HUT67859A - Antitumour method and antitumor agent - Google Patents
Antitumour method and antitumor agent Download PDFInfo
- Publication number
- HUT67859A HUT67859A HU9300612A HU9300612A HUT67859A HU T67859 A HUT67859 A HU T67859A HU 9300612 A HU9300612 A HU 9300612A HU 9300612 A HU9300612 A HU 9300612A HU T67859 A HUT67859 A HU T67859A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- antigen
- specific
- mice
- lymphocytes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title abstract 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 10
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 claims description 21
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 claims description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 51
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 118
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 64
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 59
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 108010026590 Q surface antigens Proteins 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 24
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 108010031650 Thy-1 Antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000011640 AKR mouse Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035695 Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001001372 Homo sapiens Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein Proteins 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001195348 Nusa Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical group 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000007693 zone electrophoresis Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTWSDDKGKIGSJE-UHFFFAOYSA-N 5-(4-aminophenyl)cyclohexa-2,4-diene-1,1,2-triamine;tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1C(N)(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 WTWSDDKGKIGSJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710172503 Chemokine-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000006486 Phosphoinositide Phospholipase C Human genes 0.000 description 1
- 108010044302 Phosphoinositide phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 101710138270 PspA protein Proteins 0.000 description 1
- 101150064691 Q gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M iodine-131(1-) Chemical compound [131I-] XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001173 tumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A jelen találmány egy tumorellenes eljárással és egy tumorsejtek felszínén termelődő tumor antigénekre specifikus immunreakciót felhasználó tumorellenes reagenssel kapcsolatos.
Fiziológiailag aktív tumorellenes anyag rákos állatok aszciteszéből történő előállítását ismerteti a nem vizsgált, 248532 számon közrebocsátott japán szabadalmi leírás.
Ezen eljárás során tumoros sejteket ültetnek be egy emlős állat hasüregébe egy tumorellenes reagenst juttatnak be az állatba, majd normál szingén emlősből nyert lépsejteket juttatnak be, majd egy előzetesen meghatározott idő eltelte után a hasüregben összegyűlt asziteszből fiziológiásán aktív anyagot nyernek ki. Másfelől fiziológiásán aktív anyag nyerhető olyan rákos betegek hasüregében összegyűlt aszitesz felülúszójából is, akik immunkezeléses terápia során javulást mutatnak.
Tumoros állatokban a tumorsejtek elpusztításának immunológiai mechanizmusa azonban máig nem kielégítően tisztázott.
A jelen találmány egyik tárgya egy tumor antigénre specifikus immunreakciót felhasználó tumorellenes módszer.
A jelen találmány másik tárgya egy tumorellenes reagens, mely hasznossága egy tumor antigénre specifikus immunreakción alapul.
Nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási (szöveti összeférhetőség) antigén bejuttatására számos eljárás lehetséges, beleértve a következőket:
1) allogén limofociták bejuttatása, melyek keresztreakciót mutatnak egy a tumorsejteken expresszálódó nem klasszikus I osztályú hisztokompatibilitási antigénnel;
2) a génsebészet módszereivel előállított nem klasszikus I.
• · ·
osztályú hisztokompatibilitási antigén bejuttatása;
3) izolált nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigén cDNS-ének tenyésztett limfocitákba bejuttatása, melynek során lehetővé tesszük, hogy a limfocita sejtek ezt a nem klaszszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigént a felszínükön expresszálják, és ezt követően ezen limfociták in vitro szaporítjuk és bejuttatjuk.
Ezen eljárások jól ismertek a tudomány területén, pl. a fenti 2) és 3) pont antigénjének előállítási módszere a következő lépésekből áll:
a) nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigént expresszáló tumorsejtekből mRNS előállítása;
b) az mRNS-nek megfelelő cDNS előállítása reverz - transzkriptáz alkalmazásával;
c) a cDNS-ből lambda fág felhasználásával cDNS könyvtár készítése;
d) a cDNS könyvtárból azon lambda fág kiválasztása a plakk hibridizációs eljárást felhasználva, mely a nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigén cDNS-ét tartalmazza;
e) ezen cDNS-t expressziós vektorba juttatva a nem klaszszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigén fehérje molekula nagy mennyiségben való termelése E. coli-t alkalmazva; és
f) a d) lépésben nyert cDNS bejuttatása tenyésztett limfocitákba egy DNS transzfekciós módszert alkalmazva, majd ezen limfociták IL-2 jelenlétében való tenyésztése és a limitált hígítás! módszert felhasználva olyan sejtklónok létrehozása, melyek az antigént erősen expresszálják.
Olyan antitest előállítására, mely nem klasszikus I. ősz- 4 • · ·
• · · • · tályú hisztokompatibilitási antigént ismer fel, szintén számos, e tudományterületen ismert eljárást használhatunk. Pl. a következő eljárás alkalmazható:
1) hibridoma (hibrid sejtek) előállítása limfómasejtek és a fenti e) lépésben nyert antigén molekulákkal immunizált állatokból nyert lépsejtekkel való fúzióval vagy olyan limfocitákkal történő fúzióval, melyeket rákos betegek perifériás véréből nyerünk és a fenti e) lépésben kapott antigén molekulák jelenlétében in vitro aktiváljuk; ezután
2) ezen hibridómák közül azok kiválasztása a limitált hígítási eljárás alkalmazásával, melyek a nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigén azonosítására képesek. Ilyen szelekcióhoz mikrotitráló lemezeken végzett ELISA módszert alkalmazunk.
Olyan citotoxikus limfociták előállítására, melyek a nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigént azonosítják, szintén e tudományterületen ismert módszereket használhatunk. A következő eljárás alkalmazható például:
1) citotoxikus limfociták előállítása a fenti f) lépésben előállított nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigént expresszáló limfocitákkal immunizált állatokból nyert lépsejtek tenyésztésével vagy rákos betegek perifériás véréből nyert limfociták révén, melyeket a fenti f) lépésben kapott limfociták jelenlétében in vitro tenyésztünk;
1) a limitált hígítási módszer alkalmazásával ezen limfocitákból citotoxikus kiónok felállítása; és
3) az azonosítás specificitásának bizonyítása mérve a fenti f) lépésben előállított és kontroll cDNS-sel nem transzfektált
..... · .....
limfocitákkal szembeni citotoxicitást.
A jelen találmány egy tumorellenes eljárást, amely során nem
| klasszikus | I. osztályú hisztokompatibilitási antigént, ezt az |
antigént azonosítani képes antitestet vagy egy citotoxikus lépsejtet juttatunk a kezelendő egyedbe, továbbá egy tumorellenes reagenst szolgáltat, mely hatékony komponensként a fenti antigént tartalmazza.
A jelen találmányt a következő példák segítségével részletesen ismertetjük, de a találmány nem korlátozódik ezen példákra.
| Az 1. | ábra a Qa-2 antigén jelenlétét mutatja H-2k egérből |
származó tumorsejteken;
| a 2. | ábra az anti-Qa-2 monoklonális antitest (mAb) és a |
gyors fehérje folyadékkromatográfiás (FPLC) eljárással tisztított anyag komplement-függő citotoxikus aktivitási vizsgálatának eredményeit mutatja;
| a 3. | ábra a 125-J-dal jelzett FPLC-tisztított anyag |
autoradiográfiás vizsgálatának eredményét mutatja;
a 4. ábra a regresszor szérum (RS) aktivitás egy anti—IgDSepharose oszlopon való adszorpcióját mutatja;
| az 5. | ábra a Qa-2 antigénre specifikus IgD jelenlétét |
| mutatja az | RS-ben enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálattal |
(ELISA);
| a 6. | ábra a polimeráz láncreakció (PCR) láncindítóként |
alkalmazott oligonukleotidok specificitását mutatja;
| a 7. | ábra egy DNS-DNS hibridizációs vizsgálat eredményét |
mutatja;
| a 8. | ábra egy DNS-RNS hibridizációs vizsgálat eredményét |
•· ···· ····
- 6 mutatja;
a 9. ábra a BW5147 cDNS PCR-rel való felerősítését mutatja;
a 10. ábra a Qa-2 antigénre specifikus mAb E. coliból származó fúziós fehérjével való reakció reaktivitását mutatja;
a 11. ábra humán tumorsejtvonalakból előállított cDNS-ek nukleotid erősítését mutatja.
1. példa
Anyagok és módszerek
1) Állatok szingén ismert Qa. TL és Ly fenotípusú egértörzset használunk (lásd az 1. táblázat) és a következő hivatkozásokat: Figueroa J., Dávid F., C.S.: H-2 Haplotypes, gene and antigens: Second listing, Immunoqenetics. 1983, 17:553, Mckenzie, IFC.,
Potter, T.: Murine lymphocyte surface antigens, Adv Immunoi, 1979, 27:179).
A B6, B6,K1 és B6,K2 törzsek a Qa-1 és Qa-2 és Qa-3 antigénekre nézve kongenikusak (STANTON, TH., BOYSE, EA: A new serologically defined locus, Qa-1, in the Tla-region of the mouse, Immunoqenetics. 1976, 3:525).
A C3H/He és C3H-Ly6.2 törzsek az Ly6 antigén allotipusait tekintve kongenikusak. A B6.K1, B6.K2 és C3H-Ly6.2 törzseket Dr. T. Takahashi, Aichi Cancer Center Research Institute bocsátotta rendelkezésünkre és a találmány feltalálói tartják fenn.
- 7 ♦ ···
1. táblázat
Az alkalmazott egértörzsek H
| Törzs | H-2 | Ly -1 | Ly -2 | Ly -3 | Ly -4 |
| C3H/He | k | 1 | 1 | 2 | 1 |
| C3H-Ly6.2 | k | 1 | 1 | 2 | 1 |
| CBA | k | 1 | 1 | 2 | 1 |
| CE | k | 2 | 1 | 2 | 1 |
| AKR | k | 2 | 1 | 1 | 1 |
| C58 | k | 2 | 1 | 1 | 1 |
| BALB/c | d | 2 | 2 | 2 | 1 |
| DBA/2 | d | 1 | 1 | 2 | 1 |
| DBA/1 | q | 1 | 1 | 2 | 1 |
| A/J | a | 2 | 2 | 2 | 1 |
| C57BL/6 | b | 2 | 2 | 2 | 2 |
| B6.K1 | b | 2 | 2 | 2 | 2 |
| B6.K2 | b | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 2/ | Qa, | TL és Ly | fenotipusa | |||
| Ly | Ly | Ly | TL Q | :a | Qa | Qa |
| -5 | -6 | -7 | -1 | -2 | -3 | |
| 1 | 1 | 2 | b | - | - | - |
| 1 | 2 | 2 | b | - | - | - |
| 1 | 1 | 2 | b | - | - | - |
| 1 | 1 | 2 | b | - | - | - |
| 1 | 2 | 2 | b | - | - | - |
| 1 | 2 | 1 | a | + | - | - |
| 1 | 1 | 2 | c | - | - | - |
| 1 | 2 | 2 | c | - | ♦ | ♦ |
| 1 | 1 | 2 | b | + | - | |
| 1 | 1 | 2 | a | + | ♦ | + |
| 1 | 2 | 1 | b | - | + | ♦ |
| 1 | 2 | 1 | b | + | - | - |
| 1 | 2 | 1 | b | 4- | + | — |
- 8 ···· · • · • · ·
2) Tumorsejtek
A felhasznált MM2, MM46, MM48, MM102D, FM3A, MH134, MH125F,
MH125P és X5563 jelű aszcitesz típusú rákos sejtek C3H/He egerekből származnak, az EL-4 típusú aszcitesz típusú rákos sejt B6 egerekből származik; és a BW5147 jelű tenyésztett rákos sejt AKR egerekből származik.
