CZ307785B6 - Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku - Google Patents

Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku Download PDF

Info

Publication number
CZ307785B6
CZ307785B6 CZ2017-812A CZ2017812A CZ307785B6 CZ 307785 B6 CZ307785 B6 CZ 307785B6 CZ 2017812 A CZ2017812 A CZ 2017812A CZ 307785 B6 CZ307785 B6 CZ 307785B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
sarcosine
nanoparticles
sample
zone
solution
Prior art date
Application number
CZ2017-812A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2017812A3 (cs
Inventor
Dagmar Uhlířová
Michaela Dočekalová
Martina Staňková
Josef RĹŻĹľiÄŤka
René Kizek
Original Assignee
Prevention Medicals s.r.o.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prevention Medicals s.r.o. filed Critical Prevention Medicals s.r.o.
Priority to CZ2017-812A priority Critical patent/CZ2017812A3/cs
Priority to PT182112011T priority patent/PT3498859T/pt
Priority to RS20200279A priority patent/RS60195B1/sr
Priority to HUE18211201A priority patent/HUE049042T2/hu
Priority to DK18211201.1T priority patent/DK3498859T3/da
Priority to EP18211201.1A priority patent/EP3498859B1/en
Priority to PL18211201T priority patent/PL3498859T3/pl
Priority to ES18211201T priority patent/ES2781322T3/es
Priority to SI201830047T priority patent/SI3498859T1/sl
Priority to LTEP18211201.1T priority patent/LT3498859T/lt
Publication of CZ307785B6 publication Critical patent/CZ307785B6/cs
Publication of CZ2017812A3 publication Critical patent/CZ2017812A3/cs
Priority to HRP20200421TT priority patent/HRP20200421T1/hr
Priority to CY20201100323T priority patent/CY1122955T1/el

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G7/00—Compounds of gold
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
    • G01N2333/9065—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • G01N2333/90672—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general
    • G01N2333/90677—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general with a definite EC number (1.5.3.-)
    • G01N2333/90683—Sarcosine oxidase (1.5.3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan
    • G01N2400/28—Chitin, chitosan

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Vynález se týká způsobu vázání enzymů sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy na nanočástice FeO/Au pomocí chitosanu pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo ekologickém vzorku s použitím těchto nanočástic modifikovaných enzymy s vyhodnocením reakce v roztoku nebo na diagnostickém proužku. Test je vhodný pro rutinní stanovení sarkosinu v množství 1 až 100 µg/ml v biologickém vzorku, zejména v moči s vysokou citlivostí. Stanovení je proveditelné během 0,5 až 1 hodiny pomocí běžně dostupného vybavení.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobu navázání enzymů sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy na nanočástice FezOs/Au pomocí chitosanu pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku s vyhodnocením reakce v roztoku nebo na diagnostickém proužku.
Dosavadní stav techniky
V 21. století se projevují snahy dosáhnout jednoduché, rychlé a cílené diagnostiky sarkosinu jako markéru a jeho snadné a spolehlivé stanovení v běžných podmínkách klinických laboratoří. Výrazný vzestup diagnostiky umožňuje prudký vývoj nanotechnologií a především jejich využití ve zdravotnictví. Byla navržena řada různých technologických přístupů umožňujících zlepšit a rozšířit diagnostické metody a postupy. Významnou skupinu představují železné nanočástice, které vykazují magnetické vlastnosti (jsou často označovány jako SPIONs: superparamagnetic iron oxide nanoparticles) [1.2], Na základě zjištěného faktu, že některé skupiny chemických látek nebo nanomateriálů, jako zlaté nanočástice (AuNPs). mohou vykazovat enzymatickou (také peroxidázovou) aktivitu, se tyto částice dostaly do popředí výzkumu. Zlaté nanočástice (AuNPs) jsou již velmi dlouhou dobu používány jako vhodný nástroj pro molekulámě-biologické experimenty. Částice mohou být modifikovány celou řadou biomolekul (nukleové kyseliny, proteiny, aminokyseliny apod.). Nanočástice mohou být modifikované například chitosanem, který může sloužit výhodně pro imobilizaci enzymů nebo enkapsulaci léčiv jako nosič, jak popisuje vynález CN 106265597. Medicínským prostředkem na bázi chitosanu jako podpůrné struktury se zabývá také dokument EP 2792375. Chitosanem pokryté magnetické mikročástice pro imobilizaci enzymů uvádí spis CN 105695442. Patentový dokument EP 2995627 se zabývá syntézou systémů nanočásticových genových nosičů založených na chitosanu. Dokument CN 102703418 uvádí způsob přípravy magnetických chitosanových mikročástic jako nosiče s navázanou křenovou peroxidázou pro potřebné použití tohoto enzymu.
V řadě vědeckých studií bylo ukázáno, že aminokyselina sarkosin se podílí na metabolismu aminokyselin a metylačních procesech. Hladina sarkosinu v moči u pacientů s diagnostikovaným zhoubným nádorem prostaty je zvýšená [3-9], Pro detekci sarkosinu byla popsána enzymatická detekce za využití sarkosin oxidázy v odborných publikacích [10], ale i patentových spisech [1113], Sarkosin oxidáza je enzym štěpící sarkosin na glycin, formaldehyd a peroxid vodíku [14], Vytvořený peroxid vodíku je využíván v následných chemických reakcích. Výsledné změny jsou pozorovány jako interakce s vhodným substrátem jako je 3,3'5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) a jiné [15], V posledních pěti letech velmi roste zájem o použití jednoduchého testu na hladinu sarkosinu v biologickém vzorku (převážně moči, séru). Známé a běžně využívané analytické techniky, jako je HPLC, mikrofluidní systémy, spektrofotometrie, hmotnostní detektory jsou citlivé, ale časové náročné a vyžadují komplikovanou přípravu vzorků.
Dosud však nebyl vyvinut časově nenáročný test využívající imobilizováných enzymů uzpůsobený pro rutinní stanovení sarkosinu v domácím prostředí dostatečně citlivý pro včasnou diagnostiku zvýšeného množství sarkosinu v těle souvisejícího mimo jiné s nádorovým onemocněním.
- 1 CZ 307785 B6
Literatura:
1. Mahmoudi, M.; Sant, S.; Wang, B.; Laurent, S.; Sen, T. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (spions): Development, surface modification and applications in chemotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews 2011, 63, 24-46.
2. Wahajuddin; Arora, S. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: Magnetic nanoplatforms as drug carriers. Int. J. Nanomed. 2012, 7, 3445-3471.
