WO2012011848A1 - Полипептид с антибактериальной активностью и средство для лечения бактериальных инфекций - Google Patents

Полипептид с антибактериальной активностью и средство для лечения бактериальных инфекций Download PDF

Info

Publication number
WO2012011848A1
WO2012011848A1 PCT/RU2011/000535 RU2011000535W WO2012011848A1 WO 2012011848 A1 WO2012011848 A1 WO 2012011848A1 RU 2011000535 W RU2011000535 W RU 2011000535W WO 2012011848 A1 WO2012011848 A1 WO 2012011848A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
peptides
polypeptide
peptide
treatment
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000535
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Максим Н. ЖМАК
Борис В. ПИНЕГИН
Анна С. БУДИХИНА
Елена С. ФЕДЕНКО
Евгений А. МАКАРОВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохарт"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохарт" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохарт"
Publication of WO2012011848A1 publication Critical patent/WO2012011848A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to biochemistry, in particular to new peptide compounds having a bactericidal effect. More specifically, the invention relates to the use of such compounds for the manufacture of medicaments for the prevention or therapeutic treatment of a bacterial or fungal infection of a person.
  • antimicrobial peptides can be an alternative to classical antibiotics (Giuliani et al., 2008, Cell. Mol. Life Sci., 65, 2450 - 2460).
  • Antimicrobial peptides were isolated from plants, insects, fish, amphibians, and mammals (Ganz, T., 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen, 8, 209-217). These peptides vary in length, amino acid composition and structure, but most of them are small cationic amphipathic peptides with a wide spectrum of activity against gram-positive and gram-negative bacteria, yeast, fungi and enveloped viruses. Several human proteins and peptides also have antimicrobial activity and play an important role in the innate immunity system.
  • Defensins are cationic peptides containing three disulfide bonds between six cysteine residues and having a three-loop beta-folded spatial structure.
  • Two classes of defensins were discovered in humans: alpha-defensins and beta-defensins.
  • Alpha defensins are chemoattractants with respect to monocytes, dendritic cells and T lymphocytes. They are an important component of the human immune system, protecting the body from infection and participating in the development of an adaptive (acquired) immune response.
  • Beta-defensins are chemoattractants for dendritic and memory T cells through the CCR6 chemokine receptor (Tang Y.-Q.
  • the mouse model shows that human defensins, administered intranasally, enhance the acquired immune response by increasing the level of antigen-specific IgG and IgM in serum blood (Lillard JW et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 651-656). Defensins exhibit high antibacterial, antifungal and antiviral activity against a wide range of microorganisms (Selsted M.E. et al., 1984, Infect. Immun. 46, 150-154).
  • Histatins are small, cationic, histidine-enriched peptides found in human saliva (MacKay B.J. et al., 1984, Infect. Immun. 44, 688-694). These peptides are produced and secreted by the submandibular, sublingual and parotid glands (van derSpek J.C. et al., 1989, Am. J. Hum. Genet. 45: 381-387). Studies have shown that histatins have some bactericidal and, most importantly, fungicidal effect (Pollock J.J. et al., 1984, Infect. Immun. 44: 702 707). These peptides are part of the innate immunity system and play a key role in limiting oral infections. Histatins have a disordered structure in aqueous solutions and form an alpha helix in non-aqueous solvents.
  • the third group of human antimicrobial peptides contains only one peptide - cathelicidin LL-37.
  • LL-37 is formed by proteolytic cleavage of the C-terminal portion of the hCAP18 protein, which is expressed in leukocytes, such as neutrophils, monocytes, adopted role in the epithelial cells of the skin, gastrointestinal and respiratory tract (Gudmundsson GH et al., 1996, Eur. J. Biochem. 238, 325-332). Increased expression of LL-37 occurs in response to an inflammatory or infectious process (M. Frohm, 1997, J. Biol. Chem. 272, 15258-15263).
  • LL-37 has antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria (Turner J. et al., 1998, Antimicrob. Agents Chemother., 42, 2206-2214), as well as the ability to bind and neutralize bacterial lipopolysaccharide (LPS) and protect against endotoxic shock during purulent infection (Bals R. et al., 1999, Infect. Immun. 67, 6084-6089).
  • LPS bacterial lipopolysaccharide
  • LL-37 is a chemoattractant for neutrophils, monocytes, mast cells and T-lymphocytes, stimulates wound healing and re-epithelization of the skin (Zanetti M., 2004, J. Leukoc. Biol. 75, 39-48).
  • LL-37 consists of 37 amino acids, does not contain cysteine and has a linear structure.
  • cathelicidin has a disordered structure in a hydrophilic environment and form an amphipathic alpha-helix in a hydrophobic environment.
  • the main mechanism of action of human antimicrobial peptides is based on the electrostatic binding of a positively charged peptide to negatively charged components of the outer membrane of the pathogen, which are represented by lipopolysaccharide (LPS) in gram-negative bacteria, polysaccharide (teichoic acid) in gram-positive bacteria and phospholipids.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the antimicrobial peptide databases contain more than one and a half thousand substances (http://aps.unmc.edu/AP/main.php), to date, some of them are at different stages of clinical trials as medicines for the treatment and prevention of local and systemic infections (Gordon YJ et al., 2005, Curr Eye Res. July, 30 (7), 505-515), but the need to create new structures suitable for obtaining drugs based on them is only increasing. Since candidate peptides for use as medicines should not only possess the desired biological activity, but also be suitable for industrial production.
  • the present invention solves the problem of expanding the arsenal of antimicrobial peptides suitable for the preparation of drugs based on them for the treatment and prevention of bacterial infections of humans. Disclosure of the invention.
  • SE-41 which is a retro-sequence of the C-terminal part of the CAP 18 protein, which has antimicrobial activity and has the following amino acid composition SEQ ID ⁇ : 1: SETRPVLNRLFDKIRQVIRKFEKGIKEKSb RFFDGLLAFRK, as well as fragments of the SE-41 peptide having its composition is from 16 to 40 amino acids and selected from the group consisting of SE40, SE39, SE38, SE37, SE36, SE35, SE34, SE33, ET32, TR31, RP30, PV29, VL28, LN27, NR26, RL25, KF24, FD23, DK22, KI21, IR20, RQ19, QV18, VI17, IR16, ETZZ, TR32, RP31, PV30, VL29, LN28, NR27, RL26, LF25, FD24, DK23, KI22,
  • Retro peptides are molecules that have a topochemical affinity for the original peptides, isomeric to natural peptides and differing from them in the opposite direction of the peptide bonds. Such molecules may possess the biological activity of the starting compounds.
  • a computer model of the alpha helix, both direct and retro-sequence indicates a high probability of the formation of an amphipathic structure under physiological conditions, which is a key factor for peptides to exhibit bactericidal activity.
  • the invention also encompasses retro peptide analogues and modified retro peptides.
  • Analogues include peptides obtained by replacing one or several amino acids with homologous ones, as well as peptides that are retro-sequences of the C-terminal part of the CAP 18 protein of various mammals, for example, macaque, gibbon, orangutan, chimpanzee, rat, gorilla, mouse, etc. .d., the sequences of which can be found in public databases (http://au.expasy.org/cgi-bin/blast.pl).
  • An additional aspect of the invention are peptides derived from SE-41 SEQ ID ⁇ : 1 and its fragments by replacing one or more homologous amino acids.
  • the following pairs of amino acids are related to homologous ones; the choice of any amino acid from a pair does not lead to a noticeable change in the properties of the peptide: Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr Phe, Ala Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala Glu, Asp / Gly (WO 2004/108752).
  • modified peptides that contain amino acids in the D form and / or the alpha-amino group of N- the terminal amino acid is acetylated and the alpha-carboxyl group of the C-terminal amino acid is amidated.
  • modifications can increase the resistance of peptides to the action of proteolytic enzymes.
