CN104634958B - 血清巯基总氧化能力的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血清生物学指标领域，更具体地涉及血清巯基总氧化能力的检测方法及试剂盒，本发明提出血清巯基总氧化能力概念并建立测定方法。利用二硫苏糖醇、含巯基的多肽或蛋白作为反应基质液，用二硫代二硝基苯甲酸作为残余巯基的指示剂，测定血清中巯基总氧化能力，这一新发展的综合指标可帮助了解机体的巯基总氧化能力。利用这种检测方法发现，不同种属血清巯基总氧化能力差别大，而同一种属血清在不同个体上也有不同。
Description
技术领域
本发明涉及血清生物学指标领域，用于评价血清巯基总氧化能力这一综合指标，具体涉及血清巯基总氧化能力的检测方法及试剂盒。
技术背景
血清中包含多种抗氧化酶，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽转移酶、硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶。血清中还存在诸多抗氧化小分子，如谷胱甘肽、维生素C和维生素E。另一方面，血清包含多种氧化酶，如NADPH氧化酶和髓过氧化酶等。血清还存在诸多具氧化能力的小分子，如脂质过氧化物、过氧化氢。面对这种氧化与还原并存的复杂背景，人们提出血清总抗氧化能力这一综合指标并建立了测定方法。目前，有关血清总抗氧化能力文献超过5000篇，其中与疾病相关的文献有2267篇(来源于中国知网)，主要是评价生活方式和环境以及疾病对总抗氧化能力水平的影响，没有用总抗氧化能力作为诊断疾病或评价健康状况的依据。总抗氧化能力检测方法已经商业化，市场上已经有可出售的试剂盒(http://www.bioon.com.cn/reagent/show_product.asp？id＝2557989)。因此，总抗氧化能力只能帮助了解机体的抗氧化能力，作为一个中间结果，它与疾病的诊断或健康状况无直接必然联系。
血清含有多种可氧化巯基的物质，包括大分子巯基氧化酶，例如静息巯基氧化酶和肝再生增强因子，和小分子化合物，例如过氧化物和四价态硒。相反，血清也含有多种可还原巯基的物质，包括大分子硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和小分子还原剂谷胱甘肽。
针对这种巯基氧化与还原并存的复杂背景，有必要借鉴总抗氧化能力，提出血清巯基总氧化能力这一综合指标并建立了测定方法。
发明内容
本发明首先提出血清硫基总氧化能力这一综合指标概念。血清巯基总氧化能力是指血清中各种可氧化巯基物质和可还原巯基的物质综合起来总共能够氧化巯基的能力。血清巯基总氧化能力的单位定义为一定条件下单位时间内血清氧化1纳摩尔巯基为血清巯基总氧化能力的1个活力单位。
.含巯基的小分子、多肽或蛋白可同时被大分子巯基氧化酶和小分子化合物氧化。氧化所形成的二硫键或氧化型巯基可被大分子硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和小分子还原剂所还原。本发明优选使用含巯基的小分子、多肽或蛋白检测血清巯基总氧化能力。
本发明的技术方案一方面涉及一种血清巯基总氧化能力的检测方法，其特征在于，该方法包括：
1)取一定体积的血清样品放入测定离心管中，保温；
2)取与1)相同体积的生理盐水放入空白离心管中，保温；
3)分别加入一定量反应缓冲液，混合均匀，保温；
4)分别加入一定量反应基质液，混合均匀，保温反应；
5)分别加入反应终止液，终止反应，混合均匀；
6)分别加入显色溶液；
7)30分钟内，用显色溶液校零，在412nm波长下比色，记录吸光值；
所述反应缓冲液选自：含有乙二胺四乙酸(EDTA)的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液或磷酸盐缓冲液；反应基质液选自：含有巯基的小分子、多肽或蛋白的溶液；反应终止液选自：盐酸胍、三氯乙酸、硫酸溶液；显色溶液为含有二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)的溶液。
血清硫基总氧化能力的计算公式为：
注：消光系数为硫代二硝基苯甲酸(TNB)的消光系数。
上述血清和生理盐水的用量选自20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、180、200μL；优选的，上述血清来源于人、小鼠、猪、狗、马、牛、羊、兔或者猴。上述反应缓冲液的用量选自200、250、300、350、400、420、440、460、480、500、550、600、650、700μL；优选400、420、440、460、480、500μL；最优选440μL。优选的，上述反应缓冲液为含有乙二胺四乙酸的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。