3. Cernei, N.; Heger, Z.; Gumulec, L; Zitka, O.; Masarik, M; Babula, P.; Eckschlager, T.; Stiborova, M.; Kizek, R.; Adam, V. Sarcosine as a potential prostatě cancer biomarker-a review. International Journal of Molecular Sciences 2013,14, 13893-13908.
4. Cernei, N.; Zitka, O.; Ryvolova, M: Adam, V.; Masarik, M.; Hubalek, J.; Kizek, R. Spectrometric and electrochemical analysis of sarcosine as a potential prostatě carcinoma markér. International Journal of Electrochemical Science 2012, 7, 4286-4301.
5. Khan, A.P.; Rajendiran, T.M.; Ateeq, B.; Asangani, I.A.; Athanikar, J.N.; Yocum, A.K.; Mehra, R.; Siddiqui, J.; Palapattu, G.; Wei, J.T., et al. The role of sarcosine metabolism in prostatě cancer progression. Neoplasia 2013,15, 491-+.
6. Sreekumar, A.; Poisson, L.M.; Rajendiran, T.M.; Khan, A.P.; Cao, Q.; Yu, J.D.: Laxman, B.; Mehra, R.; Lonigro, R.J.; Li, Y., et al. Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostatě cancer progression. Nátuře 2009, 457, 910-914.
7. Heger, Z.; Cernei, N.; Křižkova, S.: Masarik, M.; Kopel, P.; Hodek, P.; Zitka, O.; Adam, V.; Kizek, R. Paramagnetic nanoparticles as a platform fortret-based sarcosine picomolar detection. Sci Rep 2015, 5.
8. Zitka, O.; Cernei, N.; Heger, Z.; Matoušek, M.; Kopel, P.; Kynicky, J.; Masarik, M.; Kizek, R.; Adam, V. Microfluidic chip coupled with modified paramagnetic particles for sarcosine isolation in urine. Electrophoresis 2013, 34, 2639-2647.
9. Zitka, O.; Heger, Z.; Komínkova, M.; Skalickova, S.; Křižkova, S.; Adam, V.; Kizek, R. Preconcentration based on paramagnetic microparticles for the separation of sarcosine using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with coulometric detection. J. Sep. Sci. 2014, 37, 465-475.
10. Mayr, U.; Moellering, H.; Siedel, J.; Seidel, H. Hydrogen peroxide-forminfg sarcosine oxidase us patent-4743549. May 10 1988. US 4743549, 1988.
11. Uhlířova, D.; Dočekalova, M.; Staňkova, M.; Ruzicka, J.; Kizek, R. Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy. UV č. záp. 3059(5 2017, 08.08.2017.
12. Uhlířova, D.; Dočekalova, M.; Staňkova, M.; Melichar, L.; Ruzicka, J.; Kizek, R. Diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu, kreatininu a peroxidu vodíku v biologickém nebo environmentálním vzorku. UVč. záp. 30831 2017, 11.07.2017.
13. Uhlířova, D.; Dočekalova, M.; Staňkova. M.; Melichar, L.; Ruzicka, J.; Kizek. R. Diagnostický proužek pro kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí protilátek proti sarkosinu a nanočástic zlata s peroxidázovou aktivitou nebo kvantových teček. UV č. záp. 30902 2017, 08.08.2017.
14. Chen, Z.-w.; Hassan-Abdulah, A.; Zhao, G.; Jorns, M.S.; Mathews, F.S. Heterotetrameric sarcosine oxidase: Structure of a diflavin metalloenzyme al 1.85 á resolution. Journal of Molecular Biology 2006, 360, 1000-1018.
15. Mayr, U.; Moellering, H.; Siedel, J.; Seidel, H. Method for the determination of sarcosinecreatinine or creatinine us patent-4845029, July 4 1989, US 4845029, 1989.
16. Mahmoudi, M.; Simchi, A.; Milani, A.S.; Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. J. Colloid Interface Sci. 2009, 336, 510-518.
Podstata vynálezu
Chitosan, případně jiná vhodná polymerizační činidla mají schopnost imobilizovat enzymy za pomoci tripolyfosfátu (TPP) a iontů zinku. Způsob navázání enzymů sarkosin oxidázy a křenové
-2CZ 307785 B6 peroxidázy na nanočástice FC2O3/A11 s peroxidázovou aktivitou pomocí chitosanu a tripolyfosfátu řeší výše uvedený nedostatek stanovení sarkosinu v biologickém vzorku.
Tento způsob navázání enzymů za specifických podmínek propůjčuje nanočásticím Fe2O3/Au specifické vlastnosti, umožňující detekci sarkosinu v biologickém vzorku v množství 1 až 100 pg/ml na základě reakce v roztoku nebo pomocí diagnostického proužku.
Způsob navázání enzymů sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy na nanočástice Fe2O3/Au pomocí chitosanu podle vynálezu spočívá v tom, že k nanočásticím Fe2O3/Au v množství 20 až 60 mg se přidá chitosan o koncentraci 4 až 12 mg/ml v roztoku 1% kyseliny octové, vazebný roztok o objemu 70 až 500 μΐ obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 45 kU/1, křenovou peroxidázu o aktivitě 15 až 35 kU/1 ve fosfátovém roztoku o koncentraci 40 až 60 mM o pH 8,0 a dále tripolyfosfát (TPP) o koncentraci 1,7 až 3,2 mM v prostředí 1 % kyseliny octové o pH 4. Nanočástice Fe2O3/Au s přídavkem chitosanu, vazebného roztoku a tripolyfosfátu se následně inkubují 60 minut při pokojové teplotě za stálého míchání za vzniku modifikovaných nanočástic Fe2O3/Au o velikosti 20 až 60 nm, které se uloží ve tmě při 5 až 10 °C. Vzniklé modifikované nanočástice Fe2O3/Au se mohou výhodně před použitím lyofilizovat 5 hodin při -50°C a tlaku 300 Pa (3 mbar).
Předmětem vynálezu jsou také nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy výše uvedeným způsobem podle vynálezu.
Předmětem vynálezu je i použití nanočástic zlata modifikovaných výše uvedeným způsobem podle vynálezu pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v množství 1 až 100 pg/ml v biologickém vzorku.
Předmětem vynálezu je dále způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení sarkosinu v množství 1 až 100 pg/ml v biologickém vzorku pomocí modifikovaných nanočástic zlata, spočívající v tom, že k modifikovaným nanočásticím zlata v koncentraci 0,1 až 0,5 mg/ml ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0 se přidá reakční substrátový roztok obsahující 4-amino2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP), sodná sůl 3-(N-ethyl-3methylanilinjpropansulfonové kyseliny (TOPS), fenol a vzorek.
