CZ30902U1 - Diagnostický proužek pro kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí protilátek proti sarkosinu a nanočástic zlata s peroxidázovou aktivitou nebo kvantových teček - Google Patents

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká kvalitativní a kvantitativní detekce sarkosinu v biologickém vzorku diagnostickým proužkem pomocí protilátek proti sarkosinu značených nanočásticemi zlata s peroxidázovou aktivitou nebo kvantovými tečkami.

Dosavadní stav techniky

Neproteinogenní aminokyselina sarkosin se podílí na metabolismu aminokyselin a metylačníeh ío procesech. Byla provedena studie zabývající se hladinou sarkosinu v moči u pacientů s diagnostikovaným zhoubným nádorem prostaty [11,13-15][8][10][l 6][17][18]. Pro detekci sarkosinu byla popsána enzymatická detekce za využití sarkosin oxidázy [19]. Bylo popsáno použití peroxidu vodíku, tvořícího se při reakci sarkosin oxidázy, z enzymu získaného z Streptomycetaceae při teplotě 25 °C pro enzymatické stanovení sarkosinu a kreatininu [20]. V literatuře bylo popsáno využití N-alkyl glycinů (jejich kyselých amidů) a anhydridů sarkosinu jako účinných látek potlačujících různé typy nádorů [21], Byla popsána také jednotka pro detekci intenzity světla emitovaného z reaktoru spojené s koncentrací sarkosinu. Reaktor byl pokryt vrstvou polymerového filmu, reagenční vrstva byla vytvořena mezi enzymem katalytickou vrstvou a vrstvou polymemí fólie [22]. V literatuře se uvádí detekce sarkosinu pomocí elektroforézy, která zahrnuje přidání roztoku ?o pufru a pyridinium-rutheniového derivátu na kapilární zařízení a vstřikování vzorku do kapiláry s použitím napětí na kapilárních koncích [23]. Pro stanovení mikro koncentrací sarkosinu ve vzorku moče byla použitá kvantitativní enzymatická metoda detekce, za využití peroxidasa katalyzátoru peroxidázy, zahrnující porovnání intenzity fluorescence s koncentrací sarkosinu [24], Kompozice lyzátů byly využité pro extrakce nukleové kyseliny a detekci mikroorganismu, obsa25 hující guanidium chlorid a N-lauroylsarkosinát-sarkosin [25].

V současné době stoupá zájem o zavedení jednoduchého testu na hladinu sarkosinu v moči. Výše popsané analytické techniky, jako je HPLC, mikrofluidní systémy, spektrofotometrie, (GC/MS) jsou citlivé, ale časové náročné a vyžadují komplikovanou přípravu vzorků, na rozdíl od metody ELISA (angl. zkratka enzyme-linked immuno sorbent assay). Tato analytická metoda využívaná ke kvantitativnímu stanovení různých antígenů na základě interakce antigen-protilátka. Zlaté nanočástice (AuNPs) jsou již velmi dlouhou dobu používány jako vhodný nástroj pro molekulámě-biologické experimenty. S rychlým rozvojem nanotechnologií jsou zlaté nanočástice využívány jako jeden z hlavních nosičů biomolekul v nanomedicínských a biosenzorových aplikacích, včetně aplikací v experimentální kardiologii. Je velmi dobře známo, že peroxidázová reakce, která probíhá v nepřeberném množství biochemických přeměn, je široce biotechnologicky využívána. Do popředí zájmu se dostává také LFIA test (LateralFlowlmmunoAnalysis) (LFIA), jehož principem je kombinace chromatografie a imunoafinitních reakcí. Jde o jednoduchý detekční nástroj určený k zjištění přítomnosti analytu ve vzorku bez nutnosti pořizovat jakékoli přístrojové vybavení. Mezinárodní patentová přihláška WO2015119396 například uvádí imunochromatogra40 fický čip, jehož podstatou je tato metoda, využívající katalytické aktivity anorganických nanočástic, kterými je značená specifická protilátka. LFIA proužkový test využívající částice koloidního zlata je například předmětem patentu US2011091906, LFIA pro simultánní detekci několika analytů využívající detekci kvantovými tečkami popisuje patentová přihláška W02006071247.

Dosud však nebyl vyvinut časově nenáročný test uzpůsobený pro rutinní stanovení sarkosinu za použití vybavení běžně dostupného v diagnostických laboratořích dostatečně citlivý pro včasnou diagnostiku zvýšeného množství sarkosinu v těle souvisejícího mimo jiné s nádorovým onemocněním.

Literatura:

1. Gamagedara. S., et al., Validation study of urinary metabolites as potential biomarkers for prostatě cancer detection. Bioanalysis, 2012, 4(10): p. 1175-1183.

_ 1 _

CZ 30902 Ul

2. Goode. R. R., et al., Use of PCA3 in detecting prostatě cancer in initial and repeat prostatě biopsy patients. Prostatě, 2013, 73(1): p. 48-53.

