CZ30896U1 - Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy - Google Patents
Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ30896U1 CZ30896U1 CZ2017-33694U CZ201733694U CZ30896U1 CZ 30896 U1 CZ30896 U1 CZ 30896U1 CZ 201733694 U CZ201733694 U CZ 201733694U CZ 30896 U1 CZ30896 U1 CZ 30896U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- concentration
- sarcosine
- reagent
- activity
- sample
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Oblast techniky
Technické řešení se týká reakční směsi pro kvantitativní enzymatické stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy prostřednictvím automatizovaných fotometrických systémů.
Dosavadní stav techniky
Sarkosin (N-methylglycin) je aminokyselina, která muže vznikat methylací glycinu. Fyziologicky je sarkosin v organismu přítomen ve stopovém množství. Zvýšené hodnoty nacházíme v krvi a v moči u sarkosinemie z deficitu sakosindehydrogenázy a u glutarové acidurie typu II. Sarkosinemie je velmi vzácná metabolická porucha, která nemá přesně definované klinické projevy. U onemocnění dochází k vzestupu hladiny sarkosinu v moči i krevní plasmě[l]. Analyzované hodnoty sarkosinu se tak mohou pohybovat v desítkách až stovkách mikromolámích koncentrací ve sledovaném biologickém vzorku. N, N-dimethylglycin byl testován pro potencionální antioxidační efekt v průběhu fertilizace. Bylo zjištěno, že použitím N, N-dimethylglycinu dochází k lepšímu vývinu zárodků skotu [2],
Kromě uvedeného jsou hladiny vybraných aminokyselin (v moči, krevním séru) možné ukazatele potencionálního kardiovaskulárního rizika [3], Klasická homocysteinurie (HCU) je způsobena deficitem cystathionin-beta-synthasy a je charakterizován poruchami pojivové tkáně, mentální retardací a kardiovaskulárními onemocněními Léčba typicky zahrnuje snižování hladiny homocysteinu s dietou omezující methionin a dietní suplementace betainem, což přímo navazuje na metabolickou dráhu spojenou se sarkosinem [4], Podobně byly popsány poměrně významné změny hladin aminokyselin, včetně sarkosinu u pacientů s chorobami aorty [5], Navržený markér by mohl napomoci při neinvazivní a objektivní diagnostice takové závažné zdravotní poruchy [5],
Bylo zjištěno, že u pacientů s aktivně probíhajícím onemocněním HIV dochází k významným změnám hladiny sarkosinu a N, N-dimethylglycinu [6], Bylo zde také prokázáno, že po proběhlé antivirotické terapii došlo k významnému snížení hladiny obou markérů [6],
Terapeuticky se sarkosin používá ve vysokých koncentracích (2 g/den) jako podpůrná léčba psychických a psychiatrických onemocněni, především schizofrenii [7, 8], Při jeho použití dochází k ovlivnění glutamátového receptorového systému a sarkosin je pravděpodobně inhibitorem glycintransporter-1 (GlyT-1) [9],
V řadě experimentálních studií byly sledovány aminokyselinové profily ve vztahu k nádorům prostaty [5, 10, 11], Zvýšené hladiny sarkosinu v moči byly Identifikovány jako potencionální markér zhoubných nádorů a to především nádorů prostaty [12].
Kromě výše uvedených důvodů pro analýzu sarkosinu v biologickém vzorku je sarkosin v běžné spotřebitelské síti dostupný jako doplněk stravy. Zde by jeho zvýšené koncentrace měly být pravděpodobně sledovány pro posouzení maximálních vhodných dávek aminokyseliny.
Ke stanovení sarkosinu se dosud používaly běžně chromatografické a elektrochemické metody. Vzhledem ke klinickému významu tohoto metabolitu byly určité snahy o nalezení způsobu, jak tyto metody modifikovat pro použití v klinických laboratořích a umožnit kvantitativní detekci u pacienta jako součást diagnostického vyšetřeni.
