CZ31470U1

CZ31470U1 - Diagnostický proužek pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku obsahující magnetické nanočástice zlata modifikované sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou pomocí chitosanu

Info

Publication number: CZ31470U1
Application number: CZ2017-34469U
Authority: CZ
Inventors: Dagmar Uhlířová; Michaela Dočekalová; Martina Staňková; Josef Růžička; René Kizek
Original assignee: Prevention Medicals s.r.o.
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2018-02-13

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká diagnostického proužku pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku obsahujícího magnetické nanočástice zlata modifikované sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou pomocí chitosanu.

Dosavadní stav techniky

V 21. století se projevují snahy dosáhnout jednoduché, rychlé a cílené diagnostiky sarkosinu jako ío markéru a jeho snadné a spolehlivé stanovení v běžných podmínkách klinických laboratoří. Výrazný vzestup diagnostiky umožňuje prudký vývoj nanotechnologií a především jejich využití ve zdravotnictví. Byla navržena řada různých technologických přístupů umožňujících zlepšit a rozšířit diagnostické metody a postupy. Významnou skupinu představují železné nanočástice, které vykazují magnetické vlastnosti (jsou často označovány jako SPIONs: supeparamagnetic iron oxide nanoparticles) [1, 2]. Na základě zjištěného faktu, že některé skupiny chemických látek nebo nanomateriálů, jako zlaté nanočástice (AuNPs), mohou vykazovat enzymatickou (také peroxidázovou) aktivitu, se tyto částice dostaly do popředí výzkumu. Zlaté nanočástice (AuNPs) jsou již velmi dlouhou dobu používány jako vhodný nástroj pro molekulámě-biologičké experimenty. Částice mohou být modifikovány celou řadou biomolekul (nukleové kyseliny, proteiny, aminokyseliny apod.). Nanočástice mohou být modifikované například chitosanem, který může sloužit výhodně pro imobilizaci enzymů nebo enkapsulaci léčiv jako nosič, jak popisuje vynález CN106265597. Medicínským prostředkem na bázi chitosanu jako podpůrné struktury se zabývá také dokument EP 2792375. Chitosanem pokryté magnetické mikročástice pro imobilizaci enzymů popisuje spis CN 105695442. Patentový spis EP 2995627 se zabývá syntézou systémů nanočásticových genových nosičů založených na chitosanu. Dokument CN102703418 se zabývá způsobem přípravy magnetických chitosanových mikročástic jako nosiče s navázanou křenovou peroxidázou pro potřebné použití tohoto enzymu.

V řadě vědeckých studií bylo ukázáno, že aminokyselina sarkosin se podílí na metabolismu aminokyselin a metylačních procesech. Hladina sarkosinu v moči u pacientů s diagnostikovaným zhoubným nádorem prostaty je zvýšená [3-9]. Pro detekci sarkosinu byla popsána enzymatická detekce za využití sarkosin oxidázy v odborných publikacích [10], ale i patentových spisech [1113]. Sarkosin oxidáza je enzym štěpící sarkosin na glycin, formaldehyd a peroxid vodíku [14]. Vytvořený peroxid vodíku je využíván v následných chemických reakcích. Výsledné změny jsou pozorovány jako interakce s vhodným substrátem jako je 3,3’5,5’-tetramethylbenzidin (TMB) a jiné [15]. V posledních pěti letech velmi roste zájem o použití jednoduchého testu na hladinu sarkosinu v biologickém vzorku (převážně moči, séru). Známé a běžně využívané analytické techniky, jako je HPLC, mikrofluidní systémy, spektrofotometrie, hmotnostní detektory jsou citlivé, ale časové náročné a vyžadují komplikovanou přípravu vzorků.

Dosud však nebyl vyvinut časově nenáročný test využívající imobilizovaných enzymů uzpůso40 bený pro rutinní stanovení sarkosinu v domácím prostředí dostatečně citlivý pro včasnou diagnostiku zvýšeného množství sarkosinu v těle souvisejícího mimo jiné s nádorovým onemocněním.

Literatura:

1. Mahmoudi, M.; Sant, S.; Wang, B.; Laurent, S.; Sen, T. Superparamagnetic iron oxide nano45 particles (spions): Development, surface modification and applications in chemotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews 2011, 63, 24-46.