3) Monoklonális antitestek és komplement
A 141-15.8 jelű Qa-2 specifikus monoklonális antitestet az
Australian Monoclonal Development, NSW cégtől vásároltuk. Az egér IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM és IgA immunglobulin alosztályokra monospecifikus birka antiszérumokat a Binding Site Ltd., Birmingham, Egyesült Királyság cégtől szereztük be.
Az egér IgD-re monospecifikus birka antiszérumot az ICN ImmunoBiologicals, ILL. cégtől vásároltuk. Az egér IgG2b-re és IgD-re specifikus patkány monoklonális antitestek és az utóbbi peroxidáz származéka a Meiji Institute of Health Science,
Kanagawa, Japán cégtől származtak.
Az antibakteriális komponensre (az E.
coli NusA fehérjéje) specifikus egér mAb-t (IgG2b osztályú) Dr.
Y. Nakamura,
Meiji
Institute of Health Science bocsátotta rendelkezésünkre és tumor sejtfelszíni antigénekkel kapcsolatos mAb-ként használjuk.
Az egér immunglobulinra specifikus kecske antitest F(ab')2 részét és ennek fluoreszcein-izotiocianát (FITC) származékát a Tago, Inc., Burlengane, Calif. cégtől vásároljuk. A kecske antitest Fab’ fragmentumát az Fab'2 rész 2-merkapto-etil-aminnal való redukcióval és Sephacryl S-200 őszlopkromatográfiával való elválasztással állítjuk elő.
Komplement forrásként előabszorbeált nyúl szérumot használunk, amit a Ceder Lane Laboratories, Westbury, N.Y. cégtől szereztük be.
4) Regresszor szérum (RS)
Beszámoltak arról, hogy a C3H/He egerek MM2 ráksejtekkel beoltva jelentős gyakorisággal tumor regressziót mutatnak, ha a rákos sejteket az aszcitesszel együtt eltávolítják az egerekből az intraperitoneális oltást követő 12-14. napon (KIMURA, Y., TANINO-KOMAIJI, T.: Survival of hosts mice and induces resistance to transplantable ascites tumors, Japan J. Exp. Med., 1966
36:371) .
Két héttel a rákos sejtek eltávolítása után a teljes regressziót mutató egereket választjuk ki és éteres altatás közben szívpunkcióval véreztetjük. A vérből a szérumot (a következőkben regresszor szérum, RS-ként említjük) elválasztjuk és felhasználásig -60 °C-on tároljuk.
5) Az RS adszorpciója
Az RS adszorpciós vizsgálatokban való alkalmazása miatt amint ezt később ismertetjük, a gamma-globulinokat 0,35 telítettségű ammónium-szulfáttal történő kicsapással, majd ezt követően keményítő gél zónaelektroforézissel távolítjuk el az RSből. A kapott anyagot gamma-globulin depletált RS-ként használjuk, bár még mindig tartalmazhat bizonyos mennyiségű gamma-globulinokat.
A gamma-globulin-kimerített RS-t az eredeti térfogatának 100-szorosára hígítjuk 7 % magzati borjúszérummal (FCS) kiegészített RPMI-1640 tápfolyadékkal. Ezen oldat 1 ml-ét előzőleg az ammónium-kloridos eljárással (Boyle, W.: An extension of cytotoxins, Transplantion 1968, 6:761) vörösvérsejtektől ·· ··♦·
- 10 mentesített, majd háromszor Eagle's minimális esszenciális tápfolyadékkal (MÉM) mosott 2xl07 limfocitával (lépsejtek vagy lépsejtek és mezenteriális nyirokcsomósejtek keveréke) vagy hasonlóképpen mosott (4-6)xlO6 aszcitesz tumorsejttel keverjük össze.
A keveréket 25 °C-on 30 percig, majd 0 °C-on 60 percig inkubáljuk. A sejteket 1000 fordulatszámon 5 percig való centrifugálással távolítjuk el. Limfocitákkal való adszorpció esetén a folyamatot kétszer végezzük. A kapott felülúszót adszorbeált RS-ként használjuk.
6) Citotoxicitás vizsgálat
Az RS-függő in vitro citotoxicitási reakció (Tanino T. Egawa K: Regressor serum factor-dependent nonspecific killers in tumorbearing mice) effektor sejtjeiként C3H/He egerek lépsejtjeit használjuk, amiket az MM2 sejtek intraperitoneális beoltása után 3 nappal nyerünk ki. Az effektor sejteket (lxlO6) lxlO4 51Crjelzett célsejtekkel keverjük össze 0,5 ml 7 % FCS-sel kiegészített RPMI-1640 tápfolyadékban.
Az adszorpciós vizsgálatokban az adszorpció előtt vagy után gamma-globulin-kimerített RS-t adunk az eredeti RS 500-szoros hígításának megfelelő végkoncentrációban. Célsejtekként MM2 sejteket, különböző limfoblasztokat és L sejt transzformánsokat alkalmazunk. A keveréket tumorsejtek esetén 18 óráig, limfoblasztok esetén 5-7 óráig és L sejt transzformánsok esetén 10 óráig inkubáljuk 37 °C-on CO2-inkubátorban.
Inkubálás után mérjük a sejtek lízise után a felülúszóban kibocsátott és a sejtekben maradó radioaktivitást és a citotoxicitást a specifikus lízis %-ával fejezzük ki. A ··«·
- 11 meghatározásokat két párhuzamos kísérletben végezzük. Az adszorpciós vizsgálatokban az ismételt vagy a különböző kísérletekben kapott eredményeket normalizáljuk, azaz az RSaktivitás csökkenés %-ában fejezzük ki azokat.
Limfobiasztokát különböző egerek lépsejtjeinek 1x10® lépsejt/ml sejtsűrűség alkalmazásával 2 napig 10 % FCS-sel kiegészített RPMI-1640 tápfolyadékban, majd 3 napig 5 Mg/ml Concanavallin A (Sigma, St. Louis) tartalmazó tápfolyadékban való tenyésztéssel állítunk elő.
Az LQ7b/Kb gs LKb sejteket az Ltk_ sejtek Q7b/Kb hibrid gén DNS-sel és a H-2Kb gén DNS-sel való transzfekciójával hozzuk létre. Az LÖ7b/^b sejtek a Q7b géntermék al és a2 alegységeit és a H-2b molekula a3 alegységét expresszálják. Az al és a2 alegységek felelősek főleg a H-2b egér limfociták immunológiailag meghatározott Qa-2 specificitásáért (Waneck, G. L., Sherman, D. H., Clavin, S., Allén, H., és Flavell, R. A.: Tissue-specific expression of cell-surface Qa-2 antigén from a transfected Qb7 gene of C57BL/10 mice, J. Exp. Med., 1987, 165:1358). Az L^b sejtek a felszínükön a H-2b molekulát expresszálják.
A komplement-függő citotoxikus aktivitást a festékkizárási eljárással vizsgáljuk célsejtekként mezenteriális nyirokcsomó sejteket használva. A sejteket (5xl05) 100 μΐ 5 % FCS-t és antitestet tartalmazó MEM-ben szuszpendáljuk. A szuszpenziót szobahőmérsékleten 90 percig inkubáljuk. A sejteket kétszer MEMben mossuk, 100 μΐ komplementet tartalmazó MEM-ben inkubáljuk 37 °C-on 45 percig, újra kétszer MEM-ben mossuk, majd 0,2 % tripánkék festéket tartalmazó sóoldatot adunk hozzá és mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A lízis %-át határozzuk meg és az antitest ·· ··♦♦ · ··
- 12 jelenléte nélkül kapott háttérértéket kivonjuk belőle.
7) Szérumfehérje frakcionálás
A 0,35 és 0,50 telítettségű ammőnium-szulfáttal 4 °C-on kicsapott szérumfehérje frakciót tovább frakciónáljuk keményítő gél zóna elektroforézissel 0,07 mól veronál pufferrel (pH = 8,6) pufferolt 10x40x1,5 cm méretű keményítő darabot alkalmazva.
A gél elektroforézishez használt keményítőt a Connaught Laboratories, Wilowdale, Ontario cégtől vásároltuk.
A 4 °C-on 24 óráig 35 mA-rel végzett elektroforézis után a gélt 1 cm széles darabokra vágjuk és mindegyik részt 10 ml-rel eluáljuk. A kapott β-globulin frakciót 0,01 mól tris-HCl pufferrel (pH = 8,6) szemben dializáljuk egy gyors fehérje folyadékkromatográfiás (FPLC) berendezés (Pharmacia, Uppsala) 1 ml-es Mono-Q oszlopára visszük és a fenti pufferben 0-0,5 mól nátrium-klórid lineáris gradienssel eluáljuk (Tomono T., Ikeda H., Tokunaga E.: High-performance ion-exchange chromatography of plasma proteins, J. Chromatography. 1983, 266:39). Újrakromatografálás után egy szimmetrikus elúciós profillal rendelkező aktív frakciót nyerünk.
Az egér IgGl, IgG2a, IgG3, IgA, IgM és IgD-re monospecifikus birka antiszérumok Sepharose 4B-vel való kapcsolását cianogén bromid-aktivált Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala) és a megfelelő antitestek felhasználásával végezzük. Az FPLC-vel tisztított anyagot a fenti 0,4 ml-es oszlopokra visszük 4 ’C-on. Az oszlopot sóoldattal mossuk és 5 mmol sósavat tartalmazó sóoldattal eluáljuk. Az eluátumot (0,2 ml frakciók) közvetlenül 0,4 ml 10 % FCS-sel kiegészített RPMI-1640 tápfolyadékba csöpögtetjük és az aktivitásvizsgálathoz használjuk.
8) A fehérje radioaktív jóddal való jelzése és poliakrilamid gél elektroforézis
Az FPLC-vel tisztított anyagot (10 pg) 125I-dal jelöljük a klóramin T-eljárást alkalmazva (Greenwood HC., Hunter WM., Glover J.S., The preparation of 131I-labelled humán growth hormoné of high specific radioactivity, Biochem J. 1963, 89:114) 1 mCi hordozómentes nátrium[125I]-jodidot (NEN) használva. A jelzett anyagot a szabad jodidtól Sephadex G-50 oszlopon választjuk el.
Kétdimenziós poliakrilamid gél elektroforézist (PAGE) végzünk az első dimenzióban nem egyensúlyi pH gradiens elektroforézist (NEPHGE) és az anyag redukciója után a második dimenzióban nátrium-dodecil-szulfát (SDS)-PAGE-t (O'Farrell PZ., Goodman HM, O'Farrell PH.: High resolution twodiméntional electrophoresis of basic as well as acidic proteins, Cell, 1977, 12:1233) .
9) Qa-2 antigén kimutatása folyadékcitometriával
T sejtre dúsított egér lépsejteket, egér aszcitesz tumorsejteket és BW5147 sejteket használunk. A T sejtre dúsított frakciót egér lépsejtek nylon vattán való adszorpciójával nyerjük (Jurius MH., Simpson E., Herzenberg LA.: A rapid method fór isolation of functional thymus-dérived murine lymphocytes, Eur J Immunoi 1973, 3:645). A sejteket kétszer MEM-ben mossuk. A szennyező B sejtek sejtfelszine immunglobulinjait kecske antiegér immunglobulin antitestből előállított Fab' részével szobahőmérsékleten 60 percig való kezeléssel blokkoljuk.
Ezután a sejteket Qa-2 specifikus 141-15.8 jelű mAb (200szoros hígítás) reagáltatjuk. Kontrollként normál B6.K1 szérumot ·· «·«· vagy egy bakteriális komponens ellen termelt mAb-ot használunk. A sejteket 90 percig inkubáljuk a mAb-bal és ezután egér immunglobulinra specifikus FITC-cel jelzett kecske antitest F(ab’)2 részével szobahőmérsékleten 60 percig inkubáljuk.