  • amino acids constituting the polypeptide are independently selected from D or L forms.
  • the technical result of the claimed invention is achieved due to such properties of the new peptide as: the ability to obtain a peptide using chemical synthesis, bactericidal activity, wound healing effect.
  • the claimed peptides are relatively small in size and contain from 16 to 41 amino acids, they can be obtained using chemical synthesis.
  • the peptides are linear and do not contain cysteines, which also simplifies their production by chemical synthesis, since the possibility of the formation of inactive isomers upon closure of disulfide bonds is excluded.
  • Additional features of the claimed peptides, which provide a bactericidal effect, are a positive total charge and the ability to form an amphipathic alpha-helix in a non-aqueous environment.
  • An additional aspect of the invention is the bactericidal activity of the claimed peptides, shown in experiments using flow laser cytofluorimetry on bacteria Staphylococcus aureus (Wood46). For complete inhibition of the growth of these microorganisms in experiments in vitro, micromolar concentrations of the claimed peptides are required.
  • the LD50 for SE-41 is 4.0 ⁇ g / ml, and for LL-37 - 4.3 ⁇ g / ml.
  • bactericidal activity was shown for the following fragments of the peptide SE-41: SE37, IR20, IR24, LN31, LN35, characterized in that they have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 151.
  • the bactericidal properties of the claimed peptides for example, peptides SE41, LN31, IR20, IR24, characterized in that they have the amino acid sequence of SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 90, were confirmed in the classical bacteriological experiment of inhibiting the formation of colony forming units on solid nutrient media on Petri dishes.
  • the claimed peptides also have a wound healing effect in experiments on a model of planar wound defect in laboratory mice at a concentration of 25 ⁇ g / ml.
  • the set of essential features of the claimed peptides allows to achieve a technical result - to use new bactericidal peptides to obtain drugs for the treatment and prevention of bacterial infections of humans.
  • the hydroxyl group I-alkoxybenzyl polymer 0.37 mmol / g, is washed with dimethylformamide, diethyl ether and dried on a glass filter. 300 mg of p-alkoxybenzyl polymer and 13.2 mg of dimethylaminopyridine (0.11 mmol) are suspended in a minimum volume of dimethylformamide.
  • Peptide synthesis SE41 SETRPVLNRLFDKIRQVIRKFEKGIKEKSKRFFDGLLAFRK.
  • the synthesis of the polypeptide chain is carried out manually in a glass flow reactor (2 ⁇ 20 cm) according to the following protocol for each synthetic cycle (based on 8-10 ml of solvent per 300 mg of the starting polymer); during the condensation reaction (step 6), the volume of the reaction mixture 3 -4 ml:
  • peptidyl polymer For the reaction of cleavage of the peptide from the polymer and simultaneous release of the protective groups of the amino acid side chains, 300 mg peptidyl polymer (from 1.2 g of peptidyl polymer). 5 ml of a mixture of TPA-EOT-OMB-L ⁇ cresol in a volume ratio of 91: 3: 3: 3 are added to the peptidyl polymer, the suspension is stirred for 2 hours, then the resulting peptide solution is filtered off from the polymer, washed with 5 ml of TFA and excess TFA was evaporated under reduced pressure. The peptide is precipitated with 100 ml of ethyl ether, filtered and washed with ether (5 x 20 ml).
  • the precipitate was dissolved in 5 ml of 10% AcOH for 20 minutes, filtered and washed with 5 ml of 10% AcOH.
  • the resulting peptide solution was lyophilized and desalted on a column (2.5 x 60 cm) with Sephadex G-10 in 0.1 M AcOH.
  • the peptide was purified using reverse-phase HPLC in an acetonitrile gradient (from 10% to 70% in 60 minutes) in 0.1% TFA at an eluent flow rate of 4 ml / min; the absorption of the eluate was recorded at a wavelength of 226 nm. Fractions corresponding to the main peak in the chromatogram are collected and lyophilized.
  • the yield of the peptide based on the C-terminal amino acid was 30%.
  • the peptide is analyzed by analytical HPLC and mass spectrometry.
  • Analytical reverse phase HPLC was carried out in an acetonitrile gradient in 0.1% TFA (from 10% to 70% in 60 minutes) at an eluent flow rate of 1 ml / min, the absorption of the eluate was recorded at a wavelength of 226 nm.
  • the retention time of the peptide under analytical HPLC was 40.3 minutes.
  • Example 2 Evaluation of the bactericidal activity of the peptides LL-37 and SE-41 by flow laser cytofluorimetry.
  • the daily agar culture of St.aureus was washed with phosphate-buffered saline (PBS), disintegrated by ultrasound on an ultrasonic bath (51 kHz, 90 W) for 2 hours, precipitated at 1000 g for 25 minutes and washed with 10 ml of PBS.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the second time the washing is carried out with 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.5). Resuspend in the same buffer and, according to the turbidity standard, the concentration of bacteria is adjusted to 1x10 / ml.
  • St.aureus-FITZ + was adjusted to 5x108 / ml using Tru Count tubes (Becton Dickinson) with a known number of microbeads. Aliquots are stored at -70 ° C.
  • the reaction of bactericidal activity of biological fluids is carried out in a 96-well round about the bottom plate. For this, 90 ⁇ l of cationic peptides and 90 ⁇ l of St.aureus-FITC + (1x10 7 CFU / ml) are incubated for 3 hours at + 37 ° C.
  • the control of the reaction is the spontaneous death of St.aureus-FITC "1" (bacteria with FSB under the same conditions).
  • LD 50 is calculated by the Ashmarin-Kerber method (Table 5. Determination of LD50 of preparations in relation to St.aureus Wood46).
  • Example 3 Evaluation of the antimicrobial effect of synthetic cationic peptides LL37 and SE41 using the classical bacteriological method.
  • the antimicrobial effect of the obtained synthetic cationic peptides was evaluated by the classical bacteriological method.
  • the antimicrobial properties of synthetic cationic peptides were studied on the models of St.aureus (Wood46) and Escherichia coli (ATCC 25922).
  • the experiment is carried out in sterile plastic tubes with a volume of 1.5 ml (Sarstedt). 10 ⁇ l of bacteria, 10 ⁇ l of a solution of a synthetic peptide in an appropriate concentration and 30 ⁇ l of PBS are added to the tubes. The peptide was not added to the control tube.
  • concentrations 0.2, 2, and 20 ⁇ g / ml and 2.5, 5, 10, and 20 ⁇ g / ml, respectively.
  • Plastic tubes with a mixture of bacteria and peptides were incubated in a TW-2.02 water bath (ELMI) for 3 h at 37 ° C.
  • Example 4 The study of the wound healing effect of the peptide SE41 on a model of planar wound defect in laboratory mice.
  • mice 20 F ⁇ SVAhS57 BL / 6
  • a “mark” of 0.5 cm x 0.5 cm is applied on the screen and a full-layer skin flap is cut, simulating a standard wound defect in area.
  • animals are divided into 4 groups of 5 mice:
  • mice that are dripped on the wound with a solution of SE41 at a concentration of 25 ⁇ g / ml. Animals of each group are kept in separate cages in the same conditions for 5 pcs. with free access to water and food.
  • SE41 For the preparation of working solutions SE41 using sterile pyrogen-free water with the addition of 0.9% sterile sodium chloride. Saline thus prepared serves as the basis for further dilution of SE41 to working concentrations. SE41 solutions are prepared before application to wounds.
  • SE41 solutions are dripped into the wound one day after the injury using an insulin syringe without a needle of 0.1 ml, then daily for 7 days.
  • the peptide SE41 has wound healing activity when applied locally at a concentration of 25-50 ⁇ g / ml. The best effect is observed when using a solution of SE41 with a concentration of 25 ⁇ g / ml.
  • Example 5 Evaluation of the bactericidal activity of fragments of the peptide SE-41 by flow laser cytofluorimetry.
  • LD50 LD50 of SE-41 peptide and its fragments against St.aureus (Wood 46) in flow cytometry.
  • Table 15 LD50 of the peptide SE-41 and its fragments against St.aureus (Wood 46) in flow cytometry.
  • Example 6 Evaluation of the antimicrobial action of the peptide SE41 and its fragments using the classical bacteriological method.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полипептидов с антибактериальной активностью, и может быть использовано в медицине. Получают полипептид следующей формулы (I). Изобретение позволяет получить полипептид, эффективный в лечении и профилактике бактериальных инфекций человека.

