CZ20002172A3

CZ20002172A3 - Izolovaný polypeptid nebo jeho fragment nebo jejich varianta či derivát, izolovaná sekvence nukleové kyseliny, způsob získávání homologů nukleotidové sekvence, expresní vektor, hostitelská buňka, způsob přípravy rekombinantního polypeptidu, protilátka nebo její fragment, způsob detekce N. MENINGITIDIS, způsob diagnostiky infekce N. MENINGITIDIS, použití polypeptidu, použití sekvence nukleové kyseliny, použití oligonukleotidových primerů, použití protilátky, použití farmaceuticky účinného množ

Info

Publication number: CZ20002172A3
Application number: CZ20002172A
Authority: CZ
Inventors: Ian Richard Anselm Peak; Michael Paul Jennings; Richard E. Moxon
Original assignee: The University Of Queensland; Isis Innovation Limited
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2000-11-15
Also published as: JP2009045071A; US8034358B2; EP2354230A1; US8067004B2; JP4356961B2; US6607729B2; WO1999031132A1; CA2314319A1; GB9726398D0; US20090270591A1; US20100331537A1; CN101684148A; IL199175A; BR9814276A; TR200001709T2; NZ505374A; NO20002990D0; PL341160A1; HUP0100094A3; CZ299646B6

Description

Předmětný vynález se vztahuje na nové polypeptidy, které lze získat např. z N^bseria meningitidis, na nukleotidové sekvence, kódující tyto polypeptidy, na jejich použití v diagno stice, u terapeutických nebo profylaktických vakcín a při navrhování a/nebo testování léků.

Dosavadní stav techniky

Neisseria meningitidis je gramnegativní bakterie, která je příčinou meningokojkové meningitidy a septikémie. Jejím jediným známým hostitelem je člověk a může být přenášena

I !

asymptomaticky přibližně 10 % populace (Caugant, D. a kol., 1994, Journal of Clirtical Microbiology, 32: 323 až 330). ί

N. meningitidis může exprimovat polysacharidové kapsule. To umožňuje klasifikaci bakterií i

podle původu exprimovaných kapsulí. Existuje alespoň třináct séroskupin N. meningitidis: A, B, C,

29-E, Η, I, K, L, W135, X, Y a Z, přičemž séroskupiny A, B aC způsobují 90 % meningokokoýých i

onemocnění (Poolman, J.T. a kol., 1995, Infectious Agents and Disease, 4: 13 až 28). Vakčíny, zaměřené proti séroskupinám A a C jsou dostupné, ale kapsulámí polysacharid séroskupiny 6 je velmi málo imunogenní a neindukuje ochranu u člověka.

Proto jsou testovány další membránové a extracelulární složky z hlediska jejich vhodnosti pro začlenění do vakcín. Příklady zahrnují proteiny vnější membrány třídy 1, 2 a 3 (poriny) a skupiny 4 (Rmp) a 5 (opacity proteiny). Až do současné doby však není žádný z těchto kandidátů schopen í indukovat úplnou ochranu, zejména u dětí (Romero, J.D., 1994, Clinical Microbiology Review, Ί\ ' 559 až 575; Poolman, J.T. a kol., 1995, supra).

t

Pro vytvoření účinné vakcíny je nutné identifikovat složky N. meningitidis, které jsou přítomné ve většině kmenů a které jsou schopné indukovat ochrannou imunitní odpověď (baktericidní protilátky). V tomto směru lze odkázat na autory Brodeur a kol. (mezinárodní publikace WO 96/29412), kteří objevili povrchový protein o velikosti 22 kDa, který vykazuje vysokou konzervativitu s 99 % všech známých kmenů N. meningitidis. Injekce přečištěného rekombinantniho povrchového proteinu o velikosti 22 kDa ochránila 80 % imunizovaných myší před rozvinutím letální infekce, způsobené N. meningitidis. I přes objevení tohoto proteinu stále existuje nutnost izolovat více povrchových proteinů N. meningitidis, které jsou vysoce konzervativní u většiny kmenů a které mají imunoprotektivní charaktery vůči N. meningitidis a/nebo které mohou být použity v kombinaci s jinými složkami N. meningitidis tak, aby byla zvýšena účinnost ochrany proti tomuto organismu.