Metodu kvantitativní detekce sarkosinu ve vzorku moči pomocí chromatografie a hmotnostní spektrometrie uvádí spis CN102662013 nebo CN1026800599. Detekci sarkosinu pomocí zařízení na bázi elektroforézy-elektrochemiluminiscence popisuje například dokument CN101718746. Kvantitativní rutinní stanovení sarkosinu je však stále náročné na přístrojové vybavení, často vyžaduje chemickou úpravu biologického vzorku a není dostatečně citlivé a přesné.
CZ 30896 Ul
Enzymatické metody pro automatické analýzy při stanovení kreatininu, kyseliny močové, triacylglycerolu, cholesterolu, glukózy a případné dalších analytů využívají Trinderovy reakce 4-aminoantipyrinu a fenolu v přítomnosti peroxidu a peroxidázy, kdy vzniká chioniminové barvivo s výsledným vyhodnocením automatizovanými fotometrickými systémy [13]. Zavedení této res akce do klinické biochemie přineslo ve spojení se substrátově specifickými enzymy výrazné zlepšení specifity a selektivity [14],
Analýza sarkosinu v klinických laboratořích v běžném provozu není v současné době možná. Pro její provedení je nezbytné zavést vhodnou metodiku včetně práce s jednotlivými složkami a poměrně náročnou optimalizací metody.
io Literatura:
1. Lee SY, Chán KY, Chán AYW, et al. A report of two families with sarcosinaemia in Hong
Kong and revisiting the pathogenetic potential of hypersarcosinaemia. Annals of the Academy of
Medicíně Singapore 2006; 35(8): 582-584
2. Takahashi T, Sasaki K, Somfai T, et al. N, N-Dimethylglycine decreases oxidative stress and 15 improves in vitro development of bovine embryos. Journal of Reproduction and Development
2016; 62(2): 209-212.
3. Lever M, George PM, Dellow WJ: et al. Homocysteine, glycine betaine, and N,N-dimethylglycine in patients attending a lipid clinic. Metabolism: Clinical and Experimental 2005; 54(1): 1-14.
4. Maclean KN, Jiang H, Greiner LS, et al Long-term betaine therapy in a murine model of cysta2o thionine beta-synthase deficient homocystinuria: Decreased efficacy over time reveals a significant threshold effect between elevated homocysteine and thrombotic risk. Molecular Genetics and Metabolism 2012; 105(3): 395-403.
5. Wang LL, Liu S, Yang WG, et al. Plasma Amino Acid Profile in Patients with Aortic Dissection. Sci Rep 2017 Jan; 7.
6. Look MP, Riezler R, Berthold HK, et al. Decrease of elevated N, N-Dimethylglycine and
N-methylglycine in human immunodeficiency virus infection during short-term highly active antiretroviral therapy. Metabolism: Clinical and Experimental 2001; 50(11): 1275-1281.
7. Strzelecki D, Kaluzynska O, Wysokinski A. BDNF sérum levels in schizophrenic patients during treatment augmentation with sarcosine (results of the PULSAR study). Psychiatry Res
2016 Aug; 242: 54-60.
8. Strzelecki D, Podgorski M, Kaluzynska O, et al. Adding Sarcosine to Antipsychotic Treatment in Patients with Stable Schizophrenia Changes the Concentrations of Neuronal and Glial Metabolites in the Left Dorsolateral Prefrontal Cortex. Int J Mol Sci 2015 Oct; 16(10): 24475- 24489.
9. Hashimoto K, Malchow B, Falkai P, et al. Glutamate modulators as potential therapeutic drugs 35 in schizophrenia and affective disorders. EurArch Psych Clin Neurosci 2013 Aug; 263(5): 367377.
10. Sreekumar A, Poisson LM, Rajendiran TM, et al. Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostatě cancer progression. Nátuře 2009 Feb; 457(7231): 910-914.
11. Derezinski P, Klupczynska A, Sawicki W: et al. Amino Acid Profiles of Sérum and Urine in 40 Search for Prostatě Cancer Biomarkers: a Pilot Study. Int J Med Sci 2017; 14(1): 1-12.