3. Stephan. C., B. Ralla, and K. Jung. Prostate-specific antigen and other sérum and urine markers in prostata cancer. Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews on Cancer, 2014, 1846(1): p.

s 99-112.

4. Vickers. A. J. and H. Lilja. We Need a Better Markér for Prostatě Cancer. How About RenamingPSA? Urology, 2012, 79(2): p. 254-255.

5. Lucarelli. G., et al., Sérum sarcosine increases the accuracy of prostatě cancer detection in patients with total sérum PSA less than 4,0?ng/ml Prostatě, 2012, 72(15): p. 1611-1621.

io 6. Jamaspishvili. T., et al., Urine markers in minitoring for prostatě cancer. Prostatě Cancer and Prostatic Diseases, 2010, 13(1): p. 12-19.

7. Issaq, H. J., T. J. Waybright, and 1 TD. Veenstra. Cancer biomarker discovery: Opportunities andpitfalls in analytical methods. Electrophoresis, 2011, 32(9): p. 967- 975.

8. Gamagedara. S. and Y. Ma. Biomarker analysis for prostatě cancer diagnosis using LC-MS i s and CE-MS. Bioanalysis, 2011, 3(18): p. 2129-2142.

9. Wu. H., et al., GC/MS-based metabolomic approach to validate the role of urinary sarcosine and target biomarkers for human prostatě cancer by microwave-assisted derivatization. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 20 11, 401(2): p. 635-646.

10. Meyer. T. E., et al., A Reproducible and High-Throughput HPLC/ MS Method To Separate 20 Sarcosine from alpha-and beta-Alanine and To Quantify Sarcosine in Human Sérum and Urine.

Analytical Chemistry, 2011, 83(14): p. 5735-5740.

11. Sreekumar. A., et al., Metabolomic proflles delineate potential role for sarcosine in prostatě cancerprogression. Nátuře, 2009, 457(7231): p. 910-914.

12. Masarik. M., et al., Sarcosine as a new markér for prostatě tumours. International Journal of 25 Molecular Medicine, 2010, 266 p. S47-S47.

13. Cemei. N., et al., Sarcosine as a Potential Prostatě Cancer Biomarker-A Review. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(7): p. 13893-13908.

14. Cemei. N., et al., Spectrometric and Elektrochemical Analysis of Sarcosine as a Potenciál Prostatě Carcinoma Markér. International Journal of Electrochemical Science, 2012, 7(5): p.

4286-4301.

15. Khan. A. P., et al., The Role of Sarcosine Metabolism in Prostatě Cancer Progression. Neoplasia, 2013, 15(5): p. 491 -+.

16. Heger. Z., et al., Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET- Based Sarcosine Picomolar Detection. Scientific Reports, 2015, 5.

17. Zítka. O., et al., Microfluidic chip coupled with modified paragmatic particles for sarcosine isolation in urine. Electrophoresis, 2013, 34(18): p. 2639-2647.

18. Zítka. O., et al., Preconcentration based on paramagnetic microparticles for the separation of sarcosine using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with coulometric detection. Journal of Separation Science, 2014, 37(5): p. 465-475.

19. Mayr. U., et al., Hydrogen peroxide-forming sarcosine oxidase US Patent-4743549. MAY 10

1988, 1988, Boehringer Mannheim Gmbh, p. 887.

20. Mayr. U., et al., Method for the determination of sarcosine creatine or creatine US Patent4845029. JULY 4 1989, 1989, Boehringer Mannheim Gmbh, p. 470.

21. Osswald. H. and M. Youssef. Use ofN low-alkyl glycines their acid amides and of sarcosine 45 anhydride as tumor-inhibiting active substances a remedy containing the former and process for

- 7 CZ 30902 Ul its manufacture US Patent-4766149. AUGUST 23 1988, 1988, Stiftung Deutsches Krebsforschungszentrum, p. 1942.

22. Ge. Z., H. Yang, and Y. Zhang. Prostata cancer detection device, has inner wallfixed with catalyzing enzyme layer of reactor, and light intensity detectiig unit to detect light intensity of s light emitted from reactor connected to sarcosine concentration calculation unit. Univ Shenzhen (Uysz-C). p. 5.

23. Li. H. and G. Xu. Detection of sarcosine involves adding buffer solution and pyridiniumruthenium deriváte into capillary electrophoresis device, adding buffer solution and injecting sample into capillary and applying voltage at capillary ends. CHANGCHUN APPLIIED CHEM i o INST CHINESE ACAD (CHAN-Non-standard) CHINESIE ACAD SCI C HIANGCHUN APPL CHIEM INST (CHSC-Non-standard). p. 8.

24. Ge. Z. and H. Yang. Micro sarcisine cantent quantitative-detection method for e, g. urine sample, involves comparing sarcosine cancentration-fluorescense intensity relationship curves to obtain content of unknown sarcosine sample, Univ Shenzhen (Uysz-C). p. 14.

25. Isac. R., et al., Lysis composition, useful in the extraction of nucleic acid and detection of microorganism, coprises guanidium chloride and N-lauroyl-sarcosine, MILLIPORE CORP (MIFI-C) ISAC R (ISAC-Individual) MARC F (MARC-Individual) MILLIPORE CORP (MIFIC) MILLIPORE CORP (MIFI-C) EMD MILLIPORE CORP (MIFI-C). p. 2245157-A1.

Podstata technického řešení

Výše uvedené nedostatky řeší diagnostický proužek pro kvalitativní a kvantitativní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí protilátek proti sarkosinu a nanočástic zlata s peroxidázovou aktivitou nebo pomocí protilátek proti sarkosinu a kvantových teček, kdy mez detekce sarkosinu je 0,05 μΜ až 1,00 μΜ.

Předmětem technického řešení je diagnostický proužek pro stanovení sarkosinu metodou LFIA (LateralFlowImmunoAnalysis) v biologickém vzorku pomocí protilátky proti sarkosinu značené nanočásticemi zlata s peroxidázovou aktivitou nebo značené kvantovými tečkami. V případě testování moče je nutné napřed stanovit množství kreatininu ve vzorku, jehož koncentrace musí být 5 mM až 10 mM, což je známkou ředění vhodného pro spolehlivé provedení stanovení sarkosinu diagnostickým proužkem. Při větším ředění nelze toto stanovení sarkosinu provést. Dia30 gnostický proužek je tvořen tuhou podložkou, obsahující na jednom konci vzorkovou zónu sestávající z jedné zóny skleněných vláken, na které je nanesena zóna skleněných vláken obsahujících primární protilátku proti sarkosinu značenou nanočásticemi zlata nebo značenou kvantovými tečkami a z druhé zóny skleněných vláken nanesených na zónu skleněných vláken obsahujících značenou primární protilátku, přičemž zóna se značenou protilátkou podélně přesahuje obě vrstvy skleněných vláken. Za zónou se značenou protilátkou následuje směrem k druhému konci proužku membrána, na které jev příčném směru k proužku nanesena kontrolní zóna obsahující protilátku proti primární protilátce proti sarkosinu a za ní testovací zóna obsahující sekundární protilátku proti sarkosinu. Za membránou následuje sací zóna tvořící druhý konec proužku.

Diagnostický proužek podle technického řešení má výhodně délku 6,0 cm a šířku 0,5 cm, vzor40 ková zóna, první i druhá zóna skleněných vláken mají délku 2,0 cm. Za vzorkovou zónou následuje zóna se značenou protilátkou délky 0,3 cm, dále membrána délky 2,2 cm s nanesenou kontrolní zónou, za kterou je ve vzdálenosti 5,0 mm nanesena testovací zóna a za membránou následuje sací zóna délky 1,5 cm tvořící druhý konec proužku.

V případě, že skleněná vlákna vzorkové zóny obsahují primární protilátku proti sarkosinu znače45 nou nanočásticemi zlata, nanočástice zlata jsou připravené při 20 °C, 40 °C, 60 °C, 80 °C nebo 100 °C, mají velikost 17 nm až 37 nm a peroxidázovou aktivitu 0,75 až 0,92 mU/ml. Tyto nanočástice se vážou na protilátku proti sarkosinu. Podle výhodného provedení se použijí nanočástice zlata připravené při 20 °C o velikosti 20 nm až 30 nm, přídavek 1 až 10 mM kyseliny zlatíte a 1 až 20 mM hydroxylamin hydrochloridu ve vzájemném poměru 1:1. K detekci je možné použít také kvantových teček, které se vážou na protilátku proti sarkosinu.

- 3 CZ 30902 Ul

Proužek se ponoří do vyvíjecího roztoku s přídavkem vzorku, kde vyvíjecí roztok obsahuje NaCl o koncentraci 0,09 až 0,20 M, KC1 o koncentraci 2 až 5 mM, Na₂HPO₄ o koncentraci 5 až 10 mM, KH₂PO₄ o koncentraci 1 až 3 mM, bovinní sérový albumin o koncentraci 0,2 až 0,8 %, polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurát (Tween20) o koncentraci 0,5 až 2,0 %, přídavek 1 až s 10 mM kyseliny zlatité a 1 až 20 mM hydroxylamin hydrochloridu v poměru 1:1 a za 15 minut se vyhodnotí intenzita zbarvení testovací zóny.

Primární protilátka proti sarkosinu může být v proužku značená též kvantovými tečkami. V tom případě se proužek ponoří do vyvíjecího roztoku s přídavkem vzorku, kde vyvíjecí roztok obsahuje NaCl o koncentraci 0,09 až 0,20 M, KC1 o koncentraci 2 až 5 mM, Na₂HPO4 o koncentraci in 5 až 10 mM, KH₂PO₄ o koncentraci 1 až 3 mM, bovinní sérový albumin o koncentraci 0,2 až

0,8 %, polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurát (Tween20) o koncentraci 0,52 % a přídavek 1 až mM kyseliny zlatité a 1 až 20 mM hydroxylamin hydrochloridu v poměru 1:1 a za 15 minut se vyhodnotí intenzita fluorescence testovací zóny (Obr. 9).

Diagnostický proužek může být proveden na plastové podložce s nitrocelulózovou membránou, i s na které je nanesena kontrolní a testovací zóna. Testovací zóna obsahuje protilátky proti sarkosinu, ale jiné části molekuly než primární protilátka s navázanými zlatými nanočásticemi, která je součástí konjugátu umístěného hned za startem testu, a který putuje proužkem. Kontrolní zóna obsahuje protilátky proti primární sarkosinové protilátce. Testovací a kontrolní linie jsou na nitrocelulózovou membránu nanášeny výhodně s využitím printeru. Konjugát skelných vláken an s ukotvenou protilátkou proti sarkosinu a všechny ostatní zóny se nalepí na plastovou podložku.

Biologickým vzorkem může být například moč, plazma, sérum nebo sperma, u kvantitativního stanovení sarkosinu v moči diagnostickým proužkem je nutné, aby množství kreatininu ve vzorku moče bylo v rozmezí 5 mM až 10 mM.

Objasnění výkresů

Obr. 1. Barevné viditelné změny studovaných nanočástic s 0,2 až 1,0 mM 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidinem (TMB) a H₂O₂. Fotografie ukazuje zleva vždy lahvičku TMB H₂O₂ bez nanočástic, nanočástice zlata (AuNPs) připravené při určité teplotě a poslední lahvička vždy barevnou reakci s částicemi. (A) AuNPs 20 °C, (B) AuNPs 40 °C, (C) AuNPs 60 °C, (D) AuNPs 80 °C, (E) AuNPs 100 °C, (F) kontrolní peroxidázová aktivita 1 mM HRP.

3o Obr. 2:(A) Nanočástice zlata modifikované sarkosinem a jejich vazba na protilátku AntiSar ukotvenou na vhodném nosiči; po vazbě protilátky na sarkosin je využíváno peroxidázové aktivity nanočástic zlata přenášené na vhodné barevné substráty.

(B) Afinita různých typů protilátek AntiSar vazbě Au-sarkosinu (100 μΜ). Aktivita AntiSar 17 byla zvolena jako 100 %; 0,1 AU.

Obr. 3. Závislost peroxidázové aktivity zlatých nanočástic využívající vhodných substrátů (ITMB) na měnící se koncentraci sarkosinu.

(A) na destičce je vázán neznačený sarkosin a k detekci je využito značené protilátky Au-AntiSar 15 (y = 0,001x - 0,0055, R² = 0,9959); (1) na destičce je vázán sarkosin a na to navázána protilátka se zlatou částicí (2), prázdná jamka, do které se dala kyselin a zlatitá (3), v prázdné jamce pouze substrát (4), zlatém značená protilátka (5), vázaný zlatý sarkosin (6). Sledování vazby protilátky na nosiči s peroxidázovou aktivitou. První sloupeček vyjadřuje celkovou získanou peroxidázovou aktivitu, druhý sloupeček vyjadřuje odečet použitých substrátů. Aktivita byla sledována jako změny signálu TMB.

(B) na destičce je vázána neznačená protilátka Anti-Sar 15 a k detekci je využíván zlatý sarkosin;

(y = 0,0004x + 0,0021, R² = 0,9944). Ředění protilátky pro sledování peroxidázové aktivity zlatých nanočástic vázaných na pevném nosiči. Množství protilátky se měnilo, koncentrace sarkosinu (10 μΜ). Aktivita byla sledována jako změny signálu TMB.

(C) Srovnání kalibračních křivek detekce sarkosinu pomocí kompetitivní ELISA metody za použití značeného sarkosinu a sendvičové metody ELISA za použití značené protilátky.

- 4 CZ 30902 Ul (D) Závislost absorbance peroxidázové aktivity na nízké koncentraci sarkosinu. Aktivita byla sledována jako změny signálu TMB. Limit detekce sarkosinu byl 0,05 μΜ.

Obr. 4: Konstrukční schéma proužkového detekčního testu.

(A) Vlevo - detekční proužek s uspořádáním jednotlivých zón B - délka 6,0 cm. A- šířka 0,5 cm. s V - vzorková zóna, délka 2,0 cm. E - zóna ze skleněných vláken obsahující protilátky s nanočásticemi zlata, délka 0,3 cm. D - membrána obsahující kontrolní zónu 2 a testovací zónu 3, délka

2,2 cm; C - sací zóna, délka 1,5 cm; Vpravo - detekční proužek - zboku; uspořádání vrstev vzorkové zóny V. Na lepící desku je umístěn filtr ze skleněných vláken první zóna F1 - následně filtr ze skleněného vlákna (konjugační) - zóna E se značenou protilátkou (Au-AntiSar; QD-AntiSar) io a překryto filtrem ze skleněných vláken - druhá zóna F2. (B). Vlastní testovací systém u moči je uspořádán do podoby D KRE, kde KRE je papírový detekční proužek na kreatinin, D je proužkový test na sarkosin se dvěma liniemi: pozitivní kontrola, testovací zóna; (C) výsledek proužkového detekčního testu využívající agregace zlatých nanočástic, jejich peroxidázové aktivity nebo fluorescence kvantových teček. Homí linie testovací zóny; v detailu níže testovací zóna-nahoře i s před barevnou reakcí, dole po reakci (substráty jsou na povrchu naneseny rovnoměrnou vrstvou).

Obr. 5: Změny intenzity agregace zlatých nanočástic u detekčního proužku v místě vazby AntiSar protilátek (A) vliv pH použitého borátového pufru; (B) vliv použitého detergentu TW; (C) vliv použitého detergentu SDS; vyvíjecí roztok pro maximalizaci odezvy. Koncentrace sarkosinu 10 μΜ, koncentrace Antisar protilátky 1 pg. Průměrná chyba stanovení 12 %.

2o Obr. 6: Detekční proužek pro stanovení množství sarkosinu v pufrovaném prostředí. (A) barevná detekční škála použitá pro vyhodnocení množství sarkosinu vybarvená díky agregaci zlatých nanočástic ./kvantových teček; (B) závislost množství sarkosinu na určené denzitě barevné reakce (KM), v insetu lineární část závislosti (R2 = 0,995); (C) známá množství sarkosinu v testovacích vzorcích v pufrovaném prostředí - šrafovaný graf v porovnání se stanovením koncentrace sarko25 sinu v těchto vzorcích pomocí detekčního proužku, jako aplikované koncentrace.

Obr. 7: Detekční proužek pro stanovení množství sarkosinu v umělé moči (chlorid sodný v koncentraci 100 až 200 mM, chlorid draselný v koncentraci 30 až 80 mM, fosforečnan sodný v koncentraci 10 až 50 mM, močovina v koncentraci 200 až 500 mM, kreatinin v koncentraci 10 až 25 mM, bovinní sérový albumin v koncentraci 600 až 800 μΜ); (A) barevná detekční škála pou30 žitá pro vyhodnocení množství sarkosinu vybarvená díky agregaci zlatých nanočástic/kvantových teček; (B) závislost množství sarkosinu na určené denzitě barevné reakce (KM), v insetu lineární část závislosti (R² = 0,995); (C) známá množství sarkosinu v testovacích vzorcích umělé moči šrafovaný graf, v porovnání se stanovením koncentrace sarkosinu v těchto vzorcích pomocí detekčního proužku, jako aplikované koncentrace. Průměrná chyba stanovení 15 %.

Obr. 8: Detekční proužek pro stanovení množství sarkosinu v moči. (A) barevná detekční škála použitá pro vyhodnocení množství sarkosinu vybarvená díky agregaci zlatých nanočástic: (B) závislost množství sarkosinu na určené denzitě barevné reakce (KM), v insetu lineární část závislosti (R² = 0,995); (C) známá množství sarkosinu v testovacích vzorcích moči - šrafovaný graf v porovnání se stanovením koncentrace sarkosinu v těchto vzorcích pomocí detekčního proužku, jako aplikované koncentrace. Průměrná chyba stanovení 18 %.

Obr. 9: Detekční proužek pro stanovení množství sarkosinu v moči za využití značení kvantovými tečkami. (A) barevná detekční škála použitá pro vyhodnocení množství sarkosinu vybarvená díky fluorescenci kvantových teček; (B) závislost množství sarkosinu na určené denzitě barevné reakce (KM), v insetu lineární část závislosti (R² = 0,9945); (C) aplikace detekčního proužku pro určení množství sarkosinu v testovacím vzorku arteficiální moči - šrafovaný graf v porovnání stanovené a aplikované koncentrace sarkosinu. Průměrná chyba stanovení 10,5 %.

Technické řešení je dále blíže popsáno pomocí příkladů provedení, které však žádným způsobem neomezují jiná možná provedení v rozsahu nároků na ochranu.

CZ 30902 Ul

Příklady uskutečnění technického řešení

Příprava nanočástic zlata, značení protilátek nanočásticemi zlata s peroxidázovou aktivitou

Nanočástice zlata byly připraveny z 0,5 až 3,0 mM roztoku HAuCL». 3H₂O a roztoku citrátu trisodného o koncentraci 0,05 až 0,2 M za stálého míchání po dobu 1 hodiny při 20 °C na magnes tické míchačce (100 rpm) v kádince zakryté hodinovým sklem.