Az összes reagenst 10 % kecske szérumot és 1 % szarvasmarha szérum albumint (BSA) tartalmazó MEM-ben hígítjuk. Az inkubálást 50 μΐ térfogatban végezzük és a sejteket minden inkubálást követően foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) kétszer mossuk 5000 fordulatszámon 2 percig mikrocentrifugában történő centrifugálással. A FITC-cel jelzett sejteket 1 % paraformaldehiddel fixáljuk és FACSIII berendezést (Becton Dickinson, Mountain View, Calif.) alkalmazva vizsgáljuk.
10) Szérum IgD kimutatása enzim-kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA)
A Qa-2 specifikus IgD kimutatásához a 2. példában ismertetésre került Qa-2-lacZ fúziós fehérjét használjuk. Az E. coli izopropil-tiogalaktoziddal (IPTG) fúziós fehérje termelésre való indukálása után a sejteket kinyerjük és 50 % ecetsavval lizáljuk. Ezután centrifugálással távolítjuk el az oldhatatlan anyagokat. Többszöri 1 % BSA-t tartalmazó PBS-sel szemben történő dializálás után a kapott fúziós fehérjét ELISA-ban használjuk.
Lapos aljú 96-lyuku lemezeket (Immunoplate, Nunc) 50 mmol karbonát pufferben (pH = 9,0) hígított E. coli extraktumával vagy birka anti-(egér IgD) szérummal fedjük, majd 3 % BSA-val újra fedjük. A fedett és mosott lyukak mindegyikéhez PBS-ben hígított szérumminták különböző hígításaiból 50 ml-t adunk és 2 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Az oldatot elöntjük, a lyukakat háromszor PBS-sel mossuk. Ezután az egér IgD-re specifikus
- 15 peroxidázzal jelzett patkány mAb 1 % BSA-ban hígított oldatából 50 μΐ-t adunk. Szobahőmérsékleten 1 óra állás után az oldatot kiöntjük és a lyukakat PBS-sel négyszer mossuk.
Ezt követően 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolin-szulfonát) oldat és hidrogénperoxid oldat (Kirkegaard and Perry Laboratories, MD) keverékéből 100 μΐ-t adunk mindegyik lyukba és szobahőmérsékleten 5 percig állni hagyjuk. A reakciót 100 μΐ 1 % SDS-oldat hozzáadásával állítjuk le. Az oldat abszorbanciáját 410 nm-en határozzuk meg.
Eredmények
1) Az RS-faktorok specificitásának meghatározása
Beszámoltak arról, hogy aszcitesz tumorsejteket hordozó C3H/He egerekből az oltás után 3 nappal kinyert lépsejtek különböző szingén (MM2, MM46, stb.) és allogén (Meth A, EL-4 stb.) tumorsejteket lizálnak egy RS-függő sejtes citotoxikus reakció révén. Néhány szingén tumorsejt (MM48, X5563 stb.) kevésbé lizálódik e reakció által (Tanino, T., Egawa, K.: Regressor serum factor-dependent nonspecific killers in tumorbearing mice).
Az ilyen RS-aktivitást a reakcióra érzékeny tumorsejtek különböző mértékben adszorbeálják. A reakcióra rezisztens tumorsejtek azonban nem adszorbeálják az RS-aktivitást. Az allogén tumorsejtek általános érzékenysége azt a lehetőséget veti fel, hogy az RS-ben lévő aktív komponensek (RS-faktorokként nevezett) olyan allogén antigéneket ismernek fel, melyek a tumorsejtek felszínén szabálytalanul expresszálódnak. Ezen feltételezés vizsgálata céjából az RS-t különböző egértörzsekből nyert limfocitákkal adszorbeáljuk. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.
- 16 • · ·
2. táblázat
Az RS-aktivitás adszorpciója különböző egértörzsből származó limfocitákkal
Az adszorpció hoz használt limfociták eredete
H-2 Célsejt haplotipus MM2 Meth A
RS-aktivitás csökkenése
| %-ban* | |||
| C3H/He | k | 3,4± 2j0 | 6,5± 4)3 |
| CBA | k | 2T1± 1,8 | 5,5± 4,1 |
| CE | k | 23,5± 1,4 40,5± 2,7 | 3,6 ± 0)0 |
| AKR | k | 6,5± 6,5 | |
| C58 | k | 47,0Í 2,7 | 24|2± 8,2 |
| C57BL/6 | b | 68,7± 16,1 | 74,3 ±12,8 |
| BALB/c | d | 41,8± 9,7 | 43,3± 3,1 |
| DBA/2 | d | 67,9 ± 11,3 | 79|6± 8,7 |
| DBA/1 | q | 46,8 ± 14,8 | 68,9 ±12,2 |
| A/J | a | 49f8± 6,5 | 84,5± 9,9 |
* jelentése két kísérlet eredményének átlag ± szórás értéke. Az MM2 és Meth A sejtek specifikus lízise nem adszorbeált anyag jelenlétében 33,2 ± 4,4 illetve 28,4 ± 4,0 %.
Amint az a 2. táblázatból látható, MM2 célsejteket használva az RS-aktivitást különböző mértékben adszorbeálják azon limfociták, melyek H-2 haplotipusa k (CE, AKR és C58) és azok, melyek H-2 haplotipusa k-tól eltérő (B6, BALB/c, CBA/2, DBA/1 és A/J) , de a C3H/He és DBA egerekből (mindkettő H-2^) származó limfociták nem adszorbeálják. Hasonló, de nem azonos adszorpciós képet figyelünk meg, amikor a citotoxikus reakció célsejtjeként Meth A sejteket alkalmazunk. Az eredmények azt mutatják, hogy az RS-faktorok adszorpciója akkor következik be, ha a limfociták Ly antigén csoportjában egy vagy több antigén allotípusa a C3H/He allotipusától különböző, vagy ha a lépsejteken a Qa/TL antigének egyike vagy némelyike expresszálódik. Ezt alátámasztják azon eredmények, amelyeket a 3. táblázatban közölt kettős adszorpciós kísérletekből nyerünk.
- 18 3. táblázat
Az RS-aktivitás kettős adszorpciója különböző egértörzsekből származó limfocitákkal
| Az alkalmazott limfociták eredete | Célsejt | |||
| 1. abszorpció | 2. abszorpció | MM2 | Meth A | |
| RS-aktivitás csökkenése %-ban* | ||||
| A. | C58 | C3H/He | 37,8 ±11,5 | 34,4 ± 5,2 |
| C58 | C57BL/6 | 97,4 ± 2j6 | 97,2 ±1,7 | |
| C58 | B6.K1 | 33,1 ± 2(2 | 45, 1 ±4,2 | |
| C58 | B6.K2 | 94,1±14,4 | 93,7 ±4,2 | |
| C58 | DBA/1 | 9,6 ± 6,3 | 94,1 ±0,3 | |
| C58 | BALB/c | 50,7± 6,8 | 38,6 ±3,1 | |
| B. | C57BL/6 | C3H/He | 57,5± 4,3 | |
| C57BL/6 | A/J | 95,7± 1,1 | ||
| C. | A/J | C3H/He | 38,4± 5,6 | 99,3 ± 1,0 |
| A/J | C57BL/6 | 92,4± 0,8 | 103,5±0,7 | |
| A/J | DBA/2 | 96,0± 2,8 | 103,9 ± 8,8 | |
| A/J | DBA/1 | 42,8± 0,4 | 106,7± 1,0 | |
| A/J | BALB/c | 55,2± 0,4 | 103,5± 2,8 |
*jelentése két kísérlet eredményeinek átlag ± szórás értéke. A kontroll kísérletekben C3H/He limfocitákkal kétszer előadszorbeált RS-t használunk. Az MM2 és Meth A sejtek specifikus lízise A-ban 27,0 ± 3,0 illetve 28,2 ± 5,4%, B-ben 25,4 ± 1,0 és C-ben 25,0± ±1,3 illetve 28,2 ± 2,0 %.
• · ♦ · · · · • · · · · • · · « · • · · · · · · • » · · · ·
- 19 Az RS-aktivitás egy részét C58 limfociták adszorbeálják. Az aktivitás csökkenése ezen adszorpció után arra utal, hogy az RS tartalmaz olyan faktor(oka)t, melyek kötődnek az Lyl.2, Ly3.1, Ly6.2, Ly7.1, Qa-1 vagy TL antigének egyikéhez vagy ezek közül néhányhoz, feltételezve, hogy az RS-faktorok célpontjai a Qa/TL vagy az Ly antigének.
Azok faktorok, melyek kötődnek az Ly2.2, Lly 4.2, Ly5.2, Qa-2 vagy Qa-3 antigén valamelyikéhez, nem adszorbeálódnak, ha a szérum tartalmazza ezek valamelyikét. A maradék aktivitást majdnem teljesen adszorbeálják a Bs6, B6.K2 vagy a DBA/1 limfociták. Az előadszorbeált RS-ből az aktivitás faktort sem a B6.K1, sem a BALB/c limfociták nem adszorbeálják. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Qa-2 antigén adszorbeál bizonyos aktivitás faktorokat.
Az RS B6 limfocitákkal, majd az A/J limfocitákkal való adszorpciójával a feltalálók vizsgálják a Qa-1 és TL antigének szerepét is a reakcióban. Bár az eredmények az előadszorbeált RS alacsony aktivitása miatt bizonytalanok, úgy tűnik, hogy egy vagy több Qa-1 és TL antigén részben adszorbeálja az aktivitást.
Az A/J lépsejtekkel előadszorbeált RS aktivitást MM2 célsejteket felhasználva az DBA/2 illetve B6 limfociták szinte teljesen adszorbeálják, míg a DBA/1 vagy a BALB/c limfociták nem. Ez arra utal, hogy az Ly6.2 antigén adszorbeálja az RS aktivitás egy részét. Célsejtként Meth A sejteket használva az A/J sejtek teljesen adszorbeálják az aktivitást.
Összegezve az eredmények arra utalnak, hogy az RS többféle faktort tartalmaz, melyek a Qa-2, Ly6.2 és egy vagy több Qa-1 és TL antigénekhez kötődnek. Ezen antigének mindegyikének fenotipusa
- 20 allogén C3H/He-re nézve. Ezek közül a Qa-1, Qa-2 és a TL antigének a nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigén csoporthoz tartoznak.
Az eredmények azt is mutatják, hogy az MM2 sejtek Qa-2, Ly6.2 és egy vagy több Qa-2 és TL antigént expresszálnak. A Qa-1, Qa-2 és TL antigének némelyike a Meth A sejteken is expresszálódhat.
A fenti megfigyeléseknek megfelelően a különböző allogén
| limfobiasztok, | melyek ezen antigének (CE, C58, C57BL/6, B6.K1, |
| B6.K2, DBA/1, | DBA/2, A/J és C3H-Ly6.2) egyikét vagy némelyikét |
| expresszálják, | az RS-függő sejtközvetített reakció során |
| lizálódnak (4. | táblázat), míg a C3H/He és AKR limfobiasztok nem. |
| A C3H-Ly6.2 | limfoblasztok lízise a C3H/He limfoblasztokkal |
szemben közvetlenül mutatja az Ly6.2 antigén szerepét.
A Qa-2 specifikus faktor jelenlétét erősíti meg a Qa-2,3kongenikus egér limfoblasztokat és L sejt transzformánsokat felhasználó RS-függő lízis (5. táblázat).
A B6 és B6.K2 limfobiasztok lízisét elősegítő RS-aktivitást a B6.K1 limfociták csak részlegesen, míg a B6 vagy a B6.K2 limfociták teljesen adszorbeálják (5a. táblázat). LÖ7b/Kb és LKb sejteket alkalmazó hasonló kísérletek azt mutatják, hogy az RS egy aktív komponenst tartalmaz, mely specifikus a Q7b géntermék al/a2 szakaszára, mely a szerológiai Qa-2 specificitást hordozza (5b. táblázat).