12. Heger Z, Gumulec J, Cemei N, et al Relation of exposure to amino acids involved in sarcosine metabolic pathway on obhavior of non-tumor and malignant prostatic cell lineš. Prostatě 2016 May; 76(7): 679-690
Jia J, Liu G, Li S, et al., inventors; SHANGHAI XUHUI DISTRICT CENT HOSPITAL 45 (SHAN- Non-standard), assignee. Urine sample hepatitis B virus covalently dosed circular DNA sarcosine quantitative detection method, involves detecting quantitative rate of sarcosine solution, and calculating content of sarcosine in urine sample patent CN102662013-A. CN102662013-A
Sep 2012 G01N-030/02 201309.
14. Wiewiorka O, Dastych M, Čermáková Z Trinderova reakce v klinické biochemii - přínosy 50 a limity. Cem Listy 2017; 111(3): 186-191.
CZ 30896 Ul
Podstata technického řešení
Výše uvedené přetrvávající nedostatky řeší reakční směs podle technického řešení pro snadné kvantitativní stanovení sarkosinu enzymatickou metodou s použitím 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) a sodné soli 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS), 3,3'-diaminobenzidinu nebo o-fenylendiaminu. Použitím těchto činidel vznikne stabilní směs s velmi dobrou citlivostí k identifikaci sarkosinu jak při použití běžných fotometrů, tak plně automatizovaných systémů.
Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy in vitro s použitím 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) a sodné soli 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) využívá následující enzymatické reakce: Sarkosinoxidáza
Sarkosin + O2 + H2O θ Glycin +HCHO+ H2O2
Peroxidáza
2H2O2 + AAP + TOPS + fenol <-> chinonimin +4 H2O
Tuto reakční směs tvoří vzorek, reakční činidlo Rl a reakční činidlo R2 v objemových poměrech 9:36:55. Reakční činidlo Rl pro tuto enzymatickou reakci obsahuje sarkosino koncentraci 10 až 100 μΜ, chlorid sodný v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM močovinu v koncentraci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ. Reakční činidlo R2 obsahuje sarkosin oxidázu o aktivitě 2 až 10 Ku/1, peroxidázu o aktivitě 10 až 100KU/I, 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol (AAP) v koncentraci 0,1 až 2,0 mM, fenol v koncentraci 1 až 5 mM a sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) v koncentraci 0,1 až 2,0 mM. Zvýšení absorbance produktu chinoniminu fialového zbarvení v poslední reakci při A = 546 nm měřitelné fotometrickou metodou je přímo úměrné koncentraci sarkosinu ve vzorku (Obr. 1 a Obr. 4). Stanovení je lineární v rozmezí koncentrací 1 až 1000 μΜ.
Předmětem technického řešení je také diagnostická souprava pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy in vitro. Souprava obsahuje reakční činidlo Rl, které tvoří chlorid sodný v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM, močovina v koncentraci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ a sarkosin v koncentraci 10 až 100 μΜ reakční činidlo R2, které tvoří sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/I, 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol (AAP) v koncentraci 0,1 až 2,0 mM, fenol v koncentraci 1 až 5 mM a sodná sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny (TOPS) v koncentraci 0,1 až 2,0 mM. Součástí diagnostické soupravy je také kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ.
Reakční činidlo R2 v reakční směsi pro kvantitativní stanovení sarkosinu, kterou tvoří vzorek, reakční činidlo Rla reakční činidlo R2 v objemových poměrech a se složením reakčního činidla Rl, jak je uvedeno výše, může mít také následující složení: peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a 3,3’-diaminobenzidin v koncentraci 1 až 10 mM.
Předmětem technického řešení je dále příslušná diagnostická souprava pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy in vitro. Souprava obsahuje reakční činidlo Rl, které tvoři chlorid sodný v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM, močovina v koncentraci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ a sarkosin v koncentraci 10 až 100 μΜ, reakční činidlo R2, které tvoři peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a 3,3'-diaminobenzidin v koncentraci 1 až 10 mM. Součástí diagnostické soupravy je také kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ.
