CZ299646B6 - Izolovaný polypeptid , fragment nebo varianta, jejich získání, jejich použití a farmaceutický prostredek je obsahující - Google Patents

Abstract

Povrchový polypeptid z Neisseria meningitidis, nukleová kyselina a homologní nukleová kyselina, kódující tento protein. Expresní vektor, hostitelská bunka, rekombinantní polypeptid, protilátka a farmaceutické prostredky, obsahující tento polypeptid a nukleové kyseliny. Jejich použití pro lécbu, prevenci a diagnostiku Neisseria meningitidis infekce.

Description

Oblast techniky

Předmětný vynález se vztahuje na nové polypeptidy, které lze získat např. z Neisseria meningitidis, na nukleotidové sekvence, kódující tyto polypeptidy, na jejich použití v diagnostice, u terapeutických nebo proíylaktických vakcín a při navrhování a/nebo testování léků.

Dosavadní stav techniky

Neisseria meningitidis je gramnegativní bakterie, která je příčinou meningokokové meningitidy a septikémie. Jejím jediným známým hostitelem je člověk a může být přenášena asymptomaticky přibližně 10 % populace (Caugant, D. a kol., 1994, Journal of Clinical Microbiology, 32: 323 až 330).

Neisseria meningitidis může exprimovat polysacharidové kapsule. To umožňuje klasifikaci bakterií podle původu exprimovaných kapsulí. Existuje alespoň třináct séroskupin N meningitidis-. A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y a Z, přičemž séroskupiny A, B a C způsobují 90 % meningokokových onemocnění (Poolman, J.T. a kol., 1995, Infectious Agents andDisease, 4: 13 až 28). Vakcíny, zaměřené proti séroskupinám A a C jsou dostupné, ale kapsulámí polysacharid séroskupiny B je velmi málo imunogenní a neindukuje ochranu u člověka.

Proto jsou testovány další membránové a extracelulární složky z hlediska jejich vhodnosti pro začlenění do vakcín. Příklady zahrnují proteiny vnější membrány třídy 1,2 a 3 (poriny) a skupiny 4 (Rmp) a 5 (opacity proteiny). Až do současné doby však není žádný z těchto kandidátů schopen indukovat úplnou ochranu, zejména u dětí (Romero, J. D., 1994, Clinical Microbiology Review,

7 : 5 59 až.575; Poolman, J. T. akol, 1995, supra}.

Pro vytvoření účinné vakcíny je nutné identifikovat složky N. meningitidis, které jsou přítomné ve většině kmenů a které jsou schopné, indukovat.ochrannou imunitní odpověď (baktericidní protilátky). V tomto směru lze odkázat na autory Brodeur a kol. (mezinárodní publikace WO

96/29412), kteří objevili povrchový protein o. velikosti 22 kDa, který vykazuje vysokou konzervativitu s 99 % všech známých kmenů N. meningitidis. Injekce přečištěného rekombinantního povrchového proteinu o velikosti 22 kDa ochránila 80 % imunizovaných myší před rozvinutím letální infekce, způsobené N, meningitidis. 1 přes objevení tohoto proteinu stále existuje nutnost izolovat více povrchových proteinů N. meningitidis, které jsou vysoce konzervativní u většiny kmenů a které_umají imunoprotektivní charaktery vůči N. meningitidis a/nebo které mohou být použity v kombinaci s jinými složkami N. meningitidis tak, aby byla zvýšena účinnost ochrany proti tomuto organismu.

Podstata vynálezu

Autoři předmětného vynálezu objevili nový gen, který je přítomen ve všech testovaných kmenech N. meningitidis a který kóduje nový polypeptid s předpokládanou molekulovou hmotností asi 62 kDa. Na základě jeho sekvenčních charakteristik a homologií se předpokládá, že tento polypeptid je adhesin. Tento fakt společně s experimentálními daty předpokládá, že polypeptid tvoří povrchový protein, který by mohl být užitečný při výrobě terapeutických a/nebo pro45 fylaktických vakcín proti N meningitidis, což je popisováno dále.

V jednom aspektu předmětného vynálezu je proto poskytován izolovaný polypeptid nebo jeho fragment nebo jejich varianta či derivát. Zmíněný polypeptid je vybrán ze skupiny, skládající se z: (a) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 2;

(b) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 5;

-1CZ 299646 B6 (c) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 7;

(d) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 9;

(e) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 11;

(t) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 13;

(g) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 15;

(h) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 17;

(i) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 19; a (j) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 21.

Zmíněný polypeptid, fragment, varianta nebo derivát výhodněji zobrazují imunologickou aktivitu proti jednomu nebo více členům, kteří jsou vybráni ze skupiny, kterou tvoří:

(i) Λί weningitidis;

(ii) zmíněný polypeptid;

(iii) zmíněný fragment;

(iv) zmíněná varianta; a (v) zmíněný derivát.

Podle dalšího aspektu poskytuje předmětný vynález izolovanou sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid nebo jeho fragment, variantu či derivát zmíněného fragmentu nebo polypeptidu podle prvně zmíněného aspektu. Zmíněná sekvence je vhodně vybrána ze skupiny, kterou tvoří:

(1) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 1;

(2) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 3;

(3) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 4;

(4) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 6;

(5) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 8;

(6) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 10;

(7) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 12;

(8) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 14;

(9) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 16;

(10) nukleotidová·sekvence s identifikačním číslem 18;

(11) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 20;

(12) fragment nukleotidové sekvence kterékoli ze sekvencí s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, 10,12,14,16, 18 a20;a (13) homolog nukleotidové sekvence ke kterékoli z předchozích sekvencí

Zmíněné sekvence výhodněji kódují produkt, který zobrazuje imunologickou aktivitu proti jednomu nebo více Členům, vybraným ze skupiny, která se skládá z:

(i) N meningitidis·, (ii) zmíněného polypeptidu prvně zmíněného aspektu;

(iii) zmíněného fragmentu prvně zmíněného aspektu;

-2CZ 299646 Bó (iv) zmíněné varianty prvně zmíněného aspektu; a (v) zmíněného derivátu prvně zmíněného aspektu.

Podle ještě dalšího aspektu spočívá vynález v expresním vektoru, obsahujícím sekvenci nukleové 5 kyseliny podle druhého zmíněného aspektu, kde zmíněná sekvence je operativně spojena s transkripční a translační regulátorovou nukleovou kyselinou.

V dalším aspektu poskytuje předmětný vynález hostitelskou buňku, obsahující expresní vektor podle třetího zmíněného aspektu.

to

V ještě dalším aspektu předmětného vynálezu je poskytován způsob přípravy rekombinantního polypeptidu podle prvního zmíněného aspektu, přičemž zmíněný způsob zahrnuje kroky:

(A) kultivaci hostitelské buňky, obsahující expresní vektor podle třetího zmíněného aspektu, a to tak, že zmíněný rekombinantní polypeptid je ze zmíněné nukleové kyseliny exprimován; a (B) izolaci zmíněného rekombinantního polypeptidu.

V ještě dalším aspektu poskytuje předmětný vynález protilátku nebo její fragment, která se váže na jednoho nebo více členů, vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

(1)/V. meningitidis', (2) zmíněný polypeptid prvně zmíněného aspektu;

(3) zmíněný fragment prvně zmíněného aspektu;

(4) zmíněná varianta prvně zmíněného aspektu; a (5) zmíněný derivát prvně zmíněného aspektu.

V ještě dalším aspektu poskytuje předmětný vynález způsob detekce N. meningitidis, v biologickém vzorku, u kterého je podezření, že obsahuje N, meningitidis. Zmíněný způsob zahrnuje _r kroky:

(A) izolaci biologického vzorku od pacienta;

(B) smíchání výše zmíněné protilátky nebo fragmentu s biologickým vzorkem s cílem vytvořit 30 směs; a (C) detekci specificky navázané protilátky nebo navázaného fragmentu ve směsi, což indikuje přítomnost N. meningitidis.

Podle dalšího aspektu je poskytován způsob detekce bakterie N. meningitidis v biologickém 35 vzorku, u kterého je podezření na přítomnost této bakterie. Zmíněný způsob zahrnuje kroky:

(I) izolaci biologického vzorku od pacienta;

(II) detekci sekvence nukleové kyseliny podle druhého zmíněného aspektu ve vzorku, což indikuje přítomnost zmíněné bakterie.

Předmětný vynález dále zahrnuje způsob diagnózy infekce, způsobené N. meningitidis, u pacientů. Zmíněný způsob zahrnuje kroky:

(1) kontakt biologického vzorku od pacienta s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem podle předmětného vynálezu; a (2) určení přítomnosti nebo nepřítomnosti komplexu mezi zmíněným polypeptidem, fragmentem, 45 variantou nebo derivátem a protilátkami, specifickými pro N. meningitidis, ve vzorku. Přítomnost komplexu indikuje zmíněnou infekci.

-3CZ 299646 B6

Předmětný vynález se též vztahuje na použití polypeptidu podle prvního zmíněného aspektu, na použití nukleových kyselin podle druhého zmíněného aspektu nebo na použití výše uvedené protilátky nebo jejího fragmentu v soupravě pro detekci bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku.

Podle dalšího aspektu předmětného vynálezu je poskytován farmaceutický prostředek, obsahující izolovaný polypeptid nebo jeho fragment nebo jejich variantu či derivát podle prvního zmíněného aspektu.

i o Zmíněný farmaceutický prostředek je výhodněj i vakcína.

V ještě dalším aspektu poskytuje předmětný vynález způsob prevence infekce bakterií N. meningitidis u pacientů. Tento způsob zahrnuje krok, během kterého je podáváno farmaceuticky účinné množství výše zmíněné vakcíny.

V dalším aspektu poskytuje předmětný vynález způsob identifikace imunoreaktivního fragmentu polypeptidu, varianty nebo derivátů podle prvního zmíněného aspektu. Způsob zahrnuje kroky:

(a) vytvoření fragmentu zmíněného polypeptidu, varianty nebo derivátu;

(b) podávání zmíněného fragmentu savci; a (c) detekcí imunitní odpovědi u zmíněného savce, jehož odpověď zahrnuje produkci prvků, které specificky váží /V. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát a nebo mají ochranný účinek proti infekci N. meningitidis.

Nevyžaduje-li kontext jinak, budou v této specifikaci a v připojených patentových nárocích slova „zahrnují“, „zahrnuje“ a „zahrnující“ chápána tak, že znamenají začlenění daného celku nebo skupiny celků, ale nikoliv vyčlenění jakéhokoli jiného celku nebo skupiny celků.

Polypeptidové sekvence

Předmětný vynález poskytuje izolovaný polypeptid podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21 nebo jejích fragment nebo variantu či derivát. Ve výhodném provedení zobrazují polypeptid, fragmenty, varianty a deriváty podle předmětného vynálezu imunologickou aktivitu proti kterémukoli členu vybranému ze skupiny, kterou tvoří N, meningitidis, zmíněný polypeptid, zmíněný fragment, zmíněná varianta a zmíněný derivát.

Sekvence s identifikačním číslem 2 odpovídá novému, asi 62 kDa velkému povrchovému polypeptidu, který je kódován genem hiaNM. získaným z kmene N. meningitidis MC58, jak je detailněji popisováno dále. Sekvence s identifikačními čísly 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21 odpovídají homologním polypeptidům, odvozeným z nukleotidových sekvencí, které byly získány z kmenů N. meningitidis BZ10, BZ198, EG327, EG329, H15, H38, H41, P20 a PMC21.

Pro účely předmětného vynálezu znamená termín „imunologická aktivita“ schopnost výše zmíněného polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vytvářet imunitní odpověď u savců, kterým je tato látka podávána. Odpověď zahrnuje produkci prvků, které specificky váží N meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, fragment, variantu nebo derivát a/nebo mají ochranný účinek proti infekci N. meningitidis.

Pod pojmem „izolovaný“ je míněn materiál, který je podstatně nebo zcela bez obsahu složek, které ho běžně v nativním stavu doprovázejí.

Pod pojmem „polypeptid“ jsou míněny peptidy s dlouhým řetězcem, včetně proteinů.

Pojem „fragment“, jak je zde používán, zahrnuje deleení mutanty a malé peptidy, např. o délce alespoň 6, výhodněji alespoň 10 a ještě výhodněji alespoň 20 aminokyselin, které zahrnují anti-4CZ 299646 Bó genní determinanty nebo epitopy. Mnoho takovýchto fragmentů může být spojeno dohromady. Peptidy tohoto typu mohou být získány prostřednictvím standardních technik pro rekombinantní nukleové kyseliny nebo mohou být syntetizovány pomocí běžných syntetických technik na bázi kapalné či pevné fáze. Zde je možno odkázat na syntézu na bázi roztoku či pevné fáze, jak je popsáno např. autory Atherton a Shephard v Kapitole 9 s názvem „Peptide Synthesis“. Tato kapitola je součástí publikace „Synthetic Vaccines, vydané Nicholsonem a publikované Blackwell Scientific Publications. Peptidy mohou být případně připravovány rozštěpením polypeptidu podle předmětného vynálezu proteinázami, jako je endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C a stafylokoková V8-proteáza. Rozštěpené fragmenty mohou být přečištěny např. kapalinovou chromatografíí v uspořádání HPLC.