2. Wahajuddin; Arora, S. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: Magnetic nanoplatforms as drug carriers. Int. J. Nanomed. 2012, 7,3445-3471.

-1CZ 31470 Ul

3. Cemei, N.; Heger, Z.; Gumulec, J.; Zítka, O.; Masarik, M.; Babula, P.; Eckschlager, T.; Stiborova, M.; Kizek, R.; Adam, V. Sarcosine as a potential prostatě cancer biomarker a review. International Journal ofMolecular Scienves 2013,14,13893- 13908.

4. Cemei, N.; Zitka, O.; Ryvolova, M.; Adam, V.; Masarik, M.; Hubalek, J.; Kizek, R. Spectrometric and electrochemical analysis of sarcosine as a potential prostatě carcinoma markér. International Journal of Electrochemical Science 2012, 7,4286-4301.

5. Khan, A. P.; Rajendiran, Τ. M.; Ateeq, B.; Asangani,!. A.; Athanikar, J. N.; Yocum, A. K.; Mehra, R.; Siddiqui, J.; Palapattu, G.; Wei, J. T.; et al. The role of sarcosine metabolism in prostatě cancer progression. Neoplasia 2013,15, 491 -+.

6. Sreekumar, A.; Poisson, L. M.; Rajendiran, Τ. M.; Khan, A. P.; Cao, Q.; Yu, J. D.; Laxman,

B.; Mehra, R.; Lonigro, R. J.; Li, Y., et al. Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostatě cancer progression. Nátuře 2009,457,910-914.

7. Heger, Z.; Cemei, N.; Křižkova, S.; Masarik, M.; Kopel, P.; Hodek, P.; Zitka, O.; Adam, V.; Kizek, R. Paramagnetic nanoparticles as a platform for ífet-based sarcosine picomolar detection. Sci Rep 2015, 5.

8. Zitka, O.; Cemei, N.; Heger, Z.; Matoušek, M.; Kopel, P.; Kynicky, J.; Masarik, M.; Kizek, R.; Adam. V. Microfluidic chip coupled with modified paramagnetic particles for sarcosine isolation in urine. Electrophoresis 2013,34, 2639-2647.

9. Zitka, O.; Heger, Z.; Komínkova, M.; Skalickova, S.; Křižkova, S.; Adam, V.; Kizek, R. Preconcentration based on paramagnetic microparticles for the separation of sarcosine using hydrophilic interaction liguid chromatography coupled with coulometric detection. J. Sep. Sci. 2014, 37,465-475.

10. Mayr, U.; Moellering, H.; Siedel, J.; Seidel, H. Hydrogen peroxide-forminfg sarcosine oxidase us patent-4743549. May 10 1988. US 4743549,1988.

11. Uhlířova, D.; Dočekalova, M.; Staňkova, M.; Ruzicka, J.; Kizek, R. Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy. UV č. záp. 30896 2017, 08.08. 2017.

12. Uhlířova, D.; Dočekalova, M.; Staňkova, M.; Melichar, L.; Ruzicka, J.; Kizek, R. Diagnostický proužek pro stanovení množství sarkosinu, kreatininu a peroxidu vodíku v biologickém nebo environmentálním vzorku. UV č. záp. 30831 2017,11.07.2017.

13. Uhlířova, D.; Dočekalova, M.; Staňkova, M.; Melichar, L.; Ruzicka, J.; Kizek, R. Diagnostický proužek pro kvantitativní stanoveni sarkosinu v biologickém vzorku pomocí protilátek proti sarkosinu a nanočástic zlata s peroxidázovou aktivitou nebo kvantových teček. UV č. záp. 30902 2017, 08. 08. 2017.

14. Chen, Z.-w.; Hassan-Abdulah, A.; Zhao, G.; Joms, M. S.; Mathews, F. S. Heterotetrameric sarcosine oxidase: Structure of a diflavin metalloenzyme at 1.85 á resolution. Journal of Molecular Biology 2006, 360,1000-1018.

15. Mayr, U.; Moellering, H.; Siedel, J.; Seidel, H. Method for the determination of sarcosinecreatinine or creatinine us patent-4845029. July 4 1989. US 4845029,1989.

16. Mahmoudi, M.; Simchi, A.; Milani, A. S.; Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. J. Colloid Interface Sci. 2009, 336, 510-518.

Objasnění výkresů.

