiplicitními faktory rozpoznávajícími allo-antigeny jejichž přítomnost je v RS předpokládaná, byla nej jasněji prokázána specificita faktoru k Qa-2 , jak bylo shora uvedenoPředkladatelé vynálezu proto zaměřili svoji pozornost na tento faktor a snažili se jej dále charakterisovat.
Po srážení síranem amonným a po preparativní elektrofořeze sérového proteinu, byla aktivita podporující lyži buněk Í36 lymfoblastfl, ale ne B6.K1 lymfoblastfl, nalezena hlavně v beta-globulinové frakci. Tato frakce byla pak rozdělena pomocí FPLC použitím Mono-Q kolony.
Aktivita byla spojena s materiálem eluovaným 0.03M NaCl. zatímco všechny myší mAb IgG podtříd a IgM třídy byly eluovány kolem 0,25 M a 0.35 M NaCl.
Částečně purifikovaný materiál byl rovněž testován na komplement-dependentní cytotoxickou aktivitu proti Qa-2* lymfocytflm. C0br.2.). Komplement-dependentní lyzát 86 mesenterických lymfonodních buněk purifikovaný FPLC nebyl detekován ani bylo-li pro stanonení použito 35 ug proteinu. Naopak anti-Qa-2 mAb IgG2b třídy v přítomnosti komplemeniu lyžovala buňky se stejným cílovým místem při koncentrace protilátky nižší než í ug proteinu.
K další charakterizaci Qa-2-specifké RS složky, materiál purifikovaný FPLC byl označený 125I, preadsorbován C58 lymfocyty, adsorbován na povrch Qa-2+ buněk a analyzován pomočí SDS-PAGE nebo dvourozměrnou PAGE s následovnou autoradiografií (Obr. 3).
Obr.3, A ukazuje jednorozměrnou SDS-PAGE v neredukovaných (a) a redukovaných (b) podmínkách při použití 7 ,5 polyakrylamidového gelu a B ukazuje obraz dvourozměrné PAGE.
Bylo pozorováno přibližně 2¾ specifické navázání radioaktivity na buňky. Relativní molekulová hmotnost vázaného materiálu v neredukčních podmínkách byla určena na 160 kDa. Pruh detekovaný za redukčních podmínek vykazoval relativní molekulovou hmotnost přibližně 50 kDa a 25 kDa. Tyto výsledky ukazují na to, že materiál obsahuje těžkou a lehkou řetězcovou strukturu podobnou IgG. Dvourozměrné gelové elektrofořezy značeného materiálu ukázaly, že je složen ze čtyř i více složek, jejichž isoelektrické body (Pí) se pohybovaly od 5,5 do 6,5 u těžkých i u lehkých řetězcových struktur.
Je známo, že IgD byl nalezen v beta-globulinové frakci sérum proteinů a že obsahuje skupinu kyselých glykoproteinů (ISHIHARA, E-. TEJIMA, Y.,TAKAHASHI, R. , TAKAYASU, T. . SHINODA.T.: Structure and location of asparagine-1inked olygosaccharides In the Fc region of a human immunoglobulin D, Biochem Biophys Res Comm, 1983, 110=181),/ Struktura a lokalizace asparagin vázaných oligosacharidů v Fc oblasti lidského immunoglobulinu D /, zatímco IgG jsou obecně basické proteiny. IgD má strukturu složenou z těžkých a lehkých řetězců jako IgGs, ale neinteraguje s Clq komplementárním systémem (SPIEGELBERG, HL.Immunoglobulin D (IgD), Methods in Enzymlogy, 1985. 116=95, SPIEGELBERG, HL. =
The structure and biology of human IgD, Immunological Rev, 1977, 37=3)./Struktura a biologie lidského IgD/.
Publikovány byly rovněž dvě formy myšího IgD. Jedna s molekulovou hmotností 170-200 kDa a druhá, bez Cl oblasti těžkého řetězce s molekulovou hmotností přibližně 150-160 kDa (FINKELMAN,FD., KESSLER, SV. , MUSHINSKI, JF-, P0TTER, M.=
IgD-secreting murine plasmocytomas= characterization of two IgD myeloma 126=680,/ IgD- sekretující myší charakterizace dvou IgD
Identification and partial protei ns, J.Immuno1, 1981, plasmocyty: Identifikace myelomatických proteinů/.
a částečná MOUNTZ, JD
MUSHINSKI.JF., OVENS, JD., FINKELMA, FD.= The in vivo generation of rourine IgD-secreting cells in accompaniedj by delebion of C μ gene and occasional deletion of the gene for the C delta 1 domain, J.Immunol, 1990,145=1583). / Generace myších IgD sekretujících buněk in vivo ve spojení s delecí C μ genu a s nepravidelnou delecí genu C delta 1 oblasti/. Variabi i i.ta v cukerné složce lidského monoklonálního IgD (NIG- myeloma protein) zřejmě způsobuje heterogenitu v isoelektrickém bodě mezi 5,6 a 6,8.
Tyto charakteristiky souhlasí s charakteristikami sérových komponent se Qa-2 specifitou. Z tohoto důvodu předkladatelé patentu předpokládají, že Qa-2 specifickým komponentem je IgD^
Pro potvrzení tohoto předpokladu byl materiál purifikováný FPLC po adsorpci s Lkb buňkami dále adsorbován na Sepharosu 4B s navázanými protilátkami specifickými pro různé podtřídy. myších imunoglobulinů. V Obr. 4-A jsou ukázány, buňkami zprostředkovaná lytická aktivita na Q^bZKb buňky matriálu před adsorpci (A), po adsorpci s LKb <) a po další adsorpci s Sepharodou 4B <·). Aktivita demonstrovaná užitím LQ7b/Kb jako cílové buňky byla dostatečně adsorbována Sepharosou 4B s navázaným anti-IgD.
Materiál zadržený a posléze eluovaný z antigen IgD kolony zřetelně lyžoval LQ7b/Kb buňky (Obr. 4-B). Šipka v Obr. 4-B ukazuje pozici startu eluce.
Aktivita nebyla prokazatelně s navázaným některým z antigenů anti-IgG3, anti-IgA a anti-IgM. Pouze slabá aktivita byla adsorbována a získána z anti-IgG2a navázaného na Sepharosu 4B. Tyto výsledky byly reprodukovatelné a ukazují, že aktivní komponenta v RS s Qa-2-specificitou byl IgD.