Koncentrace 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on činí 0,1 až 5 mM, koncentrace sodné soli 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny činí 0,1 až 4 mM a koncentrace fenolu je 1 až 25 mM v celkovém objemu reakční směsi se vzorkem, přičemž objemový poměr reakčního substrátového roztoku ku vzorku je 5:1. Reakční směs se inkubuje 30 min při 25 až 40 °C za vzniku zbarvení. Intenzita výsledného zbarvení se změří fotometricky při 546 nm a z kalibrační závislosti absorbance na koncentraci sarkosinu se odečte koncentrace sarkosinu ve vzorku.
Předmětem vynálezu je také diagnostický proužek pro kvalitativní a kvantitativní Stanovení sarkosinu v biologickém vzorku v množství 1 až 100 pg/ml s použitím nanočástic Fe2O3/Au modifikovaných způsobem podle vynálezu. Diagnostický proužek obsahuje vzorkovou zónu napuštěnou roztokem pro vzorkovou zónu obsahujícím nanočástice Fe2O3/Au v množství 0,1 až 0,5 mg/ml ve fosfátovém roztoku o koncentraci 40 až 60 mM o pH 8,0 s navázanými enzymy sarkosin oxidázy o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenové peroxidázy o aktivitě 1 až 20 kU/1 na pomocí chitosanu způsobem navázání enzymů na nanočástice Fe2O3/Au (modifikace nanočástic Fe2O3/Au) podle vynálezu. Diagnostický proužek dále obsahuje reakční zónu napuštěnou substrátovým roztokem pro reakční zónu obsahující 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0 a 1 až 25 mM fenol. Diagnostický proužek obsahuje dále detekční zónu a finální zónu.
-3CZ 307785 B6
Diagnostický proužek podle vynálezu se výhodně skládá z membrány, která má na obou koncích lepicí části o šířce 0,4 cm. Membrána má výhodně šířku 0,4 cm a délku 6,0 cm. Na jednom konci je opatřena vzorkovou zónou o délce 1,5 cm, za ní následuje v podélném směru proužku reakční zóna délky 5 cm, za reakční zónou následuje detekční zóna délky 2 cm a druhý konec proužkuje opatřen finální zónou včelího vosku délky 0,5 cm.
Vzorková zóna a reakční zóna je výhodně tvořena skleněnou podložkou, detekční zóna v horní části membrány je tvořena filtračním papírem (Whatman 2, 5) a finální zónu tvoří včelí vosk na druhém konci proužku, který zastaví vzlínání. Skleněná podložka reakční zóny v délce 10 cm je nalepena na membránu pomocí pásky lak. že podložka se přeloží napůl a po nalepení na membránu přesahuje podélně 0,5 cm detekční zónu a zároveň přesahuje 0,5 cm konec proužku se vzorkovou zónou.
Předmětem vynálezu je také způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí diagnostického proužku podle vynálezu tak, že do vyvíjecího roztoku obsahujícího nanočástice FC2O3/A11 v množství o 0,1 až 0,5 mg/ml ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0, modifikované sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15kU/l a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu způsobem podle vynálezu a fenol o koncentraci 1 až 25 mM, se přidá biologický vzorek. Objemový poměr vyvíjecího roztoku ku vzorku je 5:1, vyvíjecí roztok se vzorkem se nechá 15 minut inkubovat, poté se do něj ponoří diagnostický proužek vzorkovou zónou a nechá se ponořený inkubovat 30 minut za vzniku zbarvení detekční zóny. Po 30 minutách vzlínání a proběhlé reakci v reakční zóně se zobrazí výsledek v detekční zóně proužku zbarvením detekční zóny, jehož intenzita se vyhodnotí denzitometricky a z kalibrační křivky závislosti signálu na koncentraci sarkosinu se odečte koncentrace sarkosinu ve vzorku. Biologickým vzorkem může být moč, sérum, plazma nebo sperma.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Zjednodušené schéma připravených magnetických nanočástic zlata (FcíCWAu NPs): CHITO = chitosan; SOX = sarkosin oxidáza; HRP = křenová peroxidáza.
(A) Fe2Os/Au NPs s povrchem modifikovaným kyselinou citrónovou;
(B) Fe2O3/Au/CHITO NPs; (C) Fe2O3/Au/CHITO/SOX/ NPs;
(D) Fe2O3/Au/CHITO/SOX/ HRP NPs
Obr. 2: Biofýzikální charakteristika použitých ŠPION nanočástic v množství 40 mg/ml v 50 mM fosfátovém roztoku pH 8,0. Měření se provádělo v UV kyvetě o objemu 100 μΐ.
(A) Typické spektrum nanočástic Fe2O3/Au NPs (40 mg/ml); (B) Fe2O3/Au/CHITO NPs;
(C) Fe2O3/Au/CHITO/SOX NPs; (D) Fe2O3/Au/SOX7 HRP NPs, v insetech je ukázáno typické spektrum pseudoperoxidázové aktivity použitých nanočástic a velikostní distribuce (velikost nanočástic v průměru 20 až 30 nm). Nanočástice byly modifikovány: 8 kU/1 SOX, 5 kU/1 HRP.
Obr. 3: Testování funkčních vlastností jednotlivých typů částic: sloupec 1 - Fe2O3/Au NPs; sloupec 2 - Fe2O3/Au/CHITO NPs; sloupec 3 - Fe2O3/Au/CHITO/SOX NPs;
sloupec 4 - Fe2O3/Au/CHITO/SOX/HRP NPs; koncentrace TMB 5 mM, peroxid vodíku 30 %, acetátový pufr pH 4,0 o koncentraci 0,5 M.
Rada A - peroxidázová aktivita jednotlivých typů částic v závislosti na jejich množství (0 až 40 mg/ml) v 50 mM fosfátovém roztoku (pH 8,0); řada B - časový průběh peroxidázové reakce jednotlivých typů částic v koncentracích 0 až 40 mg/ml; řada C - časový průběh peroxidázové reakce (0 až 30 min) jednotlivých typů částic v koncentracích 40 mg/ml (křivka s kosočtverci), 20 mg/ml (křivka se čtverci), 10 mg/ml (křivka se trojúhelníky), 5 mg/ml (křivka s křížky), 2,5 mg/ml (křivka s hvězdičkami), 1,25 mg/ml (křivka s puntíky), 0,63 mg/ml (křivka s plus), 0,31 mg/ml (téměř vodorovná křivka v těsné blízkosti křivky se čtverci), 0,16 mg/ml (v těsné
-4CZ 307785 B6 blízkosti s téměř vodorovnou křivkou se čtverci), 0,08 mg/ml (v těsné blízkosti s téměř vodorovnou křivkou se čtverci) a 0 mg/ml (téměř vodorovná křivka se čtverci) mg/ml;
řada D - intenzita signálu peroxidázové reakce jednotlivých typů částic v závislosti na jejich množství (0 až 40 mg/ml).