- 21 4. táblázat
Különböző limfoblasztok RS-függő sejtközvetített lízise
A limfoblasztok RS célpont eredete +
Specifikus lízis% *
| C3H/He | 0,3 ± 1,2 | 4,2 ± 5,2 |
| C3H-Ly6.2 | 0,0 ± 0,6 | 30,5 ±12,5 |
| CE | 0,4 ± 0,3 | 20,1 ± 3,5 |
| C58 | 0,2 ± 0,4 | 31,6 ± 5,1 |
| C57BL/6 | 5,2 ±4,8 | 37,5±12,0 |
| B6.K1 | 0,1 ±0,2 | 33,2± 4,9 |
| B6.K2 | 0,1 ± 0,3 | 37,1± 7,0 |
| DBA/1 | 4,8 ± 5,3 | 32,8± 2,7 |
| DBA/2 | 2,3 ± 3,2 | 31,4± 1,5 |
| A/J | 0,3 ± 0,2 | 36,7± 1,2 |
* jelentése két kísérlet eredményeinek átlag ± szórás értékei. Az Ig-kimerített RS-t 500-szoros hígításnak megfelelő végkoncentrációban adjuk.
···♦ ♦
- 22 • · · · · · • * · · · · · • · · ♦ · · · ·· · · · · · ·
5. táblázat
Az RS-aktivitás Qa-2 specificitásának kimutatása az adszorpciós tesztekkel
Az adszorpcióhoz használt sejtek
Célsejtek
A.
Limfociták
Limfobiasztok
B6.K1
B6.K2
RS csökkenése (%) *
| C3H/He | 0,0 | + | 1,0 | -1,9 ± | 11,9 |
| B6.K1 | 95,8 | + | 8,1 | 11,6 ± | 17,8 |
| B6,K2 | 95,1 | + | 3,9 | 96,9 ± | 1,4 |
| B. | L | sejt | transzformánsok |
LKb LQ7b/Kb
L sejt transzformánsok
RS aktivitás csökkenése %-ban *
LKb 59,0 ± 1,6 90,7 1 4,5 LQ7b/Kb 93,1 ± 2,4 96,0±2,2 * két kísérlet eredményeinek átlag ± szórás értékei. Az Igkimerített RS-t limfocitákkal vagy L sejt tanszformánsokkal adszorbeáljuk és 500-szoros hígításnak megfelelő végkoncentrációban adjuk a reakciókeverékhez. A B6, B6.K1 és
B6.K2 limfoblasztok specifikus lízise nem adszorbeált RS jelenlétében 30,3 ± 4,2, 28,3 ± 1,2 illetve 35,4 ± 2,2 %. LQ7b/Kb és LKb sejtek esetén 45,0 ± 1,7 és 33,8 ± 1,3 % nem adszorbeált RS jelenlétében illetve 16,3 ± 2,7 és 10,1 ± 1,2 %.
2) A Qa-2 antigén kimutatása folyadékcitometriával
A Qa-2 antigén jelenléte MM2 és számos más H-2^ (Qa-2-)
- 23 egerekből származó tumorsejtvonalon közvetlenül membrán immunfluoreszcencia módszerével mutatható ki egy 141-15.8 jelű
Qa-2 specifikus mAb alkalmazásával.
Amint az az 1. ábrán látható, jelentős Qa-2 specifikus fluoreszcenciát mutatunk ki reprodukálhatóan a 9 vizsgált sejtvonal közül 7 esetében (MH134 (A), MH125F (B), MH125P (C),
MM2 (D), FM3A (E), MM102D (F), MM46 (G), MM48 (H) és BW5147 (1)). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Qa-2 alloantigén a tumorsejteken nem az MM2-re specifikus eset, hanem általános a különböző limfóma és nem limfóma sejtvonal között és részben hozzájárul az RS-függő reakció széles célpont szelektivitásához.
3. A Qa-2 specifikus RS-faktor jellemzői
Az RS-ben feltehetőleg jelenlévő számos alloantigéneket
| felismerő | faktor közül a legnyílvánvalobban egy Qa-2-re |
| specifikus | faktort mutatunk ki a fent ismertetett módon. A |
| feltalálók | ezért ezen faktorra összpontosítanak és megpróbálják |
tovább jellemezni azt.
A szérumfehérje ammónium-szulfátos kicsapásával és preparatív elektroforézissei a B6.K1 limfoblaszttal ellentétben a B6 limfo blaszt sejt-közvetített lízisét elősegítő aktivitás főleg a B-globulin frakcióban található. Ezt a frakciót Mono-Q oszlopon FPLC-t alkalmazva tovább frakciónáljuk.
Az aktivitással rendelkező anyag 0,3 mól nátrium-kloriddal eluálódik, míg az IgG illetve IgM alosztályú egér mAb-ok mindegyike 0,25 illetve 0,35 mól nátrium-kloriddal eluálható.
A részlegesen tisztított anyag Qa-2 pozitív limfocitákkal szembeni komplementfüggő citotoxikus aktivitását is vizsgáljuk (2. ábra). A B6 mezeteriális nyirokcsomó sejtek FPLC-vel ·· «·4· · ·· ···· · · · · • ··« ♦ · · · • · · »··· · ··· ·· · ♦ ····
- 24 tisztított anyaggal való komplementfüggő lízise nem figyelhető meg még akkor sem, ha 35 gg fehérjét használunk vizsgálatonként. Másfelől, az IgG2b osztályú anti-Qa-2 mAb komplement jelenlétében ugyanannak a célsejtnek lízisét okozza tesztenként kisebb, mint 1 μ<3 fehérje antitest koncentrációnál is.
A Qa-2 specifikus RS komponens további jellemzése miatt az FPLC-vel tisztított anyagot 125I-dal jelöljük C58 limfocitákon előadszorbeáljuk, Qa-2+ sejtek felszínén adszorbeáljuk és SDSPAGE vagy két dimenziós page és autoradiográfia segítségével analizáljuk (3. ábra).
A 3. ábrán A) az egydimenziós SPD-PAGE képét mutatja nem redukáló (a) és redukáló (b) körülmények között egy 7,5 %-os poliakrilamid gélt alkalmazva, B) a kétdimenziós PAGE képét mutatj a.
A teljes radioaktivitás kb. 2 %-ának sejtekhez való specifikus kötődését figyelhetjük meg. A kötődött anyag relatív molekulatömege nem redukált körülmények között 160 kDa nagyságúnak becsülhető. Redukáló körülmények esetén kb. 50 kDa és 25 kDa relatív molekulatömeggel rendelkező két fehérjecsík látható. Ezen eredmények mutatják, hogy az anyag az IgG-hez hasonló nehéz és könnyű lánc szerkezettel rendelkezik. A jelzett anyag kétdimenziós gél elektroforézise azt mutatja, hogy 4 vagy több komponensből áll, melyek izoelektromos pontja (Pl) kb. 5,5 és 6,5 közötti és mindegyik nehéz- és könnyű láncszerkezettel rendelkezik.
Ismert, hogy az IgD a szérumfehérjék β-globulin frakciójában található és savas glikoproteinek csoportjából épül fel (Ishihara, E., Tejima, Y. Takahashi, R. Takayasu, T., Shinoda, ··· • · · · • · · · • · · ···· · • · · ·· 9 · ··· ·
- 25 Τ.: Structure and location of asparagine-linked olygosaccharides in the Fc region of a humán immunoglobulin D, Biochem Biophvs Rés Comm 1983, 110:181), míg az IgG-k általában bázikus fehérjék. Az
IgD nehéz- és könnyű láncokból épül fel mint az IgG, de nem reagál a komplementrendszer Clq komponensével (Spiegelberg HL.: Immunoglobulin D (IgD). Methods in Enzymology, 1985, 116:95,
Spiegelberg HL: The structure and biology of humán IgD.
Immunological Rév, 1977, 37:3).
Arról is beszámoltak, hogy az egér IgD-nek két formája ismert. Az egyik kb. 170-220 kDa molekulatömegű, míg a másikból hiányzik a nehéz lánc Cl alegysége és kb. 150-160 kDa molekulatömegű (Finkelman FD., Kessler SW., Mushinski JF. , Potter M: IgD-secreting murine plasmacytomas: Identification and partial charachterization of two IgD myeloma proteins, J. Immunoi, 1981, 126:680: Mountz JD., Mushinski, JF., Owens, JD, Finkelman, FD: The in vivő generation of murine IgD-secreting cells is accompanied by deletion of C μ gene and occasional deletion of the gene fór the C<51 domain. J. Immunoi. 1990, 145:1583). Egy humán monoklonális IgD-ben (NIG-65 mieloma fehérje) a változó cukorrész az izoelektromos pont 5,6 és 6,8 közötti heterogenitását okozza.
Ezen jellemzők egybeesnek a szérum Qa-2 specifikus komponensének tulajdonságaival. Ezért a feltalálók feltételezik, hogy a Qa-2 specifikus komponens egy IgD.
Ennek a lehetőségnek a vizsgálata céljából az FPLC-vel tisztított anyagot Lkb sejtekkel való adszorpció után tovább adszorbeáljuk különböző egér immunglobulin alosztályokra specifikus antitestekkel Sepharose 4B-vel kapcsolt formájukban. A 4-A
- 26 • · ··«· ·
ábrán az anyag Q7b/Kb sejtekkel mutatott sejtközvetített lítikus aktivitását mutatja adszorpció előtt (fekete háromszög), LKb sejtekkel való adszorpció után (fekete négyszög) és Sepharose 4Bvel való további adszorpció után (fekete kör). Az L^7b/Kb célsejtekkel kimutatott aktivitás jelentősen adszorbeálódik antiIgD-vel kapcsolt Sepharose 4B esetén.
Az anti-IgD oszlopon megkötött és arról eluált anyag jelentős aktivitással segíti elő az L,Q17b/Kb sejtek lízisét (4-B ábra). A 4-B ábrán a nyíl az elúció kezdetét jelzi.
Az anti-IgGl-gyel, anti-IgG2b-vel, anti-IgG3-mal, anti-IgAval és anti-IgM-mel kapcsolt Sepharose 4B egyike sem adszorbeál jelentős aktivitást. Csak kevés aktivitás adszorbeálódik és eluálódik az anti-IgG2a-val kapcsolt Sepharose 4B oszlopról. Ezek az eredmények reprodukálhatóak és azt mutatják, hogy az RS-ben lévő Qa-2 specificitású aktív komponens egy IgD.
A Qa-2 antigénre specifikus IgD jelenlétét az RS-ben ELISAban is kimutatjuk Qa-2-lacZ fúziós fehérjét alkalmazva. Amint az az 5. ábrán látható, Qa-2 specifikus IgD mutatható ki az RS-ben, míg normál felnőtt C3H/He egér szérumban nem mutatható ki. A Qa-2 specifikus IgD megjelenésével összhangban a teljes szérum IgD növekedése is megfigyelhető az RS-ben a normál kontroll szérumhoz képest.
Kis mennyiségű Qa-2 specifikus IgG2a és IgG2b is kimutatható ELISA-val az RS-ben fúziós fehérjével fedett lemezeken és peroxidázzal jelzett egér IgG2a-ra és IgG2b-re specifikus patkány mAb-okat használva. Qa-2 specifikus IgG2a és IgG2b nem mutatható ki az FPLC-vel tisztított anyagban, míg Qa-2 specifikus IgD kimutatható.