Pojem „varianta“ se vztahuje na polypeptidy, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin nahrazena odlišnými aminokyselinami. V dané oblasti techniky je dobře známo, že některé aminokyseliny mohou být vyměněny za jiné aminokyseliny se velmi podobnými vlastnostmi, aniž by tím došlo ke změně původu aktivity polypeptidu (konzervativní substituce). Příkladné konzervativní substituce v polypeptidu mohou být provedeny podle následující tabulky:

Tabulka 1

Původní zbytek	Příkladné substituce
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ue, Leu

-5CZ 299646 Bó

Podstatné změny ve funkci jsou prováděny pomocí výběru substitucí, které jsou méně konzervativní než substituce v tab. 1. Jiné náhrady by byly nekonzervativními substitucemi z nichž může být tolerován relativně malý počet. Obecně řečeno, substituce, u kterých je pravděpodobné, že budou produkovat největší změny ve vlastnostech polypeptidu, jsou takové, u kterých je (a) hydrofilní zbytek (např. Ser nebo Thr) zaměněn za hydrofobní zbytek (např. Ala, Len, Ile, Phe nebo Val); (b) cystein nebo prolin nahrazen jakýmkoli jiným zbytkem; (c) zbytek s elektropozitivním postraním řetězcem (např. Arg, His nebo Lys) nahrazen elektronegativním zbytkem (např. Glu nebo Asp) nebo (d) zbytek s objemným postraním řetězcem (např. Phe nebo Trp) nahrazen zbytkem s menším po straním řetězcem (např, Ala, Ser) nebo bez postranního řetězce (např. Gly).

Obecně budou varianty alespoň ze 75 %, vhodněji alespoň z 80 %, výhodněji alespoň z 85 % a nejvýhodněji alespoň z 90% homologní se základními sekvencemi, jako jsou ukázány např. v sekvencích s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21. Homologie je definována jako procento aminokyselin, které jsou identické nebo tvoří konzervativní substituce, jak je defi15 nováno v tab. 1. Homologie může být určena pomocí programů na porovnání sekvencí, jako je např. GAP (Deveraux a kol. 1984, Nucleic Acid Research 12, 387 až 395), který je zde začleněn jako odkaz. Touto cestou mohou být sekvence, které mají v porovnání s výše citovanými podobnou nebo podstatně odlišnou délku, porovnávány vložením mezer do sekvenční řady. Tyto mezery jsou určeny např. srovnávacím algoritmem, používaným v programu GAP. Složení vhodných variant může být stanoveno běžnými technikami. Např. aminokyseliny, kódující polypeptidy podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21, mohou být mutovány buď náhodnou mutagenezí (pomocí např. transpozónové mutageneze) nebo místně cílenou mutagenezí. Výsledné DNA fragmenty jsou poté pomocí běžné technologie klonovány do vhodných expresních hostitelů, jako např. E. coli, a jsou detekovány klony, které si zachovají žádoucí aktivitu. Tam, kde klony pocházely z náhodné mutageneze, musí být pozitivní klony sekvenovány, aby bylo možno určit mutaci. Pojem „varianta“ rovněž zahrnuje přirozeně se vyskytující alelické varianty.

Pod pojmem „derivát“ je míněn polypeptid, který byl modifikací odvozen od základní sekvence, např. konjugací nebo tvorbou komplexů s jinými chemickými skupinami nebo technikami posttranslačních modifikací, jak by bylo rozuměno vdané oblasti techniky. Tyto deriváty zahrnují deleci a/nebo přidání aminokyselinových zbytků k polypeptidům podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15,.17, 19 a 21 nebo jejich variantám, přičemž zmíněné deriváty sí zachovávají imunologickou aktivitu. „Přidání“ aminokyselin může zahrnovat fúzi polypeptidů nebo jejich variant s jinými polypeptidy nebo proteiny. V tomto ohledu bude oceněno, že polypeptidy nebo varianty podle předmětného vynálezu mohou být začleněny do delších polypeptidů. V těchto delších polypeptidů se předpokládá, že si zachovají imunologickou aktivitu např. proti N. meningitidis. Polypeptidy, jak jsou popsány výše/móhóu fúžóvát s dalším proteinem, např. takovým, který není odvozen od N. meningitidis. Jiný protein může např. napomáhat při pře40 čišťování proteinu. V tomto ohledu mohou být použity např. polyhistidinový konec nebo protein vážící maltózu, jak je detailněji popsáno níže. Může případně produkovat imunitní odpověď, která je účinná proti N. meningitidis nebo může produkovat imunitní odpověď proti jinému patogenu. Dalšími možnými fúzními proteiny jsou ty, které produkují imunomodulaění odpověď. Mezi konkrétní příklady takovýchto proteinů patří Protein A nebo glutathion-S-transferáza (GST). Polypeptid může dále fúzovat se složkou vakcín na bázi oligosacharidů, kde působí jako nosičový protein.

Další deriváty, očekávané od předmětného vynálezu, zahrnují, avšak nejsou jimi limitovány, modifikaci postranních řetězců, začlenění nepřirozených aminokyselin a/nebo jejich derivátů během syntézy peptidu, polypeptidu nebo proteinu a použití zesíťovacích činidel a jiných postupů, které způsobí na polypeptidech, fragmentech nebo variantách podle předmětného vynálezu konformační omezení.

Příklady modifikací postranního řetězce, které předpokládá předmětný vynález, zahrnují modi55 fikace aminoskupin, jako je acýlace acetanhydridem; acylace aminoskupin sukcínanhydridem a

-6CZ 299646 Bó anhydridem kyseliny tetrahydroftalové; amidinace methylacetimidátem; karbamoylace aminoskupin kyanátem, pyridoxylace lysinu pyridoxal-5-fosfátem. po které následuje redukce NaBH₄; redukční alkylace reakcí s aldehydem, po které následuje redukce NaBH₄ a trinitrobenzylace aminoskupin kyselinou 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou (TNBS).

Karboxylová skupina může být modifikována aktivací karbodiimidu přes tvorbu O-acylisomočoviny s následnou derivatizací např. na odpovídající amid.

Guanidinová skupina argininových zbytků může být modifikována tvorbou heterocyklických kondenzačních produktů za použití činidel, jako je 2,3-butandion, fenylglyoxal a glyoxal.

Sulthydrylové skupiny mohou být modifikovány způsoby, jako je např. oxidace kyselinou mravenčí na kyselinu cysteovou; tvorba merku ryderivátů pomocí kyseliny 4-chloromerkuryfenylsulfonové, 4-^hloromerkurybenzoátu, 2-chloromerkury-4-nitrofenolu, fenylmerkurychlo15 ridu a dalších derivátů rtuti; tvorba směsných disulfidů s jinými thiolovými sloučeninami; reakce s imidem kyseliny maleinové, anhydridem kyseliny maleinové nebo jinými substituovanými imidy kyseliny maleinové; karboxymethylace jodooctovou kyselinou, jodoacetamidem a karbamoylace kyanátem v alkalickém pH.

Tryptofanové zbytky mohou být modifikovány např. alky lácí indolového kruhu 2-hydroxy-5nitrobenzylbromidem nebo sulfonylhalogenidem nebo oxidací N-bromsukcinimidem.

Tyrosinové zbytky mohou být modifikovány nitrací tetranitromethanem za vzniku 3-nitrotyrošinových derivátů.

Imidazolový kruh histidinového zbytku může být modifikován N-karbethoxylací diethylpyrokarbonátem nebo alkylací deriváty kyseliny jodooctové.

Příklady začlenění přirozených aminokyselin a derivátů během syntézy peptidu zahrnují, avšak nejsou jimi limitovány, použití kyseliny 4-aminomáselné, kyseliny 6-aminohexanové, kyseliny 4-amino-3-hydroxy-5-fenylpentanové, kyseliny 4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanové, t-butylglycinu, norleucinu, norvalinu, fenylglycinu, omithinu, sarkosinu, 2-thienylalaninu a/nebo D-izomerů aminokyselin. Seznam nepřirozených aminokyselin, předpokládaných v předmětném vynálezu, je uveden v tab. 2.

Tabulka 2

Nekonvenční aminokyselina	Nekonvenční aminokyselina
α-aminomáselná kyselina a-amino-a-methylbutyrát aminocyklopropankarboxylát aminoisomáselná kyselina aminonorbomylkarboxýlát cyklohexylalanin	L-N-methylalanin L-N-methylarginin L-N-methylasparagin L-N-methylasparágová kyselina L-N-methylcystein L-N-methylglutamin

-7CZ 299646 B6

cyklopentylalarún	L-N-methylglutamová kyselina
L-N-methylisoleucin	L-N-methylhistidin
D-alanin	L-N-methylleucin
D-argiriin	L-N-methyllysín
D-asparagová kyselina	L-N-methylmethionin
D-cysteín	L-N-methytnorleucin
D-glutamát	L-N-methylnorvalin
D-glutamová kyselina	L-N-methylornithin
D-histidin	L-N-methylfenylalanin
D-isoleucin	L-N-methylprolin
D-leucin	L-N-medlylserin
D-lysin	L-iN-methylthreoni n
D-methíonin	L-N-methyl tryptofan
D-omithin	L-N-methyltyrosin
D-fenylalanin	L-N-methylvalin
D-prolin	L-N-methylethylglycin
D-serin	L-N-methyLt-butylglycin
D-threonin	L-norleucin
D-tryptofan	L-norvalin
D-tyrosin	α-methylamínoi sobutyrát
D-valin	a-methyl-y-aminobutyrát
D-a-methylaíanin	a-methylcyklohexylalanin
D-a-methylarginin	a-methylcyklopentylalanin
D-ct-methylasparagin	ά-methyl -a-náftýlalaniri
D-a-methylaspartát	a-methylpenicilamin
D-a-methylcystein	N-(4-ami nobutyl)glycin
D-a-methylglutamin	N-(2-aminoethyl)g)ycin
D-a-methylhistidin	N -(3-aminopropy í)glyci n
D-a-methylisoleucin	N-amino-a-methylbutyrát
D-a-methylleucin	a-naftylalanin

-8CZ 299646 Bó

D-a-methyllysin

D-a-methylmethionin

D -ct-methyl omithin

D-a-methylfenylalanin

D-ct-methylprolin

D-a-methylsenn

D-a-methylthreonin

D-a-methyltryptofan

D-a-methyltyrosin

L-a-methylleucin

L-a-methylmethiOnirt

L-a-methylnorvatin

L-a-methýl fenylalanin

L-a-methylserin

L-a-methyltryptofan

L-a-methylyaiin

N-(N-(2,2-difcnylcthy]karbamylmethyl)glycín 1-karboxy-1,-(2,2difenylethylamino)cyklopropan

N-benzylglycin

N-(2-karbamylediyl)glycin

Ň-(karbamylmethyl)glycin

N-(2-karboxyethyi)glycin

N-(karboxymethyi)glycin

N-cyklobutylglycin

N-cykloheptyiglycin

N-cyklohexylgiycin

N-cyklodecylgiycín

L-a-methyílysin

L-a-methylnorleucin

L-a-methylornithin

L-a-methylprolin

L-a-methylthreonin

L-aanethyltyrosin

L-N-methylhomofenylalanin

N-(N-(3,3-difenylpropylkarbamylmethyl)glycin

Vynález rovněž popisuje kovalentní modifikaci polypeptidu, fragmentu nebo varianty podle vynálezu dinitrifenolem, s cílem učinit ho u lidí imunogenním.

Vynález výhodněji obsahuje polypeptid, vybraný zjakéhokoliv polypeptidu podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17, 19 a 21.

io Polypeptidy podle vynálezů mohou být připraveny jakýmkoliv vhodným způsobem, který je známý odborníkům v dané oblasti. Polypeptidy mohou být například připraveny způsobem, který zahrnuje následující kroky:

(a) přípravu rekombinantní nukleové kyseliny, obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle jakékoliv sekvence s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9,11,13, 15,17,19 a 21 nebo jeho fragment nebo jejich variantu či derivát, přičemž nukleotidová sekvence je operativně spojena s transkripční a translační regulátorovou nukleovou kyselinou;

(b) transfekci nebo transformaci vhodné hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou;

(c) kultivaci hostitelské buňky s cílem exprimovat ze zmíněné rekombinantní nukleové kyseliny rekombinantní polypeptid a (d) izolaci rekombinantního polypeptidu.

Uvedená nukleotidová sekvence je vhodně vybrána ze skupiny, která je tvořena sekvencemi s identifikačními čísly 1,3,4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20.

-9CZ 299646 B6

Pod pojmem „rekombinantní polypeptid“ je míněn polypeptid, připravený pomocí rekombinantních technik např. přes expresi rekombinantní nukleové kyseliny.

Termín „rekombinantní nukleová kyselina“ je zde používán v souvislosti s nukleovou kyselinou, vytvořenou manipulací nukleové kyseliny in vitro do takové formy, která se běžně v přírodě nevyskytuje. V této souvislosti rekombinantní nukleová kyselina obsahuje výhodněji expresní vektor, který může být buď samoreplikující se extra-chromozomální vektor jako je např. plasmid, nebo to může být vektor, který se integruje do genomu hostitele. Obecně tyto expresní vektory zahrnují transkripční a translační regulátorovou nukleovou kyselinu, operativně spojenou se zrn íněnou nukleotidovou sekvencí.