Description

ПОЛИПЕПТИД С АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СРЕДСТВО
ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Область техники, к которой относится изобретение.
Настоящее изобретение относится к биохимии, а именно к новым пептидным соединениям, обладающим бактерицидным эффектом. Более конкретно данное изобретение относится к применению таких соединений для производства лекарственных препаратов для профилактики или терапевтического лечения бактериальной или грибковой инфекции человека.
Уровень техники.
С середины прошлого столетия для борьбы с бактериальными инфекциями широко применяют антибиотики, однако, использование антибиотиков сталкивается с проблемой появления устойчивых штаммов микроорганизмов. Увеличение устойчивости к классическим антибиотикам отмечено у целого ряда патогенов человека: Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeroginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi. В связи с этим явлением поиск новых веществ, обладающих антимикробной активностью, является актуальной задачей. Открытие в 1980-х годах антимикробных пептидов, как ключевых инструментов системы врожденного иммунитета, позволяет разрабатывать на их основе антибиотики с принципиально новым механизмом действия, который не вызывает появления устойчивости у бактерий. Поэтому антимикробные пептиды могут стать альтернативой классическим антибиотикам (Giuliani et al., 2008, Cell. Mol. Life Sci., 65, 2450 - 2460).
Антимикробные пептиды были выделены из растений, насекомых, рыб, земноводных и млекопитающих (Ganz Т., 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen, 8, 209-217). Эти пептиды различаются по длине, аминокислотному составу и структуре, но большинство из них небольшие катионные амфипатические пептиды с широким спектром действия против грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий, дрожжей, грибов и оболочечных вирусов. Несколько белков и пептидов человека также обладают антимикробной активностью и играют важную роль в системе врожденного иммунитета.
К настоящему моменту известны три основные группы антимикробных пептидов человека (Табл.1. Аминокислотные последовательности дефенсинов, гистатинов и кателицидина (LL-37)): дефенсины, гистатины, кателицидины (Contreras R., 2005, Biotechnology Letters, 27, 1337-1347). Таблица 1. Аминокислотные последовательности дефенсинов, гистатинов и кателицидина (LL-37).
Figure imgf000004_0001
Дефенсины - катионные пептиды, содержащие три дисульфидные связи между шестью остатками цистеина, и имеющие трехпетельную бета-складчатую пространственную структуру. У человека было обнаружено два класса дефенсинов: альфа- дефенсины и бета-дефенсины. Альфа-дефенсины являются хемоаттрактантами по отношению к моноцитам, дендритным клеткам и Т- лимфоцитам. Они являются важным компонентом иммунной системы человека, осуществляя защиту организма от инфекции и участвуя в развитии адаптивного (приобретённого) иммунного ответа. Бета-дефенсины - хемоаттрактанты для дендритных и Т-клеток памяти через хемокиновый рецептор CCR6 (Tang Y.-Q. et al., 1999, Science 286, 498-502). На мышиной модели показано, что человеческие дефенсины, введенные интраназально, усиливают приобретенный иммунный ответ, увеличивая уровень антиген-специфичных IgG и IgM в сыворотке крови (Lillard J.W. et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96, 651-656). Дефенсины проявляют высокую антибактериальную, антигрибковую и антивирусную активность против широкого спектра микроорганизмов (Selsted М.Е. et al., 1984, Infect. Immun. 46, 150-154). В опытах in vitro минимальная концентрация ингибирующая рост микроорганизмов для большинства дефенсинов находится в интервале 0.5-10 мкМ (Risso А., 2000, J. Leukoc. Biol. 68, 785-792). Эти данные доказывают, что дефенсины участвуют в процессах врожденного и приобретенного иммунитета.
Гистатины - небольшие, катионные, гистидин-обогащенные пептиды, обнаруженные в слюне человека (MacKay B.J. et al., 1984, Infect. Immun. 44, 688-694). Эти пептиды продуцируются и секретируются подчелюстными, подъязычными и околоушными гландами (van derSpek J.C. et al., 1989, Am. J. Hum. Genet. 45: 381-387). Исследования показали, что гистатины обладают некоторым бактерицидным и, что особенно важно, фунгицидным действием (Pollock J.J. et al., 1984, Infect. Immun. 44: 702 707). Эти пептиды являются частью системы врожденного иммунитета и играют ключевую роль в ограничении инфекций полости рта. Гистатины имеют неупорядоченную структуру в водных растворах и образуют альфа-спираль в неводных растворителях.
Третья группа антимикробных пептидов человека содержит только один пептид - кателицидин LL-37. LL-37 образуется при протеолитическом отщеплении С-концевой части белка hCAP18, который экспрессируется в лейкоцитах, таких как, нейтрофилы, моноциты, ΝΚ-клетки, Т-клетки, В-клетки, и в эпителиальных клетках кожи, желудочно-кишечного и дыхательного трактов (Gudmundsson G.H. et al.,1996, Eur. J. Biochem. 238, 325-332). Повышение экспрессии LL-37 происходит в ответ на воспалительный или инфекционный процесс (Frohm М., 1997, J. Biol. Chem. 272, 15258- 15263). LL-37 обладает антимикробной активностью против грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий (Turner J. et al., 1998, Antimicrob. Agents Chemother., 42, 2206-2214), а также способностью связывать и нейтрализовывать липополисахарид (LPS) бактерий и защищать против эндотоксического шока при гнойной инфекции (Bals R. et al., 1999, Infect. Immun. 67, 6084-6089). Кроме того, LL-37 является хемоаттрактантом для нейтрофилов, моноцитов, тучных клеток и Т-лимфоцитов, стимулирует ранозаживление и реэпитализацию кожи (Zanetti М., 2004, J. Leukoc. Biol. 75, 39-48). LL-37 состоит из 37 аминокислот, не содержит цистеина и имеет линейную структуру. Так же как и гистатин, кателицидин обладает неупорядоченной структурой в гидрофильном окружении и образуют амфипатическую альфа-спираль в гидрофобной среде. Основной механизм действия антимикробных пептидов человека основан на электростатическом связывании положительно заряженного пептида с отрицательно заряженными компонентами внешней мембраны патогена, которые представлены липополисахаридом (LPS) у грамм-отрицательных бактерий, полисахаридом (тейхоевой кислотой) у грамм-положительных бактерий и фосфолипидами. Следующее за связыванием с мембраной встраивание пептида в липидный бислой бактериальной клетки, приводит к образованию пор, к хаотизации липидного бислоя и, в конечном счете, к разрушению микроорганизма (White et al. 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 521- 527).