Přítomnost IgD v RS se specificitou na Qa-2 antigen byla dále prokázána ELISA testem, použitím Qa2-lacZ fúzujícího proteinu. Jak ukazuje Obr. 5. Qa-2-specifický IgD byl detekován v RS, ale nebyl detekován v séru normálních dospělých C3H/He. Ve shodě s výskytem Qa-2-specifického IgD bylo detekováno rovněž větší mnžství IgD v RS ve srovnání s normálním kontrolním sérem.
Minoritní množství Qa-2-specifického IgQ2a a IgG2b bylo také detekováno v RS ELISA testem za použití ploten, pokrytých fuzním zadržena Sepharosou 4B anti-IgGí, anti-IGb2b, proteinem a peroxidem značenénými mAb. specifickými na myší IgG2a a IgG2b. Qa-2-specifické IgG2a a IgG2b nebyly detekovány v FPLC puf i f i kovaném materiálu. zatímco Qa-2-specifický IgD detekovaný byl.
Na základě těchto výsledků lze dojít k závěru, že sérová komponenta se Qa-2-specifickou aktivitou v RS je IgD.
Příklad 2 [Materiál a metody] ¢1) Myši
Byly použity myši C31I/He. AKR. B6 a B6.K1. První dvě myši měly H-2k a Qa-2~, 3“ fenotypy.
B6 a B6.K1 myši měly fenotypy Qa-1—.2^,3+, a Qa-1'*“, 2', 3” .
C2> Nádorové buňky.
BV5147 je in vitro linie buněk odvozených z T buněk lympfoma AKR myší. MM2 a FM3A jsou buněčné linie ascitů virově indukovaných karcinomů mléčných žláz C3H/He myší. MH134 jsou buněčné linie ascitů chemicky indukovaného hepatomu C3H/He.
Bylo prokázáno. že tyto buněčné linie reagují s Qa-2-specifickou mAb Í4Í-15.8 CTANINO, T.. SEO. Ν., OKAZAKI.T., NAKANISHI-ITO, C., SEKIMATA, M. a EGAVA. K.: Humoral response to Qa-2 and other tumor antigens in nice, publikované Cancer Immunology Immunotheraphy./ Humorální odpověď k Qa-2 a jiným nádorovým antigenům myší/.
LQ7b/kb a L,Kb buňky byly zavedeny transfekcí Q7b/Kb hybridního genu DNA a H-AKb genomovou DNA. LQ7b!Kb buňky exprimují ala
| a 2 oblasti Q7b | genového produktu a | a 3 , | transmembránovou |
| a cytoplasmatickou | oblast H-2Kb. Lkb | buňky | exprimují H-2k |
| antigen. Buňky obou typů, právě tak | jako | netransfektované | |
| L buňky exprimují | H-2k antigeny. | ||
| C3) Protilátky | |||
| MAb 141-15.8, | která má specifi tu | k Qb- | •2 antigenu. byla |
získána od America Type Cul ture Collection, MA.
MAb 34-1.2, která má specificitu k Qa-2 antigenu jsme obdrželi od Australian Monoclonal Development, NSW.
Hybridomní klon produkující Qa-2 specifickou mAb 59 byl npvě vytvořen fúzí NS-1 buněk s lyrafocyty z B6.K1 imunizovanými>B6 lymfocyty.
Thyl.l specifická mAb byla koupena od Meiji Institute of Helth Science, Japan. Thy1.2-specifleká mAb byla koupena od Ceder Lané Laboratorie, N.Y.
Myší nňb třídy IgG2b, specifická na bakteriální komponent (NusA protein) byla laskavě poskytnuta Dr. Y. Nakamura z Meiji Institute of Helth Science a užita jako mAb, nemající vztah k povrchovým antigenům nádorové buňky.
FCab )2 kozí protilátky specifické na myší imunoglobulin a její FITC deriváty byly získány z Tágo lne., CA. Fab fragment protilátky byl získán redukcí FCab )2 2-mercaptoethylamlnem a frakcionací na Sephacryl S-200 koloně.
C4)0pracování nádorových buněk phosphatidy1inositol-specifickou fosfolipázou C CPI-PLC)
PI-PLC1 odvozená z Bacillus thuringiensis CIKEZAVA, Η., a TAGUCHI, R.: Phosphatidy1inositol-specific phospholipase
C from Bacillus cereus and Bacillus thiringiensis, Method in Enzymol. 1981, 71:731) byla koupena od Sappro Beer Co., Tokyo.
Nádorové buňky C2xl06) byly inkubovány při 37 °C po dobu 60 min v 30 ul D-MEM CpH 7,5) obsahující 0,1 mU PI-PLC a mg/ml ovalbuminu. Po inkubaci byly buňky promyty dvakrát D-MEM a použity pro detekci buňkových povrchových antigenů.
C5) Imunofluorescenční analýzy
Detekce buňkového povrchového Qa-2 a Thyi antigenu byja provedena průtokovou cytometrií. Stručně, buňky postupně reagovaly s Qa-2 specifickou mAb a pak s FITC značenou FCab frakcí kozí protilátky specifické na myší imunoglobuliny.
V případě lymfocytů, byly T buňky zkoncentrovány na kolopě s nylonovými vlákny a buňkové povrchové imunoglobuliny kontaminujících B buněk byly blokovány opracováním s Fab fragmentem protilátky. FITC značené buňky byly fixováňy 1% paraformaldehydem a analyzovány pomocí fluorescence aktivovaných buňek CFACS III. Becton Dikinson. CA).
C6) Příprava cDNA
Celková buněčná RNA byla extrahována z nádorových buněk a z thymocytů guanidin isothyocyanátovou metodou (SHIBLER, IJ. , TOSI. M-. PINETT. A.-C., FABIAN!, L-, a WELLAUER, P..K.: Tissue-speeific expression of inouse alpha-amirase genes, J Mol Biol. 1980. 142=93)/ Tkáňově specifická exprese myších alfa-amirázovýeh genů/ a byla obohacena mRNA isolací poly(A)·1' RNA na oligo(dT)-celu1ose (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) (AVIV, Η., and LEDR, P. = Purification of biologiealy active globin messenger RNA by ehromatography on oligothymidy1ic acid cellulose. Proč Nati Acad Sci USA;1972.69= 1408)./Purifikace biologicky aktivní globin messenger RNA chromatografií na oligothymidylic acid cellulose. Syntéza cDNA z mRNA byla provedena pomocí cDNA syntetizujícího setu (cDNA plus, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) s oligo-dT jako primerem.
(7) 01igonukteotidové primery a zkoušky
Vycházelo se z publikované nukieotidové sekvence genů v Qa-2, 3 region C3H/He (VATTS, S., DAVIS, A.C., GANT, B.,
WHEELER, C... HILL, L. A GOODENOV, R.S.= Organxzation and structure of the Qa genes of the major histocompatibi1 ity complex of the C3H mouše, Implication for Qa function and class I evolution, EMBO J. 1989. 8= 1749),/ Organizace a struktura genů hlavního histokompabi1 itního komplexu C3H myší. Důsledky pro funkci Qa a evoluci třídy 1/ jedenáct dvacetimerních oligonukleotidů bylo připraveno na DNA synthetizátoru (Applied Biosystems model 391) a použito jako primerů pro polymerační řetězovou reakci (PCR). Jejich uvedeny v Tabulce 6 a Obr. 6.
Oligonukleotidy č.. 1. 2, 3, k specifické antisense sekvenci, každého z H-2DK. Qk, Q2k, Q4k. Q5k a Q10k genů. Č.10 a 11 byly komplementární k Q5k-specifické sense sekvenci v exonu 8 a exonu 7. Č. 7, 8 a 9 byly komplementární k č. 1 až 6 a byly také syntetizovány a použity jako zkoušky v DNA-RNA hybridizačních experimentech.
sekvence a specificity jsou
4, 5a 6 byly komplementární nalezené v prvních exonech
| Syntetické | Tabulka 6 | ||
| deoxyoligonukleotidy použité jako | primery | a zkoušky | |
| Jméno | Sekvence (5--3-) | Spec if ici ta | |
| č.l | TGGCCCCGGCTCAGACCCGC | H-2Dk | |
| č.2 | TGACCCTGACCAAAACCGGA | Qlk | |
| č.3 | CCCGGACCCAGAACCGAGCC | Q2k | |
| č.4 | AGTCGCCCAGACCCTGATCG | Q4k | |
| č.5 | CTCTGACCCAGACCCGCGCT | Q5k | |
| č.6 | CCCCGACCCAGACCCAGGCA | Q10k | |
| č.7 | GCTGGGCCCTGGGCTTCTAC | c lass | 1 |
| č.8 | AGGGTGAGGGGCTCAGGCAG | c lass | 1 |
| č.9 | CTGGCAGTTGAATGGGGAGG | class | 1 |
| č.10 | ATCGTCTGTCACTCAGTCCA | Q5k | |
| č.ll | GCTCTAGGAGCTGTCCCTGC | Q5k | |
| č.12 až | |||
| Č.17 | komplementární k č.l až č.6 |
(8) Polymerizačni řetězová reakce (PCR)
PCR byla provedena v 100 ul reakční směsi obsahující 50 ng
DNA, 50 pmol každého z primeríl komplementárního k sense a antisense sekvenci, 20 mM Tris-HCl (pH 8,.3), 1,5raM MgCl2 , 25 mM KC1, 0,05 % Tween 20, 0,1 mg/ml želatiny, 50 uM každého dNTP a 2 jednotky TaQ DNA polymerázy (Parkin-Elmer/Cetus, Norwalk,
CT). Reakční směs byla převrstvena 100 ul minerálního oleje » k zabránění odpařování. Termální cykler (Atto, Tokyc), Japan)běžel 40 cyklfl (vždy 1 min při 94 °C, 1,8 min při 55 °C a 2 min při 72 °C).
(9) Klonování a sekvenování PCR-amplifikované DNA DNA amplifikovaná PCR byla sekvenovaná buď přímo, nebo po klonování do Smál místa pU119. Pro klonování komplementární E. coli MV1184 byly buňky transformovány plasmidovou DNA a rostly na plotně obsahující X-gel, IPTG a ampicilin. Bílé kolonie byly vyjmuty a rostly v 2xYT půdě. Buňky byly pak infikovány M13K07 pomocným (helper) fágem.
Výsledná jednořetězcová DNA stejně jako PCR-amplifIkovaná DNA byly sekvenovány dideoxy metodou (SAMAGE, E., NICKLEN, Sa CGULSON. A.R.= cDNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proč Nat Acad Sci USA, 1977, 74=5463) / Sekvenování cDNA se řetězec končícími inhibitory/ za použití setu pro sekvenování DNA (Sequenase verš ion 2.0, Unites States Biochemical Corp., Cleveland, OH) a synthetických oligonukleotidů použitých jako PCR primerů nebo N13 univerzálních primerů.
(10) Příprava genomické DNA a DNA-DNA hybridizace
Splenocyty z B6, C3H/HE a AKR myší a BV5147 buněk byly inkubovány při 60 °C přes noc v 0,03 % SDS roztoku obsahujícím 0,1 mg/ml proteinázy K a pak extrahovány fenolem. Výsledná vodná fáze byla dialyzována přes noc proti 10 mM Tris/HCl CpH 7,5) obsahujícím 1 mM EDTA a použita jako DNA roztok.
Deset ug každé genomické DNA bylo opracováno HindlII nebo BamHI, provedena elektroforéza v agarosovém gelu a přenesena na nylonový filtr (Hybridon-N+, Amersham). Filtr byl usušen při 37 °C a inkubován 1 hod při 60 °C v 6 ml hybridizačního pufru (6xSSC, 5x Denhardtova roztoku, 0,5 % SDS, 50 % formamid, 20 mM sodiumfosfátový pufr, pH 6,5) obsahující lmg DNA z lososích spermií. DNA označená 32P randomisační primární metodou byla dána k inkubaci. Hybridizace byla prováděna při 42 °C přes noc.
Filtr po hybridizací byl promyt dvakrát za pokojové teploty 15 min 2x SSC obsahující 0,1 % SDS. Filtr byl pak opláchnut 0,lx SSC a exponován na film pro X paprsky s použitím intenzifikačního filtru.
(11) DNA-RNA hybridizace
Poly(A)+ RNA byla připravena jak popsáno shora z AKR thymocytů a BV5147 buněk, denaturována glyoxalem, rozdělena elektroforézou na 1,2 % agarosovém gelu obsahujícím 20 mM fosfátový pufr (pH 7,4) a převedena na nylonový filtr. Filtr byl sušen při 37 °C a inkubován 1 hod při 60 °C v 2 ml hybridizačního pufru obsahujícího 100 ug DNA z lososích spermat.
01igonukleotidové zkoušky, 5 -konce, které byly značeny 32P byly dány k inkubaci. Po inkubaci při 42 °C přes noc byl filtr dvakrát promyt 2x SSC po 15 min při pokojové teplotě a dvakrát 2xSSC obsahujícím 0.1 % SDS po dobu 30 min při 50 °C. Filtr byl pak opláchnut 2x SSC a exponován na film X-paprsky iza použití intenzifikačního filtru.
<12) Syntéza Q5k proteinu a Western blotting.
DNA odpovídající exonflm 1 až 4 Q5* genu. která by ampl if ikována z BW5147 cDNA byla klonována do pIJl shora. Byly vyselektovány kolon i směru v protiproudu lacZ promotor a sekvenována jak popsáno které měly inzerci v pravém
Tato kolonie rostla v L půdě obsahující Ampieilin dokud optic la
e.
u.
ká denzita při 600 nm nedosáhla 0.3. IPTG byl přidán ke kultuře v 50 uM a kultivace pokračovala dokud optická densita nedosáhla 0.75.
Buňky byly odseparovány, precipitovány 10 % trifluoroctovóu kyselinou, promyty acetonem a rozpuštěny zahřátím na 100 °C po dobu 30 min v 25 mM Tris/HCl pufru CpH 6,8) obsahujícím 2 % SDS, 5 % glycerolu, 0,0125 % BPB a 2,5 % 2-merkaptoethanolu.
Rozpuštěný materiál byl dělen na 12 % polyakrylamidovém gelu obsahujícím 0.1 % SDS a převeden na polyvinyl difluoridovou membránu CImmobilion, Millipore, Bedford, NA) elektroblotací v roztoku obsahujícím 25 mM Tris basi, 192 mM glycin 20 % methanol a 0,02 % SDS. Membrána byla pak opláchnuta 0,15 M NaCl obsahujícím 0,2 % Tweenu 20 a stabi1isována v Tris/HCl pufru CpH 7,6) CTTBS), Inkubována 2 hod při 37 <>C v TTBS obsahujícím 10 % kozí sérum a 10 % koňské sérum.
Membrána byla opláchnuta vodou a inkubována přes noc Za pokojové teploty v 200x zředěné myší ascity obsahující raAb 59 v 5 ml stejného media. Po inkubaci byl filtr 3x opláchnut TTBS a reagoval 1 hod při 37 °C s peroxidázou označeném anti-myším IgG CAmersham) v solném roztoku pufrovaném 10 mM Tris-borátovým pufrem CpH 7,6). Membrána byla opět třikrát promyta TTfes a obarvena 50 ml TTBS obsahujícím tetrahydrochloridu CWako Cemicals, peroxidu vodíku.
mg 3,3 -diaminobenzidin Osaka, Japan) a 15 ul 30¾ [Výsledky] (1) Charakteristika Qa-2 antigenu exprimovaného nádorovými buňkami odvozenými z H-2k myší.
Ve zprávě TANINO, T., SEO, N.. OKAZAKI, T., NAKANISHI-ITO. C. , SEKIMATA, M. A ECAVA, K.·- Humoral responses to Qa-2 and other tumor antigens in mice (V tisku v Immrnunogenetics) bylo dokázáno, že většina rakovinných buněčných linií <7 z 9 testovaných) odvozených od H-2k (Qa-2~) myší vytváří Qa-2 antigen detekovaný membránovou imunofluorescenční metodou za použití anti-Qa-2 antiséra nebo Qa-2 specifické mAb 141-15.8.
Bylo nalezeno, že QA-2 antigen nebyl obecně nalezen na těchto buňkách, když byl použit jiný Qa-2-specifický mAb 34-1-2- Qa-2 specificita nově získaného mAb 59 byla zkoušena a srovnávána se specificitou mAb 141-15.8 a 34-1.2. Výsledek ukazuje Tabulka 7.
Tabulka 7
Detekce Qa-2 antigenu různými buňkami za použití Qa-2 monoklonálních protilátek
| Buňka | 34-1.2 | Qa-2-specifická mAb | Nepříbuzná mAb | |
| 59 | 141-15.8 | |||
| B6 lymfocyt | Průměrná 156.1 | fluorescenční 59.0 | intenzi ta 22,3 | |
| B6.K1 lymfocyt | 30.7 | 25,0 | 30.9 | |
| C3H/He thymoczt | 16.7 | 17,4 | 16,6 | 16,8 |
| AKR thymocyt | 18,1 | 19,2 | 19,5 | 18,0 |
| MM2 | 58,9 | 101,3 | 102,8 | 64,8 |
| BV5147 | 46,4 | 80,4 | 102,3 | 45,2 |
| L q7bZKb | 192,0 | 180,2 | 42,1 | 48,4 |
| LKJb | 81,2 | 68,2 | 71,5 |
TOSHI, Μ., PINNET, A.-C-, Tissue-specific expresion of
Je zřejmé. že mAb 59 rozpoznává a 1, nebo a 2 oblast Qa-2 molekuly. která je produktem Q7b genu a nemá cross-reakci s H-2k a H-2k antigeny. Stejně tak mAb 34-1.2, mAb 59 reagovala ne jenom s H-2b lymfocyty, ale také s různými H-2k nádorovými buňkami jako MM2 a BW5147.
Tato reaktivita na Qa-2-specifické mAb indikuje, že tento nádorovými buňkami exprimovaný Qa-2 antigen je blízce příbuzný, avšak není identický s Qa-2 antigenem detekovaným na normálních lymfocytech H-2b myší, a že a 1, nebo a. 2 oblast molekuly jsou odpovědny přinejmenším částečně za část rozdílu těchto dWou Qa-2 antigenň. Tabulka 7 také ukazuje, že Qa-2 antigen nebyl detekován na lymfocytech a splonocytech H-2k myší (C3H/He a AKR?,použitím některé z mAb.
Bylo publikováno, že Qa-2 antigen exprimovaný na lymfocytech získaných z H-2k je citlivý k účinku PI-PLC, (SCHIBLER, U., FABIANI, L. a VELLAUER, P-K. mouše alfa-amirase genes. J Mol anchors, Biochem glycosyl-phosphatidy1
Biol, 1980, 142=93?,/Tkáňově specifická exprese myších alfa-amirázových genů/ což ukazuje, že molekula je zakotvena na molekulovou membránu přes glycofosfatidylinositol (GPI?.
Je známo, že GPI struktura je napojena na asparagovou kyselinu proteinové molekuly buněčného povrchu. (LOV, M.G.: Biochemistry of the glycosy1-phosphatidy1 inositol membrane J, 1987, 244:1?-/ Biochemie inositol mebránového ukotvení./ u Qa-2 molekuly se předpokládá navázání GPI přes kyselinu asparagovou na pozici 295 kódovanou CAC v exonu 5 Q7b genu (WANECÍ G.L.,SHERMAN, D.H., KINCADE, P.V. , LOV, M.G. and FAVELL. R.A. Molecular mapping of signals in the Qa-2 antigen reguired for attachment of the phosphatidy1 inos itol mumbrane anchor, PrOc Nati Acad Sci USA. 1988, 85=577?
Qa-2 antigenu,
K.
/ Zmapování molekulálníph nutných pro vazby s i gnáIQ v s phosphatidylinos itol-membránovým antigenových molekulách, které jsou rezistentní tato asparagové kyselina nahrazena valinem.
DNA sekvence genů Qa-2-3 regionu dokazuje, že i všechny jiné ukotvením/.
V na PI-PLC
H-2 je předpokládané Q genové produkty mají valin na téže pozici jako Q7 a Q9. CDEVLIN, J.J.. VEISS, E.H., PANSOLN, M. A FLAVELL, R.A.= Duplication of gene pairs and alleles of class I genes in the Qa-2 region of the murine major histocompatibi1 i ty complex= a comparison. EMOB J, 1985. 4=3203). / Zdvojení genových párů a genii allel třídy I v Qa-2 oblasti hlavního histokompatibi1itního komplexu srovnání/.
Z tohoto pozorování bylo usouzeno, že Qa-2 antigen účinný na H-2k povrchu nádorových buněk může být rezistentní na PI-PLC. Jak ukazuje Tabulka 8-A, Qa-2 molekuly, detekované mAb 141-15.8 na různých nádorových buňkách odvozených od myších H-2k byly rezistentní na PI-PLC.
V kontrolním pokuse byla testována citlivost Thy-1 antigenu na BV15147 buňky. Thy-1 antigen je rovněž jedna z povrchových molekul mající GPI vazebné místo (LOV, H,G. A KINDADE, P.W.: Phosphatidy1 inos itol is the membrane-anchoring domain of the thy-1 glycoprotein. Nátuře. 1985, 318=62). / Phosphatidy1 inosítol je membránová oblast ukotvení thy-1 glycoproteinu/.
Jak ukazuje Tabulka 8-B Thy-1 antigen působící na BV5147 buňky byl vnímavý na PI-PLC. Tyto výsledky ukazují, že nepřítomnost vazebného místa na Qa-2 antigenu BV5147 buněk nebyla důsledkem defektu na membránovém mechanismu syntézy GPI vazebného místa, ale důsledkem biochemické diferenciace Qa-2 molekuly samotné.
Tabulka 8
A. Protilátka
| mAb 141-15.8 | bez vztahu k i |
| PI-PLC | opracován í |
| Buňky | — | ·* | -+· | |
| Intenzita fluorescence | ||||
| B6 lymfocyty | 152,0 | 59,7 | 30,6 | 29.4 |
| BW5147 | 85,1 | 96,4 | 35.8 | 36,2 |
| MM2 | 88,2 | 98,0 | 73.2 | 74.6 |
| FM3A | 108.0 | 109,3 | 71,1 | 72,3 |
| MH134 | 101,2 | 102,9 | 67.9 | 72.5 |
| B. | Protilátka | |
| anti-Thyl.1 | anti-Thy1.2 bez vztahu k mAb | |
| PI-PLC opracování | ||
| Buňky | — | - 4< - |
Intenzita fluorescence
AKR thymocyty 193,0 B6 thymocyty BV5147 176,0
98,0
176,0 79.7
95.1
34,5
40,1
Z těchto pozorování vyplývá, že Qa-2 nádorových buňkách odvozených z H-2k myší imunologicky i biochemicky odlišný od téhož normálních lyrafocytech. Qa-2k antigen může tigen přítomný «a Qa-2k antigen) je přítomného na H-2b být definován jako
PI-PLC rezistentní molekula přítomná na nádorových buňkách odvozených z H-2k myší a která reaguje s mAb 59 a 141-15.8, ale? ne s mAb 34-1.2.
C2) Identifikace genu, kódujícího Qa-2k fenotyp BV5147 buněk
Mezi Qa-2k-pozitivními nádorovými buňkami,byly pro další testy vyselektovány BV5147 buňky rostoucí in vitro, pro obtížnost exprese Qa-2k . a také proto, že jedině tak mohly být získány buňky nekontaminované buňkami hostitelského zvířete.
Obr.7 ukazuje výsledky DNA-DNA hybridizační analýzy, v které byly HindlII nebo BamHI fragmenty genomických DNA hybridizovány s 32P-značeným DNA fragmentem okolo 800 bp, detekovatelným v DNA oblasti, obsahující exon 2, 3 a 4 všech tříd 1 genů.
Autoradiogramy získané použitím DNA z C3H/He myší. AKR myší a BV5147 buněk byly v zásadě identické a lišily se od autodiagramu získaného použitím DNA z B6 myší. Na základě těchto výsledku je možné se domnívat, že uspořádání genů třídy 1 bylo v genomech zachováno u H-2k myší CC3H/He a AKR) a u lymfomatické linie buněk odvozených od AKR.
Bylo nalezeno, že Qa-2,3 oblast C3H/He genomu obsahuje Q1K, Q2k, Q4k, Q5k a Q10k geny CVATTS, S. , DAVIS A.C..GANT, B., WHEELER.C., HILL.L., a G00DEN0V, R.S.= Organization and structure of the Qa genes of the major histocompatibl1 i ty complex of the C3H mouše. Implicatins for Qa function and class I evolution EMBO J, 1989, 8=1749 / Organizace a struktura Qa genů hlavního histokompatibi1 itniho komplexu C3H myší. Důsledky pro funkci Qa a evoluci třídy I/.WEISS et al.= Organization of the AKR Qa region: Structure of a divergent class I seguence,
Q5 , J Immunogenet, 1989, 16=283)./ Struktura divergence třídy I, sekvence Q5k./
Gen Q3k je pseudogenem a geny odpovídající Q6, Q7, Q8 a z velké části Q9 podlehly deleci. Gen Q5k se zdá být hybridním genem složeným z velké 5· části Q5 genu a krátké 3- části Q9 genu.
Autoři se pokusili identifikovat gen, který byl netranskribovaný v AKR ale transkríbovaný v BV51147 DNA-RNA hybridizací a také amplifikaci cDNA PCR, použitím primérů a zkoušek. specifických pro každý z genů Qlk, Q2k, Q3k, Q4 Q5k a Q10k (Tabulka 6 a obr.6).
Primér a zkouška, specifická k H-2Dk genu byly také uži jako pozitivní kontrola.
Obr. 8 ukazuje výsledky DNA-RNA hybridtzačního testu. H-2Dk-specifická zkouška CČ..Í2) ukázala specifický hybridizač pás při 1.5 kb u obou AKR thymocytní RNA a BW5147 RNA. Na rozd od toho. Q5k-specifická zkouška Cč. 16) hybridizovala přibližně 1,2, 1,5 a 4.0 kb druhíi RNA v BW5147, zatímco ve vztahu k AKR RNA nedošlo k hybridizaci žádné.
Dále nedošlo k hybridizaci u AKR RNA ani u BV5147 R u zkoušek č. 13, 14. 15 a 17 (data nejsou uvedena). Ty výsledky prokázaly, že Q5k gen, jehož transkripce neby ty ni íl
NA to la detekována v H-2k thymocytech. byl specificky transkribován mezi Q geny BW5147 buněk. Transkripce Q5k genu v BV5147 buňkách byla potvrzena výsledky PCR.
Užitím přiměřil specifických k.H-2Dk, Qlk, Q2k, Q4k, Q5k a Q10k ( č.l až č.6) a příměru Cč.8), komplementárních k třídě 1 běžné sense byla získána sekvence v 3-- konečné oblasti exo^u 4 PCR.
Jak ukazuje Obr. 9, amplifikace BV5147 cDNA byla úspěšná pouze v případě, že primery č.l a č.5, které byly komplementární k H-2Dk a Q5k exonu 1 antisense sekvence byly užity společhě s primerem č.8. Amplifikace nebyla prokázána,když přiměř č.£, 3,4 a 6 byly užity společně s primerem č. 8, dokonce i při teplotě snížené na 45°C. Rozšířená DNA pomocí primérú č.5 a č.8 byla sekvenována přímo a také po klonování do pUC119, užitím přiměřil č. 5, 7, 8 a M13 univerzálního primeru.
Nalezená sekvence byla identická s uváděnou nukleotidovou sekvencí exonil 1 až 4 Q5k genu C3H/He. Amplifikace jiných genů než Q5k nebyla během přímého sekvenování detekováma. Amplifikace H-2Dk sekvence z AKR cDNA byla detekována také při použití přiměřil č.í a č.8.
Avšak, žádná Q specifcká sekvence neumožňuje amplifikaci AKR cDNA. Amplifikace BV5147 cDNA byla také pozorována tehdy, když byl použit přiměř č.9, komplementární k třídě 1 obecné antisense sekvence v exonu 4 a primer č.10. komplementární k Q5k specifické sense sekvenci v exonu 8. Nukleotidová sekvence rozšířené RNA těmito primery. byla určena přímo primery č.9 a 10.
Nukleotidová sekvence cDNA. vyplývající z těchto výsledků se plně shoduje s popsanou nukleotidovou sekvencí Q5k genu. To dokazuje i to, že Q5k gen, který není transkribován v normálních H-2k lymfocytech byl transkribován v BV5147 buňkách.
Abychom určili, zda Q5k gen BV5147 kóduje imunologicky definovaný Qa-2 antigen. byla provedena analýza reaktivity enzymem značeného antigenu s peptidem kódovaným cDNA sekvencí amplifikovanou PCR použitím primerů č.5 a č.9.
Amplifikovaná DNA byla ligatována přímo do Smál místa pUC119, aby byl získán rekombinant, který byl vnesen do kompetentních E. coli MV1184 buněk. Fúzovaný protein s lacZ proteinem byl indukován kultivací buněk v přítomnosti IPTG.
Jak ukazuje Obr. 10, získané E. coli produkovalo peptid o molekulové hmotností 35 kD, což byla hodnota očekávaná od fúzovaného proteinu. Tento 35 kD protein reagoval s peroxidázou značenou anti-Qa-2 mAb 34-1.2.
Z těchto výsledků předkladatelé vynálezu vyvozují, že Qa-2k antigen z povrchu BUS147 buněk, který byl detekován pomocí mAb 59, ale ne pomocí mAb 34 1.2 a který byl rezistentní vůči
PI-PLC, byl produkt Q5k genu.
Příklad 3:
Z pokusů ve výše uvedených Příkladech je evidentní, že probíhá aktivace genu v Qa/Tla regionu, a že produkt Q5 genu má obecnou antigenicitu (křížovou reaktivitu) s normálním Qa-2 lymfocytovým antigenem. Dále, že na odpověď QAa-2- myší, nesoucích nádorové buňky, proti produktu Q5 genu, exprimovaného nádorovýni buňkami může být citlivý také Qa-2 antigen (produkt Q7 genu) umístěný na povrchu a 1logenických normálních lymfocytů.
Proto předkladatelé vynálezu provedli pokusy indukce imunitní rezistence proti nádorovým buňkám za použití Qa-2 antigenů. [metoda] ty
Qa-2“ myši byly imunizovány normálními lymfocyty Qa-Í allogenIckých myší. Jako Qa-2“ myši, (C3H/HexB6.KÍ) byly pužU Fi myši.
(Výsledky) (1) Pomocí výše uvedené imunizace specifické na Qa-2 antígei byla rezistence proti nádorovým buňkám na př. MM2 z C3H/He myší indukována do Fi myší. Nebot, zatímco transplantace 2xl05 nádorových buněk byla úspěšná u kontrolní neimunizované skupiny, transplantace u imunizovaných myší byla neúspěšná.
Dále, když Fi myši byly imunizované lymfocyty B6.K2 myší místo C57BL/6 myší, byly získány stejné výsledky, jak ukazuje Tabulka 9.
n.
Tabulka 9
| myši | ii rychlost transplantace I MM2 buněk |
| myši imunizované proti Qa-2 antigenů | 1 1 i 0/10 x |
| Kontrola | i |
| neImunizované myši | 1 ío/io □ |
χ jmenovatel: počet použitých myší čitatel : počet myší, u kterých byla transplantace účinná (2) Splenocyty získané z imunizovaných Fi myší byly stimulová in vitro splenocyty C57BL/6 myší indukcí T buněk mající cytotoxicltu specifickou k Qa-2 antigenů. Tyto T buňky sil stimulovaly ne jenom normální lymfocyty Qa-2* allogenické myš ale také nádorové buňky z C3H/He myší.
Dále, když splenocyty získané z Fi myší imunizova ly ;h iě l, lé lymfocyty B6.K2 myší byly stimulovány in vitro lymfocyty z B6.K2 myší. tak byly indukovány T buňky s anti-Qa-2 cytotoxici tou. Cytotoxické aktivity měřené proti cílovým nádorovým buňkám ukazuje Tabulka 10.