Obr. 1: Zjednodušené schéma připravených magnetických nanočástic zlata (Fe₂O₃/Au NPs); CHITO = chitosan; SOX = sarkosin oxidáza; HRP = křenová peroxidáza. (A) Fe₂O3/Au NPs s povrchem modifikovaným kyselinou citrónovou;

(B) Fe₂O₃/Au/CHTTO NPs;(C) Fe₂O₃/Au/CHITO/SOX/ NPs;

-2CZ 31470 Ul (D) Fe₂O₃/Au/CHITO/SOX/ HRP NPs

Obr. 2: Biofyzikální charakteristika použitých ŠPION nanočástic v množství 40 mg/ml v 50 mM fosfátovém roztoku pH 8,0. Měření se provádělo v UV kyvetě o objemu 100 pl. (A) Typické spektrum nanočástic Fe2O₃/Au NPs (40 mg/ml); (B) Fe2O₃/Au/CHTTO NPs; (C) Fe₂O₃/Au/CHITO/SOX NPs; (D) Fe2O₃/Au/SOX/ HRP NPs, v insetech je ukázáno typické spektrum pseudoperoxidázové aktivity použitých nanočástic, velikostní distribuce a elektronmikroskopická charakteristika nanočástic (velikost nanočástic v průměru 20 až 30 nm). Nanočástice byly modifikovány: 8 kU/1 SOX, 5 kU/1 HRP.

Obr. 3: Testování funkčních vlastností jednotlivých typů částic: sloupec 1 - Fe₂O₃/Au NPs; sloupec 2 - Fe₂O₃/Au/CHITO NPs; sloupec 3 - Fe2O₃/Au/CHITO/SOX NPs; sloupec 4 Fe₂O₃/Au/CHITO/SOX/HRP NPs; koncentrace TMB 5 mM, peroxid vodíku 30 %, acetátový pufr pH 4,0 o koncentraci 0,5 M.

Řada A - peroxidázová aktivita jednotlivých typů částic v závislosti na jejich množství (0 až 40 mg/ml) v 50 mM fosfátovém roztoku (pH 8,0); Řada B - časový průběh peroxidázové reakce jednotlivých typů částic v koncentracích 0 až 40 mg/ml; Řada C - časový průběh peroxidázové reakce (0 až 30 min) jednotlivých typů částic v koncentracích 40 mg/ml (křivka s kosočtverci), 20 mg/ml (křivka se čtverci), 10 mg/ml (křivka s trojúhelníky), 5 mg/ml (křivka s křížky),

2,5 mg/ml (křivka s hvězdičkami), 1,25 mg/ml (křivka s puntíky), 0,63 mg/ml (křivka s plus), 0,31 mg/ml (téměř vodorovná křivka v těsné blízkosti křivky se čtverci), 0,16 mg/ml (v těsné blízkosti s téměř vodorovnou křivkou se čtverci), 0,08 mg/ml (v těsné blízkosti s téměř vodorovnou křivkou se čtverci) a 0 mg/ml (téměř vodorovná křivka se čtverci) mg/ml;

Řada D - intenzita signálu peroxidázové reakce jednotlivých typů částic v závislosti na jejich množství (0 až 40 mg/ml).

Obr. 4: Peroxidázová aktivita Fe2O₃/Au/CHITO/SOX NPs (A) vývoj reakce v čase: V jamce 10 μΐ Fe2O₃/Au/CHITO/SOX NPs v 50 mM fosfátovém roztoku pH 8,0 a 0,5 mg/ml sarkosinu; jednotlivé signály představují měření v 15 minutových intervalech, poslední záznam je ve 180. minutě (B) teplotní závislost: aktivita sarkosin oxidázy v závislosti na teplotě inkubace. Ve směsi bylo: 10 pg/ml SOX, teplota nastavena na termobloku po dobu 30 min, měřeno v polystyrénové destičce, skenování při 300 až 700 nm, nula byla pouze fosfátový roztok. Vzorek byl připraven: 25 μΐ sarkosinu (1 mg/ml) do 125 μΐ reakční směsi (AAP, fenol, HRP ve fosfátovém roztoku pH 8). (C) časová závislost průběhu reakce (D) stanovení aktivity SOX v závislosti na koncentraci sarkosinu (E) závislost absorbance na použité koncentrací sarkosinu.