• ·· ···· · ·· ···· ·· ·· • ··♦ · · · · • · « ·«··· ·»· ·· · · ····
Ezen eredmények alapján megállapítjuk, hogy a Qa-2 specifikus aktivitással bíró szérumkomponens az RS-ben egy IgD.
2. példa
Anyagok és módszerek
1) Egerek
C3H/He, AKR, B6 és B6.K1 egereket alkalmazunk. Az első kettő H-2k és Qa-2 ,3 fenotipussal rendelkezik.
A B6 és a B6.K1 egerek Qa-l“,2+,3+, illetve Qa-l+,2~,3“ fenotipussal rendelkeznek.
2) Tumorsejtek
A BW5147 AKR egér T-sejt limfómából származó in vitro sejtvonal. Az MM2 és FM3A a C3H/He egér vírussal indukált emlő karcinóma aszcitesz sejtvonala. Az MH134 a C3H/He egérben kémiailag indukált hepatóma aszcitesz sejtvonala.
Kimutatták, hogy ezen sejtvonalak reagálnak a 141-14.8 jelű Qa-2 spefifikus mAb-bal (Tanino, T. , Seo, N. , Okazaki, T., Nakanishi-Ito, C., Sekimata, M és Egawa K.: Humorai responses to Qa-2 and other tumor antigens in mice, submitted fór publication in Cancer Immunology Immunotherapy) .
Az i,Q7b/K és LKb sejteket a Q7b/Kb hibrid gén DNS illetve a H-2Kb gén DNS transzfekciójával hozzuk létre. Az LÖ7b/Kb sejtek a Q7b géntermék al és a2 alegységeit és a H-2Kb a3, transzmembrán és citoplazmatikus alegységeit expresszálják. Az Lkb sejtek a H2Kb antigént expresszálják. Mindkét sejt a nem transzfektált L sejtekkel együtt expresszálják a H-2k antigéneket.
3) Antitestek
A 141-15.8 jelű Qa-2 antigénre specifikus mAb-ot az American
Type Culture Collection, MA cégtől szereztük be.
·· ···· · · ·· • ··· · · · · • · · ···· · ··· ·· · · ····
- 28 A 34-1.2 jelű Qa-2 specificitású mAb-ot az Australian Monoclonal Development, NSW cégtől szereztük be.
Egy Qa-2 specifikus 59 jelű mAb-ot termelő hibridoma kiónt újonnan állítottunk elő NS-1 sejteket B6 limfocitákkal immunizált B6.Kl-ből származó limfocitákkal való fúziójával.
A Thyl.1-specifikus mAb-ot a Meiji Institute of Health Science, Japan cégtől vásároltuk. A Thyl.2-specifikus mAb-ot a Ceder Lane Laboratories, N.Y. cégtől szereztük be.
Egy IgG2a alosztályú, egy bakteriális komponensre (NusA fehérje) specifikus egér mAb-ot Dr. Y. Nakamura, Meiji Institute of Health Science bocsátotta rendelkezésünkre és ezt mint tumor sejtfelszíni antigénekkel nem kapcsolatos mAb-ot használjuk. Az egér immunglobulinra specifikus kecske antitest F(ab')2 része és ennek FITS származéka a Tago Inc. , CA cégtől származik. Az antitest Fab' fragmentumát az F(ab')2 rész 2-merkapto-etilaminnal való redukciójával és Sephacryl S-200 őszlopkromatográfiával való elválasztással nyerjük.
4) A tumorsejtek foszfatidil-innositol-specifikus foszfolipáz C (PI-PLC) való kezelése
A Bacillus thurigiensis a (Ikezawa H. és Taguchi R.: Phosphatidylinositol-specific phospholipase C from Bacillus cereus and Bacillus thurigiensis, Method in Enzvmol. 1981, 71:731) származó PI-PLC-t a Sapporo Beer Co., Tokyo cégtől vásároljuk.
A ráksejteket (2xl06) 37 °C-on 60 percig inkubáljuk 30 μΐ 0,1 mU PI-PLC-t és 1 mg/ml ovalbumint tartalmazó D-MEM-ben (pH 7,5). Az inkubálás után a sejteket kétszer D-MEM-ben mossuk és sejtfelszíni antigének vizsgálatához használjuk.
··· ···· ···« · • · • · · • ···· • ·
5) Immunfluoreszcencia vizsgálat
A sejtfelszíni Qa-2 és Thyl antigének kimutatását folyadékcitometriával végezzük. Röviden összefoglalva a sejteket Qa-2 specifikus mAb-bal, majd FITC-cel jelzett egér immunglobulinra specifikus kecske antitest F(ab')2 részével reagáltatjuk.
Limfociták esetén egy nylon vatta oszlopon T sejtre dúsítunk és a szennyező B sejtek sejtfelszíni immunglobulinjait az ellenanyag Fab' fragmentumával való kezeléssel blokkoljuk. A FITC-cel jelzett sejteket 1 % formaldehiddel fixáljuk és fluoreszcencia-aktivált sejtválogatással (FACS III, Becton Dickinson, CA) analizáljuk.
6. cDNS előállítása
Tumorsejtekből és timocitákból kivonjuk a teljes celluláris RNS-t a guanidin izotiocianátos eljárással (Schibler, U., Tosi, M, Pinett, A.-C., Fabiani, L., és Wellauer P.K.: Tissue-specific expression of mouse alpha-amirase genes, J. Mól. Bioi.. 1980,
142:93), és mRNS-re dúsítjuk egy oligo(dT)-cellulózon (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) a poli(A)+ RNS-ek izolálásával (Aviv, H., és Leder, P.: Purification of biologically active globin messenger RNA chromatography on oligothymidylic acid cellulose, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1972, 69: 1408). A cDNS szintézisét az mRNS-ről egy cDNS szintézis kittel (cDNS plus, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) végezzük láncindítóként oligo-dT-t alkalmazva.
7) Oligonukleotid láncindítók és próbák
A C3H/He egér Qa-2,3 szakaszában lévő gének ismert nukleotid szekvenciája (Watts S., Davis A.C., Gant B, Wheeler C., Hill « ·· ··»* · ·· ···· · · ··
9 99 9*9 9 • · · ···· · ··· ·· ♦ · ····
L. és Goodenow R.S.: Organization and structure of the Qa genes of the major histocompatibility complex of the C3H mouse , Implications fór Qa function and eláss I evolution, EMBO J., 1989, 8:1749) alapján állítunk elő lldt20 tagú oligonukleotidot egy DNS szintetizáló berendezéssel (Applied Biosystems model 391 model), amiket a polimeráz láncreakcióban (PCR) láncindítóként használunk. Ezek szekvenciáját és specificitását a 6. táblázatban és a 6. ábrán mutatjuk be.
Az 1., 2., 3., 4., 5. és 6. oligonukleotid a H-2D^, Ql^, Q2^, Q4^, Q5^ és Q10^ gének első exonjaiban található specifikus antisense szekvenciákkal komplementerek, azaz bázispárosodásra képesek. A 10. és 11. oligonukleotid a 8. illetve 7. exon Q5k-specifikus sense szekvenciájával komplementerek. A 7., 8. és 9. oligonukleotid az összes I. osztályú génekben közös szekvenciával komplementerek. Az ugyancsak szintetizált 12-17. oligonukleotidok az 1-6. oligonukleotidokkal komplementerek és a DNS-RNS hibridizációs kísérletekben próbákként alkalmazzuk ezeket.
6. táblázat
A láncindítóként és próbaként alkalmazott szintetikus dezoxioligonukleotidok
| Név | 5'-3 szekvencia | Specificitás |
| 1. | TGGCCCCGGCTCAGACCCGC | H-2Dk |
| 2. | TGACCCTGACCAAAACCGGA | Qlk |
| 3. | CCCGGACCCAGAACCGAGCC | Q2k |
| 4. | AGTCGCCCAGACCCTGATCG | Q4k |
| 5, | CTCTGACCCAGACCCGCGCT | Q5k |
| 6. | CCCCGACCCAGACCCAGGCA | Q10k |
| 7. | GCTGGGCCCTGGGCTTCTAC | eláss 1 |
| 8. | AGGGTGAGGGGCTCAGGCAG | eláss 1 |
| 9. | CTGGCAGTTGAATGGGGAGG | eláss 1 |
| 10. | ATCGTCTGTCACTCAGTCCA | Q5k |
| 11. | GCTCTAGGAGCTGTCCCTv. | Q5k |
A 12-17. számú oligonukleotidok az 1-6.
oligonukleotidokkal komplementerek.
8) Polimeráz láncreakció (PCR)
A PCR-t 100 μΐ reakciókeverékben végezzük, mely a következőket tartalmazza: 50 μg DNS, 50 pmol sense és antisense szekvenciákkal komplementer láncindító, 20 mmol Tris—HC1 (pH 8,3), 1,5 mmol MgCl2, 25 mmol KC1, 0,05 % Tween 20, 0,1 mg/ml zselatin, 50 Mmol különböző dNTP és 2 egység Taq DNS—polimeráz (Parkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT). A reakciókeverékre 100 μΐ ásványolajat rétegzünk a párolgás megakadályozása céljából. A termikus ciklusos berendezést (Atto, Tokyo, Japán) 40 ciklussal működtetjük (mindegyik ciklus 1 perc 94 °C-on, 1,8 perc 55 °C-on és 2 perc 70 °C-on való inkubálást tartalmaz).
9) A PCR-rel felerősített DNS klónozása és szekvenálása
A PCR-rel erősített DNS-t közvetlenül vagy a pUC119 Smal helyébe való klónozás után szekvenáljuk. A klónozáshoz kompetens E. coli MV1184 sejteket plazmid DNS-sel transzforrnálünk és ezeket X-gal, IPTG és ampicillin tartalmú lemezen növesztjük. A fehér telepeket választjuk ki és 2xYT táptalajon növesztjük. A sejteket ezután M13KO7 segítő fággal infektáljuk.
A kapott egyláncú DNS-t és a PCR-rel felerősített DNS-t a didezoxi-eljárással (Samage, F., Nicklen, S. és Coulson, A.R.: DNA Sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977, 74:5463) szekvenáljuk DNS-szekvenáló kittet (Sequenase 2. változat, az United States Biochemical Corp., Cleaveland, OH) és PCR láncindítóként szintetikus oligonukleotidokat vagy univerzális M13-at alkalmazva.
10) Genom DNS előállítása és DNS-DNS hibridizáció
B6, C3H/He és AKR egerek lépsejtjeit és BW51347 sejteket 60 °C-on egy éjszakán át 0,1 mg/ml proteináz K-t tartalmazó 0,03 % •4 ···♦ 4 • 4 4 · · · · · « ··· 4 · « · • 4 · 4444 · ·»· 44 · 4 ·4··
- 33 SDS oldatban inkubáljuk és ezután fenollal extraháljuk. A kapott vizes oldatot egy éjszakán át 10 mmol Tris-HCl (pH 7,5) +1 mmol EDTA oldattal szemben dializáljuk és DNS oldatként használjuk.
A genom DNS 10 μg-ját Hindin vagy BamHI enzimmel emésztjük 0,8 % agaróz gélen elektroforézist végzünk és nylon filterre (Hybridon-N+, Amersham) visszük át. A filtert 37 °C-on megszárítjuk és 60 °C-on 1 órán át 6 ml hibridizációs pufferben (6x SSC, 5x Denhard oldat, 0,5 % SDS, 50 % formamid, 20 mmol nátrium-főszfát puffer, pH 6,5) inkubáljuk, amely 1 mg lazac sperma DNS-t is tartalmaz. Ezután a 32P-vel random-primer eljárással jelzett DNS próbát adjuk hozzá. A hibridizációt 42 °Con 1 éjszakán át végezzük.