Obr. 4: Peroxidázová aktivita FcíOa/Au/CII1TO/SOX NPs (A) vývoj reakce v čase: V jamce bylo 10 μΐ Fe2O3/Au/CHnO/SOX NPs v 50 mM fosfátovém roztoku pH 8,0 a 0,5 mg/ml sarkosinu; jednotlivé signály představují měření v 15 minutových intervalech, poslední záznam je ve 180. minutě. (B) teplotní závislost: aktivita sarkosin oxidázy v závislosti na teplotě inkubace. Ve směsi bylo: 10 pg/ml SOX, teplota nastavena na termobloku po dobu 30 min, měřeno v polystyrénové destičce, skenování při 300 až 700 nm, nula byla pouze fosfátový roztok. Vzorek byl připraven: 25 μΐ sarkosinu (1 mg/ml) do 125 μΐ reakční směsi (AAP, fenol, HRP ve fosfátovém roztoku pH 8,0). (C) časová závislost průběhu reakce (D) stanovení aktivity SOX v závislosti na koncentraci sarkosinu (E) závislost absorbance na použité koncentraci sarkosinu.
Obr. 5: Peroxidázová aktivita FcíOa/Au/CHITO/SOX NPs 5 až 50 μΐ částic při koncentraci 0 až 100 pg/ml sarkosinu ve vzorku. Jednotlivé signály představují měření v 15 minutovém intervalu, poslední záznam je ve 180. minutě. Měřilo se při 25 °C po dobu 3 hodin.
A) 50 pl částic v jamce; B) Kalibrace s 50 pl částic v jamce; C) 40 pl částic v jamce; D) Kalibrace s 40 pl částic v jamce; E) 30 pl částic v jamce; F) Kalibrace s 30 pl částic v jamce; G) 20 pl částic v jamce; H) Kalibrace s 20 pl částic v jamce; I) 10 pl částic v jamce; J) Kalibrace s 10 pl částic v jamce; K) 5 pl částic v jamce; L) Kalibrace s 5 pl částic v jamce
Obr. 6: Testování toxicity jednotlivých typů nanočástic na eukaryotickém a prokaryotickém buněčném modelu
Řada 1 - Fe2O3/Au NPs; řada 2 - Fe2O3/Au/CHITO NPs; řada 3 - Fe2O3/Au/CHITO/SOX NPs; řada 4 - Fe2O3/Au/CHITO/SOX/HRP NPs; sloupec A - S. cerevisiae; sloupec B - E. coli; sloupec C - S. aureus.
Všechny nanočástice byly testovány v následujících koncentracích: 0, 0,08, 0,16, 0,31, 0,63, 1,25, 2,5, 5 a 10 mg/ml (tyto údaje odpovídají jednotlivým křivkám, přičemž nejspodnější křivka odpovídá nejvyšší koncentraci). Hodnoty IC50 byly určeny z růstové křivky v čase 12 h od prvotní inokulace (vstupní pro všechny organismy OD 0.1).
Obr. 7: Diagnostický proužek Fe2O3/Au/CHITO/SOX/HRP NPs (A) Schématické provedení diagnostického proužku s jednotlivými zónami:
A-šířka 0,4 cm, B-délka 6,0 cm; V-vzorková zóna délky 1,5 cm s modifikovanými nanočásticemi na skleněné podložce; D-reakční zóna -2 cm pro připevnění skleněné podložky délky 5,0 cm (TOPS, AAP, fenol); E-detekční zóna délky 2,0 cm- filtrační papír; F - finální zóna délky 0,5 cm- vosk. G-skleněná podložka (reakční zóna D) přesahuje 0,5 cm konec proužku se vzorkovou zónou V (podlepovací podložku) a 0,5 cm detekční zónu E (B) Diagnostický proužek s nanesenými nanočásticemi v reálném provedení před testem (C) Uspořádání vlastního testu s vyvíjecím roztokem, do kterého se přidá testovaný vzorek biologické tekutiny a diagnostický proužek se ponoří vzorkovou zónou.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příprava nanočástic Fe2O3/Au
Tetrahydroboritan sodný o koncentraci 0,04 až 0,07 M se rozpustí v 3,5 % roztoku amoniaku a poté se po malých dávkách přidává za stálého míchání při 300 až 400 rpm k rozpuštěnému dusičnanu železitému o koncentraci 0,02 až 0,06 M a míchá se 5 až 10 min pro zreagování. Proběhne záhřev při 100 °C a stálém míchání 300 až 400 rpm po dobu 1,5 až 2,5 hodin. Po
-5CZ 307785 B6 uplynutí doby probíhá míchání dalších 12 až 16 hodin při RT. Poté se částice separují magnetem a promyjí 3x 18 ΜΩ vodou, po 3. promytí se částice separují a přidá se k nim roztok kyseliny tetrachlorozlatité o koncentraci 0,5 až 2 mM. Míchání probíhá 2,5 až 4 hodiny při 300 až 400 rpm při RT. Následně se přidá roztok citrátu trisodného o koncentraci 0.3 až 1,2 mM a míchání probíhá dalších 18 až 24 hodin při 300 až 400 rpm a RT. Poté se částice separují magnetem, promyjí 3x18 ΜΩ vodou. Po promytí se částice separují magnetem a vysuší při 45 °C, následně se seškrábnou a rozmělní.
Příprava roztoku chitosanu
Roztok chitosanu se připraví tak, že se naváží 4 až 12 mg chitosanu a rozpustí se v mililitru 1% kyseliny octové za stálého míchání při 150 až 350 rpm a RT po dobu minimálně 1 hodiny. Připravený roztok je uchováván při teplotách (10 až 5 °C) ve tmě po dobu maximálně 1 měsíc.
Modifikační roztok
Modifikační roztok pro magnetické částice se připraví z NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM a KH2PO4 1,8 mM (pH 7.2) ve sterilní vodě (18 ΜΩ).
Vazebný roztok pro nanočástice
Vazebný roztok pro použité enzymy tvoří sterilní voda (18 ΜΩ), sarkosin oxidáza o aktivitě 1 až 45 kU/1, křenová peroxidáza o aktivitě 15 až 35 kU/1 a fosfátový roztok o pH 8,0 o výsledné koncentraci 40 až 60 mM.
