CZ301719B6

CZ301719B6 - Antimikrobiální peptidy

Info

Publication number: CZ301719B6
Application number: CZ20090083A
Authority: CZ
Inventors: Monincová@Lenka; Cerovský@Václav; Slaninová@Jirina; Hovorka@Oldrich; Cvacka@Josef; Voburka@Zdenek; Fucík@Vladimír; Borovicková@Lenka
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved Ceské republiky, v. v. i.
Priority date: 2009-02-12
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2010-06-02
Also published as: WO2010091651A2; CZ200983A3; WO2010091651A4; WO2010091651A3; EP2396020A2; EP2396020B1

Abstract

Popsány jsou peptidy o vzorcích (I) a (II) izolované z jedových vácku eusociálních vcel Halictus sexcinctus a jejich syntetické analogy pripravené zámenou aminokyseliny v poloze 4, 11 nebo 12 vzorce (I) nebo v poloze 4 vzorce (II) aminokyselinou Lys, vykazující biologické úcinky a jejich použití pro výrobu léciva k lécbe mikrobiálních, parazitických a plísnových onemocnení a pro lécení rakovin.

Description

Antimikrobiální peptidy

Oblast techniky

Vynález se týká antimíkrobiálních peptidů, izolovaných z přírodního materiálu, vzorců I a II

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-IIe-Arg-NHi (I)

H-Gly-Lys-Trp-Met-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NHi (II) io ajejich syntetických analogů, majících v poloze 4, 11 nebo 12 vzorce (1) nebo v poloze 4 vzorce (II) aminokyselinu Lys, jakož i použití takových sloučenin pro přípravu antimíkrobiálních, antiparazitických, protiplísňových a protirakovinných léčiv.

Dosavadní stav techniky

Prvotní obrana proti mikrobiální infekci, kterou si příroda během evoluce vyvinula, spočívá v sekreci látek peptidové povahy dnes v odborné terminologii označovaných jako antimikrobiální peptidy [1-3]. Ty byly identifikovány prakticky v celém spektru živočišné a rostlinné říše. Napří20 klad v říši hmyzu právě antimikrobiální peptidy představují hlavní prostředek obrany proti mikrobům [4]. S přihlédnutím k prostředí, ve kterém se hmyz pohybuje, se musí jednat o peptidy velmi účinné. Tyto peptidy jsou schopny velice rychle zabíjet bakterie a některé další mikroorganismy, a to mechanismem zcela odlišným než využívá imunitní systém vyšších organismů. I když tento mechanismus ještě není zcela objasněn, v podstatě spočívá v narušení buněčné membrány bakte25 rií tvorbou transmembránových párů nebo iontových kanálů. To způsobí únik metabolitů a zborcení celé mikrobiální struktury [5,6]. Obecně je též známo, že antimikrobiální peptidy u bakterií nevyvolávají resistenci, jako třeba doposud používaná tradiční antibiotika. Poněkud zvláštní skupina peptidů s antimikrobiálním účinkem se nachází vjedu hmyzu rodu Hymenoptera [7]. V přírodě je antimikrobiální účinek peptidů izolovaných z jedu vos, včel, čmeláků a mravenců většinou sekundární, ajejich hlavní úloha spočívá spíše v toxicitě či vyvolání bolesti a zánětu, jako třeba u peptidů patřících do skupiny mastoparanů [8]. Nicméně antimikrobiální účinek peptidů izolovaných například z jedu primitivních včel je značně výrazný a vzhledem ktomu, že se jedná o peptidy snadno dostupné synteticky, mohly by se tyto peptidy využít v praktické medicíně. To souvisí se současnou situací, kdy překonávání resistence bakteriálních pato genů vůči tradičním antibiotikům vyžaduje vyhledávání stále nových typů antibakterialních látek, z nichž nejperspektivnějšími se zdají být antimikrobiální peptidy.

Předmětem tohoto vynálezu jsou antimikrobiální peptidy mající následující vzorce:

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH2 (I)

H-Gly-Lys-Trp-Met-Ser-Lcu-Lcu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH2 (II)

H-Gly-Met-Trp*Lys-LyS“Uc-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH2 (I-A/l)

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Lys-Arg-NH2 (I-A/2)

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Lys-NHa (I-A/3)

H-Gly-Lys-Típ-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-His-IIe-Leu-Lys-NH2 (II-A/1)

-iCZ 301719 B6

Tento vynález se rovněž týká použití uvedených antimikrobiálních peptídů o vzorcích I, II, ΙΑ/1-3 a II-A/1 pro přípravu antimikrobiálních, antiparazitických, protiplísňových a protirakovinných léčiv.

Podrobný popis vynálezu

Peptidy vzorce (I) a (II) byly nazvány halictin I a halictin II a izolovány z jedových váčků eusociálních včel Halictus sexcinctus. Peptidy I a II, mají výrazný antimikrobiální účinek, doprovázelo ný nevýraznou hemolytickou aktivitou.

I když primární funkce těchto peptidů v přírodě není známa, jedná se o jedinečné, nové, dosud nepopsané peptidy s výraznými antimikrobiálními účinky. Své antimikrobiální vlastnosti mají díky jedinečné primární struktuře, která podmiňuje účinnou sekundární strukturu v přítomností buněčné membrány bakterií a chemických látek napodobujících vlastnosti membrán [9].

Sekundární struktura halictinů, která je neuspořádaná ve vodném prostředí, snadno přechází na strukturu α-helixu v přítomnosti látek tuto strukturu podporujících, jako jsou trifluoroethanol či dodecylsulfát sodný (SDS) [9], nebo v kontaktu s biologickou membránou. V tzv. Edmundsono20 vě kruhové projekci [10] (Obr. 1) je patrný anthipathický charakter [11, 12] těchto peptidů s dobře definovaným hydrofobními i hydrofilními sektory. Rozdělení těchto dvou sektorů na opačné strany α-helixu, nebo-li tzv. amphipathicita [11,12], hraje výraznou úlohu při interakci antimikrobiálního peptidu s bakteriální membránou a je tedy jedním z nejdůležitějších faktorů vedoucích k narušení bakteriální membrány a v konečném výsledku ke smrti bakterie [6], V tom25 to procesu se zároveň uplatňuje kationícita peptidu [11], která je v případě halictinů I zajištěna přítomností tří bazických aminokyselin (Lys, His, Arg) v sekvenci a v případě halictinů II přítomností čtyř bazických aminokyselin (tři Lys a jeden His) soustředěných v hydrofilních sektorech peptidů. Toto prostorové uspořádání umožňuje elektrostatickou atrakci kladně nabitého sektoru peptidů k záporně nabitým fosfolipidům obsaženým v bakteriální membráně. Hydrofóbní sektor peptidů je poté vnořen do lipofílní části membrány a po dosažení určité koncentrace peptidu na bakteriální stěně dojde k jejímu narušení. Teoreticky mohou halictiny v tzv. anisotropním prostředí vytvořit strukturu optimálního α-helixu o třech závitech, jenž je stabilizován spojením jednotlivých závitů pomocí vodíkových můstků mezi kyslíky α-karbonylů jednoho závitu a vodíky-NH-skupin závitu následujícího. Z literatury je známo [9], že mírné narušení a-heltkální struktury může příznivě eliminovat nežádoucí hemolytickou aktivitu antimikrobiálních peptidů, která je mírou toxicity těchto peptidů. To můžeme ovlivnit náhradou aminokyselin v centrální části molekul halictinů za jiné aminokyseliny narušující α-helikální uspořádání (tzv. helix braker). Dalšími záměnami původních aminokyselin [13] v sekvenci halictinů za jiné ovlivníme celkovou kationicitu, hydrofobicitu či amphipathicitu halictinů ve snaze zvýšit jejich antimikro40 biální účinek a na druhé straně potlačit aktivitu hemolytickou. Příklady několika změn a jejich následky na antimikrobiální a hemolytickou aktivitu peptidů jsou uvedeny v příkladech.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I znázorňuje helikální kruhovou projekci halictinů: a) halictin I, b) halictin II. Podtržené jsou vyznačeny hydrofóbní aminokyseliny, kurzívou bazické aminokyseliny (Arg, Lys, His) a tučně ostatní hydrofilní aminokyseliny.

-2CZ 301719 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace z přírodního materiálu

Včely Halictus sexcinctus byly pochytány v oblasti východních Cech v lokalitě Veská u Hradce iú Králového a po několikadenním skladování při -20 °C byly vypreparovány jedové váčky z pěti jedinců. Tyto byly extrahovány směsí 50% vodného acetonitrilu s obsahem 0,1% kyseliny trifluorooctové (TFA) (25 μΐ). Extrakt byl frakcionován pomoci vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na koloně Vydac C-18 (250 x 4,6 mm) při průtoku 1 ml/min za použití gradientu od 5% acetonitril/voda/0,1 % TFA do 70% acetonitril/voda/0,1 % TFA. Hlavní peptidové is frakce, které byly detekovány UV absorpcí, byly sebrány a koncentrovány v rotačním vakuovém koncentrátoru. Jejich primární struktura byla stanovena pomoci hmotové spektrometrie a metodou automatického Edmanova odbourávání. Halictiny představují hlavní peptidovou složku extraktu.

Příklad 2

Syntéza sloučenin vzorců (I), (II) ajejich analogů I-A a II-A

Tyto peptidy lze syntetizovat metodou syntézy peptidů na pevné fázi (SPPS). Syntéza byla provedena manuálně v 5ml polypropylenových injekčních stříkačkách s teflonovým filtrem na dně stříkačky s využitím protokolu Fmoc-chernie. Jako pevný nosič byla použita pryskyřice Rink Amide MBHA o substituci 0,7 mmol/g. Chráněné Fmoc-aminokyseliny byly kondensovány ve 4-násobném přebytku v dimethylformamidu a ke kondensaci byl použit diisopropylkarbodiimid v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu. Surové halictiny (1) a (II) byly získány odštěpením z pryskyřice a deprotekcí působením směsi TFA/l,2-ethanedithiol/H₂0/thioanizol/triisopropyIsilan (90 :2,5 : 2,5 : 3 : 2) po dobu 3,5 h a následnou precipitací /e/v-butylmethyletherem. Tímto postupem bylo získáno 70 až 80 mg surových peptidů. Část tohoto materiálu (20 mg) byla v každém případě čištěna preparativní HPLC na koloně Vydac C-18 (250x 10 mm) pří průtoku

3,0 ml/min a s využitím stejného gradientu, jaký je popsán výše. Takto bylo získáno 8 až 11 mg peptidů čistých podle HPLC, jejichž identita byla ověřena hmotovou spektrometrií, jak udává Tabulka 1.

-3CZ 301719 B6

Tabulka 1. Sekvence halictinů (I) a (II) jejich syntetických analogů (1-A) a <11—A) peptid sekvence monoisotopická molekulární hmotnost (Da) vypočtená nalezená (I) H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NtU (II) H-Gly-Lys-Trp-Met-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH} (I-A/l) H-Gly-Met-Trp-Lys-Lys-Ue-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH₂(I-A/2) H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Lys-Arg-NH₂(I-A/3) H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-ne-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Lys-NHz (n-A/l)H-Gly-Lys-Trp-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-His-ne-Leu-Lys-NH2

1408,81	1408,9
1451,88	1451,8
1449,88	1449,8
1423,82	1423,6
1380,81	1380,6
1448.93	1449,0

(zaměněné aminokyseliny jsou vytištěny tučně)

Příklad 3

Stanovení antimikrobiální aktivity io

Antimikrobiální aktivita byla stanovena jako tzv. minimální inhibiční koncentrace (MIC) pozorováním růstu bakterií v přítomnosti různých koncentrací peptidů (Tabulka 2). Bakterie v exponenciální fázi růstu byly přidány k roztoku testovaného antimikrobiálního peptidů o různé koncentraci (0,5 až 100 μτηοΙ.Γ¹) v LB médiu (obsahuje v 1 1 deštil, vody 10 g tryptonu, 5 g kvasinkového extraktu a 10 g NaCl) v inkubačních destičkách a inkubovány při 37 °C po 20 h za stálého třepání v přístroji Bioscreen C. Absorbance byla měřena při 540 nm každých 15 min. V experimentech bylo použito 1 x 10⁴-7,5 x 10⁴ CFU bakterií (CFU = colony forming unit, tzn. jednotka vytvářející kolonie). Jako standard byl použit tetracyklin v koncentraci 1 až 50 μπιοΙ.Γ¹.

Tabulka 2. Antimikrobiální a herno lytické aktivity halictinů (I) a (II) ajejich analogů

peptid	antimikrobiální aktivita MIC [pmol.r¹]	hemolytická aktivita lc₅₀ P.a.
B.s.	S.a.	E.c.
(I)	0,7	7,4	3,8	45	80
an	0,8	7,5	22	33	80
(I-A/l)	14	6,0	1,8	12,5	93
(I-A/2)	2,2	100	28	90	>200
(I-AZ3)	0,75	12,5	6.0	50	111
(Π-Α/1)	1,5	25	3	12,5	95
B.s,. BaciUus	subtitts;	S.a,, Staphylococcus	aureus; E.c.,	Escherichia coli;

Pseudomonnas aeruginosa

-4CZ 301719 B6

Příklad 4

Stanovení hemolytické aktivity

Peptidy v koncentraci 1 až 100 (200) μιηοΙ.Γ¹ byly inkubovány s potkaními červenými krvinkami (5%) v 0,2 ml fysiologického roztoku po dobu 1 h pri 37 °C. Poté byly vzorky centrifugovány pri 250 g po dobu 5 min. Absorbance supematantu byla stanovena při 540 nm. Jako kontrola pro 100% hemolýzu byl místo peptidů použit 0,2% roztok TRITONU X100. Výsledky testování jsou io uvedeny v Tabulce 2.

Literatura

1. Zasloff M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nátuře 415,389-395 15

2. Hancock R.E.W., Sáhl H.-G. Antimicrobial and host-defense peptides as new antiinfective therapeutic strategies. Nátur. Bitech. 24, 1 551-1 557 (2006)

3. TokeO. Antimicrobial peptides: New candidates in the fight against bacterial infection.

Biopolymers (Peptide Science) 80,717-73 5 (2005).

4. Otvos L. Jr. Antimicrobial peptides isolated from insects. J. Peptide Scí. 6,497-511 (2000)

5. OrenZ, ShaiY. Mode of action of linear amphipathic α-helical antimicrobial peptides.

Biopolymers 47,451-463 (1998)

6. YeamanM.R., YountN.Y. Mechanismus of antimicrobial peptide action and resistance. Pharm. Rev. 55,27-55 (2003)

7. Kuhn-Nentwig L, Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods. Cell, Mol.

Life Sci. 60, 2 651-2 668 (2003)

8. ČeřovskýV., Slaninová J., Fučík V, HulačováH, Borovičková L., Ježek R and Bednářová L. New potent antimicrobial peptides from the venom of Polistinae wasps and their ana35 logs. Peptides (2008) 29, 992-1 003.

9. Čeřovský V., Hovorka O., Cvačka J., Voburka Z., Bednářová L., Borovičková L., Slaninová J., a Fučík V. Melectin: a novel antimicrobial peptide from the venom of the cleptoparasitic bee Melecta albifrons. ChemBioChem 9,2 815-2 821 (2008).

10. SchifferM. and Edmundson A.B. Use of helical wheels to represent the structures of proteins and to identity segments with helical potential. Biophys. J. 7, 121-135 (1967).

11. Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. Amphipathic, α-helical antimicrobial peptides. Biopo45 lymers (Peptide Science) 55,4-30 (2000)

12. Pathak N., Salas-Auvert R„ Ruche G., Janna M.-H., McCarthy D., Harrison R.G. Comparison of the effect of hydrophobicity, amphiphilicity, and a-helicity on the activities of antimicrobial peptides. Proteins: Struct. Funct. Genet. 22; 182-86 (1995)

13. ConlonJ.M., AUGhaferiN., Abraham B. and LeprinceJ. Strategies for transformation of naturally-occurring amphibian antimicrobial peptides into therapeutically valuable antiinfective agents. Methods 42,349-357 (2007).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Antim ikrobiální peptidy mající následující vzorce:

peptid antimikrobiální aktivita MIC [gmol.l'¹] hemolytická aktivita LC50 P.a. B.s. E.c. (I) 0,7 7,4 3,8 45 80 (II) 0,8 7,5 2/2 33 80 (I-A/l) 1,1 6,0 1,8 12,5 93 (I-A/2) 2/2 100 28 90 >200 (I-A/3) 0,75 12,5 6*0 50 111 (Π-Α/1) 1,5 25 3 12,5 95
2. Použití antimikrobiálních peptidů podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení mikrobiálto nich, parazitických, plísňových onemocnění a pro léčení rakovin.