CZ 30896 Ul
Reakční činidlo R2 v reakční směsi pro kvantitativní stanovení sarkosinu, kterou tvoři vzorek, reakční činidlo Rl a reakční činidlo R2 v objemových poměrech a se složením reakčního činidla Rl, jak je uvedeno výše, může mít i následující složení: peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a o-fenylendiamin s v koncentraci 5 až 20 mM.
Předmětem technického řešeníje i příslušná diagnostická souprava pro Kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy in vitro. Souprava obsahuje reakční činidlo Rl, které tvoří chlorid sodný v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM, močovina v konceniii traci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ a sarkosin v koncentraci 10 až 100 μΜ, reakční činidlo R2, které tvoří peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci až 5 mM a o-fenylendiamin v koncentraci 5 až 20 mM. Součástí diagnostické soupravy je také kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ.
Reakční směsi jsou vhodné pro kvalitativní stanovení sarkosinu díky výslednému zbarvení reakce, ale především pro kvantitativní stanovení ve vzorku lidského séra, plazmy nebo moči v koncentračním rozmezí 0 až 1000 μΜ Rozmezí hodnot sarkosinu u zdravého člověka v moči je 0 až 1 μΜ, v plazmě je rozmezí hodnot 0 až 5 μΜ. Předpokládá se, že každá laboratoř si stanoví své vlastní referenční rozmezí.
2o Reakční směsí podle technického řešení pro kvalitativní a kvantitativní enzymatické stanovení ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy umožňují snadnou a rychlou detekci sarkosinu v biologickém vzorku v laboratořích klinické biochemie prostřednictvím automatizovaných fotometrických systému
Objasnění výkresů
Obr. 1: Kvalitativní test přítomnosti sarkosinu ve vzoru (biologický vzorek, degradační produkt apod.) za využití kterékoli enzymatické reakční směsi podle technického řešení. V reakci dochází ke vzniku intenzivního zabarvení roztoku podle přítomného barevného produktu reakce, a) sarkosin negativní; b) sarkosin pozitivní.
Obr. 2: Kvantitativní stanovení sarkosinu v pufrovaném prostředí (0,2 M fosfátový pufr pH 7,0) za využití enzymatické reakční směsi dle příkladu 1 v automatizovaném fotometrickém systému. (A) Typické spektrum je ukázáno v insetu obrázku s maximem při 546 nm. Reakční kinetická křivka ukazuje strmou, časově závislou reakci (pro vlastní test je potřeba 10 až 15 min.). Při použití odečtu při 510 nm je citlivost metody o 25 % snížena. (B) Kalibrační závislost je striktně lineární (R2 = 0,9994), LOQ = 25 μΜ, LOD = 5 μΜ, relativní chyba stanovení pod 2 %, n= 30. Rl:chlorid sodný v koncentraci 130 mM, chlorid draselný 60 mM, fosforečnan sodný 30 mM, močovina 300 mM, kreatinin 20 mM, bovinní sérový albumin 750 μΜ, sarkosinlOO μΜ. R2 peroxidáza o aktivitě 20 KU/I, sarkosin oxidáza o aktivitě 4 KU/I, 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol o koncentraci 0,5 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny v koncentraci 0,5 mM a fenol o koncentraci 2 mM.
Obr. 3: Kvantitativní stanovení sarkosinu v prostředí umělé močí (chlorid sodný v koncentraci 130 mM, chlorid draselný v koncentraci 60 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 30 mM, močovina v koncentraci 300 mM, kreatinin v koncentraci 20 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 750 μΜ sarkosin v koncentraci 10 až 100 μΜ) za využití enzymatické reakční směsi v automatizovaném fotometrickém systému. (A) Typické spektrum je ukázáno v insetu obrázku s maximem při 546 nm. Reakční kinetická křivka ukazuje strmou, časově závislou reakci (pro vlastní test je potřena 10 až 15 min). (B) Kalibrační závislost je striktně lineární v celém testovaném rozsahu (0 až 1000 μΜ; R2 = 0,9997), LOQ 15 μΜ, LOD 5 μΜ a v rozsahu nízkých koncentrací (0 až 10 μΜ, R2 = 0,9873), LOQ = 2 μΜ, LOD = 0,5 μΜ, relativní chyba stanovení pod 2 %, n = 30.