Navázání enzymů na nanočástice
Po smíchání 20 až 60 mg nanočástic Fe2O2/Au promytých třikrát v modifikačním roztoku (viz výše), 40 až 70 μΐ chitosanu o koncentraci 4 až 12 mg/ml v 1% kyseliny octové a 70 až 150 μΐ vazebného roztoku pro nanočástice (viz výše) se přidá 400 až 600 μΐ roztoku tripolyfosfátu (TPP) o koncentraci 1,7 až 3,2 mM v prostředí 1% kyseliny octové. Následuje inkubace 1 hodinu při pokojové teplotě a stálém míchání.
Finální úprava nanočástic
Připravené modifikované nanočástice zachovávají svoje vlastnosti v roztoku při nižších teplotách (5 až 10 °C) v kyselém prostředí (1% kyselina octová) a ve tmě. Pro zvýšení stability a lepších fyzikálních vlastností je vhodné částice lyofilizovat (-50 °C, 3 mbar, 5 hodin) a následně umístit do exsikátoru. Nanočástice je potřebné před použitím důkladně homogenizovat.
Reakční substrátový roztok
Roztok obsahuje 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM a fenol o koncentraci 1 až 25 mM.
Testování peroxidázové aktivity různého množství nanočástic Fe2C>3/Au/CHITO/SOX NPs při použití různého množství sarkosinu ve vzorku
Na polystyrénovou destičku se napipetovalo 5 až 50 μΐ nanočástic Fe2O3/Au/CHIT0/SOX NPs 5 μΐ, 10 μΐ, 20 μΐ, 30 μΐ, 40 μΐ a 50 μΐ. Odsály se dosucha, přidalo se k nim 125 μΐ barevného substrátu (AAP, fenol, HRP ve fosfátovém roztoku pH 8,0) a 25 μΐ různých koncentrací sarkosinu (0 až 100 pg/ml). Zaznamenávala se spektra (300 až 700 nm), při kroku měření 2 nm. Jednotlivé signály představují měření v 15 minutovém intervalu, poslední záznam je ve 180.
-6CZ 307785 B6 minutě (obr. 5). Měřilo se při 25 °C po dobu 3 hodin. Z výsledků vyplývá, že měření je při koncentraci nanočástic 0.1 až 0,5 mg/ml pro množství 0 až 100 pg/ml sarkosinu ve vzorku lineární (r = 0.99 a směrnice přímky se pohybovala v rozsahu 0,0148 až 0,0189, limit detekce v rozsahu 0,5 až 1 pg/ml).
Testování toxicity vybraných typů nanočástic podle dostupných melodických postupu [16]
Měření probíhalo v intervalu 30 min po dobu 18 h v mikrotitrační destičce. Použilo se kultivační médium LB v celkovém množství 250 pl na jamku, kultivace probíhala ve tmě. Proti vypařování byla destička chráněna transparentní fólií. Teplota inkubace všech organismů byla 35 °C. V časových intervalech 30 min byly vždy vzorky protřepávány při amplitudě 6 po dobu 3 s. Testovala se toxicita nanočástic typu FcíCWAli NPs, Fe2O3/Au/CHnO NPs, Fe2O3/Au/CHITO/SOX NPs a Fe2O3/Au/CHITO/SOX/HRP NPs na eukaryotické buňky S. cerevisiae a prokaryotické buňky E. coli a S. aurcus. Hodnoty IC50 byly určeny z růstové křivky v čase 12 h od prvotní inokulace (vstupní pro všechny organismy OD 0.1), probitovou analýzou pomocí programového balíku integrovaného do LADYS informačního systému z pěti nezávislých opakování testovaného vzorku a vypočítaná průměrná růstová křivka byla použita pro matematické vyhodnocení. Bylo zjištěno, že použité nanočástice v koncentracích pod 1,25 mg/ml nejsou toxické na testované prokaryotické a eukaryotické buněčné modely (obr. 6).
Stanovení množství sarkosinu v moči
K lyofilizovaným nanočásticím Fe2O3/Au umístěným v zkumavce nebo destičce, modifikovaným výše uvedeným postupem sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou pomocí vazebného roztoku (viz výše) se přidal reakční substrátový roztok (viz výše) v množství 250 μΐ a 50 μΐ vzorku moči, přičemž, množství lyofilizovaných nanočástic F2O3/Au Činilo 0,1 až 0,5 mg/ml reakčního substrátového roztoku. Reakční směs se inkubovala 30 min při 25 až 40 °C, poté se intenzita výsledného zbarvení změřila fotometricky při 546 nm a z kalibrační křivky závislosti absorbance na koncentraci sarkosinu, vyhotovené běžným postupem, se odečetla koncentrace sarkosinu ve vzorku moči. V případě, že ke zbarvení nedojde, je test negativní.
Diagnostický proužek pro kvantitativní a kvalitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku
Diagnostický proužek 1 se skládá z plastové podložky o délce 6,0 cm a šířce 0,4 cm, na níž je nalepena nitrocelulózová membrána. Na jednom konci membrány je nalepena skleněná podložka délky 1,5 cm tvořící vzorkovou zónu V obsahující nanočástice F2O3/Au modifikované sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou. Za vzorkovou zónou V následuje podélně ve směru proužku 1 skleněná podložka délky 5 cm ve formě reakční zóny D obsahující 4-amino-2,3-dimethyl-lfenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP). sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) a fenol. Za reakční zónou D následuje detekční zóna E, kterou tvoří filtrační papír Whatman (2, 5) o délce 2 cm a druhý konec proužku 1. tvoří finální zóna F z včelího vosku o délce 0,5 cm.
Vzorková zóna
Skleněná membrána obsahující (lyofilizované) nanočástice Fe2O3/Au, modifikované sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše popsaným způsobem modifikace nanočástic zlata s využitím vazebného roztoku.
Roztok pro vzorkovou zónu
Nanočástice Fe2O3/Au v množství 0,1 až 0,5 mg/ml 1% kyseliny octové s navázanou sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše popsaným způsobem navázání na nanočástic zlata s využitím vazebného roztoku.
-7 CZ 307785 B6
Reakční zóna
Skleněná membrána obsahující 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM, fenol 1 až 25 mM ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0.
Substrátový roztok pro reakční zónu
4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodná sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM, fenol 1 až 25 mM ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0.
Vyvíjecí roztok
Nanočástice PcíOa/Au v množství 0,1 až 0,5 mg/ml ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0 s navázanou sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše popsaným způsobem navázání na nanočástic zlata s využitím vazebného roztoku a fenol 1 až 25 mM.