Pod pojmem „operativně spojený“ je míněno to, že trankripční a translační regulátorová nukleová kyselina je umístěna vzhledem k nukleotidové sekvenci, která kóduje zmíněný polypeptid, fragment, variantu nebo derivát v takové pozici, že tato transkripce může být zahájena. Obecně ' 15 bude transkripční a translační regulátorová nukleová kyselina vhodná pro hostitelskou buňku, používanou pro expresi. V dané oblasti techniky jsou pro řadu různých hostitelských buněk známy různé typy odpovídajících expresních vektorů a vhodné regulátorové sekvence.

Transkripční a translační regulátorová nukleová kyselina může většinou zahrnovat, aniž by tím však byla nějak limitována, promotorové sekvence, vedoucí nebo signální sekvence, ribozomální vazebná místa, transkripční start a stop sekvence, translační start a stop sekvence a zesilující nebo aktivační sekvence.

Vynález předpokládá konstitutivní nebo induktabilní promotory, které jsou v dané oblasti techni25 ky známé. Promotory mohou být buď přirozeně se vyskytující promotory nebo hybridní promotory, které kombinují prvky více než jednoho promotoru.

Ve výhodnějším provedení obsahuje expresní vektor značkový gen, který umožňuje selekci transformovaných hostitelských buněk. Selekční geny jsou v dané oblasti techniky dobře známé a liší se v závislosti na použité hostitelské buňce.

Expresní vektor může také zahrnovat fúzního partnera (většinou poskytovaného expresním vektorem), a to tak, že rekombinantní polypeptid podle vynálezu je exprimován jako fúzní polypeptid se zmíněným fůzním partnerem, Hlavní výhodou fúzních partnerů je to, že se uplatňují při identifikaci a/nebo přečišťování zmíněného fúzního polypeptidu.

Aby byl zmíněný fúzní polypeptid exprimován, je nezbytné ligovat nukleotidovou sekvenci podle vynálezu do expresního vektorutak, aby se translační čtecí rámce fúzního partnera a' ůúkleótidová sekvence vynálezu shodovaly.

Mezi dobře známé příklady fúzních partnerů patří, avšak nejsou v žádném směru limitující, glutathion-S-transferáza (GST), Fc řetězec, lidských IgG, protein vážící maltózu (MBP) a hexahistidin (HIS^), které jsou užitečné konkrétně při izolaci fúzního polypeptidu afinitní chromatografií. Pro účely přečištění fúzního polypeptidu afinitní chromatografií jsou odpovídajícími matricemi pro afinitní chromatografií glutathion- amylóza- pryskyřice, konjugované s kobaltem nebo niklem. Rada z těchto matricí je dostupná v “soupravách“ jako např. QIAexpress™ systém (Qiagen), používaný pro (HIS₆) fúzní partnery a systém pro přečištění Pharmacia GST.

Dalším fůzním partnerem, který je v dané oblasti techniky dobře známý, je zelený fluorescenční protein (GFP). Tento fúzní partner slouží jako fluorescenční „značka“, která umožňuje identifikaci fúzního polypeptidu podle vynálezu fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií. GFP je užitečný při určování subcelulámí lokalizace fúzního polypeptidu vynálezu nebo při izolaci buněk, které exprimují fúzní polypeptid vynálezu. V této aplikaci jsou konkrétně užitečné průtoková cytometrie jako např, FACS.

-10CZ 299646 B6

Výhodněji mají fúzní partneři také místa pro štěpení proteázami jako např. pro Faktor X_a nebo Thrombin, která umožňují dané proteáze částečně naštěpit fúzní polypeptid vynálezu a tím z něj uvolnit rekombinantní polypeptid vynálezu. Uvolněný polypeptid může být poté izolován od fúzního partnera následnou chromatografickou separací.

V rámci svého rozsahu fúzní partneři podle vynálezu také zahrnují „epitopové značky, což jsou obvykle krátké peptidové sekvence, pro které existuje specifická protilátka. Mezi dobře známé příklady epitopových značek, pro které jsou snadno dostupné specifické monoklonální protilátky, patří c-myc, virus chřipky haemagglutinin a FLAG značky.

10'

Rekombinantní polypeptidy vynálezu mohou být připravovány kultivací hostitelské buňky, tranformované expresním vektorem, který obsahuje nukleovou kyselinu, kódující polypeptid, fragment, variantu nebo derivát podle vynálezu. Podmínky, které jsou vhodné pro expresi proteinu, se budou lišit v závislosti na výběru expresního vektoru a hostitelské buňky a odborníci v dané oblasti je mohou snadno zjistit pomocí rutinních pokusů.

Hostitelské buňky, vhodné pro expresi, mohou být prokaryotické i eukaryotické. Jednou hostitelskou buňkou, která je výhodnější pro expresi polypeptidu podle vynálezu, je bakterie. Bakterie, která může být použita, je Escherichia coli. Hostitelskou buňkou může být také hmyzí buňka jako jsou např. SF_Ď buňky, které mohou být využívány bakulovirálním expresním systémem.

Rekombinantní protein může být odborníkem připraven pomocí příslušných standartních protokolů jako jsou např. popsány v Sambrook a kol., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989), který je zde zahrnut jako odkaz, konkrétně Sekce

16 a 17; v Ausubel a kol., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, lne. 1994 až 1998), rovněž zahrnutý jako odkaz, konkrétně Kapitoly 10 a 16 a Coligan a kol., CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, lne. 1995 až 1997), který je zde také zahrnut jako odkaz, konkrétně Kapitoly 1, 5 a 6.

Nukleotidové sekvence

Tento vynález dále poskytuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, fragment, variantu nebo derivát, které jsou definovány výše. Uvedená sekvence je vhodně vybrána ze skupiny, kterou tvoří: sekvence s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20; fragment jakékoliv nukleotidové sekvence s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20 a homolog předcházejících nukleotidových sekvencí. Tyto sekvence výhodněji kódují produkt, zobrazující imunologickou aktivitu, jak je definováno výše.

Jak bude podrobněji popsáno dále, sekvence s identifikačním číslem 1 odpovídá genu hiaNM, získanému zN. meningitidis kmen MC58. Tento gen kóduje nový povrchový polypeptid se sekvencí s identifikačním číslem 2 a o velikosti 62kDa (přibližně). Sekvence s identifikačním číslem 3 odpovídá sekvenci otevřeného čtecího rámce hiaNM kmene MC58, HiaNM. Sekvence s identifikačními čísly 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18 a 20 odpovídají homologům, sekvencí otevřeného čtecího rámce hiaNM, získaných z N. meningitidis kmenů BZ10, BZ198, EG327, H15, H38,

H41, P20 aPMC21.

Termín „nukleotidové sekvence“, jak je zde používán, označuje mRNA, RNA, cRNA, cDNA nebo DNA.

Termín „homolog nukleotidové sekvence“ se obecně vztahuje k nukleotidovým sekvencím, které za podstatně stringentních podmínek hybridizují swild-type (divokou) nukleotidovou sekvencí podle vynálezu. Vhodné hybridizační podmínky budou diskutovány později.

Homology nukleotidové sekvence vynálezu mohou být připraveny následujícím postupem:

(i) zisk extraktu nukleové kyseliny z vhodného hostitele;

-11 CZ 299646 B6 (ii) vytvoření primerů, které mohou být degenerovány, přičemž každý obsahuje část wild-type nukleotidové sekvence vynálezu; a (iii) použití zmíněných primerů pro amplifíkaci, prostřednictvím technik pro amplifíkaci j nukleových kyselin, jednoho nebo více amplifikacních produktů ze zmíněného extraktu nukleové kyseliny. 5

I

Vhodným hostitelem může být bakterie. Výhodněji je hostitel z rodu Neisseria, ještě výhodněji í ze N. meningitidis. ΐ

Primery jsou výhodněji vybrány ze skupiny, kterou tvoří:

(1) 5'- TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3 (sekvence s identifikačním číslem 22), (2) 5CTTCCCTTCAAACCTTCC-3 '(sekvence s identifikačním číslem 23), (3) 5-GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATACCGCAT-3 (sekvence s identifikačním číslem 24);

(4) 5 -TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACCACTGAT AAC-3* (sekvence s identifikačním číslem 25);

(5) 5CCAAACCCCGATTTAACC-3' (sekvence s identifikačním číslem 26);

(6) 5'- AATCGCCACCCTTCCCTTC-3' (sekvence s identifikačním číslem 27);

(7) 5TTTGCAACGGTTCAGGC A-3' (sekvence s identifikačním číslem 28);

(8) 5 V TATTC AGC AGCGTATCGG-3' (sekvence s identifikačním číslem 29);

(9) 5'- TGCCTGAACCGTTGCAAA-3' (sekvence s identifikačním Číslem 30) a (10) 5CCGATACGCTGCTGAATA-3' (sekvence s identifikačním číslem 31).

Techniky, vhodné pro amplifíkaci nukleových kyselin, jsou odborníkům dobře známé a zahrnují polymerázovou řetězovou reakci (PCR), která je popsána např. v knize Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra, Kapitola 15), která je zde začleněna jako odkaz; amplifíkaci nahrazováním vlákna

DNA (SDA) jako je popsáno např. v patentu US 5 422 252, který je zde začleněn jako odkaz; replikací cestou valivé kružnice (RCR) jako je popsáno např. v Liu a kol., (1996,J. Am. Chem.

Soc. 118:1587 až 1594 a v Mezinárodní přihlášce WO 92/01813) a v Lizardi a kol., (Mezinárodní přihláška WO 97/19193), které jsou zde začleněny jako odkaz; amplifíkaci, založenou na sekvenci nukleové kyseliny (N AS BA) jako je např. popsáno, v Sooknanan a koí, (1994, Biotechniques

17: 1077 až 1080), který je zde začleněn jako odkaz a amplifíkaci s pomocí repl i kázy Q-β, což je popsáno např. v Tyagi a kol., (1996, Proč, Nati. Acad Sci. USA 93:5 395 až 5 400), který je zde zahrnut jako odkaz.

Zde používaný „amplifikační produkt“ znamená nukleovou kyselinu, vytvořenou pomocí technik pro amplifíkaci nukleových kyselin.

Termíny „hybridizovat“ nebo „hybridizace“ je zde používány pro označení párování komplementárních bází vzdálených nukleotidových sekvencí podle pravidel o párování bází s cílem připravit hybrid DNA-DNA, hybrid DNA-RNA nebo hybrid RNA-RNA.

V DNA jsou komlementární báze:

(i) AaT;a (ii) CaG.

-12CZ 299646 B6

V RNA jsou komlementámí báze:

(i) A a U; a (ii) CaG.

V RNA-DNA hybridech jsou komplementární báze:

(i)AaU;

(ií)AaT;a (iii) Ga C,

Podstatně komplementární nukleotidové sekvence jsou většinou identifikovány blotovacími technikami, které zahrnují krok, ve kterém jsou nukleotidy (mobilizovány na matrici (výhodněji syntetickou membránu jako je nitro celulóza), hybridizační krok a detekční krok. Southern blot je používán pro identifikaci komplementární sekvence DNA; Nothem blot je používán pro identifikaci komplementární sekvence RNA. Dot blot a Slot blot mohou být použity pro identifikaci komplementárních DNA/DNA, DNA/RŇA nebo RNA/RNA polynukleotidových sekvencí. Tyto techniky jsou odborníkům v dané oblasti techniky velmi dobře známé a jsou popsány v Ausubel a kol. (1994 až 1998, supra) na stranách 2.9,1 až 2.9.20.

Podle těchto metod zahrnuje Southern blot separaci molekul DNA na základě velikosti gelovou elektroforézou, přenos DNA, rozdělených podle velikosti, na syntetickou membránu a hybridizaci DNA, vázané na membránu, s komplementární nukleotidovou sekvencí, označenou radioaktivně, enzymem nebo fluoroscencí. Při Dot a Slot blotech jsou vzorky DNA před tím, než dojde k hybridizaci jako je uvedena výše přímo aplikovány na syntetickou membránu.

V případě identifikace komplementárních nukleotidových sekvencí v cDNA nebo knihovně genomické DNA je použit alternativní blotovací krok jako např. hybridizace kolonií a plaků. Typický příklad tohoto postupuje popsán v Sambrook a kol., (1989, supra), Kapitoly 8 až 12.

Pro stanovení hybridizačních podmínek může být většinou použit následující obecný postup,

Nukleotidové sekvence jsou blotovány/přeneseny na syntetickou membránu, což je popsáno výše. Wild-type nukleotidová sekvence vynálezu je označena, jak je popsáno výše, a je analyzována schopnost této značené nukleotidové sekvence hybridizovat s imobilizovanou nukleotidovou sekvencí.