CZ 30896 Ul
V případech A, B, C a) byl standardní přídavek sarkosinu 100 μΜ. Obrázek C b) znázorňuje kalibrační závislost v nízkých koncentracích (0 až 10 μΜ, R2= 0,972). LOQ = 35 μΜ, LOD = 10 μΜ, pří standardním přídavku sarkosinu 10 μΜ.
Obr. 4: Kvantitativní stanovení sarkosinu v prostředí reálného vzorku močí (hustota močí 1,0112, pH7,l) za využití enzymatické reakční směsi dle příkladu 2 v automatizovaném fotometrickém systému. (A) Typické spektrum je ukázáno v insetu obrázku s maximem při 546 nm. Reakční kinetická křivka ukazuje strmou, časově závislou reakci (pro vlastní test je potřeba 10 až 20 min). (B) Kalibrační závislost je striktně lineární v celém testovaném rozsahu (0 až 1000 μΜ; R2 = 0,9979), LOQ 50 μΜ, LOD 15 μΜ. (C a)) V rozsahu nízkých koncentrací (0 až 10 μΜ, R2 = 0,9873), LOQ = 2 μΜ, LOD = 0,5 μΜ, relativní chyba stanovení pod 2 %, n = 30. (C b)) Metoda je využitelná pro stanovení sarkosinu i při odečtu 510 nm (0 až 10 μΜ, R2 = 0,9824), LOQ = 2 μΜ, LOD = 0,8 μΜ, relativní chyba stanovení pod 5 %, n = 30.
Obr. 5: Kvantitativní stanovení sarkosinu v prostředí krevní plasmy (koncentrace bílkoviny 75 g/1, pH 7.1) za využití enzymatické reakční směsí dle příkladu 3 v automatizovaném fotometrickém systému. (A) Typické spektrum je ukázáno v insetu obrázku s maximem při 546 nm. Reakční kinetická křivka ukazuje strmou, časově závislou reakci (pro vlastní test je potřeba 10 až 20 min). (B) Kalibrační závislost je striktně lineární v celém testovaném rozsahu (0 až 1000 μΜ: R2 = 0,9933), LOQ 85 μΜ, LOD 25 μΜ. (C a))
V rozsahu nízkých koncentrací (0 až 10 μΜ, R2 = 0,987), LOQ = 2 μΜ, LOD = 0,5 μΜ, relativní chyba stanovení pod 2 %, n = 30 Obrázek C b) znázorňuje hladiny sarkosinu v krevní plasmě u 7 vzorků (0,8 až 3,4 μΜ).
Příklady uskutečnění technického řešení
| Příklad 1: | ||
| Kvantitativní stanovení sarkosinuve vzorku lidského séra enzymatickou metodou s použitím bar- | ||
| viv 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazolu (AAP) a sodné soli 3-(N-ethyl-3-methylanilin)pro- | ||
| pansulfonové kyseliny (TOPS). | ||
| Ke stanovení se použila diagnostická souprava obsahující kalibrační roztok standardu sarko- | ||
| sinu o koncentraci 10 μΜ, činidlo R1 a R2 s níže uvedeným složením a koncentraci jednotlivých složek: | ||
| R 1 | —............-..........................- | |
| 5 | Chlorid sodný | r 100-200 mM |
| Chlorid draselný | 30-80 mM | |
| ! | Fosforečnan sodný | 10-50mM ί |
| ! | — 111------ Močovina | 200-500 mM ' |
| Kreatinin | 10-25 mM | |
| Bovinní sérový albumin | 600-800 μΜ | |
| i i ...... | Sarkosin | 10-100 μΜ |
| ' R2 | ’........... - - | ·?...............------ ---------------------7 |
| Sarkosm oxidáza | ' 2-10 KU/ι ' | |
| Peroxidáza | ’ 10-100 KU/I | |
| i i | AAP | l Ó. 1-2 OmM j |
| i | TOPS | J μ 1-2,OmM j |
| Fenol | 1 -5 mM H |
CZ 30896 Ul
Ke stanovení množství sarkosinu se použil vzorek lidského séra s trvanlivostí až 7 dní pri 2 až °C nebo 3 měsíce pri -20 °C nebo vzorek moči s trvanlivostí pri 4 až 8 °C 5 dní. Je možné použít též vzorek lidské plazmy, která má stejnou trvanlivost jako sérum. Plná krev a hemolytické vzorky se však nedoporučují zpracovávat touto metodou. Současně se s přípravou vzorku ke stas novení sarkosinu připravil i slepý vzorek (blank). Pro stanovení sarkosinu v séru se jako blank používá fosfátový pufr o koncentraci 0,2 M a pH 7,0.