Postup přípravy diagnostického proužku
Skleněná podložka délky 1,5 cm a šířky 0,4 cm se ponoří do roztoku pro vzorkovou zónu V (viz výše) a nechá se při laboratorní teplotě zaschnout 30 minut nebo se může lyofilizovat při -50 °C, 3 mbar po dobu 5 hodin.
Druhá skleněná podložka o délce 10 cm a šířce 0,4 cm se ponoří do substrátového roztoku pro reakční zónu D (viz výše) a nechá se při laboratorní teplotě zaschnout 30 minut nebo se může lyofilizovat při -50 °C, 300 Pa (3 mbar) po dobu 5 hodin.
Plastová podložka o délce 6 cm a šířce 0,4 cm má na povrchu nalepenou nitrocelulózovou membránu přelepenou lepicí páskou Na membránu se po odlepení pásky od konce nalepí filtrační papír délky 2,5 cm a šířky 0,4 cm tvořící detekční zónu E. Konec podložky s detekční zónou E v délce 0,5 cm se namočí do rozehřátého včelího vosku, po dobu 5 sekund, který se nechá na proužku 1 při laboratorní teplotě 1 minutu zaschnout. Zóna včelího vosku slouží jako finální zóna F k zastavení vzlínání. Pak se odlepí lepicí páska z druhého konce membrány o délce 1,5 cm a na něj se nalepí skleněná podložka napuštěná roztokem pro vzorkovou zónu V (viz výše) po úplném zaschnutí nebo lyofilizaci, obsahujícím nanočástice FC2O3/A11 s navázanými enzymy uzavřenými v chitosanové kleci. Za vzorkovou zónu V se pak nalepí druhá skleněná podložka tvořící reakční zónu D, napuštěná substrátovým roztokem pro reakční zónu D obsahujícím 4-amino-2,3dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP), sodnou sůl 3-(N-ethyl-3methylanilinjpropansulfonové kyseliny (TOPS) a fenol. Tato skleněná podložka o délce 10 cm se přeloží napůl a připevní se k membráně tak, aby její jeden konec přesahoval 0,5 cm začátek detekční zóny E a její druhý konec přesahoval 0,5 cm konec proužku 1 se vzorkovou zónou V. Reakční zóna D se připevní pomocí pásky k membráně tak, že páska je přilepená 0,5 cm od konce vzorkové zóny V a druhým koncem je páska připevněna na detekční zónu E - přes skleněnou membránu (Obr. 7).
Způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení sarkosinu v plazmě pomocí detekčního proužku
Do nádobky s vyvíjecím roztokem 2 (viz výše) o objemu 100 μΐ se pomocí kapátka, které je součástí diagnostické soupravy, přidá jedna kapka (50 μΐ) vzorku 3 plazmy. Obsah nádobky se nechá 15 minut inkubovat. Po inkubaci se do nádobky vzorkovou zónou V ponoří diagnostický proužek 1 a ponořený se nechá 30 minut vzlínat. V reakční zóně D proběhne reakce a výsledek se
-8CZ 307785 B6 projeví v detekční zóně E proužku 1 (obr. 7) jejím zbarvením. Intenzita zbarvení detekční zóny E se vyhodnotí denzitometricky a z kalibrační křivky závislosti signálu na koncentraci sarkosinu se odečte koncentrace sarkosinu ve vzorku plazmy. V případě, že ke zbarvení nedojde, je test negativní.
Průmyslová využitelnost
Test je vhodný pro rutinní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku, především moči. Provedení je vhodné pro rutinní stanovení sarkosinu v diagnostických laboratořích a případně v domácnostech. Na základě tohoto testu lze získat informace o hladině sarkosinu v neznámém vzorku s vysokou citlivostí. Stanovení je proveditelné v řádu 0,5 až 1 hodin za použití běžně dostupného vybavení. Oproti běžným postupům (analýza aminokyselin pomocí kapalinové chromatografie) je doba stanovení výrazně zkrácena a je vyžadována minimální úprava vzorku.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (12)

1. Nanočástice IWWAu o velikosti 20 až 60 nm s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu připravitelné tak, že k nanočásticím IWWAu v množství 20 až 60 mg se přidá chitosan o koncentraci 4 až 12 mg/ml v roztoku 1% kyseliny octové, vazebný roztok o objemu 70 až 150 μΐ obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 45 kU/1, křenovou peroxidázu o aktivitě 15 až 35 kU/1 ve fosfátovém roztoku o koncentraci 40 až 60 mM o pH 8,0 a dále tripolyfosfát o koncentraci 1,7 až 3,2 mM v prostředí 1% kyseliny octové o pH 4, nanočástice IWWAu s přídavkem chitosanu, vazebného roztoku a tripolyfosfátu se následně inkubují 60 minut při pokojové teplotě za stálého míchání za vzniku nanočástic Fc2ÍWAu s navázanými enzymy, které se uloží ve tmě při 5 až 10 °C.
2. Způsob navázání enzymů sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu na nanočástice IvOJAu. vyznačující se tím, že k nanočásticím FC2O3/A11 v množství 20 až 60 mg se přidá chitosan o koncentraci 4 až 12 mg/ml v roztoku 1% kyseliny octové, vazebný roztok o objemu 70 až 150 μΐ obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 45 kU/1, křenovou peroxidázu o aktivitě 15 až 35 kU/1 ve fosfátovém roztoku o koncentraci 40 až 60 mM o pH 8,0 a dále tripolyfosfát o koncentraci 1,7 až 3,2 mM v prostředí 1% kyseliny octové o pH 4, nanočástice IWWAu s přídavkem chitosanu, vazebného roztoku a tripolyfosfátu se následně inkubují 60 minut při pokojové teplotě za stálého míchání za vzniku nanočástic IWWAu o velikosti 20 až 60 nm s navázanými enzymy, které se uloží ve tmě při 5 až 10 °C.
3. Způsob navázání enzymů na nanočástice IWWAu podle nároku 2, vyznačující se tím, že vzniklé nanočástice IWWAu s navázanými enzymy se lyofilizují 5 hodin při 50 °C a tlaku 300 Pa.
4. Použití nanočástic FC2O3/AU podle nároku 1 pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v množství 1 až 100 pg/ml biologického vzorku.