Odborníci rozpoznají, že hybridizaci ovlivňuje řada faktorů. Aby byl získán detekovatelný signál, měla by být specifická aktivita radioaktivně značené polynukleotidové sekvencé většinou vyšší nebo rovna přibližně 10⁸ dpm/mg. Radioaktivně značená nukleotidová sekvence se specifickou aktivitou 10* až 10⁹ dpm/mg může detekovat přibližně 0,5 pg DNA. V dané oblasti techniky je velmi dobře známo, že, aby byla umožněna detekce, musí být na membránu imobilizováno dostatečné množství DNA. Je žádoucí mít imobilizovanou DNA v přebytku, obvykle 10 pg. Citlivost hybridizace může také zvýšit přídavek inertního polymeru jako je 10 hmotn./obj.% síran dextranu (Mw 500 000) nebo polyethylenglykol 6000 během hybridizace (viz Ausubel supra na 2.10.10),

Aby byly získány dobré výsledky hybridizace mezí nukleotidovou sekvencí, imobilizovanou na membráně a značenou nukleotidovou sekvencí, musí být na imobilizovanou nukleotidovou sekvenci hybridizováno dostatečné množství značené nukleotidové sekvence a musí následovat promytí. Promytí zajišťuje, aby byla značená nukleotidová sekvence hybridizována na imobilizovanou nukleotidovou sekvenci pouze se žádoucím stupněm komplementarity vůči značené nukleotidové sekvenci.

„Stringentnost“ ve smyslu v jakém je zde používána znamená podmínky, zahrnující teplotu a iontovou sílu a přítomnost či nepřítomnost určitých organických rozpouštědel v průběhu hybrid i-13CZ 299646 Bó zace. Čím vyšší stringentnost, tím vyšší bude stupeň komplementarity mezi mobilizovanými nukleotidovými sekvencemi a značeno u polynukleotidovou sekvencí.

„Stringentní podmínky“ označují takové podmínky, za kterých budou hybridizovat pouze nukleotidové sekvence s vysokou frekvencí komplementárních bází.

Typickými stringentními podmínkami jsou např. (1) 0,75M fosforečnan disodný/0,5M fosforečnan sodný/1 mM EDTA (sodná sůl)/l% sarkosyl při teplotě asi 42 °C po dobu alespoň 30 min.; nebo (2) 6,0M močovina/0,4% laurylsulfát sodný/0,1 SSC při teplotě asi 42 °C po dobu alespoň 30 min.; nebo (3) 0,1 SSC/0,1% SDS při teplotě asi 68 °C po dobu alespoň 20 min.; nebo (4) lx SSC/0,1% SDS při teplotě asi 55 °C po dobu asi 60 min; nebo (5) lx SSC/0,1% SDS při ίο teplotě asi 62 °C po dobu asi 60 min; nebo (6) lx SSC/0,1% SDS při teplotě asi 68 °C po dobu 60 min; nebo (7) 0,2x SSC/0,1 % SDS při teplotě asi 55 °C po dobu asi 60 min; nebo (8) 0,2x SSC/0,1 % SDS při teplotě asi 62 °C po dobu asi 1 h; nebo (9) 0,2x SSC/0,1 % SDS při teplotě asi 68 °C po dobu asi 60 min. Podrobnější příklady jsou uvedeny v CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, na stranách 2.10.1 až 2.10.16 a v Sambrook a kol.,

MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbour Press, 1989) v sekcích 1.101 až 1.104. Obě citace jsou zde začleněny jako odkaz.

Ačkoliv promytí při střingentních podmínkách většinou probíhá při teplotách od asi 42 do 68 °C, odborní pracovníci ocení, že pro stringentní podmínky mohou být vhodné i jiné teploty. V přípa20 dě tvorby hybridu ĎNA-DNA dojde k maximální hybridizací většinou při teplotě asi 20 až 25 °C pod T_m. Je dobře známo, že T_m je teplota tání nebo teplota, při které disociují dvě komplementární polynukleotidové sekvence. Způsoby stanovení T_m jsou v dané oblasti techniky dobře známé (viz CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra na straně 2.10.8). U hybridu DNA-RNA dojde k maximální hybridizací většinou při teplotě asi 10 až 15 °C pod T_m.

V této oblasti techniky jsou dobře známé i jiné stringentní podmínky. Odborní pracovníci jistě pochopí, že při optimalizaci specifíty hybridizace mohou být upraveny různé faktory. Optimalizace stringentnosti závěrečných promytí může sloužit k zajištění vysokého stupně hybridizace.

Způsoby detekce značených nukleotidových sekvencí, hybriďizovaných na imobilizovanou nukleotidovou sekvenci, jsou pracovníkům v dané oblasti techniky dobře známé. Mezi tyto metody patří autoradiografie, chemii uminicsenční, fluorescenční a kolorimetrická detekce. Protilátky

Vynález rovněž předpokládá protilátky proti dříve zmíněným polypetidům, fragmentům, variantám a derivátům. Tyto protilátky mohou zahrnovat jakékoliv vhodné protilátky, které se vážou na' polypeptid, fragment, variantu nebo derivát vynálezu nebo s ním vytvářejí konjugát. Mezi protilátky mohou patřit například polyklonální protilátky. Tyto protilátky mohou být připraveny například aplikací polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu formou injekce do druhů, kde dochází k produkci protilátek, s cílem získat polyklonální antisérum. Mezi tyto produkční druhy patří myš nebo králík. Způsoby produkce polyklonálních protilátek jsou pracovníkům v dané oblasti techniky dobře známé. Příkladné protokoly, které mohou být použity, jsou popsány například vColligan a kol., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons, lne., 1991), který je zde začleněn jako odkaz a v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra) konkrétně Sekce III Kapitoly 11.

Místo polyklonálního antiséra, získaného v produkčních druzích, mohou být pomocí standarta ího postupu produkovány monoklonální protilátky. Tento postup je popsán např. v článku Kohler a Milstein (1975, Nátuře 256, 495 až 497), který je zde začleněn jako odkaz. Je možno použít také modifikované postupy jako jsou popsány např. v Coligan a kol., (1991, supra), a to pomocí nesmrtelných slezinných buněk nebo jiných buněk, které produkují protilátku. Dané buňky pocházejí z produkčních druhů, které byly zaočkovány jedním nebo více polypeptidy, fragmenty, variantami nebo deriváty vynálezu.

- 14CZ 299646 B6

Vynález v rámci svého rozsahu zahrnuje také protilátky, které obsahují Fc nebo Fab fragmenty polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, které byly zmíněny výše. Protilátky mohou příležitostně obsahovat protilátky proti peptidům podle vynálezu s jediným Fv řetězcem (scFvs).

Tyto scFvs mohou být připraveny například v souladu s postupy, které jsou popsány v patentu US 5 091 513, v patentu EP 239 400 nebo v článku autorů Winter a Milstein (1991, Nátuře, 349 293), které jsou zde začleněny jako odkazy.

Protilátky podle vynálezu mohou být využity při izolaci přirozených nebo rekombinantních polyio peptidů zN. meningitidis afinitní chromatografií. Například je možno odkázat na imunoafínitní chromatografické postupy, popsané v Kapitole 9.5 v knize Coligana a kol., (1995 až 1997, supra).

Protilátky mohou být použity pro testování expresních knihoven na varianty polypeptidů vynálezu. Protilátky vynálezu mohou být také použity pro detekci infekce bakterií N. meningitidis, což bude popsáno níže.

Detekce N. meningitidis

Přítomnost nebo nepřítomnost N. meningitidis u pacientů může být stanovena tak, že je od pacienta izolován biologický vzorek, poté je smíchán s protilátkou nebo fragmentem protilátky, které jsou popsány výše, za vzniku směsi. Poté je ve směsi detekována specificky navázaná protilátka nebo navázaný fragment, což naznačuje přítomnost N. meningitidis ve vzorku.

Termín „biologický vzorek“, který je zde používán, označuje vzorek od pacienta, který může být extrahovaný, neošetřovaný, ošetřený, zředěný nebo zahuštěný. Biologický vzorek je vhodně vybrán ze skupiny, kterou tvoří krev, sérum, plasma, sliny, moč, pot, ascitická tekutina, peritoneální tekutina, synoviální tekutina, amniotická tekutina, cerebrospinální tekutina, vzorek z biopsie kůže a podobné.

Pro stanovení tvorby komplexu může být použita jakákoliv vhodná technika. Například protilátka nebo fragment protilátky podle vynálezu, které obsahují připojenou značku, mohou být využity v imunostanoveních. Mezi tato imunostanovení mohou patřit, aniž by tím však byla nějak limitována, radioimunostanovení (RIA), heterogenní enzymoimunoanalýza (ELISA) a imunochromatografické techniky (ICT). Všechna tato stanovení jsou pracovníkům v dané oblasti techniky dobře známá. Například je možno odkázat na „CURRENT PROTOCOLS ÍN IMMUNOLOGY“ (1994, supra), kde je uvedena řada imunostanovení, která mohou být použita v souladu s předmětným vynálezem. Imunostanovení mohou zahrnovat kompetitivní stanovení, což je známo v dané oblasti techniky. - - - ^{40 * * * * 45}

Značky, které jsou připojovány na protilátku nebo fragment protilátky, mohou zahrnovat následující:

i. přímé připojení značky na protilátku nebo fragment protilátky;

ii. nepřímé připojení značky na protilátku nebo fragment protilátky tzn. Připojení značky na jinou měřenou látku, která se následně váže na protilátku nebo fragment protilátky; a iii.^J připojení protilátky nebo fragmentu protilátky na následný reakční produkt.

Značka může být vybrána ze skupiny, která zahrnuje chromogen, katalyzátor, enzym, fluorofor, chemiluminiscenční molekulu, lanthanidový ion jako je Europium (Eu³⁴), radioizotop a přímou vizuální značku.

⁵⁰

V případě přímé vizuální značky je možno použít koloidní kovovou a nekovovou částici, barevnou částici, enzym nebo substrát, organický polymer, latex, liposom nebo jinou částici, obsahující látku, poskytující signál apod.

-15CZ 299646 B6

Řada enzymů, které je možno použít jako značky, je uvedena v dokumentech US 4 366 241, US 4 843 000 a US 4 849 338, které jsou zde všechny začleněny jako odkazy. Mezi vhodné enzymové značky, které jsou užitečné v předmětném vynálezu, patří alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza, luciferáza, β-galaktosidáza, glukosaoxídáza, lysozym, malátdehydrogenáza apod.

Enzymová značka může být použita buď samostatně nebo v kombinaci s druhým enzymem, který je v roztoku.

Fluorofor je vhodně vybrán ze skupiny, která zahrnuje fluoresceinizothiokyanát (FITC), tetramethylrhodaminizothiokyanát (TRITL) nebo R-Phycoerythrin (RPE).

ío

Vynález je rovněž rozšířen na způsob detekce infekce N. meningitidis u pacientů. Zmíněný postup zahrnuje krok, během kterého dojde ke kontaktu biologického vzorku od pacienta s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu a krok, kdy je stanovena přítomnost nebo nepřítomnost komplexu mezí zmíněným polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivá15 tem a protilátkami, specifickými vůči N. meningitidis, které jsou ve zmíněném séru, přičemž přítomnost zmíněného komplexu je indikátorem zmíněné infekce.

Ve výhodnějším provedení je detekce výše uvedeného komplexu zvýšena detekovatelnou modifikací zmíněného polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu pomocí vhodné značky, dobře známé v dané oblasti. Tato modifikovaná sloučenina je použita ve vhodném imunostanovení jako je např. popsáno výše.

Podle dalšího aspektu poskytuje vynález také způsob detekce bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku, u kterého je podezření, že obsahuje zmíněnou bakterii. Zmíněný postup zahrnuje izolaci biologického vzorku od pacienta, detekci sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu ve zmíněném vzorku, což naznačuje přítomnost zmíněné bakterie.

Detekce zmíněné sekvence nukleové kyseliny může být provedena pomocí jakékoliv vhodné techniky. Například značená sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může být použita jako próba při Southern blotu extraktu nukleové kyseliny, který byl získán od pacienta. Tento postup je v dané oblasti techniky dobře znám. Značená sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může být také využita jako próba při Nothem blotu extraktu RNA od pacienta. Extrakt nukleové kyseliny od pacienta je výhodněji využit při amplifikaci nukleové kyseliny jako je PCR nebo při ligázové řetězové reakci (LCR), které jsou popsány např. v Mezinárodní přihlášce WO89/09385, která je zde začleněna jako odkaz, v souladu s oligonukleotidovými primery, odpovídajícími sense a antisense sekvencím k sekvenci nukleové kyseliny podle vynálezu nebo s přesahujícími sekvencemi.

Vhodné jsou rovněž automatizované techniky detekce na bázi pevné fáze. Například pro detekci nukleových kyselin jsou použity řady souprav imobilizováných primerů (VLSIPS™), což je popsáno např. v publikaci Fodor a kol.,'(1991, Science 25\:76l až 777) a v Kazal a kol., (1996, Nátuře Medicine 2:753 až 759). Výše uvedené techniky jsou pracovníkům v dané oblasti techniky dobře známé.

Farmaceutické prostředky

Dalším charakteristickým iysem vynálezu je využití polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu („imunogenní činidla“) jako aktivních složek farmaceutického prostředku pro ochranu pacientů před infekcí bakterií N. meningitidis. Farmaceutický prostředek vhodně obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič.