K 180 μΐ výše uvedeného činidla Rl v plastové kývete se napipetovalo 45 μΐ vzorku lidského séra a v případě blanku 45 μΐ fosfátového pufru o koncentraci 0,2 M a pH 7,0. Směs činidla Rl a vzorku se promíchala a inkubovala 1 až 5 minut pri 37 °C. Následně se přidalo k této směsi ni 275 μΐ činidla R2. Výsledná směs se promíchala a inkubovala 21 minut při 37 °C. Fotometrickou metodou se měřila absorbance vzniklého produktu chinoniminu fialového zbarvení ve vzorku a blanku při 546 nm (Obr. 2A). Získaná hodnota rozdílu absorbance ΔΑ = [ΔΑ vzorku] - [ΔΑ blanku] byla přímo úměrná množství sarkosinu ve vzorku séra, moči dle odečtu pomocí kalibrační křivky (Obr. 2B).
i s Příklad 2
Kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moci enzymatickou metodou s použitím barvivá 3,3 ‘-diammobenzidin
Ke stanovení se použila diagnostická souprava obsahující kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ, činidlo Rl a R2 s níže uvedeným složením a koncentraci jednotlivých slo2o žek:
| R 1 | ||
| Chlorid sodný | 100-200 mM | |
| Chlorid draselný | 30-80 mM | |
| Fosforečnan sodný | 10-50 mM | |
| Močovina | 200-500 mM | |
| Kreatinin | 10-25 mM | |
| Bovinní sérový albumin | 600-800 μΜ | |
| Sarkosin | 10-100 μΜ |
| R2 | ||
| Sarkosin oxidáza | 2-10 KU/I | |
| Peroxidáza | 10-100 KU/I | |
| Fenol | 1-5 mM | |
| 3,3 ‘ -diaminobenzidin | 1-10 mM |
Ke stanovení množství sarkosinu se použil vzorek lidské moči s trvanlivostí pri 4 až 8 °C 5 dní. Současně se s přípravou vzorku ke stanovení sarkosinu připravil i slepý vzorek (blank).
Pro stanovení sarkosinu v moči se jako blank použila artificiální moč, kterou tvoří chlorid sodný 25 v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM, močovina v koncentraci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM a bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ.
K 180 μΐ výše uvedeného činidla Rl v plastové kyvetě se napipetovalo 45 μΐ vzorku lidského séra a v případě blanku 45 μΐ artificiální moči. Směs činidla Rl a vzorku se promíchala a inkubo30 vala 1 až 5 minut při 37 °C. Následně se přidalo k této směsi 275 μΐ činidla R2. Výsledná směs se
CZ 30896 Ul promíchala a inkubovala 21 minut při 37 °C. Fotometrickou metodou se měřila absorbance vzniklého produktu chinoniminu fialového zbarvení ve vzorku a blanku při 546 nm (Obr. 4A). Získaná hodnota rozdílu absorbance ΔΑ = [ΔΑ vzorku] - [ΔΑ blanku] byla přímo úměrná množství sarkosinu ve vzorku séra, moči dle odečtu pomocí kalibrační křivky (Obr. 4B).
Příklad 3
Kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské plazmy enzymatickou metodou s použitím barvivá o-fenylendiamin
Ke stanovení se použila diagnostická souprava obsahující kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ, činidlo Rl a R2 s níže uvedeným složením a koncentrací jednotlivých složek:
| Rl | ||
| Chlorid sodný | 100-200 mM | |
| Chlorid draselný | 30-80 mM | |
| Fosforečnan sodný | 10-50 mM | |
| Močovina | 200-500 mM | |
| Kreatinin | 10-25 mM | |
| Bovinní sérový albumin | 600-800 μΜ | |
| Sarkosin | 10-100 μΜ |
| R2 | ||
| Sarkosin oxidáza | 2-10 KU/I | |
| Peroxidáza | 10-100 KU/I | |
| Fenol | 1-5 mM | |
| o-fenylendiamin | 5-20 mM |
Ke stanovení množství sarkosinu se použil vzorek lidské plazmy s trvanlivostí až 7 dní při 2 až 8 °C nebo 3 měsíce pří -20 °C. Plná krev a hemolytické vzorky se nedoporučují zpracovávat touto metodou. Současné se s přípravou vzorku ke stanovení sarkosinu připravil i slepý vzorek (blank). Pro stanovení sarkosinu v plazmě se jako blank používá fosfátový pufr o koncentrací 0,2MapH 7,0.
K 180 μΐ výše uvedeného činidla Rl v plastové kývete se napipetovalo 45 μΐ vzorku lidského séra a v případě blanku 45 μΐ fosfátového pufru o koncentraci 0,2 M a pH 7,0. Směs činidla Rl a vzorku se promíchala a inkubovala 1 až 5 minut při 37 °C. Následně se přidalo k této směsi 275 μΐ činidla R2. Výsledná směs se promíchala a inkubovala 21 minut pří 37 °C. Fotometrickou metodou se měřila absorbance vzniklého produktu chinoniminu fialového zbarvení ve vzorku a blanku při 546 nm (Obr. 5A). Získaná hodnota rozdílu absorbance ΔΑ = [ΔΑ vzorku] - [ΔΑ blanku] byla přímo úměrná množství sarkosinu ve vzorku séra, močí dle odečtu pomocí kalibrační křivky (Obr 5B).
Průmyslová využitelnost
Stabilní a citlivá reakční směs podle technického řešení umožňuje snadné, rychlé a finančně nenáročné enzymatické stanovení množství sarkosinu ve vzorku lidské moče, séra či plazmy v běžném fotometru nebo plně automatizovaném fotometrickém systému. Stanovení sarkosinu a jeho
CZ 30896 Ul množství usnadňuje jeho detekcí obecně jako markerové molekuly pro diagnostiku a další aplikace v klinické biochemii.
Claims (3)
1. Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo s plazmy in vitro, vyznačující se tím, že jej tvoří vzorek, reakční činidlo RI a reakční činidlo R2 v objemových poměrech 9:36:55, přičemž reakční činidlo RI obsahuje chlorid sodný v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM, močovinu v koncentraci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ a sarkosin v koncentraci 10 až ni 100 μΜ a reakční činidlo R2 obsahuje peroxidázu o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidázu o aktivitě 2 až 10KU/I, 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol o koncentraci 0,1 až 2,0 mM, sodnou sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny v koncentraci 0,1 až 2,0 mM a fenol o koncentraci 1 až 5 mM.
2. Reakční směs podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakční činidlo R2 obsa15 huje peroxidázu o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidázu o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a 3,3'-diaminobenzidin v koncentraci 1 až 10 mM.
3. Reakční směs podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakční činidlo R2 obsahuje peroxidázu o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidázu o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a o-fenylendiamin v koncentraci 5 až 20 mM.
2ii 4. Diagnostická souprava pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy in vitro, vyznačující se tím, že obsahuje reakční činidlo RI, které tvoří chlorid sodný v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM, močovina v koncentraci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ, sarkosin
25 v koncentraci 10 až 100 μΜ, reakční činidlo R2, které tvoří peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, 4-amino-2,3-dimethyl-l-fenyl-3-pyrazol v koncentraci 0,1 až 2,0 mM, sodná sůl 3-(N-ethyl-3-methylanilin)propansulfonové kyseliny v koncentraci 0,1 až 2,0 mM, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ.
to 5. Diagnostická souprava pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy in vitro podle nároku 4, vyznačující se tím, že reakční činidlo R2 tvoří peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/1, sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a 3,3'-diaminobenzidin v koncentraci 1 až 10 mM a kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ.