Obr. 5: Peroxidázová aktivita Fe₂O₃/Au/CHnO/SOX NPs 5 až 50 μΐ částic při koncentraci 0 až 100 pg/ml sarkosinu ve vzorku. Jednotlivé signály představují měření v 15 minutovém intervalu, poslední záznam je ve 180. minutě. Měřilo se při 25 °C po dobu 3 hodin. A) 50 pl částic v jamce;

B) Kalibrace s 50 pl částic v jamce; C) 40 pl částic v jamce; D) Kalibrace s 40 pl částic v jamce; E) 30 pl částic v jamce; F) Kalibrace s 30 μΐ částic v jamce; G) 20 pl částic v jamce; H) Kalibrace s 20 pl částic v jamce; I) 10 pl částic v jamce; J) Kalibrace s 10 pl částic v jamce; K) 5 pl částic v jamce; L) Kalibrace s 5 pl částic v jamce.

Obr. 6: Testování toxicity jednotlivých typů nanočástic na eukaryotickém a prokaryotickém buněčném modelu. Řada 1 - Fe₂O₃/Au NPs; řada 2 - Fe2O₃/Au/CHITO NPs; řada 3 Fe₂O₃/Au/CHITO/SOX NPs; řada 4 - Fe₂O₃/Au/CHlTO/SOX/HRP NPs; sloupec A - S. cerevisce; sloupec B - E. coli; sloupec C - S. aureus.

Všechny nanočástice byly testovány v následujících koncentracích: 0, 0,08, 0,16, 0,31, 0,63, 1,25, 2,5, 5 a 10 mg/ml (tyto údaje odpovídají jednotlivým křivkám, přičemž nejspodnější křivka odpovídá nejvyšší koncentraci). Hodnoty IC50 byly určeny z růstové křivky v čase 12 h od prvotní inokulace (vstupní pro všechny organismy OD 0,1)

Obr. 7: Diagnostický proužek Fe2O₃/Au/CHITO/SOX/HRP NPs (A) Schematické provedení diagnostického proužku s jednotlivými zónami:

-3CZ 31470 Ul

A - šířka 0,4 cm. B - délka 6,0 cm. V - vzorková zóna délky 1,5 cm s modifikovanými nanočásticemi na skleněné podložce; D - reakční zóna -2 cm pro připevnění skleněné podložky délky 5,0 cm (TOPS, AAP, fenol); E - detekční zóna délky 2,0 cm - filtrační papír; F - finální zóna délky 0,5 cm - vosk. G - skleněná podložka (reakční zóna D) přesahuje 0,5 cm konec proužku se vzorkovou zónou V (podlepovací podložku) a 0,5 cm detekční zónu E. (B) Diagnostický proužek s nanesenými nanočásticemi v reálném provedení před testem (C) Uspořádání vlastního testu s vyvíjecím roztokem, do kterého se přidá testovaný vzorek biologické tekutiny a diagnostický proužek se ponoří vzorkovou zónou.

Podstata technického řešeni

Chitosan, případně jiná vhodná polymerizační činidla mají schopnost imobilizovat enzymy za pomoci tripolyfosfátu (TPP) a iontů zinku. Způsob modifikace magnetických nanočástic zlata s peroxidázovou aktivitou, na kterých je pomocí chitosanu a tripolyfosfátu navázaný enzym sarkosin oxidáza a křenová peroxidáza řeší výše uvedený nedostatek stanovení sarkosinu v biologickém vzorku.

Tento způsob modifikace za specifických podmínek propůjčuje magnetickým nanočásticím zlata specifické vlastnosti, umožňující detekci sarkosinu v biologickém vzorku v množství 1 až 100 pg/ml na základě reakce v roztoku nebo pomocí diagnostického proužku.

Způsob modifikace magnetických nanočástic zlata sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou pomocí chitosanu podle vynálezu spočívá v tom, že k magnetickým nanočásticím zlata v množství 20 až 60 mg se přidá chitosan o koncentraci 4 až 12 mg/ml v roztoku 1% kyseliny octové, vazebný roztok o objemu 70 až 150 μΐ obsahující sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 45 kU/1, křenovou peroxidázu o aktivitě 15 až 35 kU/1 ve fosfátovém roztoku o koncentraci 40 až 60 mM o pH 8,0 a dále tripolyfosfát (TPP) o koncentraci 1,7 až 3,2 mM v prostředí 1% kyseliny octové o pH 4. Magnetické nanočástice zlata s přídavkem chitosanu, vazebného roztoku a tripolyfosfátu se následně inkubují 60 minut při pokojové teplotě za stálého míchání za vzniku modifikovaných magnetických nanočástic zlata o velikosti 20 až 60 nm, které se uloží ve tmě při 5 až 10 °C. Vzniklé modifikované nanočástice zlata se mohou výhodně před použitím lyofilizovat 5 hodin při -50 °C a tlaku 3 mbar.