Pod pojmem „farmaceuticky přijatelný nosič“ je míněna pevná nebo kapalná náplň, ředidlo nebo enkapsulovaná látka, které mohou být bez rizika použity v systemickém podávání. V závislosti na konkrétním způsobu podávání mohou být použity různé farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou dobře známé v dané oblasti techniky. Tyto nosiče mohou být vybrány ze skupiny, která ’’·ώιΰ_:

-16CZ 299646 B6 zahrnuje cukry, škroby, celulózu a její deriváty, slad, želatinu, talek, síran vápenatý, rostlinné oleje, syntetické oleje, polyoly, kyselinu alginovou, roztoky, pufrované fosfátem, emulgátory, izotonický fyziologický roztok a vodu bez obsahu pyrogenu.

Pro poskytnutí prostředku vynálezu pacientovi může být použita jakákoliv vhodná cesta aplikace například orální, rektální, parenterální, sublinguální, bukální, íntravenózní, intraartikulární, intramuskulámí, intradermální, subkutaneózní, inhalační, intraokulární, intraperitoneální, intracerebroventrikulámí, transdermální a podobné. Např. pro podávání imunogenních prostředků, vakcín a DNA vakcín je vhodná intramuskulámí a subkutaneózní aplikace.

Mezi formy, které jsou podávány patří tablety, disperze, suspenze, injekce, roztoky, sirupy, pastilky, kapsule, čípky, aerosoly, transdermální náplasti apod. Mezi tyto formy dávky mohou také patřit injekční a implantační zařízení s regulovaným uvolňováním, navržené specielně pro tyto účely nebo jiné formy implantátů, které jsou upraveny tak, aby pracovaly konkrétním způsobem. Regulované uvolňování terapeutického činidla může být ovlivněno potažením činidla např. hydrofobními polymery včetně akrylových pryskyřic, vosků, vyšších alifatických alkoholů, polymléčných a polyglykolových kyselin a určitých celulózových derivátů jako je hydroxypropylmethylcelulóza. Regulované uvolňování může být dále ovlivněno použitím jiných polymeru ích matricí, lipozómů a/nebo mikrosfér.

Farmaceutické prostředky předmětného vynálezu, které jsou vhodné pró orální nebo parenterální podávání, mohou být prezentovány jako samostatné jednotky jako jsou kapsule, sáčky nebo tablety, z nichž každá obsahuje předem stanovené množství jednoho nebo více terapeutických činidel vynálezu, jako prášek nebo granule nebo jako roztok či suspenze ve vodné kapalině, bezvodé kapalině, v emulsi olej ve vodě nebo v emulsi voda v oleji. Tyto prostředky mohou být připraveny jakýmkoliv farmaceutickým postupem, avšak všechny postupy zahrnují krok, kdy dochází ke spojení jednoho nebo více imunogenních činidel, které jsou popsány výše, s nosičem, který obsahuje jednu nebo více nezbytných přísad. Prostředky jsou obecně připravovány uniformním a známým smícháváním imunogenních činidel vynálezu s kapalnými nosiči nebo s finálně rozdělenými pevnými nosiči nebo s oběmi a poté, je-li to třeba, je produkt vytvarován do žádoucí formy.

Výše uvedené prostředky mohou být podávány způsobem, který je slučitelný s dávkovači formulací a v takovém množství, které je ímunogenně účinné pro ochranu pacientů od infekce

A. meningitidis. Dávka, podávaná pacientovi, by měla být v kontextu předmětného vynálezu dostatečná pro získání účinné odpovědi jako je např. snížení hladiny N. meningitidis, ke které by mělo u pacienta dojít, nebo pro inhibici infekce bakterií N. meningitidis. Množství imunogenního činidla (činidel), které má být podáváno, může záviset na subjektu, který je léčen, včetně jeho věku, pohlaví, hmotnosti a celkového zdravotního stavu. S ohledem na toto závisí přesná množ40 ství imunogenního činidla (činidel), která je třeba podávat, na posouzení lékaře. Při určování účinného množství imunogenního činidla proti V. meningitidis, které má být podáváno v průběhu léčby nebo profylaxe, může lékař stanovit hladiny cirkulující plasmy, vývoj onemocnění a tvorbu protilátek proti N. meningitidis. V každém případě mohou být vhodné dávky imunogenních činidel vynálezu snadno stanoveny odborníky vdané oblasti. Tyto dávky se mohou pohybovat v nanogramech až miligramech imunogenních činidel vynálezu.

Výše uvedené prostředky mohou být použity jako terapeutické nebo profylaktícké vakcíny. Kromě toho je vynález rozšířen na výrobu vakcín, obsahujících jako aktivní složku jedno nebo více imunogenních činidel vynálezu. Pro přípravu těchto vakcín se předpokládá jakýkoliv vhodný po50 stup. Příkladné postupy jsou popsány např. v NEW GENERATION VACCINES (1997, Lev i ne a kol., Marcel Dekker, lne. New York, Baset Hong Kong), který je zde začleněn jako odkaz.

Imunogenní činidlo podle vynálezu může být smícháno, konjugováno nebo fúzováno s jinými antigeny včetně B a T buněčných epitopů jiných antigenů. Kromě toho může být činidlo také konjugováno na nosič, což je popsáno níže.

-17CZ 299646 B6

V případě, zeje použit haptenový peptid vynálezu (tzn. peptid, který reaguje se stejnými protilátkami, ale sám o sobě nemůže vyvolat imunitní odpověď), může být konjugován s imunogenním nosičem. Použitelné nosíce jsou vdané oblasti techniky dobře známé a patří mezi ně např.: thyroglobulin; albuminy jako je lidský sérový albumin; toxiny; toxoidy nebo jakýkoliv mutantní

5. materiál, vykazující křížovou reaktivitu (CRM), toxinu tetanu, záškrtu, černého kašle, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus a Streptococcus', polyaminokyseliny jako je po ly( lysin: kysel i na glutamová); chřipka; Rotavirus VP6, Parvovirus VP1 a VP2; jaderný protein viru hepatitidy B; rekombinantní vakcína viru hepatitidy B apod. Rovněž může být použit fragment nebo epitop nosičového proteinu nebo jiný imunogenní, protein. Například haptenový peptid vynálezu může ío být připojen na epitop T buňky bakteriálního toxinu, toxoidu nebo CRM. V souvislosti s tím je možno odkázat na patent US 5 785 973, který je zde začleněn jako odkaz.

Polypeptid, fragment, varianta nebo derivát vynálezu mohou kromě toho pracovat jako nosičový protein ve vakcínách, zaměřených proti Neisseria nebo proti jiným bakteriím či virům.

Imunogenní ěinidlá vynálezu mohou být podávána jako multivalentní podjednotkové vakcíny v kombinaci s antigeny N. meningitidis nebo s antigeny jiných organismů včetně pathogenních bakterií H. influenzae, M. calarrhahs, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae atd. Příležitostně nebo dále mohou být imunogenní činidla podávána v souladu s oligosacharidovými nebo poly20 sacharidovými komponentami N. meningitidis.

Vakcíny mohou také obsahovat fyziologicky přijatelné ředidlo nebo vehikulum jako je voda, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok a fyziologický roztok.

Vakcíny a imunogenní prostředky mohou zahrnovat adjuvants, které jev dané oblasti techniky dobře známé. Mezi vhodná adjuvants patří, aniž by tím však byla limitována: povrchově aktivní látky jako je hexadecylamin, oktadecy lamin, oktadecyestery aminokyselin, lysolecithin, dimethyldiaoktadecylamoniumbromid, N,N-dioktadecyl-N',N'bi$(2-hydroxyethylpropandiamin), methoxyhexadecylglycerol a polyoly kyseliny pluronové; polyaminy jako je pyran, síran dextranu, póly IC karbopol; peptidy jako jsou muramyldipeptid a deriváty, dimethylglycin, tuftsin; olejové emulse a minerální gely jako je fosfát hlinitý, hydroxid hlinitý nebo alum; lymfokiny, QuilA a imunostimulační komplexy (ISCOMS).

Imunogenní činidla vynálezu mohou být exprimována oslabenými virovými hostiteli. Pod pojmem „oslabený virový hostitel“ jsou míněny virové vektory, které jsou buď přirozeně podstatně avirulentní, nebo jimi byly učiněny. Virus může být učiněn podstatně avirulentním jakoukoliv vhodnou fyzikální (např. působením tepla) nebo chemickou cestou (např. působením formaldehydu). Jako „podstatně avirulentní“^:je označován virus, jehož schopnost infikovat byla zničena. V ideálním případě je nakažl ivost viru zničena tak, aby nedošlo k nežádoucímu ovlivnění proteinů, které zajišťují imunogenicitu viru. Na základě výše uvedených fakt bude oceněno, že oslabení viroví hostitelé mohou obsahovat živé viry nebo ínaktivované viry.

Oslabení viroví hostitelé, které je možno použít ve vakcínách podle vynálezu, mohou obsahovat virové vektory, a to včetně adenoviru, cytomegaloviru a výhodněji virů neštovic jako je virus kravských neštovic (viz např. Paoletti a Panicali, patent US 4 603 112, který je zde začleněn jako odkaz) a oslabených kmenů Salmonella (viz např. Stocker, patent US 4 550 081, který je zde začleněn jako odkaz). Živé vakcíny jsou výhodné konkrétně proto, že vedou k prodlouženému podnětu, což může způsobit podstatně dlouhodobou imunitu.

Multivalentní vakcíny mohou být připraveny, z jednoho nebo více mikroorganismů tak, že exprimují odlišné epitopy N. meningitidis (např. jiné povrchové proteiny nebo epitopy N. meningitidis). Epitopy jiných pathogenních mikroorganismů mohou být začleněny do vakcíny.

Ve výhodnějším provedení bude tento postup zahrnovat konstrukci rekombinantního viru nešto55 vic pro expresi sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu. Po vpravení do hostitele exprimuje

-18CZ 299646 B6 rekombinantní virus neštovic imunogenní činidlo a tím vyvolává odezvu u hostitele. Například je možno odkázat na patent US 4 722 848, začleněný zde jako odkaz, který popisuje vektory neštovic a způsoby, které jsou užitečné v imunizačních protokolech.

ř*

Na základě předmětného odhalení bude odborníkům v dané oblasti techniky zřejmá existence řady různých jiných vektorů, užitečných pro terapeutické podávání nebo imunizaci imunogenními činidly vynálezu. ;

^!í

V dalším provedení může být nukleotidové sekvence použita jako vakcína ve formě vakcíny . io „samotné DNA“, což je vdané oblasti známé. Například expresní vektor vynálezu může být * včleněn do savce, kde způsobí produkci polypeptidu in vivo, proti kterému hostitel vytváří imunitní odpověď, jako je to například popsáno v Bány, M. a kol., (1995, Nátuře, 377:632 až 635), který je zde začleněn jako odkaz.

Detekční soupravy

Předmětný vynález také poskytuje soupravy pro detekci N. meningitidis v biologickém vzorku.

Tyto soupravy budou obsahovat jedno nebo více konkrétních činidel, popsaných výše, a to v závislosti na povaze použitého testovacího způsobu. V této souvislosti mohou soupravy obsahovat jeden nebo více polypeptidu, fragmentů, variant, derivátů, protilátek, fragmentů protilátek nebo nukleových kyselin podle vynálezu. Soupravy mohou také příležitostně obsahovat činidla, vhodná pro detekci značek, pozitivní a negativní kontroly, promývací roztoky, pufry pro ředění apod. Například detekční souprava na bázi nukleové kyseliny může obsahovat (i) nukleovou kyselinu podle vynálezu (která může být použita jako pozitivní kontrola), (ii) oligonukleo25 tidový primer podle vynálezu a někdy také DNA polymerázu, DNAligázu a další, a to v závislosti na použité technice pro amplifikaci nukleové kyseliny.

Příprava imunoreaktivních fragmentů

Vynález je rovněž rozšířen na způsob identifikace imunoreaktivního fragmentu polypeptidu, varianty nebo derivátů podle vynálezu. Tento způsob musí obsahovat vytvoření fragmentu polypeptidu, varianty nebo derivátu, podávání fragmentu savci a detekci imunitní odpovědi u savce.

Tato odpověď bude zahrnovat produkci prvků, které specificky vážou N meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát a/nebo působí jako ochrana vůči infekci

N. meningitidis.

Před testováním imunoreaktivity konkrétního fragmentu ve výše uvedeném postupu, může být použita řada metod, které umožňují předpovídat, je-li možno konkrétní fragment použít pro získání protilátky, která vykazuje křížovou reaktivitu s nativním antigenem. Tyto předpovědní me40 tody mohou být založeny na sekvenci aminokonce nebo karboxykonce jako je to např. popsáno v Kapitole 11.14 v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra). Tyto předpovědní metody mohou být založeny na předpovědi hydrofilicity jako je to popsáno např. v Kyte a Doolittle (1982, J. Mol.

Biol. 157:105 až 132) a v Hopp a Woods (1983, Mol. Immunol. 20:483 až 489), které jsou zde začleněny jako odkazy nebo na predikcích sekundární struktury, jako popisují např. Choo a

Fasman (1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251 až 276), který je zde začleněn jako odkaz.

Optimální výsledky obecně poskytují peptidové fragmenty, obsahující 10 až 15 zbytků. Peptidy menší než 6 nebo větší než 20 zbytků pracovaly uspokojivě. Tyto peptidové fragmenty mohou být poté chemicky připojeny na nosičovou molekulu jako je hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin, KLH) nebo hovězí sérový albumin (BSA) jako je např. popsáno v Sekcích 11.14a 11.15 v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra).