A hibridizáció után a filtert kétszer mossuk szobahőmérsékleten 15 percig 0,1 % SDS-t tartalmazó kétszeres SSC-ben és kétszer 37 °C-on 30 percig 0,1 % SDS-t tartalmazó 0,2-szeres SSCben. A filtert 0,1-szeres SSC-vel öblítjük és röntgen filmet helyezünk rá intenzifikáló réteget használva.
11) DNS-RNS hibridizáció
AKR-tímuszsejtekből és BW5147 sejtekből poli (A)+-RNS-t állítunk elő a fent ismertetett módon, glioxállal denaturáljuk, 20 mmol foszfát puffért (pH 7,4) tartalmazó 1,2 %-os agaróz gélen elektroforézist végzünk és nylon filterre visszük át. A filtert 37 °C-on szárítjuk és 60 °C-on 1 órán át 2 ml 100 μg lazac sperma DNS-t tartalmazó hibridizációs pufferben inkubáljuk.
Az 5'-végükön 32P-vel jelzett oligonukleotid próbákat adjuk hozzá. Egy éjszakán át 42 ’C-on való inkubálás után a filtert kétszer mossuk 15 percig szobahőmérsékleten kétszeres SSC-ben és kétszer 30 percig 50 °C-on 0,1 % SDS-t tartalmazó kétszeres SSC34
ben. A filtert 0,2-szeres SSC-vel öblítjük és röntgen filmet helyezünk rá intenzifikáló réteget alkalmazva.
12) A Q5^ fehérjeszintézise és Western biot
A BW5147 cDNS-ből felerősített gén 1-4. exonjainak megfelelő DNS-t pUC119-ben klónozzuk és szekvenáljuk a fent ismertetett módon. Azt a telepet választjuk ki, amely az inzerciót a megfelelő irányban és a lacZ promotertől 5',3' irányban megfelelő keretben tartalmazza. Ezt a telepet ampicillint tartalmazó L táptalajon növesztjük, míg optikai denzitása 600 nm-en el nem éri a 0,3 értéket.
μπιοί koncentrációban
IPTG-t adunk a tenyészethez és tovább tenyésztjük, míg az optikai denzitása 0,75 nem lesz.
A sejteket összegyűjtjük, 10 % trifluorecetsawal kicsapjuk, acetonnal mossuk és 2 % SDS-t, 5 % glicerolt, 0,0125 BPB-t és 2,5 % 2-merkaptoetanolt tartalmazó 25 mmol tris-HCl-ben (pH 6,8) oldjuk 100 °C-on 30 percig.
A feloldott anyagot 0,1 % SDS-t tartalmazó 12 %-os poliakrilamid gélen elektroforetizáljuk és polivinil-difluorid membránra (Immobilon, Millipore, Bedford, NA) blottoljuk át 25 mmol tris bázis, 192 mmol glicin, 20 % metanol és 0,02 % SDS tartalmú oldatban. A membránt 10 mmol tris-HCl-lel (pH 7,6) pufférőit és 0,2 % Tween 20 tartalmú 0,15 mól nátrium-kloriddal (TTBS) öblítjük és 2 órán át 37 ’C-on 10 % kecskeszérumot és 10 % lószérumot tartalmazó TTBS-ben inkubáljuk. A membránt vízzel öblítjük és egy éjszakán át szobahőmérsékleten 5 ml, a fenti pufferben 200-szorosára hígított 59 jelű mAb-ot tartalmazó aszcitesszel inkubáljuk. Inkubálás után a membránt háromszor TTBS-ben mossuk és 1 órán át 37 °C-on 10 mmol tris-boráttal (pH «· • · ··· • <· ·*·« · ·· • · · · ♦ · · a « ♦ ··· · • · ·♦··
7,6) pufferőit sóoldatban hígított peroxidázzal jelzett anti-egér IgG-vel (Amersham) inkubáljuk. A membránt újra háromszor TTBS-ben mossuk és a szín kialakítása végett 50 ml 40 mg 3,3-diaminobenzidin-tetrahidrokloridot (Wako Chemicals, Osaka, Japán) és 15 μΐ 30 % hidrogénperoxidot tartalmazó oldattal kezeljük.
Eredmények
1) H-2k egerekből származó tumorsejteken expresszálódó Qa-2 antigén jellemzése
Anti-Qa-2 antiszérumot, vagy a 141-15.8 jelű Qa-2-specifikus mAb-ot alkalmazva membrán immunfluoreszcencia eljárással kimutatták Tanino T., Seo N., Okazaki T., Kananishi-Ito C.,
Sekimata M. és Egawa K: Humorai responses tömeg% Qa-2 and other tumor antigens in mice.
Immunogenetics), hogy (H-2^ (Submitted fór publication in (Qa-2“) egerekből származó legtöbb tumorsejtvonal (a 9 vizsgált közül 7) Qa-2 antigént expresszál.
Ezen sejteken azonban általában nem mutatható ki a Qa-2 antigén, ha egy másik Qa-2-specifikus
34-1.2 jelű mAb-ot használunk.
Az újonnan előállított jelű mAb Qa-2 specificitását vizsgáljuk és összehasonlítjuk a 141-15.8 és a 341.2 mAb-okkal.
Az eredmények a 7. táblázatban láthatóak.
* ···· · ·· • · · · · · · · • ··· · · · · • V · ···· · ··· *· · · ····
7. táblázat
A Qa-2 antigén kimutatása különböző sejteken anti-Qa-2 monoklonális antitestekkel
Qa-2-specifikus mAb Nem-specifikus
Sejt mAb
| 34-1.2 | 59 | 141-15.8 | ||
| Fluoreszcencia | intenzitás | átlag | ||
| B6 limfocita | 156,1 | 59,0 | 22,3 | |
| B6.K1 limfocita | 30,7 | 25,0 | 30,9 | |
| C3H/He timocita | 16,7 | 17,4 | 16,6 | 16,8 |
| AKR timocita | 18,1 | 19,2 | 19,5 | 18,0 |
| MM2 | 58,9 | 101,3 | 102,8 | 64,8 |
| BW5147 | 46,4 | 80,4 | 102,3 | 45,2 |
| LQ7b/Kb | 192,0 | 180,2 | 42,1 | 48,4 |
| LKb | 81,2 | 68,2 | 71,5 |
Nyilvánvaló, hogy az 59 jelű mAb a Qa-2 molekula al vagy a2 alegységét ismeri fel, mely a Q7^ gén terméke, és nem keresztreagál a H-2k és Η-2^ antigénekkel. A 34-1.2 mAb-bal szemben az 59 nemcsak a H-2^ limfocitákkal reagál, hanem különböző H-2k tumorsejtekkel is, pl. MM2-vel és BW5147-tel.
A Qa-2 specifikus mAb-ok ilyen reaktivitása azt jelzi, hogy ezen tumorsejtek olyan Qa-2 antigént expresszálnak, amely nagyon • ·
- 37 hasonló, de nem azonos a H-2^ egerek normál limfocitáin kimutatható Qa-2 antigénnel és azt, hogy a molekula al vagy a2 alegysége legalább részben felelős két Qa-2 antigénben lévő különbségekért. A 7. táblázat azt is mutatja, hogy a Qa-2 antigén nem kimutatható H-2^ egerek (C3H/He és AKR) tímuszsejtjein és lépsejtjein, ha ezeket a mAb-okat használjuk.
Kimutatták, hogy a H-2b egerekből nyert limfocitákon expresszálódó Qa-2 antigén érzékeny PI-PLC-vel való emésztésre (Schibler U., Toshi M., Pinett A.-c., Fabiani L. és Wellauer,
P.K.: Tissue-specific expression of mouse alpha-amirase genes, J. Mól Bioi., 1980, 142:93) jelezve, hogy a molekula egy glikofoszfatidil-inozitol (GPI) részen keresztül kapcsolódik a sejtmembránhoz.
Ismert, hogy a GPI szerkezet a sejtfelszíni fehérje molekula egyik aszparaginsaván kapcsolódik (Low, M.G.: Biochemistry of the glycosyl-phosphatidyl inositol membráné anchors, Biochem. J..
1987, 244:1). A Qa-2 molekulát tekintve feltételezik, hogy a GPI a 295. helyzetben lévő aszparaginsavon keresztül kötődik, amit a Q7*3 gén 5. exonjában egy CAC kódol (Waneck G.L., Sherman D.H., Kincade P.W., Low M.G. és Favell R.A.: Molecular mapping of signals in the Qa-2 antigén required fór attachment of the phosphatidil-inozitol membráné anchor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1988, 85:577). A H-2 antigén molekulában, ami PI-PLC kezeléssel szemben rezisztens, ezt az aminosavat egy valin helyettesíti.
A Qa-2,3 szakasz génjeinek eddig ismert DNS szekvenciája azt mutatja, hogy a Q7 és Q9 kivételével az összes feltételezett Q géntermék valint hordoz ebben a helyzetben (Devlin J.J., Weiss E.H., Panslon M. és Flavell R.A.: Duplication of gene pairs and ♦ · ·
- 38 allels of eláss I genes in the Qa-2 region of the murine major histocompatibility complex: a comparison, EMOB J, 1985 4:3203).
Ezen megfigyelésekből kiindulva feltételezik, hogy a H-2^ tumorsejt felszínén expresszált Qa-2 antigén rezisztens lehet a PI-PLC kezeléssel szemben. Amint az a 8-A táblázatban látható, a 141-15.8 mAb-bal H-2k egerekből származó különböző tumorsejteken detektált Qa-2 molekula rezisztens a PI-PLC kezeléssel szemben.
Kontroll kísérletként a BW5147 sejteken lévő Thy-1 antigén érzékenységét vizsgáljuk. A Thy-1 antigénről szintén tudjuk, hogy egyike azon sejtfelszíni molekuláknak, amely egy GPI-n keresztül kötődnek (Low M.G. és Kindade P.W.: Phosphatidylinositol is the membrane-anchoring domain of the thy-1 glyeoprotein, Natúré, 1985, 318:62).
Ahogy azt a 8-B táblázat mutatja, BW5147 sejteken expresszálódó Thy-1 antigén érzékeny a PI-PLC kezeléssel szemben. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a BW5147 sejteken lévő Qa-2 antigénen a GPI hiánya nem a GPI szintézis celluláris mechanizmusának hibájának köszönhető, hanem maguknak a Qa-2 molekuláknak biokémiai különbözőségéből származik.
·· ««·«« ·· • · 9 9 99
999 9999
99 9 99999
- 39 8. táblázat
A Qa-2 és a Thy-1 antigének PI-PLC kezeléssel szembeni érzékenysége
A Antitest
141-15.8 mAb nem-specifikus mAb
PI-PLC kezelés
| Sejt | + | + | ||
| Fluoreszcencia | intenzitás | átlaga | ||
| B6 limfocita | 152,0 | 59,7 | 30,6 | 29,4 |
| BW5147 | 85,1 | 96,4 | 35,8 | 36,2 |
| MM 2 | 88,2 | 98,0 | 73,2 | 74,6 |
| FM3A | 108,0 | 109,3 | 71,1 | 72,3 |
| MH134 | 101,2 | 102,9 | 67,9 | 72,5 |
Antitest anti-Thyl.l anti-Thyl.2 nem-specifikus mAb
PI-PLC kezelés
| Sejt | + - | + | ||
| fluoreszcencia | intenzitás | átlaga | ||
| AKR timocita | 193,0 | 98,0 | 34,5 | |
| B6 timocita | 176,0 | 79,7 | 40,1 | |
| BW5147 | 176,0 | 95,1 |
• ··· · 9 · · • · · ···*· ··· ·· · · ····
- 40 Ezen megfigyelések alapján nyilvánvaló, hogy a H-2k egerekből származó tumorsejteken expresszált Qa-2 antigén (Qa-2k antigén) immunológiailag és biokémiailag különbözik attól, ami a H-2^ normál limfocitákon expresszálódik. A Qa-2k antigént úgy határozhatjuk meg, mint egy H-2k egerekből származó tumorsejteken expresszálódó PI-PLC-rezisztens molekula, mely az 59 és 141-15.8 jelű mAb-okkal reagál, de nem reagál a 34-1.2 mAb-bal.