上述反应基质液的用量选自10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200μL；优选40、50、60、70、80μL；最优选60μL。浓度选自0.5、1、2、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10mM；优选2、3、3.5、4、5、6mM；最优选3.5mM。优选的，上述反应基质液为二硫苏糖醇(DTT)溶液。
优选的，所述的反应终止液为盐酸胍溶液。
优选的，上述步骤2)和3)中的保温的温度为35-40℃，优选37℃。
优选的，上述步骤3)中保温反应时间为5-60分钟，优选10-30分钟，优选15分钟。
本发明的技术方案的另一方面涉及一种用于检测血清巯基总氧化能力的试剂盒，包括a)反应缓冲液；b)反应基质液；c)反应终止液；d)显色溶液；其中反应缓冲液选自：含有乙二胺四乙酸.的羟乙基哌嗪乙硫磺酸.缓冲液或磷酸盐缓冲液；反应基质液选自：含有巯基的小分子、多肽或蛋白的溶液；反应终止液选自：盐酸胍、三氯乙酸、硫酸溶液；显色溶液为含有二硫代二硝基苯甲酸的溶液。
优选的，所述试剂盒还包括用于实施检测血清巯基总氧化能力的测定的说明书。
优选的，所述反应缓冲液为含有乙二胺四乙酸的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。
优选的，所述的试剂盒中的反应基质液为二硫苏糖醇溶液。
优选的，所述的试剂盒中的反应终止液为盐酸胍溶液。
上述检测方法中，步骤5)中的反应终止液和步骤6)中的显色液可以同时加入。
本发明的技术方案还涉及所述的试剂盒在检测血清巯基总氧化能力中的应用。优选的，将所述试剂盒应用于比较不同种属及同种属不同个体血清巯基总氧化能力。
本发明的检测方法在检测巯基变化时，呈现出良好的反应时间依赖性和血清体积依赖性，因此可实现对巯基总氧化能力的评估。利用这种检测方法发现，不同种属血清巯基总氧化能力差别大。而同一种属血清在不同个体上也有明显不同，因此这一综合指标可帮助了解机体巯基总氧化能力。
巯基总氧化能力也只能帮助了解机体的巯基氧化能力，作为一个中间结果，基于现有技术和本申请所公开的内容，它与疾病的诊断或健康状况没有直接必然联系。
附图说明
图1健康人血清氧化巯基的时间效应。
图2健康人血清氧化巯基的剂量效应。
图3检测40份健康人样本的血清巯基总氧化能力。
图4检测32份健康小鼠样本的血清巯基总氧化能力。
具体实施方式
现结合附图和实施例，对本发明作详细描述。
本发明的实施例包括使用该试剂盒研究血清氧化巯基的时间效应与剂量效应、检测40份健康人样本的血清巯基总氧化能力和检测32份健康小鼠样本的血清巯基总氧化能力。
本发明试剂盒试剂包括：a)反应缓冲液；b)反应基质液；c)反应终止液；d)显色溶液。其中反应缓冲液选为含有乙二胺四乙酸的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液；反应基质液为二硫苏糖醇溶液；反应终止液为盐酸胍溶液；显色溶液为含有二硫代二硝基苯甲酸的缓冲液。
实施例按照本发明试剂盒操作方法，具体步骤如下：
1)取100μL血清样品放入测定离心管中，保温37℃；
2)取100μL生理盐水放入空白离心管中，保温37℃；
3)分别440μL反应缓冲液，混合均匀，保温37℃；
4)分别60μL反应基质液，混合均匀，启动反应，保温37℃；
5)反应15分钟，立即加入800μL的显色溶液和反应终止液按1：9比例的混合液，终止反应，混合均匀，显色5分钟；
6)30分钟内，用显色溶液和反应终止液的混合液校零，在412nm波长下比色，记录吸光值；
血清硫基总氧化能力的计算公式为：
注：硫代二硝基苯甲酸(TNB)在盐酸胍溶液中的消光系数为13600M-1cm-1
本实施例的结果如下：
我们对健康人血清氧化巯基的时间效应进行了研究。在37℃反应温度条件下，使用15μL血清氧化巯基，并检测反应液中残余的巯基。如图1所示，OD412nm随时间延长线性依赖地减小，其线性相关指数R2达到0.9935，表明血清氧化巯基呈现出良好的时间效应。
我们对血清氧化巯基的剂量效应进行了研究。在37℃反应温度条件下，血清与巯基反应15分钟，使用不同体积的健康人血清氧化反应液中巯基，并检测反应液中残余的巯基。如图2所示，随着血清体积的不断增加，OD412nm不断地减小；当血清体积大于80μL时,OD412nm的减小进入平台期，不再随着血清体积增加而减小。血清体积在40μL以内，随着血清体积增加而减小呈现出线性依赖关系，其线性相关指数R2达到0.9901，表明血清氧化巯基呈现出良好的剂量效应。