35 6. Diagnostická souprava pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy in vitro podle nároku 4, vyznačující se tím, že reakční činidlo R2 tvoří peroxidáza o aktivitě 10 až 100 KU/I, sarkosin oxidáza o aktivitě 2 až 10 KU/I, fenol o koncentraci 1 až 5 mM a o-fenylendiamin v koncentraci 5 až 20 mM a kalibrační roztok standardu sarkosinu o koncentraci 10 μΜ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-33694U CZ30896U1 (cs) | 2017-05-16 | 2017-05-16 | Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-33694U CZ30896U1 (cs) | 2017-05-16 | 2017-05-16 | Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ30896U1 true CZ30896U1 (cs) | 2017-08-08 |
Family
ID=59655767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-33694U CZ30896U1 (cs) | 2017-05-16 | 2017-05-16 | Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ30896U1 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ307785B6 (cs) * | 2017-12-18 | 2019-05-02 | Prevention Medicals s.r.o. | Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku |
-
2017
- 2017-05-16 CZ CZ2017-33694U patent/CZ30896U1/cs not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ307785B6 (cs) * | 2017-12-18 | 2019-05-02 | Prevention Medicals s.r.o. | Nanočástice Fe2O3/Au s navázanými enzymy sarkosin oxidázy a křenové peroxidázy pomocí chitosanu a jejich použití pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém nebo environmentálním vzorku |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11808776B2 (en) | Method of analyzing diluted biological sample component | |
| Alisik et al. | A colorimetric method to measure oxidized, reduced and total glutathione levels in erythrocytes | |
| McCaman et al. | Fluorimetric method for the determination of phenylalanine in serum | |
| Monostori et al. | Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples: an in-depth review | |
| Alam et al. | Measurement of homocysteine: a historical perspective | |
| US20050214161A1 (en) | Test device for simultaneous measurement of multiple analytes in a single sample | |
| US5516700A (en) | Automated urinalysis method | |
| CN104120165B (zh) | 一种稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒 | |
| CN116249904A (zh) | 用于测定来自样品的nad代谢物的量的方法以及与其相关的方法和用途 | |
| Persichilli et al. | A reversed-phase HPLC fluorimetric method for simultaneous determination of homocysteine-related thiols in different body fluids | |
| Watts | Determination of uric acid in blood and in urine | |
| WO2011133581A1 (en) | Methods and compositions for assaying enzymatic activity of myeloperoxidase in blood samples | |
| CZ30896U1 (cs) | Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy | |
| Price et al. | Analytical reviews in clinical biochemistry: the measurement of urate | |
| Akram et al. | Development and validation of an economical uric acid-Fe3+/Fe2+-ferrozine-based colorimetric assay to estimate uric acid level of pure and biological samples | |
| Accinni et al. | Newborn screening of homocystinuria: quantitative analysis of total homocyst (e) ine on dried blood spot by liquid chromatography with fluorimetric detection | |
| US20090123956A1 (en) | Measurement of the oxidants-antioxidants balance in liquids | |
| CZ2017271A3 (cs) | Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy | |
| Lous et al. | A comparison of three methods, utilizing different principles, for the determination of uric acid in biological fluids | |
| CN108956971A (zh) | 一种丙戊酸免疫检测试剂及其制备和检测方法 | |
| Wu | Screening for inborn errors of amino acid metabolism | |
| KR20230108628A (ko) | 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 및 그 제조방법 | |
| CN104634958B (zh) | 血清巯基总氧化能力的检测方法及试剂盒 | |
| Wagner et al. | S-adenosylhomocysteine is a more sensitive indicator of renal insufficiency than homocysteine | |
| CZ30895U1 (cs) | Reakční směs pro kvantitativní stanovení kreatininu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20170808 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20210516 |