2) A BW5147 sejtek Qa-2k fenotípusát kódoló gén azonosítása
A Qa-2k pozitív tumorsejtek közül az in vitro növekedő BW5147 sejteket választjuk további vizsgálatokhoz, mert ennek a Qa-2k expressziója elég erős és mivel ezek a sejtek hozzáférhetőek anélkül, hogy a gazdaállatokból származó sejtek szennyeznék.
A 7. ábrán a DNS-DNS hibridizációs vizsgálat eredményét láthatjuk, amely során genom DNS-ek Hindin vagy BamHI fragmentumait olyan kb. 800 bázispár nagyságú 32P-vel jelzett DNS próbákkal hibridizálunk, amelyek az I osztályú gének 2., 3. és 4. exonjait tartalmazó DNS szakaszt mutatják ki.
A C3H/He, AKR egerekből és BW5147 sejtekből származó DNS-sel nyert autoradiogrammok képe azonos és különbözik a B6 egér DNSsel nyert képétől. Ezekből az eredményekből az látszik, hogy az I osztályú gének elrendeződése azonos ezen H-2k egerek genomjában (C3H/He és AKR) és az AKR-ből származó limfóma sejtvonalban.
Tudjuk, hogy a C3H/He genom Qa-2,3 szakasza a Qlk, Q2k, Q4k, Q5k és Q10k géneket tartalmazza (Watts S., Davis A.C., Gant B. , Wheeler C., Hill L. és Goodenow R.S.: Organization and structure of the Qa genes of the major histocompatibility complex of the C3H mouse. Implications fór Qa function and eláss I evolution, EMBO J. 1989, 8:1749; Weiss E.H., Bevec D., Messer G., Schwemmle
S., Grosshause C., Stteinmetz M. és Schmidt: Organization of the AKR Qa region: Structure of a divergent eláss I sequence, Q5k, J. Immunoqenet., 1989, 16:283).
A Q3k gén egy pszeudogén és azok a gének, amelyek a Q6, Q7, Q8 és a Q9 legnagyobb részének felelnek meg, kiesnek. A Q5k gén egy olyan hibrid génnek tűnik, ami a Q5 gén 5'-részét tartalmazó hosszabb és a Q9 gén 3' részének egy rövidebb szakaszából épül fel.
A feltalálók megpróbálják DNS-RNS hibridizácóval és PCR-rel felerősített cDNS-sel azonosítani azt a gént, ami AKR-ben nem íródik át és BW5147 sejtekben átíródik Qlk, Q2k, Q4k, Q5k és a Q10k génekre specifikus láncindítókat és próbákat felhasználva (6. táblázat és 6. ábra).
Egy H-2Dk génre specifikus láncindítót és próbát is alkalmazunk pozitív kontrollként.
A 8. ábra a DNS-RNS hibridizációs vizsgálat eredményeit mutatja. A H-2Dk specifikus próba (12. számú) 1,5 kb-nál specifikus hibridizációs jelet mutat az AKR timocita RNS és BW5147 RNS esetén is. Ezzel szemben a Q5k-specifikus próba (16. számú) kb. 1,2, 1,5 és 4,0 kb-nál hibridizál BW5147 RNS esetében és hibridizáció nem mutatható ki AKR RNS esetén.
Hasonlóan AKR RNS vagy BW5147 RNS esetén nem mutatható ki hibridizáció a 13., 14., 15. és 17. próbákkal (adatokat nem közlünk) . Ezen eredmények jelzik, hogy a Q5k gén a Q-gének közül specifikusan átíródik BW5147 sejtekben, amilyen fajta átíródást nem tapasztalunk H-2k timocitákban. A Q5k gén BW5147 sejtekben való transzkripciójára a PCR-rel nyert eredmények további bizonyítékot nyújtanak.
• ·
- 42 A H-2Dk Qlk, Q2k, Q4k, Q5k és Q10k génekre specifikus láncindítókat (1-től 6-ig) és a 4. exon 3' végén lévő, az I osztályra (8. számú) jellemző sense szekvenciával komplementer láncindítót felhasználva PCR-t végzünk
Amint az a 9. ábrán látható a BW5147 cDNS erősítése csak akkor sikeres, amikor a 8.
használjuk, melyek az 1 láncindítóval az 1. és 5. láncindítót exon H-2Dk illetve Q5k antisense-nek szekvenciáival komplementerek. A 2., 3., 4. és 6. láncindítók 8.
láncindítóval való alkalmazása esetén erősítést nem figyelhetünk meg még akkor sem, ha az anellálási hőmérsékletet 45 °C-ra csökkentjük. Az 5. és 8. láncindító alkalmazásával nyert felerősített DNS-t közvetlenül illetve PUC 119-be való klónozás után szekvenáljuk az 5., 7., 8. és M13 univerzális láncindítót felhasználva.
A szekvenciát a C3H/He Q5k génjének 1-től 4-ig exonjai ismert nukleotid szekvenciájával azonosnak találjuk. A Q5k géntől eltérő gének erősítése nem figyelhető meg a közvetlen szekvenálás közben. Az AKR cDNS H-2Dk szekvenciájának erősítése is kimutatható az 1. és 8. láncindítók alkalmazásával.
Egyik Q-specifikus szekvencia sem indítható azonban az AKR cDNS erősítésekor. A BW5147 cDNS erősítése figyelhető meg szintén a 9. és 10. láncindítók használata esetén, amelyek a 4. exonban lévő I. osztályra jellemző antisense szekvenciával illetve a 8. exonban található egy Q5k-specifikus sense szekvenciával komplementerek.
Ezen láncindítókkal erősített
DNS nukleotid szekvenciáját közvetlenül határozzuk meg a 9.
és 10.
láncindítókat használva.
Ezekből az eredményekből levezetett cDNS nukleotid szekvencia ···· · ·· • · · · • · · · • · · · · · • · · · · ·
- 43 teljesen egybevág a Q5^ gén ismert szekvenciájából következő nukleotid szekvenciával. Ezért nyilvánvaló, hogy a Q5^ gén, mely normál H-2^ limfocitákban nem íródik át, a BW5147 sejtekben átíródik.
Annak meghatározása céljából, hogy vajon a BW5147 Q5k génje kódol-e immunológiailag meghatározott Qa-2 antigént, vizsgáljuk az enzimmel jelzett antigén és az 5. és 9. láncindítókat alkalmazó PCR-rel erősített cDNS szekvencia által kódolt peptid reaktivitását.
A felerősített DNS-t a pUC119 Smal helyére ligáljuk és a kapott rekombinánst kompetens E. coli MV1184 sejtekbe juttatjuk. A lacZ fehérjével kapcsolt fúziós fehérjét a sejtek IPTG jelenlétében való tenyésztésével indukáljuk.
A 10. ábrán látható, hogy a kapott E. coli egy kb. 35 kDa molekulatömegű peptid indukált szintézisét mutatja, ez a molekulatömeg érték a fúziós fehérjéből várható. A 35 kDa fehérje reagál a peroxidázzal jelzett 59 jelű anti-Qa-2 mAb-bal. A peroxidázzal jelzett 34-1.2 jelű anti-Qa-2 mAb esetén azonos körülmények között fehérje nem mutatható ki.
Ezen eredmények alapján a feltalálók megállapítják, hogy a BW5147 sejtek felszínén lévő Qa-2 antigén, amely az 59 jelű mAb— bal kimutatható, de a 34-1.2 jelű mAb-bal nem, és ami rezisztens a PI-PLC kezeléssel szemben a 5^ gén terméke.
3. példa
A fenti példák kísérleteiből nyilvánvaló, hogy a Q5^ gén aktivációja a Qa/Tla szakaszban elfogadott tény, a Q5 génterméke a normál Qa-2 limfocita antigénnel közös antigenitással (keresztreaktivitás) rendelkezik, és továbbá tumorsejteket • · · ·
- 44 hordozó Qa-2” egerek immunválasza a tumorsejtek által expresszált Q5 géntermékre az allogén normál limfociták felszínén lévő Qa-2 antigén (Q7 génterméke) felé is irányul.
Ezért a feltalálók a tumorsejtek elleni rezisztencia indukálása céljából végeznek kísérleteket a Qa-2 antigént felhasználva.
Módszer
Qa-2” egereket allogén Qa-2+ egerekből származó normál limfocitákkal immunizálunk. Qa-2” egérként (C3H/He X B6.K1) Ff hibrid egereket használunk és ezeket C57BL/6 egerek lépsejtjeinek intraperitoneális beoltásával a Qa-2 antigénéi szemben specifikusan immunizáljuk. Tumorsejtként C3H/He egerekből származó Qa-2+ tumorsejteket alkalmazunk.
Eredmények
1. A fenti, Qa-2 antigénre specifikus immunkezeléssel tumorsejtekkel szembeni, pl. C3H/He egerekből származó MM2 tumorsejttel szembeni rezisztenciát indukálunk az Fi egerekben. Azaz míg 2xl05 tumorsejt bejuttatása a kontroll, kezeletlen csoportban hatást vált ki, addig az immunizálatlan egerekben hatástalan marad.
Továbbá amikor az Fi egereket B6.K2 limfocitákkal immunizáljuk C57BL/6 egerek limfocitái helyett, ugyanezt az eredményt kapjuk, amint ezt a 9. táblázat mutatja.
- 45 ··«
9. táblázat
| Egér | Az MM2 sejtek transzplantációjának mértéke |
| Qa-2 antigénnel szemben immunizált egér | 0/10* |
| Kontroll kezeletlen egér | 10/10 |
* nevező: az alkalmazott egerek teljes száma számláló: azon egerek száma, ahol a transzplantáció hatásos
2) Az immunizát Fi egérből nyert lépsejteket in vitro C57BL/6 egerek lépsejtjeivel újra stimuláljuk a Qa-2 antigénre specifikus citotoxikus T sejtek indukálása céljából. Ezeket a T sejteket nemcsak Qa-2+ allogén egerek normál limfocitái, hanem a C3H/He egerekből származó tumorsejtek is erősen stimulálják.
Továbbá, ha B6.K2 egerek limfocitáival immunizált Fi egerekből nyert lépsejteket B6.K2 egerek limfocitáival in vitro stimuláljuk, anti-Qa-2 citotoxikus T sejteket indukálunk. A citotoxikus aktivitást tumor célsejtekkel szemben mérjük és a 10. táblázatban közöljük.
• · ··· • · * <· * • · • · · • · · · ·
- 46 10. táblázat
| Célsejt | Citotoxikus aktivitás (specifikus lízis %) |
| Tumorsejtek | |
| MM2 | 77,4±3,3 |
| Meth A | 65,3±3,2 |
| Kontrollok | 16,9±2,0 |
| B6.K1 limfociták | 77,4±3,3 |
| B6.K2 limfociták |
Effektorsejt: célsejt = 100:1
3) Fi egereket C3H/He egér eredetű NSFa tumorsejtekkel transzplantálunk a talpi részükön. Amikor a tumor átmérője 1 cm-t eléri, az egerek combját bevágva eltávolítjuk a tumorsejteket és ezután 1-4 nappal C57B1/6 egerek lépsejtjeivel a Qa-2 antigénnel specifikusan immunizálunk.
A kezeletlen kontroll csoport összes egerében számos tüdőáttét jelenik meg és kb. 4 héttel később az összes egér tüdőáttét következtében elpusztul, míg a legtöbb egérben egyáltalán nem figyelhető meg áttét, bár kevés egérben találunk
1-2 áttétet.