我们对40份健康人血清样本的巯基总氧化能力进行检测，如图3所示，血清巯基总氧化能力水平范围从42.38U/mL到142.38U/mL。最大值与最小值的相差了100.00U/mL，其比值为3.36，说明人血清巯基总氧化能力存在个体差异。
我们对32份健康小鼠血清样本的巯基总氧化能力进行检测，如图4所示，血清的巯基总氧化能力水平范围从986.92U/mL到3331.76U/mL。最大值与最小值的相差了2344.84U/mL，其比值为3.38，表明小鼠血清巯基总氧化能力存在个体差异。
如上所述，人血清中巯基总氧化能力范围在42.38-142.38U/mL，中值为92.51U/mL；而小鼠血清中巯基总氧化能力范围则在986.92-3331.76U/mL，中值为2082.61U/mL；依中值小鼠血清巯基总氧化能力是人血清的22.5倍，表明人血清和小鼠血清中巯基总氧化能力有很大差别。另外，我们每个样本或处理均设3个平行，且它们差异较小，没有显著差异，说明本发明血清巯基总氧化能力测定方法稳定性较好。
以上所述仅为本发明的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，获得更好效果。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改/等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。例如可以使用经二硫苏糖醇或β-巯基乙醇还原，再通过透析或脱盐柱脱盐而形成还原型的多肽或蛋白替代二硫苏糖醇作为巯基氧化的底物。
Claims (7)
1.一种血清巯基总氧化能力的检测方法，其特征在于，该方法包括：
1)取一定体积的血清样品放入离心管中，保温；
2)取与1)相同体积的生理盐水放入空白离心管中，保温；
3)分别加入一定量反应缓冲液，混合均匀，保温；
4)分别加入一定量反应基质液，混合均匀，保温反应；
5)分别加入反应终止液，终止反应，混合均匀；
6)分别加入显色溶液；
7)30分钟内，用显色溶液校零，在412nm波长下比色，记录吸光值；
所述反应缓冲液选自：含有乙二胺四乙酸(EDTA)的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液或磷酸盐缓冲液；所述反应基质液选自：含有巯基的小分子、多肽或蛋白的溶液；所述反应终止液选自：盐酸胍、三氯乙酸、硫酸溶液；所述显色溶液为含有二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)的缓冲液，其中，所述步骤4)中保温反应时间为5-60分钟。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述血清来源于人、小鼠、猪、狗、马、牛、羊、兔或者猴。
3.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述反应基质液为二硫苏糖醇(DTT)溶液。
4.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述步骤2)和3)中的保温的温度为35-40℃。
5.如权利要求4所述的检测方法，其中，所述步骤2)和3)中的保温的温度为37℃。
6.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述步骤4)中保温反应时间为10-30分钟。
7.如权利要求6所述的检测方法，其中，所述步骤4)中保温反应时间为15分钟。
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| Gorun等改进的Ellman胆碱酯酶活性测定方法介绍;高希武;《昆虫知识》;19870721(第04期);全文 * |
| Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman"s reagent and with 4,4"-dithiodipyridine;Christian K. Riener, Gerald Kada, Hermann J. Gruber;《Analytical and bioanalytical chemistry》;20020430;全文 * |
| 豆奶蛋白组分和胰蛋白酶抑制剂活性的热变化;黄惠华等;《营养学报》;20010625(第02期);全文 * |
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