Předmětem technického řešení je diagnostický proužek pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku v množství 1 až 100 pg/ml obsahující vzorkovou zónu napuštěnou roztokem pro vzorkovou zónu obsahujícím nanočástice zlata v množství 0,1 až 0,5 mg/ml v prostředí 1% kyseliny octové modifikované sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše uvedeným způsobem modifikace. Diagnostický proužek dále obsahuje reakční zónu napuštěnou substrátovým roztokem pro reakční zónu obsahující 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0 a 1 až 25 mM fenol, detekční zónu a finální zónu.

Diagnostický proužek podle technického řešení výhodně se skládá z membrány, která má na obou koncích lepící části o šířce 0,4 cm. Membrána má výhodně šířku 0,4 cm a délku 6,0 cm. Na jednom konci je opatřena vzorkovou zónou o délce 1,5 cm, za ní následuje v podélném směru proužku reakční zóna délky 5 cm, za reakční zónou následuje detekční zóna délky 2 cm a druhý konec proužku je opatřen finální zónou včelího vosku délky 0,5 cm.

Vzorková zóna a reakční zóna je výhodně tvořena skleněnou podložkou, detekční zóna v horní části membrány je tvořena filtračním papírem (Whatman 2,5) a finální zónu tvoří včelí vosk na druhém konci proužku, který zastaví vzlínání. Skleněná podložka reakční zóny v délce 10 cm je nalepena na membránu pomocí pásky tak, že podložka se přeloží napůl a po nalepení na membránu přesahuje 0,5 cm detekční zónu a zároveň přesahuje 0,5 cm konec proužku se vzorkovou zónou.

Kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí diagnostického proužku probíhá tak, že do vyvíjecího roztoku obsahujícího zlaté magnetické nanočástice

-4CZ 31470 Ul v množství o 0,1 až 0,5 mg/ml ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0, modifikované sarkosin oxidázu o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázu o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše popsaným způsobem a fenol o koncentraci 1 až 25 mM, se přidá biologický vzorek, přičemž objemový poměr vyvíjecího roztoku ku vzorku je 5:1, vyvíjecí roztok se vzorkem se nechá 15 minut inkubovat, poté se do něj ponoří diagnostický proužek vzorkovou zónou, nechá se ponořený inkubovat 30 minut za vzniku zbarvení detekční zóny. Po 30 minutách vzlínání a proběhlé reakci v reakční zóně se zobrazí výsledek v detekční zóně proužku zbarvením detekční zóny, jehož intenzita se vyhodnotí denzitometricky a z kalibrační křivky závislosti signálu na koncentraci sarkosinu se odečte koncentrace sarkosinu ve vzorku. Biologickým vzorkem je výhodně moč, sérum, plazma nebo sperma.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příprava zlatých magnetických nanočástic

Tetrahydroboritan sodný o koncentraci 0,04 až 0,07 M se rozpustí v 3,5% roztoku amoniaku a poté se po malých dávkách přidává za stálého míchání při 300 až 400 rpm k rozpuštěnému dusičnanu železnému o koncentraci 0,02 až 0,06 M a míchá se 5 až 10 min pro zreagování. Proběhne záhřev při 100 °C a stálém míchání 300 až 400 rpm po dobu 1,5 až 2,5 hodin. Po uplynutí doby probíhá míchání dalších 12 až 16 hodin při RT. Poté se částice separují magnetem a promyjí 3x 18 ΜΩ vodou, po 3. promytí se částice separují a přidá se k nim roztok kyseliny tetrachlorozlatité o koncentraci 0,5 až 2 mM. Míchání probíhá 2,5 až 4 hodiny při 300 až 400 rpm při RT. Následně se přidá roztok citrátu trisodného o koncentraci 0,3 až 1,2 mM a míchání probíhá dalších 18 až 24 hodin při 300 až 400 rpm a RT. Poté se částice separují magnetem, promyjí 3x 18 ΜΩ vodou. Po promytí se částice separují magnetem a vysuší při 45 °C, následně se seškrábnou a rozmělní.