- 47 Továbbá, Fi egereket C3H/He egerekből származó NFSa tumorsejtekkel transzplantálunk a talpi részükön. Amikor a tumor átmérője 8-10 mm-es lesz, az egerek combját bevágva eltávolítjuk a tumorsejteket és B6.K2 egerek lépsejtjeit intraperitoneálisan oldva a Qa-2 antigénnel specifikusan immunizálunk. 17 nappal később az egereket felboncoljuk és tüdejüket sztereomikroszkóp alatt vizsgálva a tüdőáttéteket számoljuk, amit a 11. táblázatban mutatunk be.
11. táblázat
| Csoport | Az immunizálás hoz használt limfociták száma | A tüdőáttétek száma | |||
| C3H/HexB6.Kl Fi egerek | C3H/HexB6.K2 Fi egerek Egér A gócok száma | ||||
| Egér | A gócok száma | ||||
| 1 | 5xl06 | 1 | 0 | 1 | 20 |
| 2 | 0 | 2 | 6 | ||
| 3 | 0 | 3 | 11 | ||
| 4 | 0 | ||||
| 2 | 5xl06 | 1 | 0 | 1 | 9 |
| 2 | 1 | 2 | 8 | ||
| 3 | 0 | 3 | 10 | ||
| 4 | 1 |
| 3 | 5X106 | 1 | 5 | 1 | 6 |
| 2 | 8 | 2 | 12 | ||
| 3 | 6 | 3 | 14 |
| 4 | immunizálás | 1 | 5 | 1 | 9 |
| nélküli | 2 | 9 | 2 | 14 | |
| kontroll- | 3 | 9 | 3 | 10 | |
| csoport |
így nyilvánvaló, hogy tumorsejtekkel szembeni rezisztenciát indukálhatunk Qa-2“ limfociták allogén normál Qa-2+ limfocitákkal való immunizálásával. Pontosabban a Qa-2“ egerek Q7 génterméke « ♦ • · ·
- 48 elleni immunreakció keresztreakciót ad a Q5 gén termékével és nyilvánvalóan ez a keresztreakció alakítja ki a fenti tumorsejtekkel szembeni rezisztenciát.
4. példa
A humán nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigének esetén néhány antigénben a gének teljes nukleotid szekvenciája már ismert. Az is ismert, hogy normál felnőttekben néhány gén inaktív.
Ezért valamely génre specifikus nukleotid szekvenciával rendelkező polinukleotidot állítunk elő, amit láncindítóként használunk humán tumorsejtvonalakból (HL60, U937, Hmy2ClR és SKW-3) kinyert cDNS-ek PCR-rel való felerősítésére. Amint a 11. ábrán látható, egy megfelelő hosszúságú (nyilakkal jelezzük) nukleotid felerősítését mutatjuk ki.
Ezen eredmények azt mutatják, hogy a nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigének, melyek normál felnőttekben nem aktiválódnak, humán tumorsejtekben aktiválódnak.
Mint fent ismertettük, tumorsejtekkel szemben rezisztencia indukálható Qa-2“ egerekben ezek Qa-2+ allogén normál limfocitákkal való immunizálásával. Továbbá Qa-2 + egér eredetű tumorsejtekben a Q5 gén a normál felnőttekkel ellentétben aktiválódik és ezért Q5 géntermékére specifikus immunreakció indukálható a Q5 géntermékét felhasználható immunkezeléssel, ezzel lehetővé téve autogén tumorsejtekkel szembeni rezisztencia indukálását.
Továbbá, emberek tumorsejtjeiben a normál felnőttekkel ellentétben a nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigének aktiválódnak.
A jelen találmány szerint egy tumorellenes eljárást és egy tumorellenes reagenst nyújtunk. Pontosabban tumorsejtekkel szembeni rezisztencia indukálása lehetséges egy nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigén, vagy ezt az antigént felismerő antitest vagy egy citotoxikus limfocita szervezetbe való bejuttatásával.
Szabadalmi igénypontok
Claims (6)
1. Tumorellenes eljárás, azzal jellemezve, hogy egy nem klasszikus I. osztályú antigént juttatunk be a kezelendő élőlénybe.
2. Tumorellenes eljárás, azzal jellemezve, hogy egy nem klasszikus I. osztályú antigént felismerő antitestet juttatunk be a kezelendő élőlénybe.
3. Tumorellenes eljárás, azzal jellemezve, hogy egy nem klasszikus I. osztályú antigént felismerő citotoxikus limfocitát juttatunk be a kezelendő élőlénybe.
4. Tumorellenes reagens, azzal jellemezve, hogy hatásos komponense egy nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigén.
5. Tumorellenes reagens, azzal jellemezve, hogy hatásos komponense egy nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigént felismerő antitest.
6. Tumorellenes reagens, azzal jellemezve, hogy hatásos komponense egy nem klasszikus I. osztályú hisztokompatibilitási antigént felismerő citotoxikus limfocita.
oidoüL + /11 öJcAiuJdocL·
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4048840A JPH05246889A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 制癌方法および制癌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9300612D0 HU9300612D0 (en) | 1993-05-28 |
| HUT67859A true HUT67859A (en) | 1995-03-23 |
Family
ID=12814449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9300612A HUT67859A (en) | 1992-03-05 | 1993-03-05 | Antitumour method and antitumor agent |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0563627A2 (hu) |
| JP (1) | JPH05246889A (hu) |
| KR (1) | KR930019225A (hu) |
| CN (1) | CN1079400A (hu) |
| AU (1) | AU3398793A (hu) |
| BR (1) | BR9300764A (hu) |
| CA (1) | CA2090957A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ34293A3 (hu) |
| FI (1) | FI930976A (hu) |
| HU (1) | HUT67859A (hu) |
| IL (1) | IL104944A0 (hu) |
| NO (1) | NO930798L (hu) |
| NZ (1) | NZ247057A (hu) |
| SK (1) | SK15993A3 (hu) |
| ZA (1) | ZA931558B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
| IT1274592B (it) * | 1994-08-05 | 1997-07-18 | Angela Turiano | Composizione farmaceutica per la terapia tumorale contenente xenoantigeni |
| EP0937258A2 (en) * | 1996-10-29 | 1999-08-25 | Fred Hutchinson Cancer Research Center, Inc. | Cell stress regulated human mhc class i gene |
| EP1054688B1 (fr) * | 1998-02-20 | 2004-06-30 | Commissariat A L'energie Atomique | Methode de selection de tumeurs exprimant hla-g, sensibles a un traitement anticancereux et ses applications |
| FR2775189B1 (fr) * | 1998-07-24 | 2001-06-08 | Commissariat Energie Atomique | Compositions anti-tumorales a base d'antigenes hla-g ou d'anticorps anti-hla-g |
| GB9827104D0 (en) * | 1998-12-10 | 1999-02-03 | Onyvax Ltd | New cancer treatments |
| EP1245675A1 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-02 | Kohji Egawa | Cancer cell-specific HLA-F antigen and a diagnostic method of cancer by using thereof |
| WO2004078137A2 (en) * | 2003-03-04 | 2004-09-16 | Greenville Hospital System | Antitumor agents comprising a targeting portion and an immune response triggering portion |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3825615A1 (de) * | 1988-07-28 | 1990-02-01 | Behringwerke Ag | Antigenkonstrukte von "major histocompatibility complex" klasse i antigenen mit spezifischen traegermolekuelen, ihre herstellung und verwendung |
-
1992
- 1992-03-05 JP JP4048840A patent/JPH05246889A/ja active Pending
-
1993
- 1993-03-03 CA CA002090957A patent/CA2090957A1/en not_active Abandoned
- 1993-03-03 NZ NZ247057A patent/NZ247057A/en unknown
- 1993-03-04 AU AU33987/93A patent/AU3398793A/en not_active Abandoned
- 1993-03-04 SK SK15993A patent/SK15993A3/sk unknown
- 1993-03-04 CZ CZ93342A patent/CZ34293A3/cs unknown
- 1993-03-04 NO NO93930798A patent/NO930798L/no unknown
- 1993-03-04 ZA ZA931558A patent/ZA931558B/xx unknown
- 1993-03-04 IL IL104944A patent/IL104944A0/xx unknown
- 1993-03-04 FI FI930976A patent/FI930976A/fi unknown
- 1993-03-05 KR KR1019930003358A patent/KR930019225A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-03-05 EP EP93103650A patent/EP0563627A2/en not_active Withdrawn
- 1993-03-05 HU HU9300612A patent/HUT67859A/hu unknown
- 1993-03-05 CN CN93103844A patent/CN1079400A/zh active Pending
- 1993-03-05 BR BR9300764A patent/BR9300764A/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0563627A2 (en) | 1993-10-06 |
| CN1079400A (zh) | 1993-12-15 |
| BR9300764A (pt) | 1993-09-28 |
| JPH05246889A (ja) | 1993-09-24 |
| FI930976A0 (fi) | 1993-03-04 |
| NO930798L (no) | 1993-09-06 |
| CA2090957A1 (en) | 1993-09-06 |
| HU9300612D0 (en) | 1993-05-28 |
| NZ247057A (en) | 1995-10-26 |
| IL104944A0 (en) | 1993-07-08 |
| NO930798D0 (no) | 1993-03-04 |
| KR930019225A (ko) | 1993-10-18 |
| EP0563627A3 (hu) | 1994-04-27 |
| ZA931558B (en) | 1993-09-27 |
| AU3398793A (en) | 1993-09-09 |
| SK15993A3 (en) | 1993-10-06 |
| CZ34293A3 (en) | 1994-01-19 |
| FI930976A (fi) | 1993-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10005845B2 (en) | Antibodies and fragments thereof raised against the alpha-3 domain of HLA-G protein, methods and means for their preparation, and uses thereof | |
| JP3399943B2 (ja) | 癌胎児性抗原を発現する組換えウイルスとその使用方法 | |
| JP6182127B2 (ja) | 腫瘍において示差的に発現する遺伝子産物およびその利用 | |
| Guy-Grand et al. | Two gut intraepithelial CD8+ lymphocyte populations with different T cell receptors: a role for the gut epithelium in T cell differentiation. | |
| ES2537323T3 (es) | Péptido CDCA1 y agente farmacéutico que lo comprende | |
| US8703916B2 (en) | B7-H3 and B7-H4, novel immunoregulatory molecules | |
| US9404925B2 (en) | Cancer antigen and use thereof | |
| JP2004504808A (ja) | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 | |
| JPH07126300A (ja) | ヒトのｂ細胞受容体複合体の特異抗原を認識するモノクローナル抗体 | |
| JP2005504513A (ja) | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 | |
| EA009026B1 (ru) | Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях | |
| JP2003528591A (ja) | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 | |
| JP2007001984A (ja) | Ｗｔ１特異的免疫療法のための組成物および方法 | |
| JP2004504065A (ja) | Ｎｋ細胞活性化受容体並びにその治療上および診断上の使用 | |
| JP5652987B2 (ja) | ヒトＩｇＧＦｃレセプターＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）に結合する物質 | |
| HUT67859A (en) | Antitumour method and antitumor agent | |
| US20200276291A1 (en) | Immunotherapeutic methods for treating and/or preventing lung cancer | |
| US20190359677A1 (en) | Novel t cell receptors and immune therapy using the same for the treatment of cancer and infectious diseases | |
| KR20220052987A (ko) | Ebv 유래 항원에 특이적인 tcr 작제물 | |
| JP2002537272A (ja) | アジュバントおよび細胞成熟物質 | |
| JP4557886B2 (ja) | 食道癌の抗原およびその利用 | |
| Sharma | Generation of single chain Fv protein a fusion molecules for melanoma therapy | |
| JP2008271978A (ja) | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |