CZ302293B6

CZ302293B6 - Prirozené brassinosteroidy pro použití pri lécení hyperproliferace, lécení proliferativních onemocnení a redukci nepríznivých úcinku steroidních dysfunkcí u savcu, farmaceutické prostredky je obsahující a jejich použití

Info

Publication number: CZ302293B6
Application number: CZ20070571A
Authority: CZ
Inventors: Swaczynová@Jana; Hoffmanová@Lucie; Steigerová@Jana; Kohout@Ladislav; Kolár@Zdenek; Strnad@Miroslav
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v. v. i.; Universita Palackého
Priority date: 2007-08-22
Filing date: 2007-08-22
Publication date: 2011-02-09
Also published as: US20100204460A1; WO2009024103A3; EP2222690A2; WO2009024103A2; IL204194A0; CZ2007571A3

Abstract

Predložené rešení se týká prirozených brassinosteroidu a jejich derivátu a farmaceutických prostredku je obsahující pro použití pri lécení savcích bunek, ruzných stavu snížení rustu nebo úplné inhibici proliferacní kapacity bunek. Rešení také zahrnuje zastavení bunecného cyklu pomocí prirozených brassinosteroidu vedoucích k apoptickým zmenám v nádorových bunkách.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká brassmosteroidů ajejich derivátů pro použití při léčení hypeproliferace savčích buněk, léčení proliferativních onemocnění u savců a regulaci nepříznivých efektů steroidních dysfunkcí u savčích buněk u savců. Vynález rovněž zahrnuje použití přirozených brassinosteroidů ajejich derivátů v protinádorové terapii.

Dosavadní stav techniky

Tento vynález se týká přirozených brassmosteroidů, farmaceutických přípravků tyto sloučeniny a jejich využití, především v protinádorové terapii.

Brassinosteroidy jsou rostlinné hormony steroidní povahy s důležitými regulačními funkcemi ve fyziologických procesech zahrnujících růst, diferenciaci a prodlužování kořene i stonku, rezistenci vůči chorobám a odolnost rostlin vůči stresu a senescenci (Bajguz a spol., Phytochemistry 2003, 62, 1027 až 1046). Tato skupina rostlinných steroidů zahrnuje více než 70 sloučenin vyskytujících se od nižších po vyšší rostliny. Byly objeveny a izolovány ze semen, plodů, listů, hálek a pylu (Sasse J., v Brassinosteroids: Steroidal Plant Hormones; Springer-Verlag, Tokyo, 1999; str. 219 až 262; Khripach a spol., A new class of Plant Hormones, Academie Press; San Diego, 1999, str. 456). Brassinosteroidy jsou strukturně velmi podobné živočišným steroidním hormonům. Stejně jako jejich živočišná analoga regulují expresi Četných genů, ovlivňují aktivitu komplexních metabolických drah a přispívají k regulaci dělení a diferenciaci buněk. Jsou rovněž zapojeny v regulaci fotomorfogeneze a buněčného růstu (Clouse, Current Biol. 2002, 12, 485 až 487). Právě vysoká biologická aktivita brassmosteroidů přilákala pozornost řady specialistů z oblasti chemie, biologie, farmakologie a zemědělství.

Brassinosteroid (1), brassinosteroid s nej vyšší biologickou aktivitou, byl poprvé izolován v roce 1979 z pylu řepky (Brassica napus) (Grove a spol., Nature 1979, 281, 216 až 217). Do dnešní doby byl brassinolid vzorce 1 identifikován ve všech dosud studovaných rostlinných druzích (Bajguz a spol., Phytochemistry 2003, 62, 1027 až 1046; Zullo a spol., Braz. J. Plant Physiol. 2002, 14, 143 až 181). Brassinolid (1) je přítomný v rostlinných pletivech ve velmi nízkých koncentracích (pmol/g čerstvé váhy) a jeho syntéza je velmi obtížně realizovatelná. Z tohoto důvodu je současný výzkum zaměřen převážně na vývoj stejně účinných ale snadněji dostupných sloučenin. Některé ze synteticky připravených brassmosteroidů byly později nalezeny i v přírodě (Soeno a spol., Biosc. Biotechnol. Biochem. 2000, 64, 702 až 709). Příklad takové sloučeniny, která je poměrně snadno synteticky dostupná v porovnání s brassinolidem, je jeho 24—epimer, 24-epibrassinolid (vzorce 6) (Back a spol., J. Org. Chem. 1997, 62, 1179 až 1182). Tento brassinosteroid je proto nej studovanější sloučeninou a je nejlepším kandidátem pro praktické využití.

Prozatím byly popsány značně protikladné účinky brassinosteroidů na buněčné dělení u různých rostlinných druhů a kultivovaných buněčných linií. Účinek brassinosteroidů na buněčné dělení byl prokázán jako převážně podpůrný. Dosud byly popsány stimulační účinky. Nahrazují účinky cytokininů (brassinosteroidy a cytokininy indukují expresi genu cycD3) a podporují buněčné dělení v průběhu Časných fází růstu buněčných kultur, což naznačuje, že brassinosteroidy jsou limitujícím faktorem indukce buněčného cyklu (Hu a spol., Plant. J. 2000, 24, 693 až 701, Miyazawa a spol. J. Exp. Bot. 2003, 54, 2669 až 2678).

V dnešní době jsou již také známy některé léčebné aplikace brassinosteroidů. Wachsman a spol. (Antivir, Chem. Chemother. 2000, 11, 71 až 77; Chemother. 2002, 13, 61-66) popsal in vitro

- 1 CZ 302293 B6 antivirální účinek některých přirozených brassinosteroidů (28-homokastasteronu - 9, 28-homobrassinotidu - 2) a jejich syntetických analog proti několika patogenním virům, např. herpes simplex viru typu 1 (HSV-1), arenaviru a spalničkovému viru (MV). Některá analoga brassinolidu mají 10 až 18krát vyšší účinek než ribavirin (používaný jako srovnávací lék) pro HSV-1 a arena5 viry. Jsou však nutné ještě další studie k přesnému popisu antivirálního mechanismu účinku těchto brassinosteroidů in vitro a korelaci vztahů molekulární struktury a bioaktivity. Franěk a spol. (Franěk a spol., Coli. Czech Chem, Commun. 2003, 68, 2190 až 2200) popsali možný účinek 24-epibrassinolidu (6) na kultivované buňky myšího hybridomu. Typické účinky látky 6 byly: a) nárůst hodnoty mitochondriálního membránového potenciálu, b) snížení intracelulamího io množství protilátek, c) nárůst počtu buněk v Go/Gi fázi buněčného cyklu a d) vice versa snížení počtu buněk v S-fázi. Kromě toho byla hustota živých buněk významně vyšší po aplikaci 24epibrassinolidu v rozmezí koncentrací 10¹³ až 10¹²M (Franěk a spol., Coli. Czech Chem.

Commun. 2003,68, 2190 až 2200). Tedy znovu stimulační účinky.

Zjistili jsme, že řada přirozených brassinosteroidů efektivně inhibuje růst mnoha různých nádorových buněčných linií v mikromolámích koncentracích, přestože mají minimální účinek na normální buňky. Antiproliferační aktivita může alespoň částečně souviset s interakcemi se steroidními receptory. Brassinosteroidy jsou zcela novou skupinou látek, u kterých dosud není zcela objasněn mechanismus jejich účinku na molekulární úrovni. Prokázali jsme však, že aplikace brassinosteroidů indukuje cytotoxicitu a způsobuje ínhibici růstu buněk karcinomu prsu a prostaty. Proto mohou být použity jako antimitotické a apoptické léky, především v protinádorové terapii.

Podstatou tohoto vynálezu jsou antiproliferativní sloučeniny na bázi přirozených brassinosteroi25 dů, které mají vysoký index selektivity a efektivity, tzn. jsou méně toxické avšak účinnější než dříve známá analoga.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I

v němž

R znamená CH₂ nebo O-CH₂ skupinu,

R² znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

R³ znamená hydroxyl,

R²⁴ znamená atom vodíku, alkyl nebo alkenyl vybrané ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, 40 propyl, isopropyl, methylen, ethylen a propylen, a

R²⁵ znamená atom vodíku, alkyl vybraný ze skupiny zahrnující methyl a ethyl,----znamená jednoduchou nebo dvojnou vazbu a jejich farmaceuticky použitelné soli,

-2CZ 302293 B6 pro výrobu léčiva pro selektivní léčení hyperproliferace nádorových savčích buněk bez cytotoxického působení na nenádorové buňky organismu.

Vynález zahrnuje přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I a jejich použití k výrobě léčiva pro selektivní inhibici buněčné hyperproliferace a indukci apoptózy.

Předmětem vynálezu jsou rovněž přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I pro použití při výrobě léčiva k selektivnímu léčení hyperproliferace a indukce apoptózy u savčích buněk, kdy se podává terapeuticky účinné množství uvedených brassinosteroidů obecného vzorce I nebo jejich (0 farmaceuticky použitelné soli. Přirozené brassinosteroidy jsou pak využitelné zejména pro použití při léčení onemocnění, z nichž některé zahrnují buněčnou proliferaci a mezi které patří nádory, Alzheimerova choroba, Huntingtonova choroba, steroidy-indukovaná osteoporóza, poruchy sexuální diferenciace, hyperadrenokorticismus asociovaný s přebytkem sexuálních steroidů, androgen insenzitivní syndrom, glukokortikoid— insenzitivní astma, steroidy-indukovaná kata15 rakta a deficience P450 oxidoreduktázy.

Předmětem vynálezu je rovněž použití přirozených brassinosteroidů obecného vzorce I k výrobě léčiva, použitelného jako růstový regulátor při selektivní regulaci hyperproliferace a morfogeneze živočišných a lidských buněk v tkáňových kulturách.

Vynález rovněž zahrnuje deriváty brassinosteroidů ve formě volné sloučeniny obecného vzorce I nebo ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Farmaceuticky přijatelná sůl může být sůl takovéto sloučeniny s alkalickým kovem, amoniakem či aminem ve formě racemátu nebo opticky aktivního izomer u, nebo jeho adiční sůl s kyselinou, včetně pomocných látek.

Předmětem vynálezu jsou dále brassinosteroidy nebo jejich deriváty pro použití pro výrobu léčiva k selektivnímu léčení hyperproliferativních onemocnění savčích buněk, zahrnujícímu aplikaci efektivního množství přirozených brassinosteroidů nebo jejich derivátů k ošetření savčích buněk.

Podrobný popis vynálezu

Předmětem vynálezu jsou přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I

v němž

R znamená CH₂ nebo O-CH₂ skupinu,

R² znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

R³ znamená hydroxyl,

R²⁴ znamená atom vodíku, alkyl nebo alkenyl vybrané ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, methylen, ethylen a propylen, a

R²⁵ znamená atom vodíku, alkyl vybraný ze skupiny zahrnující methyl a ethyl,----znamená jednoduchou nebo dvojnou vazbu

-3 CZ 302293 B6 ajejich farmaceuticky využitelné soli, pro výrobu léčiva pro selektivní léčení hyperproliferace nádorových savčích buněk bez cytotoxického působení na nenádorové buňky organismu.

Výše uvedené dosud nevymezené generické skupiny mají významy uvedené v následující legendě, přičemž alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, alkenyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové io atomy, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methylen, ethylen, propylen, isopropylen, vodík znamená H a hydroxyl znamená skupinu -OH.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou přirozené brassinosteroidy shora uvedeného obec15 něho vzorce I zahrnující sloučeniny 1 až 38

-4CZ 302293 B6

24-EpJ kasta steron

28-HomobrasainolFd

2-DeoKybrasslnolld

2$-MethyÍkastasteron

3-Epikastasteron

p-Hydroxykastasteron

2,3-Diepi-25-niethyl‘ dolichosteron

3Έρ i-1 α-hydro xykasta· teron

28-HomotyfMtarof

28-Homoteasteron

2-Epl-25-methyidolichosteron

2-Oeoxy-2$- methyl· dolichosteron

-5CZ 302293 B6

yEpl-a-<l«9My.2S*m»Wyl* «4>Mxyfcutasflmii dollchoettron

6*Otexytfoll«lK»|won

6*0«HtD»2&*nor* kMttttoron

C-Deoxo-24-epl· kastasteron

6*Deoxo*2&»ffi6thyldolehosteran

3-Epkt-daaxokastasteron e-Osovrtyfasterol

G-Oeoxote«steroo

GO*oxO-2*-homoóoHchotteron ajejich farmaceuticky přijatelné soli.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující kastasteron, 28-homokastasteron, 24—epibrassinolid, dolichosteron, typhasterol, teasteron, 6—deoxotyphasterol, homotyphasterol, homoteasteron, homodolichosteron, 25-methylkastasteron, 25-methyldolichosteron, 2-deoxy-25-methyldolichosteron a 3-epi-2-deoxy-25-methyldolichosteron.

Terapeutická aplikace

Vhodné cesty pro aplikaci jsou orální, rektální, místní (zahrnující okulámí, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (zahrnující subkutánní, intramuskulámí, intravitreózní, nitrožilní, intradermální, intrathekální a epidurální). Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, a dalších faktorech známých klinickému odborníkovi.

Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují s výhodou od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují s výhodou od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 do 1,0 g aktivní látky.

Farmaceutické přípravky tohoto vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy.

S výhodou jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, zvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizováných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem, jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují látky neutrální povahy, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, rozpoustěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku anebo pufiy. Jsou připravovány známým způsobem, např, běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat

-6CZ 302293 B6 látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.

Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být použity, jsou zvláště kapalné estery mastných kyselin, které jako kyselou složku obsahují mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem s 8 až 22, s výhodou s 12 až 22 atomy uhlíku, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-terf-butyl-4_ hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a znamená alkohol s jednou nebo více hydroxylovými skupinami, např. s jednou, dvěma nebo třemi, jako je methanol, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich izomer y, s výhodou glykol a glycerol.

Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl-oleát, isopropyl-myristát, isopropyl-palmitát, „Labrafil M 2375“ (trioleát polyoxyethylenglycerolu, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cg až Cn od Híils AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje, jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sojový olej a olej z podzemnice olejně.

Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.

Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více pevnými nosiči, případnou granulací výsledné směsi a, pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.

Vhodné nosiče jsou zvláště plnidla jako cukry, např. laktóza, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulózové preparáty anebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá, jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy a polyvinylpyrrolidin a, pokud požadováno, desintegrátory, jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylovaný škrob, zesíťovaný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další použitelné neutrální látky jsou regulátory toku a mazadla, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli, jako stearát horečnatý nebo vápenatý, potyethylenglykol nebo jeho deriváty.

Jádra potahovaných tablet mohou být vybavena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používaný potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, potyethylenglykol a nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulózových preparátů, jako ftalát acetylcelulózy nebo ftalát hydroxypropylmethylcelulózu. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávána do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla, jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly, jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo mazadly, jako talek nebo stearát horečnatý, a se stabilizátory,

-7CZ 302293 B6

V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy, jako je mazací tuk, parafinový olej nebo kapalný polyethylen glykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylenglykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty, např. typu esterů polyethylensorbitanových mastných kyselin.

Ostatní formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, s výhodou okolo 10% nebo podobných koncentrací, které umožňují vhodnou individuální dávku, např. když se odměřuje 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.

Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafinové uhlovodíky, polyethylenglykoly nebo vyšší alkoholy.

Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol nebo dextran, a stabilizátory tam, kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofilizátu společně s neutrálními látkami, kde je to vhodné, a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. pro infuzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty, jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy, jako je kyselina sorbová či benzoová.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafíny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny, jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetylalkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin, pro zlepšení schopnosti vázat vodu. Emulgátory jsou odpovídající lipofílní sloučeniny, jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou oleát sorbitanu nebo isostearát sorbitanu. Přísady k vodné fázi jsou např. smáČedla, jako polyalkoholy, např. glycerol, propylenglykol, sorbitol a polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako základ hlavně uhlovodíky, např. parafín, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricinový olej nebo podzemnicový olej, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. mono- a distearát glycerolu. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a přísady zmíněné v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, např. isopropyl-myristát, lanolin, včelí vosk nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolatum) a parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxyadukty, např. póly gly cerických mastných kyselin nebo polyethylen-sorbitanové estery Či kyselé estery polyglycerických mastných kyselin (Tween), dále polyoxy ethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxy ethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako jsou alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl-stearyl-alkoholu nebo stearylalkoholu. Přísady k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy, jako glycerol, sorbitol, propylenglykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.

-8CZ 302293 B6

Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či křemičitany hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.

Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlorfluor(nižší)alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N₂O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jak shora uvedeno pro masti a také jsou používány přísady tam uvedené.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolický základ, ke kterému jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a polyethylenglykol, dále mazadla, jako jsou estery mastných kyselin a nižších polyethylenglykolů, tj. lipofílní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem a, pokud je to nutné, i ostatní neutrální látky a přísady.

Tento patent dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku. Mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.

Vynález se týká také postupu a způsobu léčení nemocí uvedených výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství, které je účinné proti uvedeným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 50 g, s výhodou 0,5 až 10 g.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje inhíbiční účinek 28-homokastasteronu (28-homoCS; 9; A) a 24-epibrassinolidu (24-epiBL; 6; B) na buněčnou viabilitu u nádorových linií RPMI-8226 a CEM. Data reprezentují výsledky ze 3 nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka.

Obr. 2 znázorňuje vliv 28-homoCS (9; A) a 24-epiBL (6; B) na viabilitu buněčné linie MCF-7 odvozené od karcinomu mléčné žlázy sledovaný na základě MTT testu buněčné viability. Hodnoty vyjádřené v procentech jsou vztaženy ke kontrolním buňkám. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů prováděných v triplikátech, z nichž byla určena směrodatná odchylka. * představuje hodnoty p < 0,05 významně odlišné od kontroly.

Obr. 3 znázorňuje výsledky analýzy buněčného cyklu u linie MDA-MB-468 odvozené od karcinomu mléčné žlázy pomocí průtokové cytometrie. A) - kontrolní neošetřené buňky; B) - buňky ošetřené 28-homoCS; C) - buňky ošetřené 24-epiBL. Oblast Mi reprezentuje buňky v G_b S, a G₂/M fázi buněčného cyklu a oblast M₂ představuje apoptické buňky s redukovaným obsahem DNA (subGl frakce buněčného cyklu). V pokusu byly srovnávány histogramy neošetrených kontrolních buněk s histogramy buněk ošetřených testovanými brassinosteroidy, přičemž horizontální osa představuje relativní množství jaderné DNA a vertikální osa vyjadřuje počet buněk.

Obr. 4 znázorňuje Western blot analýzu proteinů (p53, MDM-2, pl6, p21, p27, cyklin Di, pRbP) uplatňujících se při regulaci buněčného cyklu u rnammámích (A) a prostatických (B) nádorových linií. Exprese proteinů u buněk ošetřených 28-homokastasteronem (9) (28-homoCS 6; 28homoCS 12; 28-homoCS 24) a 24-epibrassinolidem (6) (24-epiBL 6; 24-epiBL 12; 24-epiBL 24) v koncentraci IC₅₀ po dobu 6, 12 a 24 hodin byla porovnávána s proteinovou expresí neošet-9CZ 302293 B6 řených kontrolních buněk(C 6 - kontrola, 6 h; C 12 - kontrola, 12 h; C 24 - kontrola, 24 h). Exprese proteinů mcm-7 nebo a-tubulinu byla použita jako vnitřní kontrola množství proteinů vzorku.

Obr. 5 znázorňuje detekci zlomů v jádrech apoptických buněk metodou TUNEL u prostatických nádorových buněk LNCaP po jejich ošetření 28-homoCS nebo 24-epiBL v koncentraci IC₅o po dobu 24 hodin vzhledem ke kontrolním neošetřeným buňkám.

Obr. 6 reprezentuje výsledky Western blot analýzy zaměřené na expresí proteinů (Bcl-2, Bc1-Xl, io Bax, Bid, kaspázy-3) zapojených do regulace apoptózy u mammámích (A) a prostatických (B) nádorových linií. Exprese proteinů u buněk ošetřených 28-homokastasteronem (9) (28-homoCS

6; 28-homoCS 12; 28-homoCS 24) a 24-epibrassinolídem (6) (24-epiBL 6; 24-epiBL 12; 24epiBL 24) v koncentraci IC₅₀ po dobu 6, 12 a 24 hodin byla porovnávána s proteinovou expresí neošetřených kontrolních buněk(C 6 - kontrola, 6 h; C 12 - kontrola, 12 h; C 24 - kontrola,

24 h). Exprese proteinů mcm-7 nebo α-tubulinu byla použita jako vnitřní kontrola množství proteinů vzorku.

Následující příklady slouží pouze pro ilustraci použití brassinosteroidů, aniž by se tím jakkoliv omezoval tento vynález.

Příklady provedení vynálezu

Obecný postup

Zásobní roztoky testovaných látek (10 pmol/l) byly připraveny rozpuštěním ekvivalentního množství látky v dimethylsulfoxidu. Kultivační média (DMEM, RPMI 1640, F-12), fetální telecí sérum, L-glutamin, penicilín a streptomycin byly zakoupeny u firmy Sigma (MO, USA), 3-(4,5dimethylthÍazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid (MTT) u firmy Serva Electrophoresis (Heidelberg, Germany) a Calcein AM u firmy PAA Laboratories GmbH (Paschíng, Austria). Myší monoklonální protilátka proti bromdeoxyuridinu (BrdU) byla získána od firmy DakoCytomation (Glostrup, Denmark). Calcein AM byl získán od PAA Laboratories GmbH (Rakousko). Všechny použité buněčné linie (T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, buněčné linie odvozené od karcinomu mléčné žlázy MCF-7 (estrogen-senzitivní) a MDA-MB35 468 (estrogen-nesenzitivní), buněčné linie LNCaP (androgen-senzitivní) a DU-145 (androgennesenzitivní) odvozené od karcinomu prostaty, buněčná linie plicního adenokarcinomu (A 549), lidská erythroleukemie K562, buňky lidského mnohočetného myelomu RPMI 8226, buňky cervikálního karcinomu HELA, buňky G361 lidského maligního melanomu, buněčná linie plicního adenokarcinomu (A 549), buněčná linie lidského osteosarkomu (HOS) a normální lidské fibro40 blasty (BJ) byly získány z registru American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA. Buňky linie MCF7 byly pěstovány v F-12 médiu (Sigma, MO, USA). LNCaP byly kultivovány v médiu RPMI 1640 (GIBCO, USA). Všechny ostatní buňky byly kultivovány v DMEM kultivačním médiu (Sigma, MO, USA). Všechny používaná média byla doplněna 10 % tepelně Zaktivovaného fetálního telecího séra, 2 mmol/L L-glutaminu, 1 % penicilin/streptomycinu. Buněč45 né linie byly udržovány ve standardních kultivačních podmínkách při 37 °C, v atmosféře 5 % CO₂ a vlhké atmosféře. Buněčné linie byly pasázovány standardní trypsinizační procedurou (Sigma, USA) dvakrát až třikrát týdně.

Příklad 1

Testování in vitro účinků na buněčnou viabiiitu

Buněčná suspenze o koncentraci přibližně 1,25 x 10⁵ buněk/ml byla přenesena do 96-jamkových 55 mikrotitračních destiček a po 12h stabilizaci byly přidány testované brassinosteroidy o různé

- 10CZ 302293 B6 koncentraci. Brassinosteroidy byly rozpuštěny v DMSO. Kontrolní buňky byly ošetřeny pouze pomocí DMSO. Finální koncentrace DMSO nepřesáhla v reakčním prostředí 1 %. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20μ1 alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny vyhodnocovaly v šesti koncentracích v čtyřnásobné ředicí řadě. Při rutinním testování byla nej vyšší koncentrace v jamce 50μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 96 hodin při 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře CO₂. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (OD) byla měřena pomocí Fluoroscan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (IC₅₀) bylo io spočítáno podle následujícího vztahu: IC₅₀ = (OD_jamky s^vem/střední j_nmky) x 100 (v %).

Každá sloučenina byla testována ve třech pokusech, test byl opakován alespoň třikrát. Hodnota IC₅₀, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných křivek závislosti na dávce.

Byl sledován vliv brassinosteroidů na životaschopnost normálních a rakovinových buněčných linií rozdílného histopathologického původu. Lidská T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, buněčná linie plicního adenokarcinomu A 549, lidská erythroleukemie K562, buněčná linie odvozená od mnohočetného myelomu RPMI 8226, buňky cervikálního karcinomu HeLa, buňky G361 lidského maligního melanomu, buněčná linie lidského osteosarkomu HOS a normální lidské fíbroblasty BJ byly použity pro rutinní screening cytotoxických vlastností brassinosteroidů a jim příbuzných steroidů. Buňky byly vystaveny 6 koncentracím ve čtyřnásobných ředicích řadách pro každou látku po dobu 72 h pro určení množství přeživších buněk. Hodnoty IC₅₀ získané pomocí Calcein AM testu jsou prezentovány v tabulce č. 1.

Tabulka 1

IC₅o (pmol/l) hodnocené pomocí Calcein AM testu přežívajících buněk. Data reprezentují průměr ± SD ze 3 nezávislých experimentů prováděných v triplikátech, z nichž byla určena směrodatná odchylka.

Brassinosteroidy i.	Sloučenina	Buněčné linie	BJ
(IC_M; gmoVl)	CEM	RPMI 8226	G361
	Cholesterol	>50	38 ± 2,9	>50	>50
	β-Ekdyson	>50	>50	>50	>50
	5a-Cholestan	>50	>50	>50	>50
	Brasicasterol	>50	>50	>50	>50
	Stigmasterol	>50	32 ±0,6	>50	>50
	Sitosterol	>50	32 x 1,6	>50	>50
1	Brassinolid	>50	>50	>50	>50
2	28-Homobrassinolid	48 ± 1,3	>50	>50	>50
	22S.23S-28- Homobrassinolíd	35 ±2.2	31 ±7,3	>50	>50
6	24-Epibrassinolid	44 ± 2,2	>50	>50	>50
	22S.23S-24-	>50	>50	>50	>50

- 11 CZ 302293 B6

Epíbrassinolid
8	Kastasteron	16 ±5.3	33 ± 1,3	>50	>50
9	28-Homokastasteron	13 ±2.8	26* 1,4	>50	>50
	22S.23S-28- Homokastasteron	24 ± 1.5	25 ± 4.7	45 ± 2.2	>50
16	24-Ep i kastasteron	>50	>50	>50	>50
	22S.23S-24- Epikastasteron	49 ± 1,8	>50	>50	>50

Ošetření sloučeninami 9 a 6 mělo za následek na dávce závislé snížení životaschopnosti buněk linií CEM a RPMI 8226, ačkoliv na různé úrovni (Obr. 1). Látka 9 byla nejúčinnější na buněčné linii CEM (IC50: 13 pmol/l, zatímco její 22S,23S-izomer byl nejúčinnější na nádorové linii RPMI 8226 (ICjo: 25 pmol/l). Navíc byla pozorována i zvýšená aktivita po aplikaci kastasteronu a jeho SS-homologu. Brassinolid (1), který je obvykle nejúčinnější brassinosteroid v rostlinných biotestech, nebyl protinádorově aktivní nebo prokazoval téměř nulovou cytotoxickou aktivitu, zatímco synteticky připravený analog 22S,23S-28-homobrassinolid vykazoval protinádorovou io aktivitu v rozmezí IC₅₀: 31-35 pmol/l. Nebrassinosteroidní rostlinné steroly, jako cholesterol, stigmasterol, brassicasterol, 5a-cholestan, β-ekdyson a β-sitosterol, byly v rozmezí testovaných koncentrací (až k 50 pmol/l) neúčinné; cholesterol, stigmasterol a β-sitosterol vykazovaly minimální protinádorovou aktivitu (IC₅₀ > 30 gmol/l) pouze na linii RPMI 8226. Na buněčných liniích K 562, A 549, HeLa a HOS byly všechny testované sloučeniny neaktivní. Překvapujícím zjištěním bylo, že nemaligní buněčná linie, lidské fibroblasty BJ, byla vůči protinádorovému působení brassinosteroídů rezistentní. Tyto výsledky naznačují rozdílnou odpověď v působení steroídů na nádorové a nenádorové buněčné linie. Do dnešní doby je známo jen několik přírodních látek, které by selektivně působily pouze na nádorové buňky bez ošetření buněk normálních. Tato studie také přinesla první důkaz brassinosteroídů jako protirakovinových sloučenin s anti20 proliferačními vlastnostmi. Doposud je znám pouze pozitivní efekt sloučeniny 6 na růst myších hybridomových linií v rozmezí koncentrací IO“¹² až I0“¹³ mol/1.

Jak vyplývá ze studia vztahů mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou, mezi protinádorové nejaktivnější brassinosteroidy patří látka 9, Změna skupiny 6-oxo-7—oxalakton na funkční skupinu 6-oxo vede k výraznému zvýšení růstové inhibiční aktivity. Proto je sloučenina 9 asi 3krát účinnější než 28-homobrassinoIid 2. Flexibilnější konformace v poloze 24R na postranním řetězci u 24-ep i kastasteronu (13) při srovnání s kastasteronem (8), jak vyplývá ze studií NMR, je kritickou vlastností pro snížení protinádorových účinků. Konformace 24R na postranním řetězci je také rozhodující pro snížení protinádorově aktivity brassinosteroídů. Ethylová skupina na uhlí30 ku C24 na postranním řetězci u 9 a 2 je poněkud efektivnější než odpovídající analogy s methylovou skupinou na C24. Z minimální inhibiční aktivity β-ekdysonu obsahujícího 2β,3β,22αfunkční uspořádání lze usoudit, že 3a-hydroxylová skupina, 2a,3a-vicinální dioly nebo 3 α,4avicinální dioly budou důležité pro protinádorovou aktivitu brassinosteroídů.

Příklad 2

Vliv nových sloučenin na mammámí a prostatické nádorové linie

Nejsnadnější a snadno dostupné brassinosteroidní analogy se zajímavými antiproliferačními účinky byly vybrány k dalším experimentům na buněčných linií MCF 7 (estrogen-senzitivní) a MDA-MB-468 (estrogen-nesenzitivní) odvozených od karcinomu mléčné žlázy a u buněčných linií LNCaP (androgen-senzitivní) a DU-145 (androgen-nesenzítivní) odvozených od karcinomu prostaty.

-12CZ 302293 B6

Karcinom prostaty u lidí představuje mnohastupňový proces, který je zpočátku u většiny nádorů prostaty závislý na androgenech a většina pacientů úspěšně odpovídá na terapeutickou androgenní blokádu. U části nemocných nádory po určité době mohou přecházet do stádia růstu na androgenech nezávislého. Tyto androgen-independentní nádory prostaty jsou potom rezistentní na konvenční terapii. Zatímco androgen-dependentní nádorové buňky podléhají během androgenové ablace apoptické buněčné smrti, androgen-independentní buňky mají schopnost obejít apoptické dráhy během androgenové deprivace, aniž by došlo k narušení této dráhy. Vývoj a progrese karcinomu prostaty souvisí s akumulací změn genů podílejících se na udržení normální buněčné proliferace a homeostázy. Podobný model hormonální responsibility představují estrogen-senzitivní nebo estrogen-nesenzitivní nádory mléčné žlázy. Na studium vzniku a vývoje těchto nádorů je v dnešní době zaměřeno intenzivní výzkumné úsilí, které by přineslo nové přístupy v terapii nádorových onemocnění.

Buněčná viabilita byla v tomto případě sledována pomocí MTT testu za použití 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromidu (MTT) k určení koncentrací ICjo studovaných látek, jak bylo popsáno dříve. Buňky byly vysety v počtu 4,5.10³ (MCF-7, DU-145) nebo 5.10³(MDA-MB-468, LNCaP) buněk na jamku v médiu prostém steroidů do 96-jamkových mikrotitračních destiček. Buňky rostly 24 h (MCF-7, MDA-MB-468, DU-145) popřípadě 48 h (u buněk LNCaP). Buňky (konťluence 70 až 80 %) byly ošetřeny brassinosteroidy po dobu 6, 12 a 24 h v kultivačním médiu. Buňky, které byly použity jako kontroly, byl inkubovány jen s maximálním možným množstvím steroidního rozpouštědla DMSO. Koncentrace vedoucí k 50% inhibici buněčného růstu (IC₅₀) byla určena po 24 h pomocí měření MTT reduktázové aktivity. Absorbance byla změřena pomocí ELISA readeru Labsystem Multiscan RC při 570 nm. Viabilita ošetřených buněk testovanými brassinosteroidy byla vztažena ke kontrolním buňkám představující 100% viabilitu. Experiment byl proveden v triplikátech a nejméně čtyřikrát nezávisle zopakován.

Tabulka 2

Koncentrace IC₅o (pmol/l) látek 9 a 6 byly stanoveny MTT testem cytotoxicity. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů prováděných v tripl ikátech, z nichž byla určena směrodatná odchylka (SD)

Buněčná linie	IC» (gmol/l)
9	6
MCF-7	40 ±1,5	60 ± 1,8
MDA-MB-468	65 ± 2,8	68 ± 2,5
LNCaP	45 ± 2,3	60 ±3,1
DU-145	45 ± 2,8	65 ±0,9

K vyhodnocení vlivu vybraných brassinosteroidů (9 a 6) na viabilitu hormonálně senzitivních a nesenzitivních nádorových buněčných linií (MCF-7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145) jsme použili MTT test cytotoxicity. Cytotoxické koncentrace byly stanoveny pro všechny analoga na 4 nádorových buněčných linií. Brassinosteroid 9 inhiboval buněčný růst v závislosti na aplikovaném množství ve všech nádorových buněčných liniích podobně jako 6. Buňky MCF-7 byly k působení 9 nej citlivější v porovnání s dalšími třemi buněčnými liniemi. Brassinosteroid 6 vykazuje cytotoxický účinek při vyšších koncentracích (Obr. 2). Na základě MTT testu jsme našli koncentrace obou brassinosteroidů, které způsobovaly 50% inhibici růstu buněk (ICso) po 24 h (Tab. 2). Zajímavé je, že zde byly malé rozdíly mezi účinností 9 a 6 na různých buněčných liniích, přičemž se hodnoty ICso shodně pohybovaly kolem 43,3±2,4 pmol/l, případně

-13CZ 302293 B6

61,7± 1,7 pmol/l. Výjimkou byly mammámí estrogen-necitlivé buňky MDA-MB-468, které byly k aplikaci obou brassinosteroidů rezistentnější (9 IC₅₀: 65±2,8 pmol/l, 6 IC₅₀: 68±2,5 pmol/l).

Příklad 3

Buněčná proliferace na základě bromdeoxyuridin inkorporačního testu

Ke zjištění, zda inhibice buněčné viability je dána sníženou proliferací buněk, jsme měřili syntéio zu DNA za přítomnosti brassinosteroidů. Efekt brassinosteroidů 6 nebo 9 na buněčnou proliferací a replikací DNA nádorových buněk byl měřen pomocí BrdU inkorporačního testu. Tato metoda je založena na schopnosti modifikované nukleotidové báze BrdU začlenit se do DNA v místě thymidinu během S-fáze buněčného cyklu pomocí primární monoklonální protilátky prodi BrdU (Gratzner, Science, 1982, 218, 474—475). Buňky (v konfluenci 60 až 70 %) adherované na kry15 cích sklech byly v 60mm kultivačních miskách ošetřeny brassinosteroidy (IC₅o) po dobu 6, 12 a

h. BrdU (0,1 mmol/l) byl přidán do kultivačního média s buňkami na dobu 4 h v CO₂ inkubátoru při 37 °C. Poté byly buňky třikrát promyty ve fosfátovém pufru a fixovány vychlazenou směsí acetommethanol (1:1, obj./obj.) 10 minut. Buňky byly denaturovány kyselinou chlorovodíkovou (1:5; Lachema, Česká republika) a inkubovány se specifickou protilátkou proti BrdU (ředěnou 1:100 ve fosfátovém pufru; klon Bu20a, DakoCytomation, Dánsko) po 60 min ve tmě. Poté byly buňky třikrát promyty ve fosfátovém pufru (10 mM, pH 7,4) a inkubovány s kozí antimyší sekundární protilátkou značenou FITC (Sigma, MO, USA) po dobu 60 min ve tmě. Buňky byly opět 3x promyty ve fosfátovém pufru a následně inkubovány s 4'-6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI; 50 pg/ml; Sigma, MO, USA) 10 min ve tmě. Krycí sklíčka s buňkami byla opláchnuta v deionizované vodě a ponořena do vodného média Mowiol (Calbiochem, CA, USA) naředěného v roztoku glycerolu a fosfátového pufru (1:3, obj./obj.) určeného pro fluorescenci. Buňky byly vizualizovány pomocí mikroskopu a byl spočítán počet BrdU pozitivních buněk (buňky v S fázi buněčného cyklu) a vztažen k celkovému počtu všech buněčných jader v nejméně polích.

Tabulka 3

Buněčná proliferace stanovená na základě detekce inkorporace BrdU. Buňky MCF-7, MDA35 MB-468, LNCaP a DU-145 byly ošetřeny brassinosteroidy 9 nebo 6 v koncentraci IC₅₀ po dobu

6/12/24 h a srovnávány s buňkami kontrolními (K). Výsledky představují procenta (%) BrdU pozitivních buněk. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka. * představuje p < 0,05 signifikantně odlišné od kontroly.

Buněčná linie

Kontrola /BRs(lC;₀)	MCF-7	MDA-MB-468	LNCaP	DU-145
K (6 h)	50 * 3,6	64 ± 1,5	44 = 6,0	51 ±3,8
9(6 h)	46 ± 2,5	55 = 5,0	25 ±3,0*	41 ±4.5
6(6 h)	42 ± 3,2	53 ±4,4*	36 ± 5,5	32 ±3,8*
K (12 h)	53 ± 3,5	58 ± 3,0	52 ± 7,6	54 = 4,2
9(12h)	31 ± 3,8*	48 ± 4.6	28 ± 4,6*	36 ±4,4*
6(12 h)	40 i 7,1	55 ±3,5	31 ±2,0*	27 ±5,3*
K (24 h)	69 ± 4,5	64 ± 5,6	59 ±8,0	56 ± 6,5
9 (24 h)	29 ± 4,0*	28 ±4,6*	27 ±2,1*	38 ±4,0*
6 (24 h)	36 ±5,5*	43 ±3,6*	29x4,7*	16± 1,5*

- 14CZ 302293 B6

Buňky mammámích a prostatických nádorových linií byly ošetřeny látkami 9 a 6 v koncentracích IC₅₀ po dobu 6, 12 a 24 h a porovnány s buňkami kontrolními. Oba brassinosteroidy inhibovaly u všech linií buněčnou proliferaci jak v závislosti na koncentraci látky, tak na čase působení (Tab. 3). Ošetření brassinosteroidy snížilo procenta BrdU pozitivních buněk. Aplikace sloučeniny 9 (IC₅o pro 24 h) vedla k výraznému poklesu počtu proliferujících buněk MCF-7 (z 69±4,5 % u kontrolních buněk na 29±4,0 % u buněk ošetřených látkou 9) (Tab. 3). Tyto výsledky naznačují, že brassinosteroidy mají schopnost redukovat buněčný růst u některých mammámích a prostatických nádorových linií. Zůstává stále nejasné, zda hormon-dependentní buněčné linie jsou citlivější k aplikaci látek nebo zdaje cytotoxický účinek brassinosteroidů ošetřen jejich interakcí se steroidními receptory. Poznatky o korelaci estrogenového receptorů (ER) u nádorů a pozitivní odpovědí na endokrinní terapii by mohly přispět k vývoji estrogenových antagonistů.

Příklad 4

Brassinosteroidy regulují buněčný cyklus

U buněčné linie MCF-7 odvozené od karcinomu mléčné žlázy, která se řadí mezi nejčastěji používaný experimentální buněčný model, bylo zjištěno, že typicky růstové inhibiční odpověď na antiestrogeny vede k typickému poklesu buněk syntetizujících DNA (S-fáze) po ošetření antiestrogenem. Tento pokles buněk v S-fázi je doprovázen zvýšeným zastoupením buněk v Go/Gi fázi buněčného cyklu. Je známo, že aktivita androgenového receptorů (AR), která obvykle nastává vazbou ligandů k receptorů, může být rovněž regulována změnami buněčné signalizace. Již dříve bylo popsáno, že aktivace AR nezávislá na ligandů může být u nádorových buněk prostaty zprostředkována různými růstovými faktory. Jelikož AR může být aktivován i za nepřítomnosti daných hormonů, zdá se, že podmínky aktivace mohou být omezenější, než je tomu u ER. Při experimentech hraje rozhodující význam použití fyziologických dávek ligandů (dihydrotestosteron; DHT), jelikož buňky LNCaP mohou proliferovat pouze v koncentraci DHT ΙΟ^-9 M a nižší. Vyšší dávky proliferaci inhibují. Na rozdíl od proliferace, transaktivace cílových genů přímo regulovaných AR (např. PSA, prostatický specifický gen) byla po ošetření buněk DHT v koncentraci 10^_1° M a vyšší stimulována. Jedním zmožných vysvětlení výrazných cytotoxických účinků brassinosteroidů 9 a 6 by mohl být vliv na steroidní receptory ER a AR u buněčných liniích hormonálně dependentních (MCF-7, LNCaP) v porovnání s buněčnými liniemi hormonálně independentních (MDA-MB-468 a DU-145). Naším cílem bylo zjistit vliv brassinosteroidů na průběh buněčného cyklu u různých nádorových buněčných linií. Na základě průtokové cytometrie bylo sledováno procentuální zastoupení buněk ve fázích cyklu včetně detekce subGi buněčné frakce. Kontrolní a ošetřené buňky byly dvakrát promyty vychlazeným fosfátovým pufrem, centrifugovány při 360 x g a teplotě 4 °C po dobu 10 min a následně fixovány ledovým ethanolem (70%; obj ./obj.) za pomalého míchání. Obsah DNA byl stanoven po obarvení buněčných jader propidiumbromidem. Buňky byly analyzovány průtokovým cytometrem FACS Calibur (Becton Dickinson Bioscience, USA).

Tabulka 4

Distribuce buněčného cyklu u buněk MCF-7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145 analyzovaná průtokovou cytometrií. Histogramy buněk ošetřených brassinosteroidy byly srovnávány s histogramy buněk kontrolních. Data představují procentuální zastoupení buněk sub Gi frakce a v jednotlivých fázích buněčného cyklu Gi, S, G₂/M

- 15CZ 302293 B6

Buněčná linie	Kontrola / BRs aC_Jn; 24 h)	Apoptická subGi	Distribuce buněčného cyklu
Gj	S	GJM
MCF-7	K	17%	60%	14%	26%
	9	15%	80%	11 %	9%
	6	13%	81 %	7%	12 %
MDA-MB- 468	K	10%	52%	31 %	17%
	9	35%	74%	17%	9%
	6	75 %	88%	10%	2%
LNCaP	K	8%	70%	14%	16%
	9	18%	94%	2%	4%
	6	47%	86%	5%	9%
DU-145	K	20%	62%	15%	23%
	9	28%	46%	8%	46%
	6	24%	53%	8%	39%

Průtoková cytometrie prokázala blokaci buněčného cyklu v Gi fázi u buněk MCF-7, MDA-MB468 a LNCaP ošetřených brassinosteroidy 9 a 6 (Tab. 4). U všech buněčných linií brassinosteroi5 dy snížily procentuální zastoupení buněk v S-fázi buněčného cyklu. Po ošetření buněk DU-145 testovanými brassinosteroidy byl zaznamenán nárůst buněk v G₂/M fázi za současného poklesu buněk v ostatních fázích buněčného cyklu (Tab. 4).

io Příklad 5

Vliv brassinosteroidů 9 a 6 na expresi proteinů buněčného cyklu

Sledovali jsme účinek brassinosteroidů 9 a 6 na expresi inhibitorů cyklindependentních kináz (cdk) p21^Wafl/Cipl a p27^Kipl, které představují klíčové regulátory progrese buněčného cyklu a inhibují aktivity cyklin/cdk. Po ošetření buněk MCF-7 látkou 9 po 6 h byl zjištěn nárůst exprese p2|Wafvcipi a p27^KjP¹, zatímco u buněk MDA-MB-468 nebyly zjištěny žádné signifikantní změny. Po ošetření buněk MCF-7 látkou 6 zůstala exprese p21 ^Wafl^^lp'nezměněna, exprese p27^Kipl byla po 6 a 12 h expozici látky 6 snížena. Po 12 a 24h ošetření buněk MDA-MB—468 látkou 6 došlo k signifikantnímu zvýšení hladiny inhibitoru cdk p2i^Wafvc,pl (Obr. 4A). Oproti tomu exprese proteinu p27^Kipl byla u těchto buněk ve všech časových intervalech snížena. U buněk LNCaP jsme zaznamenali snížení hladiny p21^Wafl/Cipl po 12 h a zvýšení hladiny p27^K,pí po 24 h vlivem látky 9 i 6. Dále toto ošetření brassinosteroidy vedlo u buněk LNCaP k poklesu exprese _p21wafl/ci_Pi _{po 6 a} 24 _{h a} p27^Kipl po 6 a 12h. Oba typy brassinosteroidů vedly u buněk DU-145 ke zvýšení exprese p2i^Wafl/Cipl a p27^Klpl po 12 a 24 h (Obr. 4B).

Exprese proteinu p53 byla u buněk MCF-7 mírně zvýšena po 6h působení látky 9 i 6 za současného snížení exprese MDM-2, regulátoru degradace p53, ve všech sledovaných časových intervalech. U buněk MDA-MB-468 zůstala hladina proteinů p53 i MDM-2 po ošetření oběma typy brassinosteroidů nezměněna (Obr. 4A). U buněk LNCaP byl zjištěn pokles exprese p53 po ošetření buněk brassinosteroidy 9 i 6 12h a 24h po aplikaci, zatímco u buněk DU-145 nebyly změny exprese p53 prokázány. Exprese MDM-2 byla u buněk LNCaP ošetřených látkou 9 zvýšena (6 h) a po ošetření látkou 6 nezměněna. U buněk DU-145 ošetřených brassinosteroidy 9 ΐ 6 došlo ke snížení hladiny MDM-2 ve všech časových intervalech (Obr. 4B).

- 16CZ 302293 B6

Ošetření obou mammámích nádorových linií látkou 24-epiBL 6 (6/12/24 h) vedla ke snížení exprese cyklinu Dj. Exprese obou fosforylovaných a defosforylovaných forem retinoblastomového proteinu (Rb) byla u buněk MCF-7 a MDA-MB-468 po aplikaci brassinosteroidů 9 a 6 snížena (Obr. 4A). U buněk LNCaP ošetřených oběma typy BRs byla hladina cyklinu Di snížena, zatímco u buněk DU-145 nebyla hladina tohoto cyklinu ovlivněna. Exprese proteinu Rb byla u buněk LNCaP léčených BRs mírně snížena. U buněk DU-145 nebyly žádné změny zaznamenány (Obr. 4B).

Příklad 6

Detekce apoptózy u nádorových buněk

Detekce apoptózy pomocí průtokové cytometrie. Některé studie uvádějí, že indukce apoptózy může být závislá na buněčném cyklu. Proto jsme se v následujících experimentech zaměřili na možnost, zda jsou brassinosteroidy 9 nebo 6 schopny indukovat apoptózu karcinomu buněk mléčné žlázy a prostaty prostřednictvím blokace buněčného cyklu. Z tohoto důvodu byla provedena analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií, která je založena na detekci endonukleolytické degradace DNA vedoucí k extrakci nízkomolekulámí DNA z buněk. Průtoková cytometrie, používaná jako konvenční technika k detekci specifické formy buněčné smrti, umožňuje výskyt subGi maxima v hypodiploidní oblasti buněčného cyklu DNA histogramů. Analýzy prokázaly, že oba typy brassinosteroidů zvyšovaly u buněk MDA-MB-468 (Obr. 3), LNCaP a mírně í u buněk DU-145 procenta subGi buněčné frakce v porovnání s kontrolními buňkami (Tab. 4). U buněk MCF—7 nebylo subG_t maximum obsahující apoptické buňky zaznamenáno. Brassinosteroidy zprostředkovaná apoptická buněčná smrt je významným zjištěním, jelikož molekulární analýzy využívané u lidských nádorů odhalily, že regulátoiy buněčného cyklu jsou často mutovány u většiny maligních onemocnění.

Detekce apoptického indexu metodou TdT-Mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). K detekci apoptických buněk byla použita metoda TUNEL. Buňky rostoucí na krycích sklech v 60mm Petriho kultivačních miskách byly kultivovány se sloučeninou 9 a 6 (IC₅₀) po dobu 6, 12 a 24 h. Po Časové periodě ošetření byly následně buňky opláchnuty roztokem PBS a fixovány na sklíčkách po dobu 10 min chlazenou směsí aceton:methanol (1:1, obj./obj.). Fragmentace jaderné DNA indukovaná apoptózou byla detekována na základě vazby terminální deoxynukleotidyltransferasy (TdT) metodou TUNEL dle protokolu výrobce (In Šitu Cell Death Detection Kit; Roche Diagnostics, Mannheim, Německo). Po dalším trojnásobném oplachu buněk v PBS byla jádra dobarvena 4',6-diamino-2—fenylindolem (DAPI; 50 pg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) po dobu 10 min ve tmě. Poté byla krycí sklíčka opláchnuta v deionizované vodě a přiložena na skla pomocí hydrofilního média Mowiolu (Calbiochem, Fremont, CA, USA) naředěného v roztoku glycerolu a PBS (1:3, obj?obj.) určeného pro fluorescenci. Ošetřené buňky byly vízualizovány fluorescenční mikroskopií a srovnávány s buňkami kontrolními. Na základě metody TUNEL byla zjištěna apoptóza buněk všech buněčných linií. Ošetření buněk brassinosteroidy ve všech časových intervalech (ICjo; 6/12/24 h) vedlo k mírnému, ale ne příliš signifikantnímu zvýšení TUNEL pozitivních buněk (Tab. 5). Výrazné zvýšení procentuálního zastoupení apoptických TUNEL pozitivních buněk bylo zaznamenáno u buněk LNCaP po ošetření látkou 9 (IC₃₀ po 24 h) na 25,8 % a látkou 6 (IC₅₀ po 24 h) na 21,9 % vzhledem ke kontrolním buňkám. Obrázek 5 znázorňuje účinek látky 9 a 6 u buněk LNCaP vzhledem ke kontrolním buňkám.

Tabulka 5

Detekce DNA zlomů v jádrech apoptických buněk stanovená na základě metody TUNEL. Buňky MCF-7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145 byly po dobu 6, 12 a 24 h ošetřovány sloučeninou 9 a 6 v IC₅₀ koncentraci a detekovány metodou TUNEL ve srovnání s kontrolními neošetřenými

- 17 CZ 302293 B6 buňkami. Buňky byly promyty v PBS a fixovány na krycí skla s vychlazenou směsí aceton/methanol (1:1, obj./obj.), jak bylo popsáno výše. K (6 h), K (12 h), K (24 h) -kontrolní neošetřené buňky 6, 12 a 24 h; 9 (6 h), 9 (12 h), 9 (24 h) - vzorky buněk ošetřené sloučeninou 9 (IC₅o; po dobu 6, 12 a 24 h); 6 (6 h), 6 (12 h), 6 (24 h) - vzorky buněk ošetřené sloučeninou 6 s (IC₅o; po dobu 6, 12 a 24 h). Data udávají procentuální zastoupení TUNEL pozitivních buněk ze tří nezávislých pokusů. Výsledky představují průměr ± SD. * představuje p < 0,05 signifikantně odlišné od kontroly.

Buněčná linie

Kontrola / BRs (ICío)	MCF-7	MDA-MB-468	LNCaP	DU-145
K<6 h)	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,3 ± 0,6	0,0 ±0,0
9(6 h)	10,6 ± 1,5*	1,7 ±0,6	7,3 ±2,1*	6,0 ±2,0*
6(6 h)	2,7 ± 1,2*	4,7 ± 0,6*	10,7 ±4,0*	4.7 ± 2,5*
K(12h)	0,0 ± 0,0	0,0 ±0,0	0,6 ± 0,6	0,0 ±0,0
9(12 h)	13,7 ±3,8*	2,3 ±0,6	15,7 ±2,5*	7,5 ±4,0*
6 (12 h)	8,3 ±3,1*	16,7 ±4,7*	12,2 ±5,1*	5,6 ±2,0*
6(12 h)	8,3 ±3,1*	16,7 ±4,7*	12,2±5,1*	5,6 ±2,0*
K (24 h)	0,3 ± 0,6	0,0 ± 0,0	0.6 ± 0,6	0,0 ±0,0
9 (24 h)	13,7 ±2,6*	4,3 ± 0,6*	25,8 ± 2,5*	8.0 ±4,0*
6 (24 h)	11,7 ±3,8*	18,3 ±3,0*	21.9 ±3,0*	5,1 ±5,6*

Příklad 7

Western blot analýza pro- a anti-apoptických proteinů

Pro přípravu vzorků byly buňky nasazeny v počtu 1,6.10⁴ buněk/cm² (LNCaP), 1,4.10⁴buněk/cm² (DU-145, MDA-MB-468 a MCF-7) do lOOmm kultivačního Petriho misek a po dosažení konfluence 70 až 80 % byly ošetřeny testovanými sloučeninami 9 a 6 v koncentraci IC_i0 stanovené na základě MTT testu, který byl popsán výše. Kontrolní buňky byly připraveny inkubací s příslušným objemem DMSO jako vehikulem.Po 6, 12 a 24 byly buňky opláchnuty vychlazeným PBS a uvolněny z misek škrabáním do extrakčního pufru (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 2,5 mM EGTA; 10 % glycerolu; 0,1 % Tweenu 20) s proteázovými a fosfatázovými inhibitory (aprotinin 2,5 μΐ/ml; leupeptin 2,5 μΐ/ml; fenylmethansulfonyl25 fluorid aprotininu 25 μΐ/ml, 10 mM β-glycerolfosfát; 0,1 mM Na₃VO₄ a 1 mM dithiotretiol). Lyzáty byly posbírány do mikrocentrifugačních zkumavek a pak inkubovány na ledu 1 h. Buňky byly v protein extrakčním pufru inkubovány 60 min za občasného třepání při 4 °C. Po centrifugaci (45 000 x g, 4 °C, 30 min) byl supematant odebrán, rozdělen na alikvoty a zmražen při -80 °C. V supematantu byla změřena celková koncentrace proteinů Bredfordovou metodou dle protokolu výrobce (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Při Western blot analýzách bylo naneseno alikvoty proteinů (15-30 μg/jamku) na 10%, případně na 12% SDS-PAGE gelu. Elektroforeticky separované proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Amersham Biosciences, Rakousko) pomocí „semi-dry“ metody. Pro určení molekulové hmotnosti byl použit barevný molekulový hmotnostní standard (Rainbow™, Amersham Biosciences, Rakousko). Nespecifická vazebná místa byla blokována inkubací blotu 2 h v 5% roztoku sušeného nízkotuČného mléka v PBS. Poté byla provedena inkubace membrány

- 18CZ 302293 B6 přes noc při 4 °C s příslušnou primární protilátkou, která detekuje zájmové proteiny a nakonec promyta vychlazeným v PBS s 0,1 % Tweenem 20) po dobu 1 h. Poté byly membrány inkubovány s naředěnou sekundární kozí anti-myší IgG protilátkou konjugovaná s křenovou peroxidasou (ředění 1:6 000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) nebo kozí anti-králičí IgG protilátkou konjugovaná s křenovou peroxidázou (ředění 1:2000, DakoCytomation, Glostrup, Denmark) po dobu 45 min při 4 °C. Závěrečně byla membrána promyta vychlazeným v PBS s 0,1 % Tweenem 20) po dobu 1 h. Proteiny byly detekovány chemiluminiscenčním detekčním systémem (Amersham Biosciences, Vídeň, Rakousko) dle protokolu výrobce. Srovnatelnost proteinů přenesených na membránu byla potvrzena barvením pomocí Ponceau S (Sigma, St. Louis, MO, USA) io a detekcí pomocí protilátek proti α-tubulinu (Sigma, USA) nebo mcm-7 (Santa Cruz, USA). Experimenty byly třikrát zopakovány. Exprese proteinů u buněk ošetřených a kontrolních byly srovnávány.

Na základě Western blot analýzy byly sledovány změny exprese proteinů uplatňujících se během apoptózy u buněčných linií prsu a prostaty. Ke zjištění změn během 24 h ošetření byly odebírány buňky ošetřené brassinosteroidy po dobu 6, 12 a 24 h v koncentracích ICjo stanovených dle MTT testu. Změny exprese proteinů regulujících apoptickou buněčnou smrt po ošetření buněk brassinosteroidy znázorňuje Obr. 6. Western blot analýzou nebyly u rnammámích nádorových buněk MCF-7 a MDA-MB-468 zjištěny signifikantní změny v expresi apoptických proteinů po ošetře20 ní buněk testovanými brassinosteroidy (Obr. 6A). Exprese antiapoptického proteinu Bcl-2 u buněk LNCaP a DU-145 klesla po 6, 12 i 24 h působení 9 a po 6 a 24 h aplikaci 6, zatímco při sledování exprese dalšího antiapoptického proteinu Bcl-X_L nebyla zjištěna žádná změna po ošetření studovanými brassinosteroidy ve všech časových intervalech (Obr. 6B). Exprese pro-apoptického proteinu Bax byla zvýšena u buněk LNCaP ošetřených 9, zejména po 6 a 12 h působení, a snížena exprese pro-apoptického neštěpeného proteinu Bíd po 6 a 12 h ošetření oběma typy BRs. Tento pokles exprese proteinu Bid může představovat jeho štěpení vlivem brassinosteroidů. U buněk DU-145 nebyla exprese pro-apoptických proteinů Bax a Bid změněna. Po ošetření buněk LNCaP látkou 9 jsme detekovali štěpné aktivní fragmenty kaspázy-3 po 6, 12 a 24h aplikaci. Ošetření straně u linie DU-145 nebyla žádná změna kaspázy-3 zjištěna. Positivní exprese poly-(ADP-ribosa)-poIymerázy (PARP) byla zjištěna pozitivní exprese u kontrolních buněk prostatických nádorových linií, ovšem brassinosteroidy neměly žádný efekt na expresi ani na jeho degradaci ve všech časových intervalech 6/12/24 h (Obr. 6B).

V této studii jsme zjistili, že ošetření sloučeninou 9 vyvolalo výrazný pokles hladiny anti-apop35 tického proteinu Bcl-2 a nárůst pro-apoptického proteinu Bax u buněčné linie LNCaP. Dále bylo u těchto buněk zjištěno štěpení pro-kaspázy-3 na její aktivní formu ve všech Časových intervalech po ošetření látkou 9 a po 24 h aplikace u látky 6. Toto zjištění svědčí o iniciaci apoptických změn u buněk LNCaP. Již dříve bylo popsáno, že v efektorové fázi apoptózy hraje důležitou roli aktivace kaspázové kaskády (Budihardjo a spol., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 269 až 290,

1999). Kaspáza-3 představuje exekuční proteázu, která se podílí na štěpení proteinů PARP a následné DNA degradace a apoptické smrti (Allen a spol., Cell. Mol. Life Sci. 54, 427 až 445, 1998; Cain a spol., Biochimie 84, 203 až 214, 2002). Tyto výsledky naznačují, že brassinosteroidy 9 a 6 mohou u buněčných linií odvozených od karcinomu prostaty podpořit apoptózu cestou aktivace kaspázy-3 a modulací proteinů rodiny Bcl-2.

U rnammámích nádorových buněčných linií Western blot analýza nepotvrdila signifikantní změny v expresi proteinů rodiny Bcl-2 ani aktivaci kaspázy-3 po ošetření brassinosteroidy 9 a 6.

Příklad 8

Suché tobolky

5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I 55 uvedených shora v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

- 19CZ 302293 B6

Složení

Aktivní složka 1250 g

Talek 180 g

Pšeničný škrob 120 g

Magnesium stearát 80 g

Laktóza 20 g

Postup přípravy: Rozemleté složky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g t o směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 9

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce í uvedených shora v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

Lauroglykol 2 litry

Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (laurát propylenglykolu, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozemele se ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o hmotnosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Příklad 10

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I uvedených shora v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

PEG 400 1 litr

Tween 80 1 litr

Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o molekulové hmotnosti mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich USA) a Tweenu® 80 (monolaurát polyoxyethylensorbitanu, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na Částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o hmotnosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití přirozených brassinosteroidů obecného vzorce I v němž

R znamená CH₂ nebo O-CH₂ skupinu,

R² znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

R³ znamená hydroxyl,

R²⁵ znamená atom vodíku, alkyl vybraný ze skupiny zahrnující methyl a ethyl,----znamená jednoduchou nebo dvojnou vazbu a jejich farmaceuticky použitelné soli, pro výrobu léčiva pro selektivní léčení hyperproliferace nádorových savčích buněk bez cytotoxického působení na nenádorové buňky organismu.

2. Použití podle nároku 1, přičemž přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I jsou vybrány ze skupiny zahrnující následující sloučeniny: kastasteron, 28-homokastasteron, 24epibrassinolid, dolichosteron, typhasterol, teasteron, 6-deoxotyphasterol, homotyphasterol, homoteasteron, homodolichosteron, 25-methylkastasteron, 25-methyldolichosteron, 2-deoxy25-methyldolichosteron a 3-epi-2-deoxy-25-methyldolichosteron.

3. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, přičemž přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I mají konfiguraci 24R.

4. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 a 3 pro regulaci proliferace a morfogeneze in vitro ve zvířecíchch a lidských buněčných tkáňových kulturách.

5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, přičemž selektivním léčením hyperproliferace nádorových savčích buněk bez cytotoxického působení na nenádorové buňky organismu je indukce apoptózy v nádorových savčích buňkách.

6. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, přičemž selektivním léčením hyperproliferace nádorových savčích buněk bez cytotoxického působení na nenádorové buňky organismu je léčení rakoviny.

7. Použití podle nároku 6, kde rakovina znamená rakovinu prsu, dělohy nebo prostaty.

-21 CZ 302293 B6

8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, přičemž selektivním léčením hyperproliferace nádorových savčích buněk bez cytotoxického působení na nenádorové buňky organismu je léčení nepříznivých účinků steroidních dysfunkcí v nádorových savčích buňkách.

5 9. Použití podle nároku 8, přičemž substituenty R², R³, R²⁴ a R²⁵ přirozených brassinosteroidů obecného vzorce I popsaného v nároku 1 mají nezávisle na sobě (R) nebo (S) konfiguraci.