Vznik zlatých nanočástic se projevil pozorovatelnou změnou žlutého zabarvení roztoku na fialové. Dále byly připraveny nanočástice zlata termální syntézou při 40 °C, 60 °C, 80 °C a 100 °C stejným postupem jako při 20 °C. Nej vhodnější pro provedení způsobu podle technického řešení a nej jednodušší pro přípravu jsou částice připravené při 20 °C, jako další vhodné alternativy jsou ni použitelné termálně připravené částice při teplotě 40 °C, 60 °C, 80 °C a 100 °C.

Částice se dále navázaly na protilátky. Do kádinky se napipetoval borátový pufř o pH 8,8 (3 až 6 mM) a za stálého míchání se přidaly zlaté nanočástice (AuNPs). Následně se po malých dávkách přidávaly protilátky o koncentraci 1 mg/ml. Poté se roztok inkuboval 90 minut při 37 °C a za stálého míchání. Po ukončení inkubace se roztok centrifugoval při teplotě 10 °C po dobu i s 15 minut při 13600 x g. Supematant se odpipetoval a k peletům se přidal promývací roztok a opět za stejných podmínek centrifugoval. Tento postup se opakoval s 0,5 ml promývacího roztoku a centrifugoval opět za stejných podmínek. Poté se k peletu přidal skladovací roztok. Takto připravený konjugát se uchovával při 4 °C v temnu.

Získané částice byly charakterizovány dostupnými fyzikálně-chemickými postupy. Získané vý2o sledky jsou shrnuty v Tab. 1. Hodnocení peroxidázové aktivity AuNPs bylo normalizováno na aktivitu křenové (HRP) peroxidázy a substrátu. U všech typů AuNPs byla peroxidázová aktivita v rozmezí 0,75 až 0,92 mU/ml (Obr. 1).

Tab. 1 Základní charakterizace termálně připravených zlatých nanočástic.

Připravené AuNPs při	AuNPs 20°C	AuNPs 40°C	AuNPs 60°C	AuNPs 80°C	AuNPs 100°C
pH	5,1	4,9	5,0	5,0	5,0
Velikost částic [nm]	29	29	37	17	17
Zeta potenciál [mV]	-37,9	-32,0	-32,4	-43,9	-37.3
Absorpční maximum [nm]	531	529	529	529	529

V biologickém experimentu byl hodnocen vliv nanočástic na buněčnou kulturu H9C2. AuNPs byly aplikovány k buněčné kultuře v exponenciální fázi růstu. Na buněčnou kulturu nebyly pozorovány efekty toxicity.

Příprava kvantových teček a jejich konjugace s protilátkou

Kvantové tečky CdTe se připravily smícháním roztoku Cd(CH₃COO)₂ · 2H₂O o koncentraci 0,01 až 0,05 M, destilované vody, roztoku kyseliny merkaptosukcinové (MSA) o koncentraci 0,2 až 0,6 M, roztoku NH₃ o koncentraci 0,5 až 2,0 M, roztoku Na₂TeO₃ o koncentraci 0,01 až 0,04 M a 30 až 50 mg NaBH₄ na magnetické míchačce. Míchání probíhalo alespoň 2 hodiny, dokud se nezastavila tvorba bublin. Následně se objem upravil na 100 ml. Do skleněných vialek se napipetoval připravený roztok, zaklaply se bílým víčkem a zašroubovaly teflonovým. Takto připra35 vené vialky se vložily do mikrovlnky, která se nastavila na výkon 300 W, a záhřev probíhal 3 minuty. Vzniklá barva CdTe částice byla zelená.

Připravené kvantové tečky CdTe se použily ke konjugaci s protilátkou a to tak, že se nejprve vysrážely CdTe pomocí 2-propanolu v poměru 1:1. Následovala centrifugace při 14 000 xg 5 min při laboratorní teplotě. Poté se odpipetoval supematant a k peletu se přidala destilovaná voda.

K tomuto se přidal roztok N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloridu (EDC) o koncentraci 1,5 až 3,5 mM a roztok N-hydroxysuccinimidu (NHS) o koncentraci 3 až 6 mM a metanol. Provedla se inkubace 30 min při laboratorní teplotě. K části tohoto roztoku se přidal roztok protilátek, které byly lOx naředěny. Následovala inkubace minimálně 4 hodiny při s laboratorní teplotě ve tmě. Vzniklý produkt se uchoval při 4 °C.

Příprava diagnostického proužku

Připravil se diagnostický proužek 1 (Obr. 4) z lepící podložky se začleněnou nitrocelulozovou membránou (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Spojené království) o délce B 6,0 cm a šířce A 0,5 cm. Vzorková zóna V měla délku 2,0 cm a byla tvořena třemi vrstvami (na lepící ii) desku se umístil filtr ze skleněných vláken - první zóna F1 délky 2 cm, následně filtr ze skleněných vláken (konjugační) se značenou protilátkou (Au-AntiSar; QD- AntiSar) - zóna E, která byla překryta filtrem ze skleněných vláken o délce 2 cm - druhá zóna F2. Zóna E přesahovala první zónu F1 i druhou F2 podélně o 0,3 cm. Připravené vrstvy vzorkové zóny V se mohou vysušit za laboratorní nebo mírně zvýšené teploty, využitím nízkého tlaku a využitím lyofilizace.