Peptidy mohou být použity pro imunizaci zvířete jako je diskutováno výše. Titry protilátky proti nativnímu nebo rodičovskému polypeptidu, ze kterého byl peptid vybrán, mohou být poté

-19CZ 299646 B6 stanoveny např. radioimunostanovením nebo metodou ELIS A, což je popsáno např, v Sekcích 11.16 a 114 v Ausubel a kol, (1994 až 1998, supra).

Protilátky mohou být poté přečištěny z vhodné biologické tekutiny zvířete pomoct srážení síra5 nem amonným nebo chromatograficky, což je v dané oblasti techniky dobře známo. Příkladný protokol na přečištění protilátek je uveden v Sekcích 10.11 a 11,13 v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra).

Imunoreaktivita protilátky proti nativnímu nebo rodičovskému polypeptidů může být stanovena i o jakýmkol i v vhodným postupem jako je např. Western blot.

Funkcionální blokátory

U polypeptidů podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11,, 13, 15, 17, 19 a 21 se před15 pokládá, že mají vlastnosti adhesinu. Fakticky mají určitou podobnost s adhesiny z Haemophilus influenzae, což jsou povrchové antigeny. Specificky jsou přibližně ze 67 % homologní s Hia proteinem zH. infuenzae (Barenkamp, S. a St. Geme III, J. 1996 Molecular Microbiology 19: 1215 až 1233) a ze 74% homologní s Hsf proteinem zH. influenzae (St. Geme III, J. a kol., 1996, Journal of Bacteriology 178: 6 281 až 6 287; patent US 5 646 259). Pro tato porovnávání byla použita mezera 3 a délka 0,01 a program GAP (Deveraux, 1984, supra). Seřazené sekvence těchto proteinů jsou ukázány na obr. 6. Přerušení funkce těchto polypeptidů by mělo mít významný terapeutický přínos, protože by mělo zabraňovat bakterii N. meningitídis přisednout a napadnout buňky. Přerušení funkce může být ovlivněno několika cestami.

Např. mohou být podávány skupiny jako chemické reaktanty nebo polypeptidy, které blokují receptory na povrchu buňky a které interagují s polypeptidy podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21. Tyto kompetují u infekčního organismu s receptorovými místy. Tyto skupiny mohou obsahovat např. polypeptidy vynálezu, konkrétně fragmenty, nebo jejich funkcionální ekvivalenty i mimetiky.

Termín „mimetiky“ je zde používán pro označení chemikálií, které jsou navrženy pro napodobení konkrétních funkcionálních oblastí proteinů nebo peptidů. Rovněž mohou být použity antiídiotypické protilátky, vytvořené proti výše popsaným protilátkám, které blokují vazbu bakterie na povrch buňky. Skupiny, které interagují s receptorovými vazebnými místy v polypeptidech podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21, mohou účinně zabraňovat infekci buňky bakterií N. meningitídis. Tyto skupiny mohou obsahovat blokovací protilátky, peptidy nebo jiné chemické látky.

Všechny tyto skupiny, farmaceutické prostředky, ve kterých jsou skupiny kombinovány s farma40 ceuticky přijatelnými nosiči a způsoby léčby pacientů, kteří jsou postiženi infekcí N. meningitídis a kterým jsou podávány tyto skupiny nebo prostředky, tvoří další aspekt vynálezu.

Polypeptidy vynálezu mohou být použity při testování a výběru sloučenin, které by mohly být použity ve výše uvedených metodách. Např. polypeptidy vynálezu mohou být kombinovány se značkou a vystaveny buněčné kultuře v přítomnosti testované látky. Poté může být pozorována schopnost látky inhibovat vazbu značeného polypeptidů na povrch buňky. V takovémto testu mohou být značené polypeptidy použity přímo na organismus jako je E. coli. Příležitostně může být sama N. meningitídis upravena tak, aby exprimovala modifikovanou a detekovatelnou formu polypeptidů. Použití upravených kmenů N, meningitídis v tomto postupu je výhodnější, protože je lepší, když terciární struktura proteinu bude podobnější než je to v případě exprimovaném ve wild-type bakterii.

Aby byl vynález srozumitelný a aby byl uveden do praktických souvislostí, budou nyní popsána konkrétní výhodnější provedení a to prostřednictvím následujících neomezujících příkladů.

-20CZ 299646 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje mapy plasmidů a strategii klonování, k amplifikaci oblasti, identifikované v databázi TIGR jako homolog AIDA-I, zMC58 byly použity primery A3A a A3B (sekvence s identifikačními čísly 28 a 29). Aby byl získán pNMAIDA3, byl klonován produkt PCR. K amplifikaci Eagl fragmentu o velikosti 3 kbp, který obklopuje hiaNM, byly použity při inverzním PCR primery A3C (sekvence s identifikačním číslem 30) a A3D (sekvence s identifikačním číslem 31). Tento produkt byl klonován a byl získán piEAGA3. piEAGA3 byl subklonován za vzniku piEagA3.8 a piEagA3.9. K amplifikaci přilehlé oblasti zMC58 byly použity primery HiaNM: M a HiaNM:P (sekvence s identifikačními čísly 22 a 23) a produkt byl klonován za vzniku pHiaNM. K amplifikaci otevřeného čtecího rámce hiaNM byly použity primery HiaMBPA (sekvence s identifikačním číslem 24) a Hia-MBPB (sekvence s identifikačním číslem 25) a produkt byl klonován do pMALC2 za vzniku pMBP-HiaNM;

Obr. 2 je Southern blot genomické DNA mnoha kmenů N. meningitidis. 2A: kmeny séroskupiny B. Dráha 1 PMC28, dráha 2 PMC27, dráha 3 PMC25, dráha 4 PMC24, dráha 5 PMC16, dráha 6 PMC13, dráha 7 PMC12, dráha 8 standardy molekulové hmotnosti, dráha 9 2970, dráha 10 1000, dráha 11 528, dráha 12 SWZ107, dráha 13 H41, dráha 14 H38, dráha 15 NGH36, dráha 16 H15, dráha 17 NGG40, dráha 18 NGF26, dráha 19 NGE30, dráha 20 NGE28. 2B: Kmeny jiných séroskupin než B. Dráha 1 PMC3, dráha 2 PMC 17, dráha 3 PMC20, dráha 4 PMC23, dráha 5 PMC8, dráha 6 PMC9, dráha7 PMC11, dráha8 PMC14, dráha9 PMC18, dráha 10 PMC21, dráha 11 PMC29, dráha 12 standardy molekulové hmotnosti, dráha 13 PMC 19, dráha 14 PMC1, dráha 15 PMC6, dráha 16 PMC10, dráha 17 PMC22, dráha 18 PMC26, dráha 19 PMC2. Standardy molekulové hmotnosti jsou uváděny v kilobazích (kb). GenomickáDNA byla hybridizována s próbou, odpovídající ntp 276-2054 sekvence s identifikačním číslem 1.

Obr. 3 ukazuje gel MBP-HiaNM, obarvený Coomassie modří, buňky, obsahující pMALC2 (dráha 2) nebo pMBP-HiaNM (dráha 3) po indukci pomocí 1PTG. V dráze 1 jsou standardy molekulové hmotnosti (kDa), Šipky označují MBP a MBP-HiaNM.

Obr. 4 je Western blot proteinů MC58 a MC58AHiaNm, inkubovaný s králičím antisérem. Dráha 1 jsou standardy molekulové hmotnosti v kDa, dráha 2 jsou celkové buněčné proteiny MC58, dráha 3 jsou celkové buněčné proteiny MC58AHiaNM, dráha 4 je OMC preparát MC58, dráha 5 je OMC preparát MC58AHiaNM. Každá dráha obsahovala 50 μΐ suspenze proteinů s A₂go⁼ 3,75.

Obr. 5 ukazuje gel, který probíhal paralelně s gelem pro Western blot na obr. 4. Tento gel byl obarven Coomassie modří. Dráhyjsou stejné jako na obr. 4.

Obr. 6 ukazuje porovnání sekvencí polypeptidu HiaNM, Hia, Hsf pomocí programu PÍLEUP.

Obr. 7 ukazuje porovnání polypeptidových sekvencí HiaNM z 10 kmenů N meningitidis pomocí programu PILEUP.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Molekulární klonování a subklonování a konstrukce mutántu hiaNM

Gen A/aM/byl nejprve izolován PCR amplifikaci pomocí standartních způsobů. Stručně řečeno, vzhledem k naší předcházející práci na homolozích proteinu AIDA-I z £. coli (Jennings, M, a koí, 1995, Microbial Pathogenesis, 19:391 až 407), Peak, 1. a kol., Microbial Pathogenesis, v tisku) jsme provedli výběr homologů, identifikaci sledované sekvence v dřívějších datech,

-21 CZ 299646 B6 pocházejících z projektu na sekvenování genomu MC58c3 (The Institute for Genomic Research, ftp://ftp.tigr.org/pub/datayn. meningitidis/) a amplifikovali jsme homologní oblast pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce) s použitím oligonukleotidů A3A (5 '-TTTGC AACGGTTC AGGCA-3', sekvence s identifikačním číslem 28) a A3B (5-TATTCAGCAGCGTATCGG-3', sekvence s identifikačním číslem 29). Vznikající produkt o 449 párech bází (bp) byl klonován do pT7Blue za vzniku plasmidu pNMAIDA3. Aby byl klonován celý gen, byly navrženy další oligonukleotidy a byly použity v inverzní PCR reakci. Tyto oligonukleotidy byly A3C (sekvence s identifikačním číslem 30) a A3D (sekvence s identifikačním číslem 31) a odpovídaly komplementární sekvenci A3A (sekvence s identifikačním číslem 28) a A3B (sekvence s identifikačním číslem 31). Templátem pro tuto reakci byla chromozomální DNA MC58, která byla naštěpena restrikčními enzymy Eagi a poté samoligována. Vznikající produkt PCR s velikosti 3 kbp byl klonován do vektoru pCRII (Invitrogen), produkujícího plasmid piEagA3. Ten byl naštěpen Eag\ a £cí?RI a vznikající fragmenty o velikosti 1,4 kbp a 1,6 kbp, obsahující klonovanou DNA, byly klonovány do pBluescriptSKII, Ml 3minus. (Stratagene), za vzniku piEagA3.8 a piEagA3.9.

Plasmid pHiaNM byl vytvořen amplifikací PCR hiaNMa sekvenováním 5' a 3' k němu pomocí oligonukleotidových primerů HiaNM:P (5 -TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3“ sekvence s identifikačním číslem 22) a HiaNM:M (5'-CTTCCCTTCAAACCTTCC-3^ř, sekvence s identifikačním číslem 23), odpovídajících v sekvenci s identifikačním číslem 1 nukleotidové pozici (ntp) 113 až 133 a 2102 až 2085. Produkt byl klonován do pT7Blue. Plasmid pHiaNMAKan byl vytvořen inzercí úseku, nesoucího resistenci vůči kanamycinu, do místa BglII v pHiaNM, odpovídajícího v sekvenci s identifikačním číslem 1 ntp 680. Úsek, nesoucí resistenci vůči kanamycinu, byl zpUC4Kan (Pharmacia) odstraněn pomocí BarM. pHiaNMAKan byl transformován do N meningitidis kmen MC68 pomocí inkubace bakterie s plasmidovou DNA po dobu 3 h na agaru Brain Heart Infusion (Acumedia Manufacturefs lne), který byl obohacen 10% zahřátou koňskou krví („BHI misky“). Inkubace probíhala při 37 °C v 5% CO₂, Jednotlivé kolonie byly přeneseny na čerstvá selektivní média, byly kultivovány a použity pro další studium. Tento mutantní kmen byl označen jako MC58AHiaNm. Porušení genu hiaNM v tomto kmeni bylo potvrzeno Southern blotem pomocí próby, odpovídající v sekvenci s identifikačním číslem 1 ntp 276 až 2054,

Příklad 2. Analýza nukleotidové sekvence

Nukleotidová sekvence byla analyzována pomocí sekvenační soupravy PRISM Dye terminátor s AmpliTaq DNA potymerázou FS nebo pomocí soupravy BigDye terminátor, jak je doporučováno v návodech od výrobce (Perkin Etmer), ve spojení s automatickým sekvenátorem model 373a (Applied Biosystems). Pro každý kmen byl amplifikován hiaNM ve 3 nezávislých PCR reakcích s použitím primerů HiaNM5'A2: 5-CCAAACCCCGATTTAACC-3' (sekvence s identifikačním číslem 26) a HiaNM3'A:5'-AATCGCCACCCTTCCCTTC-3' (sekvence s identifikačním číslem 27), což je naznačeno na obr. 1. Primery odpovídají v sekvenci s identifikačním číslem 1 ntp 230 až 247 a 2114 až 2097. Vznikající produkty byly přečištěny a shromážděny. Toto bylo použito jako templát pro přímé sekvenování obou řetězců. Data byla analyzována pomocí programů GCG (Deveraux a kol. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387 až 395) a AssemblyLIGN (Oxford Molecular). Bylo vytvořeno také několik nukleotidů nezbytných pro kompletní sekvence. Sekvence hiaNM 10 kmenů jsou ukázány v sekvencích s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20, odvozené aminokyselinové sekvence těchto genů jsou ukázány v sekvencích s.identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21.

Srovnání hiaNM l těchto kmenů naznačilo, že sdílejí 90 až 99% identitu s hiaNM zMC58,

Kromě toho hiaNM z MC58 vykazuje 62% až 68% homologii s hia a hsf z Haemophillus influenzae, v testovaných kmenech má však hiaNM délku 1770 až 1800 bp. Toto je odlišné od hia a hsf; jejichž délka je 3294 a 7059 bp. Předpovězený polypeptid z hiaNM, HiaNM, rovněž vykazuje homologii s několika dalšími bakteriálními proteiny včetně AlDA-l, s adhesinem zahrnutým v diíuzní adherencí diaroické Escherichia coli kmen 2787 (0126:H27), HMW1, s dalším adhesinem z Haemophillus, UspAl, s vysokomolekulámím proteinem z Moxarella catarrthalis a

-22CZ 299646 B6 se SepA, zahrnutým do napadání tkáně Shigella flexneri (Benz, I. a Schmidt, M. A., 1992, Molecular Microbiology 6: 1539 až 1546, Barenkamp, S. J, a Leininger, E. 1992, ínfection and ímmunity6Q: 1302 až 1313, Aebi, C, a kol. 1997, ínfection and immunity 65; 4367 až 4377, Benjelloun-Touimi, Z. a kol. 1995, Molecular Microbiology 17: 123 až 135). Homologie těchto (a několika dalších proteinů) se vyskytuje v rámci prvních 50 aminokyselin HiaNM. Analýza této sekvence ukázala přítomnost předpovídané signální sekvence s místy štěpení v aminokyselině 50 ve všech testovaných sekvencích HiaNM. Tyto dlouhé signální sekvence jsou běžné u proteinů, lokalizovaných ve vnější membráně gramnegativní bakterie (Henderson, I a kol., 1998, Trends in Microbiology 6:370 až 378). Výše zmíněné proteiny, se kterými vykazuje homologii prvních 50 aminokyselin HiaNM, jsou členy proteinové rodiny „autotransportních“ proteinů vnější membrány (Henderson, I, supra). Toto striktně udává, že HiaNM je umístěn ve vnější membráně N. meningitidis.

Příklad 3. Analýza Southern blotem

Analýza Southern blotem byla provedena standartními technikami (Sambrook a kol., supra, Ausubel a kol., supra). Stručně řečeno, genomická DNA byla připravena ze 70 kmenů N. meningitidis několika séroskupin, byla naštěpena restrikčními enzymy a elektroforeticky separována na agarózovém gelu. Poté byla kapilárou převedena na nylonovou membránu. Tyto membrány byly hybridizovány se značenou próbou. Použitá próba odpovídala v sekvenci s identifikačním číslem 1 ntp 276 až 2054, obklopující celý otevřený čtecí rámec hiaNMkmene MC58. Tato byla označena DIG (d i oxygen inem) podle návodů výrobce (Boehringer Mannheim). K promytí byly použity stringentní podmínky (dvojnásobné promytí 5 min. při 22 °C v roztoku

2x SSC/0,1% SDS, následované dvěma promytími po dobu 30 min. při 68 °C, 0,2xSSC/0,l% SDS). Hybridizace byla detekována kolorimetricky pomocí nitrobluetetrazolium/bromo-chloryl“ indolyl-fosfátu (NBT/BCIP) jak je doporučováno výrobcem. Signály byly detekovány ve všech testovaných kmenech (např. obr. 2). Kromě prototypního kmene MC58 byly testovány následující kmeny:

Tabulka 3

Název kmene	Zdroj	Séroskupina	Název kmene	Zdroj	Séroskupina
PMC 3 (J1Q79)	2a	A	ŇGF26	1	B
PMC17 (K874)	2	A	NGG40	T	B
PMC20 (H79)	2	A	H15	1	B
PMC23 (K750)	2	A	SWZ107	1	B
PMC12(K852)	2	B	528	1	B
PMC 13 (K859)	2	B	.2970	1	B
PMC 16 (K873)	2	B	1000	í	B
PMC 24 (K782)	2	B	MPJB28	3C	B
PMC25(K79Í)	2	B	MPJB56	3	B
PMC 27 (K816)	2	B	MPJB88	3	B
PMC28(K837)	2	B	MPJB157	3	B
BZ10	1B	B	MPJB328	3	B
BZ47	1	B	MPJB627	3	B
BZ83	1	B	MPJB820	,3	B
BZ133	1	B	MPJB945	3	B

23CZ 299646 B6

BZ147	1	B	PMC 8 (K157)	2	C
BZ163	I	B	PMC 9 (K497)	2	C
BZ169	1	B	PMC11(K848)	2	c
BZ198	1	B	PMC 14 (K860)	2	c
BZ232	1	B	PMC 18 (K879)	2	c
NG3/88	1	B	PMC 21 (K656)	2	c
NG4/88	1	B	PMC 29 (K841)	2	c
NG6/88	1	B	MPJC05	3	c
EG327 .	i	B	MPJC14	3	c
EG329	1	B	MPJC134	3	c
DK353	1	B	MPJC302	3	c
179/82	1	B	MPJC379	3	c
66/84	1	B	PMC19	2	w
DK24	l	B	MPJW025	3	w
NGH36	1	B	PMC 1 (J603)	2	X
H38	1	B	PMC6(K131)	2	X
H41	1	B	PMC 10 (K526)	2	Ύ
NGE28	1	B	PMC 22 (K685)	2	Y
NGE30	1	B	PMC 26 (K810)	2	Y
NGP20	i	B	PMC 2 (J1049)	2	z

^A World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Meningococci, Oslo, Norsko ^B Public Health Laboratory Service Meningococcal Reference Laboratory, Manchester, Velká Británie ^c Brisbane Hospitals, nyní ve sbírce kmenů M.P. Jenningse, Ústav Mikrobiologie, University of Queensland, Brisbane, Austrálie.

Příklad 4. Exprese a částečné přečištění MBP-HiaNM

Plasmidový vektor byl konstruován tak, že umožňoval expresi proteinu, který obsahoval fúzi proteinu, vážícího maltózu a HiaNM (MBP-HiaNM). Plasmid pHiaMBP byl vytvořen ampli15 fikací hiaNM z MC58 pomocí primerů HiaNM-MBPA 5 -GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATACCGCAT-3' (sekvence s identifikačním číslem 24) a HiaNM-MBPB5'-TCACCCAAGCTTAACCCTTACCACTGATAAC-3' (sekvence s identifikačním číslem 25). Tyto primery obklopují start a stop kodóny hiaNMzN. meningitidis kmen MC58 a modifikovaná restrikční místa pro snadné klonování. Plasmidové restrikční mapy a pozice oligonukleotidů jsou ukázány na obr. 1. Vzniklý produkt PCR byl ligován do plasmidu pMALC2, naštěpeného Bani\-\\/Hind\.]\ (New England Biolabs) a vzniklý plasmid pHiaMBP (viz obr. 1) byl začleněn zpět do E. coli kmen DHSa. Tento kmen £. coli, obsahující pHiaMBP, byl indukován pro expresi fúzního proteinu HiaNM-MBP za podmínek, které doporučuje výrobce (New England Biolabs). Buněčné extrakty z kultur, obsahujících pHiAMBP, byly separovány SDS-PAGE v 10% gelu a fúzní protein byl částečně přečištěn elucí v zařízení mini-Gel Electro—eluter (BioRad) podle pokynů výrobce. Frakce, obsahující fúzní protein HiaNM-MBP, byly detekovány Western blotem

-24CZ 299646 B6 s použitím králičího séra proti MBP (New England Biolabs). Čistota fúzního proteinu HiaNMMBP byla stanovena pomocí SDS-PAGE s následným barvením pomocí Coomassie modři. Množství získaného proteinu bylo stanoveno stanovením s BCA (Sigma) nebo měřením absorbance pří vlnové délce 280 nm.

Příklad 5, Příprava polyklonálního séra

Částečně přečištěný fúzní protein HiaNM-MBP, získaný v Příkladu 4, byl použit pro přípravu io polyklonálního séra v králíkovi. Vzorky eluovaného fúzního proteinu HiaNmMBP byly dialyzovány proti sterilnímu fyziologickému roztoku, který byl pufrován fosfátem, o pH 7,4 (PBS) (Sigma). Poté byl vzorek smíchán v koncentraci 50 až 150 pg/ml s adjuvants (MPL+TDM+CWS, Sigma) a zaočkován ve dvou týdenních intervalech do bílých novozélandských králíků (New Zealand White). Z těchto králíků byla shromážděna krev. Sérum bylo extrahováno vysrážením při laboratorní teplotě po dobu 1 h, následovala inkubace přes noc při 4 °C a odstředění při 4000 rpm při 4 °C. Supernatant byl získán opětovným odstředěním. Sérum bylo skladováno v alikvotních podílech při -80 °C. Získaná séra byla použita při baktericidních stanoveních a Western blotech (viz níže).

Pro testování specifity získaného séra byl proveden Western blot. Stručně, proteiny z V. meningitidis kmenů MC58 a MC58AHiaNm byly separovány elektroforeticky SDS-PAGE a poté byly elektroforeticky převedeny na nitrocelulóžovou membránu pomocí zařízení Semi-Dry Blotter (BioRad). Poté byly ínkubovány postupně se sérem a alkalickou fosfatázou konjugovanou s IgG proti králičím IgG (Sigma) a kolorimetricky detekovány s NBT/BCÍP (Sigma). Tyto pokusy ukázaly, že protilátky byly fúzním proteinem HiaNM-MBP vyvolány, jsou specifické pro MC58 a jsou detekované v MC58, ale nikoliv v MC58AHiaNM (viz obr. 4). Předpovězená molekulová hmotnost odvozeného polypeptidu HiaNM je 62,3 kDa. Proužek, detekovaný sérem, migruje u zdánlivé Mw vyšší než 150 kDa. Tuto anomální migraci rovněž vykazují alespoň tři homologní „autotransportní“ proteiny, uvedené v literatuře: vysokomolekulární proteiny vnější membrány

UspAl a UspA2 z Moxarella catarrhalis mají předpovídané molekulové hmotnosti 62,5 kDa a 88,3 kDa, ale migrují u 85 kDa a 120 kDa a jako komplex UspA mezi 350 kDa a 720 kDa (Aebi, C. a kol, 1997, Infection and Immunity, 65: 4367 až 4377, Klingman, K. L. a Murphy, T. F., 1994, Infection and Immunity, 62: 1150 až 1155). Podobně Hia z Haemophilus influenzae má předpovídanou molekulovou hmotnost 116 kDa, ale je-li exprimována ve fágu, migruje Hia u hodnot vyšších než 200 kDa (Barenkamp, S. a St. Geme III, J. 1996 Molecular Microbiology 19:1215 až 1233).

Aby bylo potvrzeno, že HiaNM je spojen s vnější membránou N. meningitidis, byly připraveny komplexy vnější membrány (omc), jako bylo popsáno dříve (van der Ley, P. a koL, 1991,

Infection and fmmwiity, 59:2963 až 2971). Stručně, bakterie byly kultivovány přes noc na BHI miskách s agarem Brain Heart ínfusion (Acumedia ManufactureCs lne), který byl obohacen 10% zahřátou koňskou krví, byly resuspendovány v 10 mM Tris pH 8,0 a povařením usmrceny. Poté byl vzorek sonikován, aby byla porušena membrána. Zbytky buněk byly odstraněny odstředěním při 10 000 g (rcf, relativní odstředivá síla) a supematant byl znovu odstředěn při 50 000 g. Peleta byla resuspendována v 1% sarkosyl/10 mM Tris pH 8,4 a suspenze byla odstředěna při 10 000 g, Supematant byl odstředěn při 75 000 g a peleta byla před spektrofotometrickou kvantifikaci při vlnové délce 280 nm resuspendována v Tris pH 8,4. Část frakce, nerozpustné v sarkosylu, která obsahovala proteiny vnější membrány (50 μΐ sA₂8o = 3,75), byla podrobena SDS-PAGE a Western blotu, které jsou popsány výše. Výsledky, ukázané na óbr. 4, ukazují, že reaktivita santisérem proti HiaNmMBP je pozorována v případě wild-type MC58, ale nikoliv u MC58AHiaNM, ve kterém byl hiaNM inaktivován. Zvýšení reaktivity se sérem proti HiaMBP, pozorované mezi vzorky celých buněk a omc vzorky, které obsahují stejné celkové množství proteinu, v kulturách MC58 je v souladu s membránovým spojením HiaNM.