5. Použití podle nároku 4, kde biologickým vzorkem je moč, sérum, plazma nebo sperma.
6. Způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení sarkosinu v množství 1 až 100 pg/ml v biologickém vzorku pomocí nanočástic FC2O3/AU s navázanými enzymy podle nároku 1, vyznačující se tím, že k těmto nanočásticím FC2O3/AU v koncentraci 0,1 až 0,5 mg/ml ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0 se přidá reakční substrátový roztok obsahující 4-amino2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on, sodná sůl 3-(N-ethyl-3methylanilinjpropansulfonové kyseliny, fenol a vzorek, přičemž koncentrace 4-amino-2,3
-9CZ 307785 B6 dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on činí 0,1 až 5 mM, koncentrace sodné soli 3-(N-ethyl-3methylanilin)propansulfonové kyseliny činí 0,1 až 4 mM a koncentrace fenolu je 1 až 25 mM v celkovém objemu reakční směsi se vzorkem, přičemž objemový poměr reakčního substrátového roztoku ku vzorku je 5:1, reakční směs se inkubuje 30 min při 25 až 40°C za vzniku zbarvení, jehož intenzita se změří fotometricky při 546 nm a z kalibrační křivky závislosti absorbance na koncentraci sarkosinu se odečte koncentrace sarkosinu ve vzorku.
7. Způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení sarkosinu v biologickém vzorku podle nároku 6, vyznačující se tím, že biologickým vzorkem je moč, sérum, plazma nebo sperma.
8. Diagnostický proužek (1) pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku v množství 1 až 100 pg/ml s použitím nanočástic I‘C2O3/A11 s navázanými enzymy podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje vzorkovou zónu (V) napuštěnou roztokem pro vzorkovou zónu (V) obsahujícím nanočástice IvOí/Au v množství 0,1 až 0,5 mg/ml v prostředí 1% kyseliny octové s navázanou sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu způsobem podle nároků 1 a 2, reakční zónu (D) napuštěnou substrátovým roztokem pro reakční zónu (D) obsahujícím 4-amino-2,3dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl o 3-(N-ethyl-3methylanilinjpropansulfonové kyseliny o koncentraci 0,1 až 4 mM ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0, detekční zónu (E) a finální zónu (F).
9. Diagnostický proužek (1) podle nároku 8, vyznačující se tím, že se skládá z membrány šířky 0,4 cm a délky 6 cm, která je na jednom konci opatřena vzorkovou zónou (V) o délce 1,5 cm, za ní následuje v podélném směru proužku (1) reakční zóna (D) délky 5 cm, za reakční zónou (D) následuje detekční zóna (E) délky 2 cm a druhý konec proužku (1) je opatřen finální zónou (F) délky 0,5 cm, přičemž reakční zóna (D) přesahuje konec proužku (1) se vzorkovou zónou (V) o 0,5 cm a detekční zónu (E) podélně o 0,5 cm.
10. Diagnostický proužek (1) podle nároků 8 a 9, vyznačující se tím, že vzorková zóna (V) a reakční zóna (D) je tvořena skleněnou podložkou, detekční zóna (E) je tvořena filtračním papírem a finální zóna (F) je tvořena včelím voskem.
11. Způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí diagnostického proužku (1) podle nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že do vyvíjecího roztoku (2) obsahujícího nanočástice FC2O3/A11 v množství o 0,1 až 0,5 mg/ml ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0 s navázanou sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu způsobem podle nároku 1 a 2 a fenol o koncentraci 1 až 25 mM, se přidá vzorek (3), přičemž objemový poměr vyvíjecího roztoku ku vzorku je 5:1, vyvíjecí roztok se vzorkem se nechá 15 minut inkubovat, poté se do něj ponoří diagnostický proužek (1) vzorkovou zónou (V), nechá se ponořený inkubovat 30 minut za vzniku zbarvení detekční zóny (E), jehož intenzita se vyhodnotí denzitometricky a z kalibrační křivky závislosti signálu na koncentraci sarkosinu se odečte koncentrace sarkosinu ve vzorku.
12. Způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení sarkosinu v biologickém vzorku podle nároku 11, vyznačující se tím, že biologickým vzorkem je moč, sérum, plazma nebo sperma.
CZ2017-812A 2017-12-18 2017-12-18 Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku CZ2017812A3 (cs)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2017-812A CZ2017812A3 (cs) 2017-12-18 2017-12-18 Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku
EP18211201.1A EP3498859B1 (en) 2017-12-18 2018-12-10 Determination of sarcosine using sarcosine oxidase and horseradish peroxidase bound to fe2o3/au nanoparticles via chitosan
RS20200279A RS60195B1 (sr) 2017-12-18 2018-12-10 Određivanje sarkozina koristeći oksidazu sarkozina i peroksidazu rena vezanih za fe203/au nano čestice putem hitozana
HUE18211201A HUE049042T2 (hu) 2017-12-18 2018-12-10 Szarkozin meghatározása Fe203/Au nanorészecskékhez kitozánnal kötött szarkozin-oxidáz és torma-peroxidáz alkalmazásával
DK18211201.1T DK3498859T3 (da) 2017-12-18 2018-12-10 Bestemmelse af sarcosin under anvendelse af sarcosinoxidase og peberrodsperoxidase bundet til fe2o3/au-nanopartikler via chitosan
PT182112011T PT3498859T (pt) 2017-12-18 2018-12-10 Determinação de sarcosina oxidase e peroxidase de rábano silvestre ligadas a nanopartículas de fe2o3/au através de quitosano
PL18211201T PL3498859T3 (pl) 2017-12-18 2018-12-10 Oznaczanie sarkozyny z użyciem oksydazy sarkozynowej i peroksydazy chrzanowej związanych do nanocząsteczek fe203/au z wykorzystaniem chitosanu
ES18211201T ES2781322T3 (es) 2017-12-18 2018-12-10 Determinación de sarcosina utilizando sarcosina oxidasa y peroxidasa de rábano picante unidas a nanopartículas de Fe2O3/AU mediante quitosano
SI201830047T SI3498859T1 (sl) 2017-12-18 2018-12-10 Določitev sarkozina z uporabo sarkozin oksidaze in hrenove peroksidaze, vezanih na nanodelce fe2o3/au preko hitozana
LTEP18211201.1T LT3498859T (lt) 2017-12-18 2018-12-10 Sarkozino nustatymas naudojant sarkozino oksidazę ir krienų peroksidazę, per chitozaną surištus fe2o3/au nanodalelėmis
HRP20200421TT HRP20200421T1 (hr) 2017-12-18 2020-03-16 Određivanje sarkozina korištenjem sarkozin oksidaze i peroksidaze hrena vezane na nanočestice fe2o3/au putem hitozana
CY20201100323T CY1122955T1 (el) 2017-12-18 2020-04-07 Προσδιορισμος της σαρκοζινης χρησιμοποιωντας οξειδαση σαρκοζινης και υπεροξειδαση χρενου προσδεμενα σε νανοσωματιδια fε2ο3/αu μεσω χiτοζανης

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2017-812A CZ2017812A3 (cs) 2017-12-18 2017-12-18 Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ307785B6 true CZ307785B6 (cs) 2019-05-02
CZ2017812A3 CZ2017812A3 (cs) 2019-05-02

Family

ID=65033293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2017-812A CZ2017812A3 (cs) 2017-12-18 2017-12-18 Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP3498859B1 (cs)
CY (1) CY1122955T1 (cs)
CZ (1) CZ2017812A3 (cs)
DK (1) DK3498859T3 (cs)
ES (1) ES2781322T3 (cs)
HR (1) HRP20200421T1 (cs)
HU (1) HUE049042T2 (cs)
LT (1) LT3498859T (cs)
PL (1) PL3498859T3 (cs)
PT (1) PT3498859T (cs)
RS (1) RS60195B1 (cs)
SI (1) SI3498859T1 (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113000053B (zh) * 2021-03-02 2022-09-09 广东工业大学 一种Au-Au/IrO2@Cu(PABA)级联反应器
CN113804633B (zh) * 2021-09-15 2023-07-11 中国石油大学(华东) 基于Au-Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695442A (zh) * 2015-12-02 2016-06-22 浙江工商大学 用于酶固定化的改性磁性壳聚糖微球、其制备方法及应用
CZ30831U1 (cs) * 2017-05-16 2017-07-11 Prevention Medicals s.r.o. Diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu, kreatininu a peroxidu vodíku v biologickém nebo environmentálním vzorku
CZ30896U1 (cs) * 2017-05-16 2017-08-08 Prevention Medicals s.r.o. Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy
CZ30895U1 (cs) * 2017-05-16 2017-08-08 Prevention Medicals s.r.o. Reakční směs pro kvantitativní stanovení kreatininu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy
CZ30902U1 (cs) * 2017-06-19 2017-08-08 Prevention Medicals s.r.o. Diagnostický proužek pro kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí protilátek proti sarkosinu a nanočástic zlata s peroxidázovou aktivitou nebo kvantových teček

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695442A (zh) * 2015-12-02 2016-06-22 浙江工商大学 用于酶固定化的改性磁性壳聚糖微球、其制备方法及应用
CZ30831U1 (cs) * 2017-05-16 2017-07-11 Prevention Medicals s.r.o. Diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu, kreatininu a peroxidu vodíku v biologickém nebo environmentálním vzorku
CZ30896U1 (cs) * 2017-05-16 2017-08-08 Prevention Medicals s.r.o. Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy
CZ30895U1 (cs) * 2017-05-16 2017-08-08 Prevention Medicals s.r.o. Reakční směs pro kvantitativní stanovení kreatininu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy
CZ30902U1 (cs) * 2017-06-19 2017-08-08 Prevention Medicals s.r.o. Diagnostický proužek pro kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí protilátek proti sarkosinu a nanočástic zlata s peroxidázovou aktivitou nebo kvantových teček

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20200421T1 (hr) 2020-06-12
DK3498859T3 (da) 2020-03-30
ES2781322T3 (es) 2020-09-01
HUE049042T2 (hu) 2020-09-28
EP3498859B1 (en) 2020-01-08
PT3498859T (pt) 2020-04-24
CZ2017812A3 (cs) 2019-05-02
SI3498859T1 (sl) 2020-07-31
RS60195B1 (sr) 2020-06-30
LT3498859T (lt) 2020-04-27
EP3498859A1 (en) 2019-06-19
CY1122955T1 (el) 2021-10-29
PL3498859T3 (pl) 2020-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Development of nucleic acid aptamer-based lateral flow assays: A robust platform for cost-effective point-of-care diagnosis
Zhang et al. Portable glucose meter: trends in techniques and its potential application in analysis
Li et al. Nanozyme-enhanced tyramine signal amplification probe for preamplification-free myocarditis-related miRNAs detection
JP5948056B2 (ja) 側方流動核酸検出器
Dong et al. Sensitive detection of microRNA-21 in cancer cells and human serum with Au@ Si nanocomposite and lateral flow assay
WO2007109500A1 (en) Lateral flow devices
JPS6329247A (ja) 分析用組成物，分析要素及び被分析物の測定方法
US20180364249A1 (en) Method of quantitative determination of sarcosine in a biological sample
CN105699650B (zh) 克百威生物条形码免疫分析测定试剂盒及其应用
Torabi et al. Small-molecule diagnostics based on functional DNA nanotechnology: a dipstick test for mercury
Kucherenko et al. Application of zeolites and zeolitic imidazolate frameworks in the biosensor development
Li et al. An array-based approach to determine different subtype and differentiation of non-small cell lung cancer
Zitka et al. Microfluidic tool based on the antibody‐modified paramagnetic particles for detection of 8‐hydroxy‐2′‐deoxyguanosine in urine of prostate cancer patients
CN105779602A (zh) 一种检测端粒酶活性的胶体金试纸条及试剂盒与应用
EP3498859B1 (en) Determination of sarcosine using sarcosine oxidase and horseradish peroxidase bound to fe2o3/au nanoparticles via chitosan
JP2005253412A (ja) マイクロウェルアレイチップ、その製造方法及び被検体の活性検定方法
Li et al. A surface-enhanced Raman scattering and colorimetric dual-mode aptasensor for ultrasensitive detection of kanamycin based on DNA hydrogel network fishing the MIL-101@ AuNP nanohybrids
CN105319374A (zh) 一种筛选靶蛋白核酸配体的方法和试剂盒
Wang et al. A spherical nucleic acid-based two-photon nanoprobe for RNase H activity assay in living cells and tissues
Park et al. Catapult-like DNA actuator for highly stable and ultrasensitive detection of urinary miRNA
Khoshbin et al. A CRISPR/Cas12a-Powered Liquid Crystal Aptasensor for Point-of-Care Detection of Prostate-Specific Antigen for Early-Stage Cancer Diagnosis
CN111751540A (zh) 一种用于核酸酶检测的sers横向流动试纸条及检测方法
CZ31470U1 (cs) Diagnostický proužek pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku obsahující magnetické nanočástice zlata modifikované sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou pomocí chitosanu
CN104880424B (zh) 一种用于检测amacr的双功能纳米探针、试剂盒及方法
Xiang et al. DNA nanoflowers encapsulating horseradish peroxidase as a signal amplification tag for rapid diagnosis in cytology specimens

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20201218