Celá vzorková zóna se překryla inertní páskou, tak aby kapalina do detekčního proužku přicházela pouze laterálně. Na nitrocelulozovou membránu D délky 2,2 cm následující za zónou E se nanesly protilátky do kontrolní zóny 2- protilátka proti protilátce a v 5 mm vzdálenosti od kontrolní zóny 2 protilátka antisar do testovací zóny 3. Těsně za membránu D se do sací zóny C umístil filtrační papír Whatman 1 (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Spojené království)

2o o šířce 0,5 cm a délce 1,5 cm. s ohledem na dlouhodobé použití je vhodné proužek i uchovávat v suchu, temnu, chladu a za snížené koncentrace kyslíku. Z důvodu posouzení vhodnosti navrhovaného testu detekčním proužkem je uspořádání detekčního testu rozšířeno o část pro sledování množství kreatininu (obr. 4 B vpravo). Především v případě testování moče je nutné stanovit ve vzorku nejprve množství kreatininu, které musí být v rozmezí 5 mm až 10 mm, což svědčí ?5 o vhodném ředění vzorku. Při větším ředění nelze toto stanovení sarkosinu provést.

Ke změně zbarvení v testovací zóně 3 dochází díky agregaci (Obr. 4 C) zlatých nanočástic s peroxidázovou aktivitou nebo kvantových teček s fluorescenčními vlastnostmi.

Příklad 9

Stanovení sarkosinu v pufrovaném prostředí a ve vzorku moče

3o Pro testování se použije vzorek čerstvé, nejlépe ranní moče, která musí být promíchána. Nejprve se otestovalo množství kreatininu ve vzorku moče kvůli prověřeni vhodného zředění vzorku pro provedení stanovení sarkosinu. Množství kreatininu se otestovalo pomocí diagnostického proužku (Obr. 48) se vzorkovou zónou, dvěma reakčními zónami, detekční zónou a zónou včelího vosku na základě enzymatického testu využívajícího enzymu kreatinináza, kreatináza a sar35 kosin oxidáza za vzniku peroxidu vodíku, který díky peroxidázové reakci a chromogennímu substrátu vytvoří barevné zbarvení úměrné množství kreatininu ve vzorku. Diagnostický proužek na kreatinin se ponořil vzorkovou zónou do vzorku, který se nechal 15 minut vzlínat, a pak se vyhodnotila intenzita vzniklého zbarvení. Stanovené množství kreatininu ve vzorku bylo v požadovaném rozmezí 5 mM až 10 mM.

Následně se provedlo stanovení sarkosinu ve vzorku pomocí diagnostického proužku připraveného dle postupu uvedeného výše. Proužek I obsahující protilátku značenou nanočásticemi zlata se vzorkovou zónou V ponořil do vyvíjecího roztoku s přídavkem vzorku, kde vyvíjecí roztok obsahoval NaCl o koncentraci 0,09 až 0,20 M, KC1 o koncentraci 2 až 5 mM, Na₂HPO₄ o koncentraci 5 až 10 mM, KH2PO4 o koncentraci 1 až 3 mM, bovinní sérový albumin o koncentraci

0,2 až 0,8 %, polyoxyetlhylen(20)-sorbitan-monolaurát (Tween20) o koncentraci 0,5 až 2,0 % a přídavek 1 až 10 mM kyseliny zlatité a 1 až 20 mM hydroxylamin hydrochloridu v poměru 1:1.

Za 15 minut se vyhodnotil výsledek změřením intenzity zbarvení testovací zóny 3. Zbarvení testovací zóny 3 se naskenovalo a po té vyhodnotilo pomocí programu Qinslab (color test) (Obr. 6 až 8).

- 7 CZ 30902 Ul

Příklad 10

Systém detekčního proužku pro stanovení sarkosinu v různých prostředích

Pro testování se využívá detekční proužek sestavený podle návodu výše. Byly hodnoceny jeho vlastnosti pro analýzu sarkosinu v různých prostředích - v pufrovaném prostředí, umělé moči a vzorku moče (Obr. 5). Pro další zlepšení detekčních vlastností agregace zlatých nanočástic je výhodné využít přídavek kyseliny zlatité (1 až 10 mM.) a hydroxylaminu (1 až 20 mM) ve vyvíjecím roztoku, který obsahuje NaCl o koncentraci 0,09 až 0,20 M, KC1 o koncentraci 2 až 5 mM, Na₂HPO₄ o koncentraci 5 až 10 mM, KH₂PO₄ o koncentraci 1 až 3 mM, bovinní sérový albumin o koncentraci 0,2 až 0,8 %, polyoxyetlhylen(20)-sorbitan-monolaurát (Tween20) o koncentraci κι 0,5 až 2 %.

Průmyslová využitelnost

Test je vhodný pro rutinní stanovení sarkosinu v biologickém vzorku, především moči. Provedení je vhodné pro rutinní stanovení sarkosinu v diagnostických laboratořích. Na základě tohoto testu lze získat informace o hladině sarkosinu v neznámém vzorku s vysokou citlivostí. Stanovení je proveditelné v řádu 2 až 3 hodin za použití vybavení běžně dostupného v těchto laboratořích. Oproti běžným postupům (analýza aminokyselin pomocí kapalinové chromatografie) je doba stanovení výrazně zkrácena a je vyžadována minimální úprava vzorku.

Claims (8)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Diagnostický proužek (1) pro stanovení sarkosinu v biologickém vzorku pomocí protilátky
2. 2o proti sarkosinu značené nanočásticemi zlata s peroxidázovou aktivitou nebo kvantovými tečkami, vyznačující se tím, že je tvořen tuhou podložkou, obsahující na jednom konci vzorkovou zónu (V) sestávající z první zóny (Fl) skleněných vláken, na které je nanesena zóna (E) skleněných vláken obsahujících primární protilátku proti sarkosinu značenou nanočásticemi zlata nebo kvantovými tečkami a z druhé zóny (F2) skleněných vláken nanesených na zónu (E), při25 čemž zóna (E) podélně přesahuje první zónu (Fl) i druhou zónu (F2), za zónou (E) následuje směrem k druhému konci proužku zóna (D), na které je v příčném směru k proužku (1) nanesena kontrolní zóna (2) obsahující protilátku proti primární protilátce proti sarkosinu a testovací zóna (3) obsahující sekundární protilátku proti sarkosinu a za membránou (D) následuje sací zóna (C) tvořící druhý konec proužku.
3. 3o 2. Diagnostický proužek (1) podle nároku 1, vyznačující se tím, že má délku (B) 6,0 cm a šířku (A) 0,5 cm, vzorková zóna (V) má délku 2,0 cm, první zóna (Fl) i druhá zóna (F2) má délku 2,0 cm, zóna (E) má délku 0,3 cm, membrána (D) má délku 2,2 cm a obsahuje nanesenou kontrolní zónu (2), za kterou ve vzdálenosti 5,0 mm následuje testovací zóna (3) a sací zóna (C) má délku 1,5 cm.

   35 3. Diagnostický proužek (1) podle nároků 1 až 2 pro stanovení sarkosinu v biologickém vzorku obsahující v zóně (E) primární protilátku proti sarkosinu značenou nanočásticemi zlata, vyznačující se tím, že nanočástice zlata jsou připravené při 20 °C, 40 °C, 60 °C, 80 °C nebo 100 °C, mají velikost 17 nm až 37 nm a peroxidázovou aktivitu 0,75 mU/ml až 0,92 mU/ml.
4. 4. Diagnostický proužek (1) podle nároku 3, vyznačující se tím, že nanočástice

   40 zlata jsou připravené při 20 °C a mají velikost 20 nm až 30 nm.
5. 5. Vyvíjecí roztok pro stanovení sarkosinu v biologickém vzorku diagnostickým proužkem (1) podle nároků 3 až 4, vyznačující se tím, že obsahuje NaCl o koncentraci 0,09 až 0,20 M, KC1 o koncentraci 2 až 5 mM, Na₂HPO₄ o koncentraci 5 až 10 mM, KH₂PO₄ o koncentraci 1 až 3 mM, bovinní sérový albumin o koncentraci 0,2 až 0,8 %, polyoxyethylen(20)-sorbi-8CZ 30902 Ul tan-monolaurát o koncentraci 0,5 až 2 % a přídavek 1 až 10 mM kyseliny zlatíte a 1 až 20 mM hydroxylamin hydrochloridu v poměru 1:1.
6. 6. Vyvíjecí roztok pro stanovení sarkosinu v biologickém vzorku diagnostickým proužkem (1) podle nároků 1 až 2 obsahujícím v zóně (E) primární protilátku proti sarkosinu značenou s kvantovými tečkami, vyznačující se tím, že obsahuje NaCl o koncentraci 0,09 až

   0,20 M, KC1 o koncentraci 2 až 5 mM, Na₂HPO₄ o koncentraci 5 až 10 mM, KH₂PO₄ o koncentraci 1 až 3 mM, bovinní sérový albumin o koncentraci 0,2 až 0,8 %, polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurát o koncentraci 0,5 až 2 %, přídavek 1 až 10 mM kyseliny zlatité a 1 až 20 mM hydroxylamin hydrochloridu v poměru 1:1.

   o
7. 7. Diagnostický proužek (1) podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že biologickým vzorkem je moč s obsahem kreatininu 5 mM až 10 mM.
8. 8. Diagnostický proužek (1) podle nároků laž4, vyznačující se tím, že biologickým vzorkem je plazma, sérum nebo sperma.