Příprava roztoku chitosanu

Roztok chitosanu se připraví tak, že se naváží 4 až 12 mg chitosanu a rozpustí se v mililitru 1% kyseliny octové za stálého míchání při 150 až 350 rpm a pokojové teplotě po dobu minimálně 1 hodiny. Připravený roztok je uchováván při teplotách (10 až 5 °C) ve tmě po dobu maximálně 1 měsíc.

Modifikační roztok

Modifikaění roztok pro magnetické částice se připraví z NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na₂HPO₄10 mM a KH₂PO₄1,8 mM (pH 7,2) ve sterilní vodě (18 ΜΩ).

Vazebný roztok pro nanočástice

Vazebný roztok pro použité enzymy je tvořen sterilní vodou (18 ΜΩ), sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 45 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 15 až 35 kU/1, fosfátovým roztokem o pH 8,0 a výsledné koncentraci 40 až 60 mM.

Modifikace nanočástic

Po smícháni 20 až 60 mg zlatých magnetických částic promytých třikrát v modifikačním roztoku (viz výše), 40 až 70 μΐ chitosanu o koncentraci 4 až 12 mg/ml v 1% kyseliny octové a 70 až 150 μΐ vazebného roztoku pro nanočástice (viz výše) se přidá 400 až 600 μΐ roztoku tripolyfosfátu (TPP) o koncentraci 1,7 až 3,2 mM v prostředí 1% kyseliny octové. Následuje inkubace 1 hodinu při pokojové teplotě a stálém míchání.

Finální úprava nanočástic

Připravené modifikované nanočástice zachovávají svoje vlastnosti v roztoku při nižších teplotách (5 °C až 10 °C) v kyselém prostředí (1% kyselina octová) a ve tmě. Pro zvýšení stability a lepších fyzikálních vlastností je vhodné částice lyofilizovat (-50 °C, 3 mbar, 5 hodin) a následně umístit do exikátoru. Nanočástice je potřebné před použitím důkladně homogenizovat.

-5CZ 31470 Ul

Reakční substrátový roztok

Roztok obsahuje 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM a fenol o koncentraci 1 až 25 mM.

Testování peroxidázové aktivity různého množství nanočástic FeíOfAu/CHITO /SOX NPs při použití různého množství sarkosinu ve vzorku

Na polystyrénovou destičku se napipetovalo 5 až 50 μΐ nanočástic Fe₂O3/Au/CHITO/SOX NPs 5 μΐ, 10 μΐ, 20 μΐ, 30 μΐ, 40 μΐ a 50 μΐ. Odsály se dosucha, přidalo se k nim 125 pl barevného substrátu (AAP, fenol, HRP ve fosfátu pH 8,0) a 25 μΐ různých koncentrací sarkosinu (0 až 100 pg/ml). Jednotlivé signály představují měření v 15 minutovém intervalu, poslední záznam je ve 180. minutě. Zaznamenávala se spektra (300 až 700 nm), při kroku měření 2 nm. Měřilo se při 25 °C po dobu 3 hodin (Obr. 5). Z výsledků vyplývá, že měření je při koncentraci nanočástic 0,1 až 0,5 mg/ml pro množství 0 až 100 pg/ml sarkosinu ve vzorku lineární (r = 0,99 a směrnice přímky se pohybovala v rozsahu 0,0148 až 0,0189, limit detekce v rozsahu 0,5 až 1 pg/ml) (Obr. 5).

Testování toxicity vybraných typů nanočástic podle dostupných metodických přístupů [16].

Měření probíhalo v intervalu 30 min po dobu 18 h v mikrotitrační destičce. Použilo se kultivační médium LB v celkovém množství 250 μΐ na jamku, kultivace probíhala ve tmě. Proti vypařování byla destička chráněna transparentní folií. Teplota inkubace všech organismů byla 35 °C. V časových intervalech 30 min byly vždy vzorky protřepávány při amplitudě 6 po dobu 3 s. Testovala se toxicita nanočástic typu Fe₂O3/Au NPs, Fe₂O₃/Au/CinTO NPs, Fe₂O3/Au/CHITO/SOX NPs a Fe₂O3/Au/CHITO/SOX/HRP NPs na eukaryotické buňky S. cerevisiae a prokaryotické buňky

E. coli a S. aureus. Hodnoty IC50 byly určeny z růstové křivky v čase 12 h od prvotní inokulace (vstupní pro všechny organismy OD 0.1), probitovou analýzou pomocí programového balíku integrovaného do LADYS informačního systému z pěti nezávislých opakování testovaného vzorku a vypočítaná průměrná růstová křivka byla použita pro matematické vyhodnocení. Bylo zjištěno, že použité nanočástice v koncentracích, pod 1,25 mg/ml nejsou toxické na testované prokaryotické a eukaryotické buněčné modely (Obr. 6).

Diagnostický proužek pro kvantitativní a kvalitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku

Diagnostický proužek 1 se skládá z plastové podložky o délce 6,0 cm a šířce 0,4 cm, na níž je nalepena nitrocelulózová membrána. Na jednom konci membrány je nalepena skleněná podložka délky 1,5 cm tvořící vzorkovou zónu V obsahující magnetické nanočástice zlata modifikované sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou. Za vzorkovou zónou V následuje podélně ve směru proužku skleněná podložka délky 5 cm ve formě reakční zóny obsahující 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP), sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) a fenol. Za reakční zónou D následuje detekční zóna E, kterou tvoří filtrační papír Whayman (2, 5) o délce 2 cm a druhý konec proužku tvoří finální zóna F z včelího vosku o délce 0,5 cm.

Vzorková zóna

Skleněná membrána obsahující (lyofilizované) zlaté magnetické nanočástice, modifikované sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše popsaným způsobem modifikace nanočástic zlata s využitím vazebného roztoku. Roztok pro vzorkovou zónu

Magnetické nanočástice zlata v množství 0,1 až 0,5 mg/ml 1% kyseliny octové, modifikované sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše popsaným způsobem modifikace nanočástic zlata s využitím vazebného roztoku.

-6CZ 31470 Ul

Reakčnízóna

Skleněná membrána obsahující 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM, fenol 1 až 25 mM, 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0.

Substrátový roztok pro reakční zónu

4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP) o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodná sůl

3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) o koncentraci 0,1 až 4 mM, fenol 1 až 25 mM ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0.

Vyvíjecí roztok ío Zlaté magnetické nanočástice v množství 0,1 až 0,5 mg/ml ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku opH8,0 modifikované sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15kU/l a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu výše popsaným způsobem modifikace nanočástic zlata s využitím vazebného roztoku a fenol 1 až 25 mM.

Postup přípravy diagnostického proužku

Skleněná podložka délky 1,5 cm a šířky 0,4 cm se ponoří do roztoku pro vzorkovou zónu V (viz výše) a nechá se při laboratorní teplotě zaschnout 30 minut nebo se může lyofilizovat při -50 °C, 3 mbar po dobu 5 hodin.

Druhá skleněná podložka o délce 10 cm a šířce 0,4 cm se ponoří do substrátového roztoku pro reakční zónu D (viz výše) a nechá se při laboratorní teplotě zaschnout 30 minut nebo se může lyofilizovat při -50 °C, 3 mbar po dobu 5 hodin.

Plastová podložka o délce 6 cm a šířce 0,4 cm má na povrchu nalepenou nitrocelulózovou membránu přelepenou lepicí páskou. Na membránu se po odlepení pásky od konce nalepí filtrační papír délky 2,5 cm a šířky 0,4 cm tvořící detekční zónu E. Konec podložky s detekční zónou E v délce 0,5 cm se namočí do rozehřátého včelího vosku, po dobu 5 sekund, který se nechá na proužku při laboratorní teplotě 1 minutu zaschnout. Zóna včelího vosku slouží jako finální zóna F k zastavení vzlínání. Pak se odlepí lepicí páska z druhého konce membrány o délce 1,5 cm a na něj se nalepí skleněná podložka napuštěná roztokem pro vzorkovou zónu V (viz výše) po úplném zaschnutí nebo lyofilizací, obsahujícím magnetické nanočástice zlata s navázanými enzymy uzavřenými v chitosanové kleci. Za vzorkovou zónu V se pak nalepí druhá skleněná podložka na30 puštěná substrátovým roztokem pro reakční zónu D obsahujícím 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on (AAP), sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) a fenol, tvořící reakční zónu D. Tato skleněná podložka o délce 10 cm se přeloží napůl a připevní se k membráně tak, aby její jeden konec přesahoval 0,5 cm začátek detekční zóny E a její druhý konec přesahoval 0,5 cm konec proužku se vzorkovou zónou V. Reakční zóna D se připevní pomocí pásky k membráně tak, že páska je přilepená 0,5 cm od konce vzorkové zóny V a druhým koncem je páska připevněna na detekční zónu E - přes skleněnou membránu (Obr. 7).