Tabulka 10
| 1 1 i | Cílové buňky | i | Cytotoxická aktivita | 1 | |
| 1 specifické | lyže) | |||
| i i 1 | Nádorové buňky MM2 | i 1 j 77,4 ± 3,3 | % | |
| i >1 | Meth A | | 65,3 ± 3,2 r | ||
| 1 i 1 | Kontroly B6.K1 lymfocyty | 1 1 J 16,9 ± 2,0 | ||
| 1 | B6.K2 lymfocyty | | 77,4 ± 3,3 5 | 1 |
Efektor: Cíl - 100=1 (3) Fi myši byly transplantovány NSEa nádorovými buňkami z C3H/He myší na plant-arní části. Myším byly odřezány ze stehen nádorové buňky, když průměr nádoru dosáhl 1 cm a 1 až 4 dny potom specificky imunizovány k Qa-2 antigenu splenocyty C57BL/6 myší.
U všech kontrolních myší se vyskytovalo v plicích mnoho metastáz a asi za 4 týdny všechny myši v důsledku těchto plicních metastáz pošly. Do té doby nebyla u většiny pokusných myší pozorována metastáze žádná, i když u malého počtu myší jedna nebo dvě metastáze byly nalezeny.
Dále, do Fi myší byly transplantovány NFSa nádorové buňky odvozené od C3H/He myší na plantarní části. Myším byly odřezány ze stehen nádorové buňky, když průměr nádoru dosáhl 8 až 10 mm a tři dny později byly specificky imunizovány proti Qa-2 antigenu intraperitoneálním podáním splenocytů B6.K2 myší. Po dnech byly myši pitvány, jejich plíce byly pozorovány pod stereoskopickým mikroskopem a byly počítány plicní metastáze. Výsledky ukazuje Tabulka 11.
Tabulka 11
Skup i itii i počet lymfocytfl použitých pro imunizac i počet, plicních metastází
C3H/HexB6.Kl Fi myš i
C3H/HexB6.K2 Fi myši myši počet metastází myši počet metastází
| 1 | -η f| 5 x 106 | | č. | 1 | 0 | Ί1 £· | 1 | 20 | |
| 1 1 | č. | 2 | 0 | 1 £· | 2 | 6 | ||
| i i | č. | 3 | 0 | i £· | 3 | 11 | ||
| 1 1 | č. | 4 | 0 | 1 | ||||
| 2 | i i | 5 x 105 i | č. | 1 | 0 | i 1 £· | 1 | 9 | |
| 1 i | č. | 2 | 1 | 1 e. | 2 | 8 | ||
| 1 i | č. | 3 | 0 | 1 £- | 3 | 10 | ||
| i 1 I 1 | č. | 4 | 1 | 1 | ||||
| 3 | 1 1 | 5 x 104 | | č. | 1 | 5 | 1 1 £- | 1 | 6 | |
| 1 1 | č. | 2 | 8 | 1 £- | 2 | 12 | ||
| 1 1 1 1 | č. | 3 | 6 | 1 £ | 3 | 14 | ||
| 4 | 1 1 | Kontrolní | | č. | 1 | 5 | 1 i £. | 1 | 9 | |
| 1 skupina | | č. | 2 | 9 | 1 č. | 2 | 14 | ||
| | bez | | č. | 3 | 9 | 1 £. | 3 | 10 | ||
| 1 imunizace | | 1 |
Je tedy zřejmé, že rezistence proti nádorovým buňkám může být indukována imunizací Qa-2~ s Qa-2+ allogenlckými normálními lymfocyty. Imunoreakce v případě Q7 genového produktu v Qa-2 myších nul totiž cross-reaktivi tu s Q5 genovým produktem a je zřejné, že tato cross-reaktivita tvoří výše uvedenou rezistenci proti nádorovým buňkám.
Příklad 4Co se týká lidských neklasických histokompatibilních antigenů 1 třídy, byly již u některých antigenů určeny všechny nukleotidové sekvence. Je známo, že některé z genů jsou u normálních dospělých jedinců neaktivní.
Byl připraven polynukleotid se specifickou nukleotidovou sekvencí tohoto genu a použit jako primer k amplifikaci cDNA připravených z lidských nádorových buněčných kmenů (HL60, U937, Hmy2C14 a SKV-3) pomocí PCR metody. Jak ukazuje Obr. 11 byly detekovány nukleotidové amplifikace o očekávané délce (viz šipka).
Tento výsledek ukazuje, že neklasické histokompatibilni antigeny 1 třídy, které nejsou aktivovány u normálních dospělých jedinců, byly aktivovány v lidských nádorových buňkách.
Jak popsáno výše, rezistence proti nádorovým buňkám je indukována v Qa-2-myších imunizováním Qa-2- myší Qa-2+ allogenními normálními lymfocyty. Dále, v tumorových buňkách Qa-2·4· myší je aktivován Q5 gen, který není aktivován u normálních dospělých myší. a proto imunoreakční specificita na produkt Q5 genu může být indukována imunizací produktem Q5 genu, takže je možné indukovat rezistenci proti autogenetickým nádorovým buňkám.
Rovněž tak u člověka neklasické histokompatibilni antigeny 1 třídy, které nejsou aktivovány u normálních dospělých jedinců, jsou aktivovány v nádorových buňkách.
Ve shodě s těmito údaji je podle předkládaného vynálezu proti nádorová metoda a proti nádorový prostředek- Je totiž možno indukovat rezistenci proti nádorovým buňkám obsahujícím neklasický histokompatibiolní antigen 1 třídy protilátkou, která tento antigen nebo cytotoxický lymfoeyt identifikuje.
<7
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY . Neklasický histokompatibilní antigen 1 . třídy pro použití k léčení nádorových onemocnění.
- 2. Protilátka identifikující neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy pro použití k léčení nádorových onemocnění.
- 3. Cytotoxický lymfocyt identifikující neklasický histokompatibilní antigen 1 . třídy pro použití k léčení nádorových onemocnění.
- 4. Prostředek pro léčení nádorových onemocnění, v. y značujicí se tím, že jako účinnou látku obsahuje neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy.
- 5. Prostředek pro léčení nádorových onemocnění, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje protilátku identifikující neklasický histokompatibilní antiger. 1. třídy.