-25CZ 299646 B6

Příklad 6. Stanovení baktericidity

Aby bylo stanoveno, zdali obsahuje antisérum proti HiaMBP baktericidní protilátky specifické .

pro HiaNM, byla provedena stanovení baktericidity u wild-type MC58 a MC58AHiaNM. Toto j stanovení bylo uskutečněno modifikovaným postupem, který popsal Hoogerhout a kol. (1995, ΐ

Infection and Immunity, 63: 3473 až 3478). Stručně, MC58 a MC58AHiaNm byly kultivovány přes noc na BHI miskách při 37 °C v 5% CO₂. Bakterie z této kultury, kultivované přes noc, byly před tím, než byly suspendovány v 1 ml PBS subkultivovány za stejných podmínek po dobu 4 až 6 h. Počet bakterií byl stanoven na základě lýze vzorku v roztoku 0,2 N NaOH/1% SDS a podle 10 absorbance při vlnové délce 260 nm, přičemž A₂₆₀ = 1 - 10⁹ cfu/ml. Bakteriální suspenze byla upravena PBS na koncentraci přibližně 10⁵ cfu/ml. Testovaná králičí séra byla zahřátím na 56 °C po dobu 45 min. inaktivována. Sérum ze čtyři týdny starých novozélandských bílých králíků bylo shromážděno a použito jako zdroj komplementu (Central Animal Breeding House, University of Queensland). Stanovení bylo provedeno ve sterilních polystyrénových mikrotitraěních destičkách t5 s 96 jamkami ve tvaru T. Celkový objem v každé jamce byl 24 μΐ: 12 μΐ dvakrát po sobě zředěného séra v PBS a 6 μΐ bakteriální suspenze (obsahující 300 až 900 bakterií). Séra a bakterie byly inkubovány pří laboratorní teplotě po dobu 10 min a poté bylo přidáno 6 μΐ 80% komplementu v PBS (konečná koncentrace 20 obj. %). Kontroly byly: a) PBS, bakterie a komplement, b) PBS, bakterie a sérum. Po přídavku všech složek a zamíchání bylo na, misku s BHI rozetřeno 7 μΐ 20 z každé kontrolní jamky. Mikrotitrační destička byla poté inkubována při 37 °C v 5% CO₂ po dobu 60 min. Po této inkubaci bylo na misky s BHI rozetřeno 7 μΐ z každé jamky. Všechny misky s BHI byly inkubovány po dobu 14 až 18 h při 37 °C a v 5% CO₂ a poté byly spočítány bakteriální kolonie. Jako bakterícidně zabíjející sérum je uváděno nejvyšší reciproční ředění, při kterém je usmrceno alespoň 90 % bakterií. Použité sérum bylo ze stejného králíka a ze stejného 25 vykrvení jako v případě Western blotu, který je uveden v Příkladu 5. Tyto pokusy shodně ukazují snížené titry (přibližně 3 krát, tab. 4) usmrcení proti MC58AHiaNm ve srovnání s wild-type kmenem MC58, což naznačuje, že antiséra proti HiaMBP obsahovala baktericidní protilátky, specifické pro HiaNM.

Tabulka 4 .i-5*

KMEN	TTTR*
MC58	12(+/-4,6)
MC58ÁHiaNm	3,5 (+/-1)

³ znamená čtyři nezávislé pokusy

Diskuse

U některých pathogenních bakterií byla s determinantami virulence spojena repetitivní DNA. Pomocí Southern blotů, odhalil motiv repetitivní DNA přítomnost alespoň 3 míst v N. meningitidis kmen MC58, která obsahovala tento motiv (Peak, 1. a kol., 1996, FEMS Microbiology Letters, 137:109 až 114). Tyto geny byly klonovány a sekvenční analýza dvou z těchto opako40 váných míst (nmrep2 a nmrep3) odhalily otevřené čtecí rámce přibližně 670 aminokyselin (Jennings, M. a kol., 1995, Microbial Pathogenesis, 19:391 až 407, Peak, I. a kol., Microbial Pathogenesis, v tisku). Tyto vykazovaly homologii jeden s druhým a homologii skarboxykoncem adhesinu AÍDA-I v E. coli. AIDA-I má délku 1286 aminokyselin. Oblast C-konce tvoří zdánlivou transportní doménu vnější membrány a aminokoncová doména zralého proteinu tvoří adhesinovou doménu. Aminokoncová doména křižuje membránu přes zdánlivou transportní doménu a je označována jako passenger doména.

Protože Nmep2 a Nmep3 sdílejí sekvenční homologii s transportní doménou AIDA-I, jsou považovány za součásti tvořící membránové póry. Nmrep2 a Nmrep3 mají přibližně poloviční velikost AIDA-I a jsou homologní s membránovou překlenovací doménou A ID A-l. Domníváme

-26CZ 299646 B6 se, že v N. meningitidis existuje místo, které vykazuje homologii s aminokoncovou doménou AIDA-I. Provedli jsme výběr těchto homologů v datech z projektu na sekvenování N. meningitidis kmen MC58v3 (TIGR, supra) a nalezli jsme jednu oblast homologní s genem, označeným v Haemophilus influenzae kmen Rd (HI 1732) jako AIDA-I, protože je homologní sAIDA-I v £ coli (Fleischmann a kol., 1995, Science 269:496 až 51,2). Z pohledu homologii, které jsou uvedeny výše, se přihlašovatelé rozhodli pokračovat v objevování dále.

Gen byl nejdříve izolován pomocí PCR amplifikace DNA, odpovídající fragmentu o 471 párech bází, označeném gnmaa84r, zN. meningitidis MC583 a sekvence byla potvrzena. Další PCR ío umožnily amplifikaci delších fragmentů. Ty byly klonovány a byla provedena sekvenční analýza jako je na obr. 1. Gen vykazoval homologii s aminokoncovou oblastí AIDA-I z E. coli a my jsme ho označili aida3, protože reprezentoval třetí homolog AIDA-Í v N. meningitidis (s nmrep2 a nmrep3). Protože byl publikován objev dvou dalších genů hia a hsf z H. influenzae (Barenkamp,

S. a St. Geme III, J. 1996 Molecular Microbiology 19:1 215 až 1 233, St. Genie lil, J. a kol., 15 1996, Journalof Bacteriology 178: 6 281 až 6 287), kterým je aida3 podobnější, přeoznaěili jsme tento gen na hiaNM. (HI1732, gen H. influenzae poprvé identifikovaný jako homolog AIDA-I byl rovněž vzhledem ke zprávám Barenkampa a St. Geme III znovu přeoznačen na hia).

Cílem bylo prostřednictvím specifikace popsat výhodnější provedení vynálezu bez omezení 20 vynálezu na jakékoliv provedení nebo specifický soubor údajů. Odborníci v dané oblasti techniky jistě ocení, že vzhledem k nynějšímu odhalení, mohou být provedeny různé modifikace a změny konkrétních provedení, uvedených jako příklady, aniž by tím došlo k odchýlení se od rozsahu předmětného vynálezu. Předpokládá se, že všechny tyto modifikace a změny budou zahrnuty do rozsahu připojených nároků.

Claims (10)

1. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 307 až 332 sekvence s identifikačním číslem 2.

35 2. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny obsahující:

a) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 2;

b) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 5;

c) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 7;

v

d) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 9;

40 e) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 11;

f) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 13;

g) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 15;

h) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 17;

i) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 19 a 45 j) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 21.

3. Varianta izolovaného polypeptidu podle nároku 1 nebo 2, která má aminokyselinovou sekvenci alespoň ze 75 % identickou s aminokyselinovou sekvencí s identifikačním číslem 2.

50 4. Varianta izolovaného polypeptidu podle nároku 1 nebo 2, která má aminokyselinovou sekvenci alespoň z 90 % identickou s aminokyselinovou sekvencí s identifikačním číslem 2.

-27CZ 299646 B6

5. Varianta podle nároku 3 nebo 4, která je alelickou variantou. ,

6. Fragment izolovaného polypeptidu podle nároku 2 nebo varianta podle některého z nároků 3 §

5 až 5, kde fragment obsahuje alespoň 20 přiléhajících aminokyselin izolovaného polypeptidu nebo varianty, a kde fragment vyvolává imunitní odpověď v savci, která obsahuje tvorbu elementů, í které specificky váží Neisseria meningitidis uvedeného polypeptidu. >

*í

7. Izolovaný polypeptid podle nároku 1 nebo 2, kde varianta podle některého z nároků 3 až 5 ;

io nebo fragment podle nároku 6 dále obsahuje fúzní partner aminokyselinové sekvence. 3

8. Izolovaný polypeptid podle nároku 1 nebo 2, varianta podle některého z nároků 3 až 5, nebo * fragment podle nároku 6, který vyvolává imunitní odpověď proti jednomu nebo více členům, kteří jsou vybráni ze skupiny, kterou tvoří:

15 i) Neisseria meningitidis;

ii) zmíněný polypeptid;

iii) zmíněný fragment;

iv) zmíněná varianta.

20 9. Izolovaný polypeptid podle nároku 1 nebo 2, varianta podle některého z nároků 3 až 5, nebo fragment podle nároku 6, který vyvolává imunitní odpověď proti Neisseria meningitidis.

10. Izolovaný polypeptid podle nároku 1 nebo 2, varianta podle některého z nároků 3 až 5, nebo fragment podle nároku 6, který vyvolává ochrannou imunitní odpověď proti Neisseria menin25 gitidis.

11. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároku 1 nebo 2, varianta podle některého z nároků 3 až 5, nebo fragment podle nároku 6.

30 12. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 11 obsahující nukleotidy 1194-1271 sekvence s identifikačním číslem 1.

13. Izolovaná sekvence nukíeové kyseliny podle nároku 11 obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

35 1) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 1;

2) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 3;

3) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 4;

4) nukleotidová sekvence s identifikačním Číslem 6;

5) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 8;

40

6) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 10;

7) nukleotidová sekvence s identifikačním Číslem 12;

8) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 14;

9) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 16;

10) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 18;

45 11) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 20.

14. Způsob získávání izolované nukíeové kyseliny kódující polypeptid podle nároku 1 nebo 2 a varianty podle některého z nároků 3 až 5 nebo fragmentu podle nároku 6, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

-28CZ 299646 B6

i) získání extraktu nukleové kyseliny z vhodného hostitele;

ii) vytvoření primerů, které jsou případně degenerovány, přičemž každý z nich obsahuje Část ,j sekvence nukleové kyseliny podle některého z nároků 11 až 13; a j iii) použití zmíněných primerů pro amplifikaci, prostřednictvím techniky pro amplifikaci T

5 nukleové kyseliny, jednoho nebo více amplifikačních produktů ze zmíněného extraktu nukleové | kyseliny.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že zmíněný extrakt nukleové jl kyseliny je získán z bakterie rodu Neisseria. ;j ío

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že zmíněný extrakt nukleové kyseliny je získán z kmene Neisseria meningitidis.

17. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že zmíněné primery jsou vybrány 15 ze skupiny zahrnující nukleotidové sekvence s identifikačními čísly 22, 23, 24, 25,26, 27,28, 29,

30a31.

18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že technikou pro amplifikaci nukleové kyseliny je polymerázová řetězová reakce.

19. Expresní vektor, který obsahuje izolovanou sekvenci nukleové kyseliny podle některého z nároků 11 až 13, kde izolovaná sekvence nukleové kyselinyje operativně spojena s transkripční a/nebo translační regulátorovou nukleovou kyselinou.

25 20. Expresní vektor podle nároku 19 dále obsahující nukleotidovou sekvenci kódující fúzního partnera.

21. Hostitelská buňka, která je transfektována nebo transformována expresním vektorem podle nároku 19 nebo 20.

22. Hostitelská buňka podle nároku 21, která je bakterií.

23. Hostitelská buňka podle nároku 22, která je Neisseria meningitidis.

35 24. Způsob přípravy rekombinantního polypeptidu, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kroky:

A) 'kultivaci hostitelské buňky podle některého z nároků 21 až 23 tak, že zmíněný rekombinantní polypeptid je exprimován hostitelskou buňkou; a

B) izolaci zmíněného rekombinantního polypeptidu.

25. Protilátka nebo fragment protilátky vázající antigen, která se váže na izolovaný polypeptid podle nároku 1 nebo 2, variantu podle některého z nároků 3 až 5, nebo fragment podle nároku 6.

26. Protilátka nebo fragment protilátky vázající antigen podle nároku 25, které vážou Neisseria 45 meningitidis.

27. Primer nukleové kyseliny obsahující část sekvence nukleotidové kyseliny podle nároku 10 nebo 11 nebo jeho reversní komplement.

50 28. Primer nukleové kyseliny podle nároku 27, který obsahuje nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny sestávající ze sekvencí s identifikačními čísly 22,23,24, 25,26,27,28,29,30 a 31.

-29CZ 299646 B6

29. Použití farmaceuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1 nebo 2, varianty podle některého z nároků 3 až 5, nebo fragmentu podle nároku 6 pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčbu Neisseria meningitidis infekce u lidí.

5 30. Použití farmaceuticky účinného množství protilátky nebo fragmentu protilátky podle nároku

25 nebo 26 pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčbu Neisseria meningitidis infekce u lidí.

31. Použití izolované sekvence nukleové kyseliny podle některého z nároků 11 až 13, pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčbu Neisseria meningitidis infekce u lidí.

32. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje izolovaný polypeptid podle nároku 1 nebo 2, variantu podle některého z nároků 3 až 5, nebo fragment podle nároku 6 a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipient.

15 33. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 19 a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipient. .

34. Farmaceutický prostředek podle nároku 34 nebo 35, vyznačující se tím, že je ve formě vakcíny.