В базах данных по антимикробным пептидам содержится более полутора тысяч веществ (http://aps.unmc.edu/AP/main.php), к настоящему времени некоторые из них находятся на разных стадиях клинических испытаний в качестве лекарственных средств для лечения и профилактики местных и системных инфекций (Gordon Y.J. et al., 2005, Curr Eye Res. July, 30(7), 505-515), но необходимость в создании новых структур, пригодных для получения на их основе лекарственных средств, только возрастает. Поскольку пептиды- кандидаты для использования в качестве лекарственных средств должны не только обладать нужной биологической активностью, но и быть пригодными для промышленного получения. С этой стороны вышеприведенные пептиды обладают некоторыми недостатками: гистатины проявляют большую фунгицидную активность, нежели бактерицидную, и это ограничивает их применение, а дефенсины, ввиду их структуры, сложны для получения, поскольку в процессе образования трех дисульфидных связей между остатками цистеина могут образовываться изомерные продукты, которые не обладают биологической активностью. В то же время, кателицидин (LL-37) не содержит цистеинов, поэтому может быть получен при помощи химического синтеза с высоким выходом, и обладает мощным бактерицидным эффектом. LL-37 является наиболее близким к заявляемому пептиду по структуре и антимикробным свойствам. Подробные сведения о свойствах LL-37 и его фрагментов, а также о применении этих пептидов для лечения различных бактериальных инфекций человека можно найти в патентах WO2009/001087, WO2004/067025, WO96/08508, RU2346950.
Настоящее изобретение решает задачу расширения арсенала антимикробных пептидов пригодных для получения на их основе лекарственных средств для лечения и профилактики бактериальных инфекций человека. Раскрытие изобретения.
Поставленная задача решается за счет структуры пептида SE-41, являющегося ретро- последовательностью С-концевой части белка САР 18, обладающего антимикробной активностью и имеющего следующий аминокислотный состав SEQ ID ΝΟ:1: SETRPVLNRLFDKIRQVIRKFEKGIKEKSb RFFDGLLAFRK, а также фрагментов пептида SE-41, имеющих в своем составе от 16 до 40 аминокислот и выбранных из группы, состоящей из SE40, SE39, SE38, SE37, SE36, SE35, SE34, SE33, ЕТ32, TR31, RP30, PV29, VL28, LN27, NR26, RL25, KF24, FD23, DK22, KI21, IR20, RQ19, QV18, VI17, IR16, ЕТЗЗ, TR32, RP31, PV30, VL29, LN28, NR27, RL26, LF25, FD24, DK23, KI22, IR21, RQ20, QV19, VI18, IR17, ЕТ34, TR33, RP32, PV31, VL30, LN29, NR28, RL27, LF26, FD25, DK24, KI23, IR22, RQ21, QV20, VI19, IR18, ЕТ35, TR34, RP33, PV32, VL31, LN30, NR29, RL28, LF27, FD26, DK25, KI24, IR23, RQ22, QV21, VI20, IR19, ЕТ36, TR35, RP34, PV33, VL32, LN31, NR30, RL29, LF28, FD27, DK26, KI25, IR24, RQ23, QV22, VI21, IRK20, ЕТ37, TR36, RP35, PV34, VL33, LN32, NR31, RL30, LF29, FD28, DK27, KI26, IR25, RQ24, QV23, VI22, IR21, ЕТ38, TR37, RP36, PV35, VL34, LN33, NR32, RL31, LF30, FD29, DK28, KI27, IR26, RQ25, QV24, VI23, IR22, ЕТ39, TR38, RP37, PV36, VL35, LN34, NR33, RL32, LF31, FD30, DK29, KI28, IR27, RQ26, QV25, VI24, IR23, ЕТ40, TR39, RP38, PV37, VL36, LN35, NR34, RL33, LF32, FD31, DK30, KI29, IR28, RQ27, QV26, VI25, IRK24; и характеризующихся тем, что имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:l l, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID N0:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID
NO: 100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID
NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID
NO: 110, SEQ ID NO:l l l, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID
NO: 115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID
NO: 120, SEQ ID NO-.121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID
NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:129, SEQ ID
NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID
NO:135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID
NO: 140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID
NO:145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID
NO: 150, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID
NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID
NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162 соответственно. Аминокислотные последовательности заявляемых пептидов приведены в табл. 2.
Таблица 2. Аминокислотные последовательности заявляемых пептидов.
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Ретро-пептиды это молекулы, имеющие топохимическое сродство с исходными пептидами, изомерные природным пептидам и отличающиеся от них противоположным направлением пептидных связей. Такие молекулы могут обладать биологической активностью исходных соединений. Для С-концевого фрагмента белка САР 18 человека компьютерная модель альфа-спирали, как прямой так и ретро-последовательности, указывает на высокую вероятность образования в физиологических условиях амфипатичекой структуры, что является ключевым фактором для проявления пептидами бактерицидной активности.
Помимо самих ретро-пептидов изобретение охватывает также аналоги ретро-пептидов и модифицированные ретро-пептиды. К аналогам относят пептиды, полученные путем замены одной или нескольких аминокислот на гомологичные, а также пептиды, являющиеся ретро-последовательностями С-концевой части белка САР 18 различных млекопитающих, например, макаки, гиббона, орангутанга, шимпанзе, крысы, гориллы, мыши и т.д., последовательности которых можно найти в общедоступных базах данных (http://au.expasy.org/cgi-bin/blast.pl). Дополнительным аспектом изобретения являются пептиды, полученные из SE-41 SEQ ID ΝΟ:1 и его фрагментов путем замены одной или нескольких аминокислот на гомологичную. Следующие пары аминокислот относят к близким, гомологичным, выбор любой аминокислоты из пары не приводит к заметному изменению свойств пептида: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr Phe, Ala Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala Glu, Asp/Gly (WO 2004/108752). Еще одним аспектом изобретения являются модифицированные пептиды, которые содержат аминокислоты в D форме и/или альфа-аминогруппа N- концевой аминокислоты ацетилирована, а альфа-карбоксильная группа С-концевой аминокислоты амидирована. Такие модификации позволяют повысить устойчивость пептидов к действию протеолитических ферментов.
Таким образом, с учетом всех условий формулу заявляемых пептидов можно представить в общем виде:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
и где аминокислоты, составляющие полипептид, выбраны независимо из D или L форм. Технический результат заявляемого изобретения достигается за счет таких свойств нового пептида, как: возможность получения пептида при помощи химического синтеза, бактерицидная активность, ранозаживляющее действие.
Поскольку заявляемые пептиды относительно небольшие по размеру и содержат в своем составе от 16 до 41 аминокислоты, то они могут быть получены при помощи химического синтеза. Кроме того, пептиды являются линейными и не содержат цистеинов, что также упрощает их получение химическим синтезом, поскольку исключена возможность образования неактивных изомеров при замыкании дисульфидных связей. Дополнительными признаками заявляемых пептидов, которые обеспечивают бактерицидное действие, являются положительный суммарный заряд и способность образовывать амфипатическую альфа-спираль в неводном окружении. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей пептидов SE-41 и его ближайшего известного аналога LL-37, проведенный при помощи программы на Интернет-сайте базы данных антимикробных пептидов
(http://aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php), приведен в табл. 3.
Таблица 3. Свойства пептидов SE-41 и LL-37.
Figure imgf000016_0001
Из данных представленных в таблице 3 следует, что ключевые для образования амфипатической альфа-спирали и проявления пептидом бактерицидных свойств параметры, а именно положительный суммарный заряд, процент гидрофобности, индекс Бомана (Boman, H.G.(2003)J.Inter.Med.254: 197-215) и число гидрофобных остатков на одной стороне поверхности молекулы, лучше для заявляемого пептида SE-41 SEQ ID ΝΟ:1 по сравнению с известным аналогом LL-37.
Дополнительным аспектом изобретения является бактерицидная активность заявляемых пептидов, показанная в опытах с применением проточной лазерной цитофлуориметрии на бактериях Staphylococcus aureus (Wood46). Для полного ингибирования роста перечисленных микроорганизмов в опытах in vitro необходимы микромолярные концентрации заявляемых пептидов. При этом LD50 для SE-41 составляет 4.0 мкг/мл, а для LL-37 - 4.3 мкг/мл. Кроме того, бактерицидная активность была показана для следующих фрагментов пептида SE-41 : SE37, IR20, IR24, LN31, LN35, характеризующихся тем, что имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:151.
Дополнительно бактерицидные свойства заявляемых пептидов, на примере пептидов SE41, LN31, IR20, IR24, характеризующихся тем, что имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:90, были подтверждены в классическом бактериологическом опыте ингибиции образования колониеобразующих единиц на твёрдых питательных средах на чашках Петри. Также заявляемые пептиды оказывают ранозаживляющее действие в опытах на модели плоскостного раневого дефекта у лабораторных мышей в концентрации 25мкг/мл.
Таким образом, совокупность существенных признаков заявляемых пептидов позволяет достичь технического результата - использовать новые бактерицидные пептиды для получения лекарственных средств для лечения и профилактики бактериальных инфекций человека.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Синтез пептида SE41 SEQ ID ΝΟ:1 :
Получение Fmoc-Lys(Boc)-P (I).
Я-алкоксибензильный полимер с содержанием гидроксильных групп 0,37 ммоль/г промывают диметилформамидом, диэтиловым эфиром и сушат на стеклянном фильтре. В минимальном объеме диметилформамида суспендируют 300 мг п- алкоксибензильного полимера и 13,2 мг диметиламинопиридина (0,11 ммоль). В 5 мл диметилформамида растворяют 515 мг (1,1 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 149 мг (1,1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, и 172 мкл (1,1 ммоль) ΝΝ'- диизопропилкарбодиимида, раствор перемешивают 10 мин при 0° С и затем приливают к суспендированному полимеру. Реакцию проводят 4 часа при периодическом перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают диметилформамидом и обрабатывают 5 мл смеси Ас20-пиридин-СН2С12
(20:20:60) в течение 1 ч., после чего полимер промывают изопропанолом и диметилформамидом .
Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-P (И),
а) Полученный на предыдущем этапе пептидил-полимер (I) в течение 20 мин. обрабатывают 20%-ным раствором пиперидина в диметил формами де. Полимер промывают последовательно 5 мл следующих растворителей: диметилформамидом - 3 раза по 2 мин., смесью диоксан-вода (2:1) - 2 раза по 5 мин., диметилформамидом - 5 раз по 2 мин.
б) В 5 мл диметилформамида растворяют 713 мг (1,1 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 149 мг (1,1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, и 172 мкл (1,1 ммоль) ΝΝ'- диизопропилкарбодиимида, раствор перемешивают 10 мин при 0° С и затем приливают к суспендированному полимеру. Реакцию проводят 4 часа при периодическом перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают диметилформамидом, и обрабатывают 5 мл смеси Ас20-пиридин-диметилформамид
(20:20:60) в течение 1 ч., после чего полимер последовательно промывают диметилформамидом, изопропанолом, диметилформамидом.
Синтез пептида SE41 : SETRPVLNRLFDKIRQVIRKFEKGIKEKSKRFFDGLLAFRK.
Синтез полипептидной цепи проводят вручную в стеклянном проточном реакторе (2 χ 20 см) по следующему протоколу для каждого синтетического цикла (из расчета 8-10 мл растворителя на 300 мг исходного полимера), при проведении реакции конденсации (операция 6) используют объем реакционной смеси 3-4 мл:
1. DMF (5 x 2 мин.);
2. 20% пиперидин в DMF (20 мин.);
3. DMF (3 х 2 мин.);
4. диоксан-вода, 2:1, (2 х 5 мин.);
5. DMF (5 x 2 мин.);
6. Реакция конденсации: 10 экв. активированной Fmoc-аминокислоты (4 ч.);
7. DMF (3 x 2 мин.);
8. ацетилирование: Ас20-пиридин-диметилформамид, 20:20:60, (1 ч.);
9. DMF (3 x 2 мин.);
10. изопропанол (3 x 2 мин.);
Для активации Fmoc-производных аминокислот DIPCDI/HOBT-методом к раствору 10 экв.( 1.1 ммоль) Fmoc-защищенной аминокислоты и 149 мг (10 экв., 1.1ммоль) HOBt в 3-4 мл DMF добавляют 172 мкл (10 экв., 1.1ммоль) DIPCDI, раствор перемешивают 10 мин.
Полноту протекания реакции конденсации контролируют с помощью нингидринового или, в случае Ν-концевого пролина, пикринового тестов после операции 6 синтетического протокола.
Для реакции отщепления пептида от полимера и одновременного деблокирования защитных групп боковых цепей аминокислот отбирают 300 мг пептидил-полимера (из 1.2г пептидил-полимера). К пептидил-полимеру приливают 5 мл смеси ТРА-ЕОТ-ОМБ-л^-крезол в объемном соотношении 91 :3:3:3, суспензию перемешивают в течение 2 ч., затем полученный раствор пептида отфильтровывают от полимера, промывают 5 мл TFA и избыток TFA упаривают при пониженном давлении. Пептид осаждают 100 мл этилового эфира, отфильтровывают и промывают эфиром (5 х 20 мл). Осадок растворяют в 5 мл 10% АсОН 20 мин., отфильтровывали и промывают 5 мл 10% АсОН. Полученный раствор пептида лиофилизовывают и обессоливают на колонке (2,5 х 60 см) с Сефадексом G-10 в 0.1М АсОН. Очистку пептида проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила (от 10 % до 70 % за 60 мин.) в 0,1% TFA при расходе элюента 4 мл/мин, поглощение элюата регистрируют при длине волны 226 нм. Фракции, соответствующие основному пику на хроматограмме собирают и лиофилизируют. Выход пептида в расчете на С- концевую аминокислоту составил 30%. Пептид анализируют с помощью аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводят в градиенте ацетонитрила в 0,1% TFA (от 10 % до 70 % за 60 мин.) при расходе элюента 1 мл/мин, поглощение элюата регистрируют при длине волны 226 нм. Время удерживания пептида в условиях аналитической ВЭЖХ составило 40,3 мин. Экспериментальная молекулярная масса 4993.5, теоретическая молекулярная масса 4992.9.
Сокращения:
01РС01-Ы,М'-диизопропилкарбодиимид; Fmoc-9-флуоренилметилоксикарбонил; НОВТ - 1-гидроксибензотриазол; TFA-трифторуксусная кислота; DMAP- диметиламинопиридин; EDT-этандитиол; DMS-диметилсульфид; АсОН-уксусная кислота; DMF-диметилформамид
Пример 2. Оценка бактерицидной активности пептидов LL-37 и SE-41 методом проточной лазерной цитофлуориметрии.
Антимикробные свойства синтетических катионных пептидов (LL37 и SE41) исследуют на модели St. aureus (Wood46).
Суточную агаровую культуру St.aureus (штамм Wood46) смывают фосфатно- солевым буфером (ФСБ), дезинтегрируют с помощью ультразвука на УЗ-бане (51 кГц, 90 W) 2 часа, осаждают при 1000g 25 мин и отмывают 10 мл ФСБ. Второй раз отмывку проводят 0,01М карбонатно-бикарбонатным буфером (рН=9,5). Ресуспендируют в этом же буфере и по стандарту мутности концентрацию бактерий доводят до 1x10 /мл. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор изотиоцианат флуоресцеина - ФИТЦ (Сигма) из расчёта 1мг/мл и вьщерживают карбонатно-бикарбонатном буфере рН=9,5 в течение 16 часов при +4°С в темноте (St.aureus-ФИТЦ"1"). После инкубации St.aureus-ФИТЦ4" трижды отмывают ФСБ (1000g 25 мин), ресуспендируют в ФСБ с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% ДМСО. Концентрацию
St.aureus-ФИТЦ + доводят до 5x108 /мл с помощью Tru Count пробирок (Becton Dickinson) с известным количеством микробусинок. Аликвоты хранят при -70°С.
После разморозки аликвоты бактерий, осаждают и отмывают в ЮмМ растворе ФСБ рН=7,4 2 раза при 1000g 25 мин.
Реакцию бактерицидной активности биологических жидкостей проводят в 96-луночном кругл о донном планшете. Для этого инкубируют 90 мкл катионных пептидов и 90 мкл St.aureus- ФИТЦ+ (1x107 КОЕ/мл) в течение 3 часов при +37°С. Контролем реакции является спонтанная гибель St.aureus-ФИТЦ"1" (бактерии с ФСБ, находящиеся в тех же условиях).
После инкубации к бактериям вносят пропидиум иодид (2,5 мкг/мл) на ФСБ. Как известно, пропидиум иодид проникает и окрашивает только убитые клетки. Через 10 мин образцы анализируют на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson) в программе CellQuest в координатах FL1 и FL3. Среди общей популяции клеток стафилококка, окрашенных ФИТЦ (зелёный флуорохром), определяют процент клеток стафилококка, окрашенных в пропидиум иодидом (красный флуорохром) (Табл.4. Антибактериальная активность синтетических кателицидинов). Далее при помощи программы Exel расчитывают LD50 методом Ашмарина-Кербера (Табл.5. Определение LD50 препаратов в отношении St.aureus Wood46).
Табл.4. Антибактериальная активность пептидов LL-37 и SE-41.
Figure imgf000020_0001
Табл.5. Определение LD50 пептидов LL-37 и SE-41 в отношении St.aureus Wood46.
Figure imgf000021_0001
Пример 3. Оценка антимикробного действия синтетических катионных пептидов LL37 и SE41 при помощи классического бактериологического метода.
Оценку антимикробного действия полученных синтетических катионных пептидов (кателицидинов) осуществляли классическим бактериологическим методом. Антимикробные свойства синтетических катионных пептидов (LL37 и SE41) исследовали на модели St.aureus (Wood46) и Escherichia coli (АТСС 25922).
Культуру бактерий, выращивают на скошенном триптиказосоевом агаре (Beckton Dickinson), смывают ЮмМ физиологическим раствором PBS (Sigma) рН=7,4 и осаждают при 1000g 25 мин. Далее отмывают в PBS и осадок ресуспендируют в PBS. Методом высева на плотные питательные среды определяют в трёх независимых опытах количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Оптическую плотность (OD) бактериальной суспензии измеряют на спектрофотометре Beckman Coulter DU 730 при λ=620ΗΜ. OD620, равная 0,2, соответствует 5x107 КОЕ/мл. Концентрацию бактерий во всех опытах доводят PBS до 1x107 КОЕ/мл.
Эксперимент проводят в стерильных пластиковых пробирках объёмом 1,5 мл (Sarstedt). В пробирки вносят 10 мкл бактерий, 10 мкл раствора синтетического пептида в соответствующей концентрации и 30 мкл PBS. В контрольную пробирку пептид не вносят. При оценке антибактериального действия пептидов на модели St. aureus и E.coli используют концентрации 0.2, 2 и 20 мкг/мл и 2.5, 5, 10 и 20 мкг/мл соответственно. Пластиковые пробирки со смесью бактерий и пептидов инкубируют в водяной бане TW-2.02 (ELMI) в течение Зч при 37° С. После инкубации смеси разводят раствором PBS и делают высевы в объёме 50 мкл на триптиказосоевый агар (Beckton Dickinson) в чашках Петри. Чашки помещали в термостат при 37°С на 18-24 час, после чего производят подсчёт выросших колониям. Определяют процент убитых бактерий по отношению к контролю и рассчитывают LD50 по методу Рида и Менча.
Результаты экспериментов представлены в табл.6. Оценка противомикробного действия препаратов на модели St.aureus(Wood46) и табл.7. Оценка противомикробного действия препаратов на модели Е.со АТСС 25922), а также на рис.1. Эффект подавления роста бактериальной культуры (St. aureus Wood 46) и рис.2. Эффект подавления роста бактериальной культуры на модели Е. coli(ATCC 25922). Результаты экспериментов показывают, что оба пептида LL-37 и SE-41 обладают высокой бактерицидностью по отношению к St.aureus и E.coli, причём в низких концентрациях эффект на E.coli пептида SE-41 выше, чем LL-37.
Таблица 6. Оценка противомикробного действия препаратов на модели St.aureus(Wood46).
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
Пример 4. Изучение ранозаживляющего действия пептида SE41 на модели плоскостного раневого дефекта у лабораторных мышей.
Ранозаживляющее действие SE41 оценивали на полнослойной ране у 20 мышей F\ (СВАхС57 BL/6). Под легким эфирным наркозом у животных выбривают шерсть на спине, по трафарету наносят «метку» 0,5 см х 0,5 см и вырезают полнослойный лоскут кожи, моделируя стандартный по площади раневой дефект. Через сутки после нанесения раны, животных распределяют на 4 группы по 5 мышей:
1 гр. - контрольные мыши, которым на рану капают физраствор.
2 гр. - мыши, которым на рану капают раствор SE41 в концентрации 100 мкг/мл.
3 гр. - мыши, которым на рану капают раствор SE41 в концентрации 50 мкг/мл.
4 гр. - мыши, которым на рану капают раствор SE41 в концентрации 25 мкг/мл. Животных каждой группы содержат в отдельных клетках в одинаковых условиях по 5 шт. при свободном доступе к воде и пище.
Для приготовления рабочих растворов SE41 используют стерильную апирогенную воду с добавлением 0,9% стерильного хлористого натрия. Приготовленный таким образом физраствор служит основой для дальнейшего разведения SE41 до рабочих концентраций. Растворы SE41 готовят перед нанесением на раны.
На рану растворы SE41 капают через сутки после травмы с помощью инсулинового шприца без иглы по 0,1 мл, далее ежедневно в течение 7 дней.
На 2, 4, 8 и 11 день от начала эксперимента проводят измерение величины ран по массе слюдяных выкроек. Результаты измерений представлены в табл. 10-14.
Таблица 10. Изменение величины раневой поверхности у мышей контрольной группы.
Figure imgf000025_0001
Результаты наблюдения показыват, что в контрольной группе мышей, без использования на ране препарата SE41, раны зажили к 14 дню, у одной мышки из 5 раневой дефект отсутствовал на 11 день после травмы.
Таблица 11. Изменение величины раневой поверхности у мышей группы N° 2
Figure imgf000026_0001
Необходимо отметить, что при нанесении раствора SE41 в концентрации 100 мкг/мл животные проявляли двигательное беспокойство, после чего начинали вылизывать друг другу раневую поверхность. В дальнейшем раны у животных этой группы внешне отличались от ран у животных других групп. Через 48 часов после травмы у животных контрольной группы, Ν° 3 и N° 4 раневой дефект представлял собой сухой струп (корочку), у животных гр. jN° 2 в течение 4 суток после травмы рана была сухой, но корочки не образовывалось, края раны при этом казались приподнятыми над дном раны. Далее сформировался сухой струп и внешний вид уже не отличался, но размеры в среднем были больше, полная краевая эпителизация закончилась к 15 суткам.
Таблица 12. Изменение величины раневой поверхности у мышей группы N° 3
Figure imgf000026_0002
группе N° 3 результаты измерения раневого дефекта практически отличались от контрольной группы, в то же время некоторую тенденцию к ускорению процесса регенерации на 4-8 сутки после раны следует отметить.
В группе N° 4 при лечении ран раствором SE41 в концентрации 25 мкг/мл у всех мышей выявлено ускорение заживления раневого процесса.
Таблица 13. Изменение величины раневой поверхности у мышей группы Ν° 4.
Figure imgf000027_0001
Табл.14. Суммарные данные по ранозаживляющему эффекту SE41 (массы выкройки в мг).
Figure imgf000027_0002
Таким образом, по результатам данного эксперимента можно сделать вывод о наличии у пептида SE41 ранозаживляющей активности при местном его использовании в концентрации 25-50 мкг/мл. Наилучший эффект наблюдается при применении раствора SE41 с концентрацией 25 мкг/мл.
Пример 5. Оценка бактерицидной активности фрагментов пептида SE-41 методом проточной лазерной цитофлуориметрии.
Оценку бактерицидной активности пептидов проводят, как описано в примере 2. Результаты определения LD50 приведены в табл.15. LD50 пептида SE-41 и его фрагментов в отношении St.aureus (Wood 46) в проточной цитофлуориметрии. Таблица 15. LD50 пептида SE-41 и его фрагментов в отношении St.aureus (Wood 46) в проточной цитофлуориметрии.
Figure imgf000028_0001
Пример 6. Оценка антимикробного действия пептида SE41 и его фрагментов при помощи классического бактериологического метода.
Эксперимент по оценке антимикробного действия пептида SE41 и его фрагментов проводят, как описано в примере 3. Результаты приведены в табл.16. Оценка противомикробного действия пептида SE-41 и его фрагментов на модели St.aureus(Wood46).
Таблица 16. Оценка противомикробного действия пептида SE-41 и его фрагментов на модели St.aureus(Wood46).
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000029_0001

Claims

Формула изобретения.
1. Полипептид, имеющий антибактериальную активность и состоящий из аминокислот по следующей формуле:
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
и где аминокислоты, составляющие полипептид, выбраны независимо из D или L форм.
2. Полипептид по п.1, выбранный из группы состоящей из: SE41, SE40, SE39, SE38, SE37, SE36, SE35, SE34, SE33, ЕТ32, TR31, RP30, PV29, VL28, LN27, NR26, RL25, KF24, FD23, DK22, KI21, IR20, RQ19, QV18, VI17, IR16, ЕТЗЗ, TR32, RP31, PV30, VL29, LN28, NR27, RL26, LF25, FD24, DK23, KI22, IR21, RQ20, QV19, VI18, IR17, ЕТ34, TR33, RP32, PV31, VL30, LN29, NR28, RL27, LF26, FD25, DK24, KI23, IR22, RQ21, QV20, VI19, IR18, ЕТ35, TR34, RP33, PV32, VL31, LN30, NR29, RL28, LF27, FD26, DK25, KI24, IR23, RQ22, QV21, VI20, IR19, ЕТ36, TR35, RP34, PV33, VL32, LN31, NR30, RL29, LF28, FD27, DK26, KI25, IR24, RQ23, QV22, VI21, IRK20, ЕТ37, TR36, RP35, PV34, VL33, LN32, NR31, RL30, LF29, FD28, DK27, KI26, IR25, RQ24, QV23, VI22, IR21, ЕТ38, TR37, RP36, PV35, VL34, LN33, NR32, RL31, LF30, FD29, DK28, KI27, IR26, RQ25, QV24, VI23, IR22, ЕТ39, TR38, RP37, PV36, VL35, LN34, NR33, RL32, LF31, FD30, DK29, KI28, IR27, RQ26, QV25, VI24, IR23, ЕТ40, TR39, RP38, PV37, VL36, LN35, NR34, RL33, LF32, FD31, DK30, KI29, IR28, RQ27, QV26, VI25, IRK24; и характеризующийся тем, что имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:l l, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:162 соответственно.
3. Полипептид по любому из пп.1-2, характеризующийся тем, что альфа-аминогруппа Ν-концевой аминокислоты ацетилирована, а альфа-карбоксильная группа С-концевой аминокислоты амидирована.
4. Применение полипептида по любому из пп.1-3 для получения лекарственного препарата для профилактики или лечения бактериальной инфекции человека.
5. Лекарственный препарат для профилактики или лечения бактериальной инфекции человека, включающий полипептид по любому из пп.1-3 и один или несколько фармацевтически приемлимых носителей, вспомогательных веществ или дополнительных противобактериальных средств.
6. Лекарственный препарат по п.5, составленный, изготовленный и предназначенный для парентерального применения.
7. Лекарственный препарат по п.5, составленный, изготовленный и предназначенный для местного применения на слизистой оболочке пораженной области или ткани, например, в виде жидкости для орошения, ушных капель, капель для носа, аэрозоля, порошкового аэрозоля, геля, крема, лосьона, суспензии или мукоадгезивной лекарственной формы.
8. Применение лекарственного препарата по любому из пп.5-7, для профилактики или лечения инфекций дыхательных путей или респираторной системы, инфекций печени, селезенки, глаза, почек, влагалища, уретры, сердца, инфекций или расстройств кожи, таких как: атопический дерматит, хроническая язва, диабетическая стопа, венозная язва, угревая сыпь, травма или ожог.
PCT/RU2011/000535 2010-07-21 2011-07-20 Полипептид с антибактериальной активностью и средство для лечения бактериальных инфекций WO2012011848A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010130096 2010-07-21
RU2010130096/10A RU2434880C1 (ru) 2010-07-21 2010-07-21 Полипептид, имеющий антибактериальную активность и пригодный для получения лекарственных средств для лечения бактериальных инфекций человека

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012011848A1 true WO2012011848A1 (ru) 2012-01-26

Family

ID=45318166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000535 WO2012011848A1 (ru) 2010-07-21 2011-07-20 Полипептид с антибактериальной активностью и средство для лечения бактериальных инфекций

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2434880C1 (ru)
WO (1) WO2012011848A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2705098C2 (ru) * 2016-11-03 2019-11-05 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Фармацевтическая композиция для лечения грибковых поражений слизистых оболочек
CN110330553B (zh) * 2019-06-05 2020-12-29 遵义医科大学珠海校区 一种抗菌肽vl25-1的突变体及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006011792A2 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Octoplus Sciences B.V. Antimicrobial peptides derived from cap18
RU2302467C1 (ru) * 2005-12-01 2007-07-10 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность
EP1891097A1 (en) * 2005-06-06 2008-02-27 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same
RU2336278C2 (ru) * 2001-11-20 2008-10-20 Новозимс А/С Противомикробные полипептиды из pseudoplectania nigrella

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2336278C2 (ru) * 2001-11-20 2008-10-20 Новозимс А/С Противомикробные полипептиды из pseudoplectania nigrella
WO2006011792A2 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Octoplus Sciences B.V. Antimicrobial peptides derived from cap18
EP1891097A1 (en) * 2005-06-06 2008-02-27 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same
RU2302467C1 (ru) * 2005-12-01 2007-07-10 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность

Also Published As

Publication number Publication date
RU2434880C1 (ru) 2011-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2341340C (en) Anti-endotoxic, antimicrobial cationic peptides and methods of use therefor
RU2472805C2 (ru) Антибиотические пептиды
JP4484941B2 (ja) 生物活性を有する短ペプチド及び該ペプチドの使用方法
JP6683601B2 (ja) 抗菌性ペプチド
Otvos Jr Immunomodulatory effects of anti-microbial peptides
KR20070107748A (ko) 항미생물성 헥사펩티드
Kamysz Are antimicrobial peptides an alternative for conventional antibiotics?
JPH05504566A (ja) 生物学的活性を有するペプチドを使用した創傷処置方法
Dorin et al. Mammalian antimicrobial peptides; defensins and cathelicidins
Ben Hur et al. Antimicrobial peptides against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa biofilm from cystic fibrosis patients
US10556926B2 (en) Synthetic artificial peptides with antimicrobial effect
RU2434880C1 (ru) Полипептид, имеющий антибактериальную активность и пригодный для получения лекарственных средств для лечения бактериальных инфекций человека
US8815812B2 (en) Synthetic arginine substituted peptides and their use
US5969098A (en) Yeast-toxin-related protein for antimicrobial vaccine and sterilizing preservative use
Yang et al. Rational Design and Antimicrobial Potency Assessment of Abaecin Analogues
WO2015099535A1 (en) Thrombocidin-derived antimicrobial peptides
KR20200006492A (ko) 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체
CN109824761A (zh) 低溶血抗菌肽BmKn2-7K及其应用
Jacobsen The effect of antimicrobial peptides on bacterial biofilms
Ramos Recombinant expression and activity of cationic antimicrobial peptides
MX2011005274A (es) Uso de un peptido antibiotico proveniente del veneno del alacran centruroides suffusus suffusus y sus composiciones farmaceuticas obtenidas con antibioticos comerciales.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11809941

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11809941

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1