Způsob kvalitativního a kvantitativního stanovení, sarkosinu v plazmě pomocí detekčního proužku

Do nádobky s vyvíjecím roztokem 2 (viz výše) o objemu 100 μΐ se pomocí kapátka, které je sou40 částí diagnostické soupravy, přidá jedna kapka (50 μΐ) vzorku 3 plazmy. Obsah nádobky se nechá 15 minut inkubovat. Po inkubaci se do nádobky vzorkovou zónou V ponoří diagnostický proužek a ponořený se nechá 30 minut vzlínat. V reakční zóně D proběhne reakce a výsledek se projeví v detekční zóně E proužku (Obr. 7) jejím zbarvením. Intenzita zbarvení detekční zóny E se vyhodnotí denzitometricky a z kalibrační křivky závislosti signálu na koncentraci sarkosinu se odečte koncentrace sarkosinu ve vzorku plazmy. V případě, že ke zbarvení nedojde, je test negativní.

-7CZ 31470 Ul

Průmyslová využitelnost

Test je vhodný pro rutinní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku, především moči. Provedení je vhodné pro rutinní stanovení sarkosinu v diagnostických laboratořích a případně v domácnostech. Na základě tohoto testu lze získat informace o hladině sarkosinu v neznámém vzorku s vy5 sokou citlivostí. Stanovení je proveditelné v řádu 0,5 až 1 hodin za použití běžně dostupného vybavení. Oproti běžným postupům (analýza aminokyselin pomocí kapalinové chromatografie) je doba stanovení výrazně zkrácena a je vyžadována minimální úprava vzorku.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Diagnostický proužek (1) pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologicio kém vzorku v množství 1 až 100 pg/ml s použitím nanočástic zlata modifikovaných sarkosin oxidázou a křenovou peroxidázou pomocí chitosanu, vyznačující se tím, že obsahuje vzorkovou zónu (V) napuštěnou roztokem pro vzorkovou zónu obsahujícím nanočástice zlata v množství 0,1 až 0,5 mg/ml v prostředí 1% kyseliny octové modifikované sarkosin oxidázou o aktivitě 1 až 15 kU/1 a křenovou peroxidázou o aktivitě 1 až 20 kU/1 pomocí chitosanu, reakční

15 zónu (D) napuštěnou substrátovým roztokem pro reakční zónu obsahujícím 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolin-5-on o koncentraci 0,1 až 5 mM, sodnou sůl o 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny o koncentraci 0,1 až 4mM, ve 40 až 60 mM fosfátovém roztoku o pH 8,0 a 1 až 25 mM fenol, detekční zónu (E) a finální zónu (F).
2. Diagnostický proužek (1) podle nároku 1, vyznačující se tím, že se stává

20 z membrány šířky 0,4 cm a délky 6 cm, která je na jednom konci opatřena vzorkovou zónou (V) o délce 1,5 cm, za ní následuje v podélném směru proužku reakční zóna (D) délky 5 cm, za reakční zónou (D) následuje detekční zóna (E) délky 2 cm a druhý konec proužku (1) je opatřen finální zónou (F) délky 0,5 cm, přičemž reakční zóna (D) přesahuje konec proužku (1) se vzorkovou zónou (V) o 0,5 cm a detekční zónu (E) o 0,5 cm.

25
3. Diagnostický proužek (1) podle nároků laž2, vyznačující se tím, že vzorková zóna (V) a reakční zóna (D) je tvořena skleněnou podložkou, detekční zóna (E) je tvořena filtračním papírem a finální zóna (F) je tvořena včelím voskem.
4. Diagnostický proužek (1) podle nároků laž3, vyznačující se tím, že biologickým vzorkem je moč, sérum, plazma nebo sperma.