- 6. Prostředek pro léčení nádorových onemocnění vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje cytotoxický lymfocyt identifikující neklasický histokompatibilní antigen 1. třídy.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4048840A JPH05246889A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 制癌方法および制癌剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ34293A3 true CZ34293A3 (en) | 1994-01-19 |
Family
ID=12814449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ93342A CZ34293A3 (en) | 1992-03-05 | 1993-03-04 | Preparation for treating tumorous diseases |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0563627A2 (cs) |
| JP (1) | JPH05246889A (cs) |
| KR (1) | KR930019225A (cs) |
| CN (1) | CN1079400A (cs) |
| AU (1) | AU3398793A (cs) |
| BR (1) | BR9300764A (cs) |
| CA (1) | CA2090957A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ34293A3 (cs) |
| FI (1) | FI930976A (cs) |
| HU (1) | HUT67859A (cs) |
| IL (1) | IL104944A0 (cs) |
| NO (1) | NO930798L (cs) |
| NZ (1) | NZ247057A (cs) |
| SK (1) | SK15993A3 (cs) |
| ZA (1) | ZA931558B (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
| IT1274592B (it) * | 1994-08-05 | 1997-07-18 | Angela Turiano | Composizione farmaceutica per la terapia tumorale contenente xenoantigeni |
| EP0937258A2 (en) * | 1996-10-29 | 1999-08-25 | Fred Hutchinson Cancer Research Center, Inc. | Cell stress regulated human mhc class i gene |
| EP1054688B1 (fr) * | 1998-02-20 | 2004-06-30 | Commissariat A L'energie Atomique | Methode de selection de tumeurs exprimant hla-g, sensibles a un traitement anticancereux et ses applications |
| FR2775189B1 (fr) * | 1998-07-24 | 2001-06-08 | Commissariat Energie Atomique | Compositions anti-tumorales a base d'antigenes hla-g ou d'anticorps anti-hla-g |
| GB9827104D0 (en) * | 1998-12-10 | 1999-02-03 | Onyvax Ltd | New cancer treatments |
| EP1245675A1 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-02 | Kohji Egawa | Cancer cell-specific HLA-F antigen and a diagnostic method of cancer by using thereof |
| US20050025771A1 (en) * | 2003-03-04 | 2005-02-03 | Greenville Hospital System | Antitumor agents comprising a targeting portion and an immune response triggering portion |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3825615A1 (de) * | 1988-07-28 | 1990-02-01 | Behringwerke Ag | Antigenkonstrukte von "major histocompatibility complex" klasse i antigenen mit spezifischen traegermolekuelen, ihre herstellung und verwendung |
-
1992
- 1992-03-05 JP JP4048840A patent/JPH05246889A/ja active Pending
-
1993
- 1993-03-03 CA CA002090957A patent/CA2090957A1/en not_active Abandoned
- 1993-03-03 NZ NZ247057A patent/NZ247057A/en unknown
- 1993-03-04 SK SK15993A patent/SK15993A3/sk unknown
- 1993-03-04 CZ CZ93342A patent/CZ34293A3/cs unknown
- 1993-03-04 FI FI930976A patent/FI930976A/fi unknown
- 1993-03-04 NO NO93930798A patent/NO930798L/no unknown
- 1993-03-04 IL IL104944A patent/IL104944A0/xx unknown
- 1993-03-04 AU AU33987/93A patent/AU3398793A/en not_active Abandoned
- 1993-03-04 ZA ZA931558A patent/ZA931558B/xx unknown
- 1993-03-05 CN CN93103844A patent/CN1079400A/zh active Pending
- 1993-03-05 EP EP93103650A patent/EP0563627A2/en not_active Withdrawn
- 1993-03-05 BR BR9300764A patent/BR9300764A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-03-05 KR KR1019930003358A patent/KR930019225A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-03-05 HU HU9300612A patent/HUT67859A/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0563627A2 (en) | 1993-10-06 |
| CA2090957A1 (en) | 1993-09-06 |
| NO930798L (no) | 1993-09-06 |
| SK15993A3 (en) | 1993-10-06 |
| NZ247057A (en) | 1995-10-26 |
| BR9300764A (pt) | 1993-09-28 |
| KR930019225A (ko) | 1993-10-18 |
| NO930798D0 (no) | 1993-03-04 |
| JPH05246889A (ja) | 1993-09-24 |
| AU3398793A (en) | 1993-09-09 |
| IL104944A0 (en) | 1993-07-08 |
| CN1079400A (zh) | 1993-12-15 |
| ZA931558B (en) | 1993-09-27 |
| FI930976A0 (fi) | 1993-03-04 |
| FI930976A (fi) | 1993-09-06 |
| HU9300612D0 (en) | 1993-05-28 |
| HUT67859A (en) | 1995-03-23 |
| EP0563627A3 (cs) | 1994-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3399943B2 (ja) | 癌胎児性抗原を発現する組換えウイルスとその使用方法 | |
| KR100380503B1 (ko) | 흑색종관련항원성폴리펩티드,그에피토프및흑색종에대한백신 | |
| US10005845B2 (en) | Antibodies and fragments thereof raised against the alpha-3 domain of HLA-G protein, methods and means for their preparation, and uses thereof | |
| JP4235984B2 (ja) | Ｗｔ１特異的免疫療法のための組成物および方法 | |
| ES2537323T3 (es) | Péptido CDCA1 y agente farmacéutico que lo comprende | |
| EA009026B1 (ru) | Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях | |
| EA003675B1 (ru) | Белки, связывающие интерлейкин-18, их получение и применение | |
| JPH11505409A (ja) | 受容体キメラによる細胞性免疫の再指示 | |
| JP2003528591A (ja) | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 | |
| EP1301605B1 (en) | Nk cells activating receptors and their therapeutic and diagnostic uses | |
| JP2004504808A (ja) | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 | |
| Staerz et al. | Monoclonal antibodies specific for a murine cytotoxic T-lymphocyte clone. | |
| AU2001278662A1 (en) | NK cells activating receptors and their therapeutic and diagnostic uses | |
| PL155084B1 (en) | A method of monoclonic antibodies generating and the useof theses antibodies in distributions based on immulogical affinity | |
| Ertl et al. | Sendai virus-specific T cell clones. V. Induction of a virus-specific response by antiidiotypic antibodies directed against a T helper cell clone. | |
| CZ34293A3 (en) | Preparation for treating tumorous diseases | |
| RU2124050C1 (ru) | Синтетический поли-iga-комплекс, белок, способ получения комплекса, способ тестирования, способ защиты | |
| Boog et al. | Role of dendritic cells in the regulation of class I restricted cytotoxic T lymphocyte responses. | |
| KR20220052987A (ko) | Ebv 유래 항원에 특이적인 tcr 작제물 | |
| JPH04505401A (ja) | 主要組織適合抗原に会合したペプチドを認識するモノクローナル抗体 | |
| McCLUSKEY et al. | Serologic and T cell recognition of truncated transplantation antigens encoded by in vitro deleted class I major histocompatibility genes. | |
| CA2049986A1 (en) | Rickettsial antigens for vaccination and diagnosis | |
| Schmidt et al. | Variation of expression of histocompatibility antigens on tumor cells: absence of H-2K k-gene products from a gross-virus-induced leukemia in BALB. K | |
| US6894146B1 (en) | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer | |
| JP2813630B2 (ja) | ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープポリペプチドおよびその抗体 |