Podstata vynálezu

Autoři předmětného vynálezu objevili nový gen, který je přítomen ve všech testovaných kmenech N. meningitidis a který kóduje nový polypeptid s předpokládanou molekulovou hmotností asi 62 kDa. Na základě jeho sekvenčních charakteristik a homologií se předpokládá, že tento polypeptid je adhesin. Tento fakt společně s experimentálními daty předpokládá, že polypeptid tvoří povrchový protein, který by mohl být užitečný při výrobě terapeutických a/nebo profylaktických vakcín proti N. meningitidis, což je popisováno dále.

V jednom aspektu předmětného vynálezu je proto poskytován izolovaný polypeptid nebo jeho fragment nebo jejich varianta či derivát. Zmíněný polypeptid je vybrán ze skupiny, skládající se z:

(a) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 2;

(b) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 5;

(c) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 7;

(d) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 9;

(e) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 11;

(f) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 13;

(g) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 15;

(h) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 17;

(i) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 19; a (j) polypeptidu podle sekvence s identifikačním číslem 21.

Zmíněný polypeptid, fragment, varianta nebo derivát výhodněji zobrazují imuno aktivitu proti jednomu nebo více členům, kteří jsou vybráni ze skupiny, kterou tvoří:

(i) N. meningitidis, (ii) zmíněný polypeptid, (iii) zmíněný fragment;

(iv) zmíněná varianta; a (v) zmíněný derivát;

ogickou

Podle dalšího aspektu poskytuje předmětný vynález izolovanou sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid nebo jeho fragment, variantu či derivát zmíněného fragmentu nebo polypeptidu podle prvně zmíněného aspektu. Zmíněná sekvence je vhodně vybrána ze skupiny, kterou tvoří:

(1) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 1;

(2) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 3;

(3) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 4;

(4) nukleotidová sekvence s identifikačním Číslem 6;

(5) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 8;

(6) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 10;

(7) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 12;

(8) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 14;

(9) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 16;

(10) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 18;

(11) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 20;

(12) fragment nukleotidové sekvence kterékoli ze sekvencí s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, j 10,

12, 14, 16, 18 a 20; a (13) homolog nukleotidové sekvence ke kterékoli z předchozích sekvencí íjí ii

Zmíněné sekvence výhodněji kódují produkt, který zobrazuje imunologickou aktivitu proti jednomu nebo více členům, vybraným ze skupiny, která se skládá z:

i i 1 (i) N. meningitidis;

(ii) zmíněného polypeptidu prvně zmíněného aspektu;

(iii) zmíněného fragmentu prvně zmíněného aspektu; , · (iv) zmíněné varianty prvně zmíněného aspektu; a I (v) zmíněného derivátu prvně zmíněného aspektu. ,'

Podle ještě dalšího aspektu spočívá vynález v expresním vektoru, obsahujícím sekvenci nukleové kyseliny podle druhého zmíněného aspektu, kde zmíněná sekvence je operativně spojena s transkripční a translační regulátorovou nukleovou kyselinou.

V dalším aspektu poskytuje předmětný vynález hostitelskou buňku, obsahující expresní vektor podle třetího zmíněného aspektu.

V ještě dalším aspektu předmětného vynálezu je poskytován způsob přípravy rekombinantního polypeptidu podle prvního zmíněného aspektu, přičemž zmíněný způsob zahrnuje kroky;

(A) kultivaci hostitelské buňky, obsahující expresní vektor podle třetího zmíněného aspektu a to tak, že zmíněný rekombinantni polypeptid je ze zmíněné nukleové kyseliny exprimován; a , í (B) izolaci zmíněného rekombinantního polypeptidu.

V ještě dalším aspektu poskytuje předmětný vynález protilátku nebo její fragment, která se váže na jednoho nebo více členů, vybraných zé skupiny, kterou tvoří;

(1) N. meningitidis·, (2) zmíněný polypeptid prvně zmíněného aspektu;

(3) zmíněný fragment prvně zmíněného aspektu;

(4) zmíněná varianta prvně zmíněného aspektu; a ', (5) zmíněný derivát prvně zmíněného aspektu.

V ještě dalším aspektu poskytuje předmětný vynález způsob detekce N. meningitidis v biologickém vzorku, u kterého je podezření, že obsahuje N. meningitidis. Zmíněný způsob zahrnuje kroky:

(A) izolaci biologického vzorku od pacienta; ' .

(B) smíchání výše zmíněné protilátky nebo fragmentu s biologickým vzorkem s cílem vytvořit směs; a ndikuje (C) detekci specificky navázané protilátky nebo navázaného fragmentu ve směsi, což přítomnost N. meningitidis.

Podle dalšího aspektu je poskytován způsob detekce bakterie N. meningitidis v biológickém vzorku, u kterého je podezřelní na přítomnost této bakterie. Zmíněný způsob zahrnuje kroky:

(I) izolaci biologického vzorku od pacienta;

(Π) detekci sekvence nukleové kyseliny podle druhého zmíněného aspektu ve vzorku, což indikuje přítomnost zmíněné bakterie.

Předmětný vynález dále zahrnuje způsob diagnózy infekce, způsobené N. meningitidis, u pacientů. Zmíněný způsob zahrnuje kroky:

(1) kontakt biologického vzorku od pacienta s polypeptidem, fragmentem, varianto li derivátem podle předmětného vynálezu; a (2) určení přítomnosti nebo nepřítomnosti komplexu mezi zmíněným polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem a protilátkami, specifickými pro N. meningitidis, ve vzorku. Přítomnost komplexu indikuje zmíněnou infekci.

Předmětný vynález se též vztahuje na použití polypeptidu podle prvního zmíněného aspektu, na použití nukleových kyselin podle druhého zmíněného aspektu nebo na použití výše t vedené protilátky nebo jejího fragmentu v soupravě pro detekci bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku.

Podle dalšího aspektu předmětného vynálezu je poskytován farmaceutický prostředek, obsahující izolovaný polypeptid nebo jeho fragment nebo jejich variantu či derivát podle pí zmíněného aspektu.

Zmíněný farmaceutický prostředek je výhodněji vakcína.

V ještě dalším aspektu poskytuje předmětný vynález způsob prevence infekce bakterií N. meningitidis u pacientů. Tento způsob zahrnuje krok, během kterého je podáváno farmaceuticky účinné množství výše zmíněné vakcíny.

V dalším aspektu poskytuje předmětný vynález způsob identifikace imunoreaktivního fragmentu polypeptidu, varianty nebo derivátů podle prvního zmíněného aspektu. Způsob zahrnuje kroky:

(a) vytvoření fragmentu zmíněného polypeptidu, varianty nebo derivátu;

(b) podávání zmíněného fragmentu savci; a nebo řvního * » (c) detekci imunitní odpovědi u zmíněného savce, jehož odpověď zahrnuje produkci prvků, které specificky váží N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát a nebo mají ochranný účinek proti infekci N. meningitidis.

Nevyžaduje-li kontext jinak, budou v této specifikaci a v připojených patentových nárocích slova zahrnují, zahrnuje a zahrnující chápána tak, že znamenají začlenění daného celku nebo skupiny celků, ale nikoliv vyčlenění jakéhokoli jiného celku nebo skupiny celků.

Polypeptidové sekvence

Předmětný vynález poskytuje izolovaný polypeptid podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21 nebo jejich fragment nebo variantu či derivát. Ve výhodném provedení zobrazují polypeptid, fragmenty, varianty a deriváty podle předmětného vynálezu imunologickou aktivitu proti kterémukoli členu vybranému ze skupiny, kterou tvoří N meningitidis, zmíněný polypeptid, zmíněný fragment, zmíněná varianta a zmíněný derivát.

Sekvence s identifikačním číslem 2 odppvídá novému, asi 62 kDa velkému povrchovému polypeptidu, který je kódován genem hiaNm, získaným z kmene N. meningitidis MC58, jak jé detailněji popisováno dále. Sekvence s identifikačními čísly 5,7, 9, 11, 13,15, 17, 19 a 21 odpovídají homologním polypeptidům, odvozeným z nukleotidových sekvencí, které byly získány z kmenů N. meningitidis BZ10, BZ198, EG327, EG329, H15, H38, H41, P20 a PMC21.

Pro účely předmětného vynálezu znamená termín imunologická aktivita schopnost výše zmíněného polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vytvářet imunitní odpověď u savců, kterým je tato látka podávána. Odpověď zahrnuje produkci prvků, které specificky váži N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, fragment, variantu nebo derivát a/nebo mají ochranný účinek proti infekci N. meningitidis.

Pod pojmem izolovaný je míněn materiál, který je podstatně nebo zcela bez obsahu složek, které ho běžně v nativním stavu doprovázejí.

Pod pojmem polypeptid jsou míněny peptidy s dlouhým řetězcem, včetně proteinů.

Pojem fragment, jak je zde používán, zahrnuje deleční mutanty a malé peptidy, např. o délce alespoň 6, výhodněji alespoň 10 a ještě výhodněji alespoň 20 aminokyselin, které zahrnují antigenní determinanty nebo epitopy. Mnoho takovýchto fragmentů může být spojeno dohromady. Peptidy tohoto typu mohou být získány prostřednictvím standardních technik pro rekombinantní nukleové kyseliny nebo mohou být syntetizovány pomocí běžných syntetických technik na bázi kapalné či pevné fáze. Zde je možno odkázat na syntézu na bázi roztoku či pevné fáze, jak je popsáno např.

autory Atherton a Shephard v Kapitole 9 s názvem Peptide Synthesis. Tato kapitola je součásti publikace Synthetic Vaccines, vydané Nicholsonem a publikované Blackwell Scientific ře dli I

Publications. Peptidy mohou být případně připravovány rozštěpením polypeptidu podle pře etného teáza.

LC.

prlteá vynálezu proteinázami, jako je endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C a stafylokoková V8 _tRozštěpené fragmenty mohou být přečištěny např. kapalinovou chromatografu v uspořádání

Pojem varianta se vztahuje na polypeptidy, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin nahrazena odlišnými aminokyselinami. V dané oblasti techniky je dobře známo, že niěkteré aminokyseliny mohou být vyměněny za jiné aminokyseliny se velmi podobnými vlastnostmi, aLíž by tím došlo ke změně původu aktivity polypeptidu (konzervativní substituce). Příkladné konzervativní substituce v polypeptidu mohou být provedeny podle následující tabulky:

Tabulka 1

Původní zbytek	Příkladné substituce
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr

Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Podstatné změny ve funkci jsou prováděny pomocí výběru substitucí, které jsou méně konzervativní než substituce vtab.l. Jiné náhrady by byly nekonzervativními substitucemi z nichž může být tolerován relativně malý počet. Obecně řečeno, substituce, u kterých je pravděpodobné, že budou produkovat největší změny ve vlastnostech polypeptidu, jsou takové, u kterých je (a) hydrofilní zbytek (např. Ser nebo Thr) zaměněn za hydrofobní zbytek (např. Ala, Leu, He, Phe nebo Val); (b) cystein nebo prolin nahrazen jakýmkoli jiným zbytkem; (c) zbytek s elektrópozitivním postraním řetězcem (např. Arg, His nebo Lys) nahrazen elektronegativním zbytkem (např. Glu nebo Asp) nebo (d) zbytek s objemným postraním řetězcem (např. Phe nebo Trp) nahrazen zbytkem s menším postraním řetězcem (např. Ala, Ser) nebo bez postraního řetězce (např. Glý).

Obecně budou varianty alespoň ze 75 %, vhodněji alespoň z 80 %, výhodněji alespoň z 85 % a nejvýhodněji alespoň z 90 % homologní se základními sekvencemi, jako jsou ukázány např. v sekvencích s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21. Homologie je definována jako procento aminokyselin, které jsou identické nebo tvoří konzervativní substituce, jak je definováno vtab. 1. Homologie může být určena pomocí programů na porovnání sekvencí, jako je např. GAP (Deveraux a kol. 1984, Nucleic Acid Research Y2, 387 až 395), který je zde začleněn jako odkaz. Touto cestou mohou být sekvence, které mají v porovnání s výše citovanými podobnou nebo podstatně odlišnou délku, porovnávány vložením mezer do sekvenční řady. Tyto mezery jsou určeny např. srovnávacím algoritmem, používaným v programu GAP. Složení vhodných variant může být stanoveno běžnými technikami. Např. aminokyseliny, kódující polypeptidy podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21, mohou být mutovány buď náhodnou mutagenezí (pomocí např. transpozónové mutageneze) nebo místně cílenou mutagenezí. Výsledné DNA fragmenty jsou poté pomocí běžné technologie klonovány do vhodných expresních hostitelů, jako např. E. coli, a jsou detekovány klony, které si zachovají žádoucí aktivitu. Tam, kde klony pocházely z náhodné mutageneze, musí být pozitivní klony sekvenovány, aby bylo možno určit mutaci. Pojem varianta rovněž zahrnuje přirozeně se vyskytující alelické varianty.

I

Pod pojmem derivát je míněn polypeptid, který byl modifikací odvozen od základní i

sekvence, např. konjugací nebo tvorbou komplexů s jinými chemickými skupinami nebo technikami posttranslačních modifikací, jak by bylo rozuměno v dané oblasti techniky. Tyto deriváty zahrnují deleci a/nebo přidání aminokyselinových zbytků k polypeptidům podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21 nebo jejich variantám, přičemž zmíněné deriváty si zachovávají imunologickou aktivitu. Přidání aminokyselin může zahrnovat fůzi polypeptidů nebo jejich vaťňint s jinými polypeptidy nebo proteiny. V tomto ohledu bude oceněno, že polypeptidy nebo varianty podle předmětného vynálezu mohou být začleněny do delších polypeptidů. U těchto delších polypeptidů se předpokládá, že si zachovají imunologickou aktivitu např. proti N. memngitidis. Polypeptidy, jak jsou popsány výše, mohou fúzovat s dalším proteinem, např. takovým, který není odvozén od N. memngitidis. Jiný protein může např. napomáhat při přečišťování proteinu. V tomto óhledu mohou být použity např. polyhistidinový konec nebo protein vážící maltózu, jak je detailněji popsáno níže. Může případně produkovat imunitní odpověď, která je účinná proti N. memngitidis neboť mže produkovat imunitní odpověď proti jinému patogenu. Dalšími možnými fuzními proteiny jsou ty, které produkují imunomodulačni odpověď. Mezi konkrétní příklady takovýchto proteinu patří Protein A nebo glutathion-S-transferáza (GST). Polypeptid může dále fúzovat se složkou vakéín na bázi oligosacharidů, kde působí jako nosičový protein. J

Další deriváty, očekávané od předmětného vynálezu, zahrnují, avšak nejsou jimi limitovány, modifikaci postraních řetězců, začlenění nepřirozených aminokyselin a/nebo jejich derivátů během syntézy peptidů, polypeptidů nebo proteinu a použití zesíťovacích činidel a jiných postupů,^ Irieré

I způsobí na polypeptidech, fragmentech nebo variantách podle předmětného vynálezu konforinační i

omezení.

Příklady modifikací postranního řetězce, které předpokládá předmětný vynález, zahrnují modifikace aminoskupin, jako je acylace acetanhydridem; acylace aminoskupin sukcinanhydrid ;m a anhydridem kyseliny tetrahydroftalové; amidinace methylacetimidátem; karbamoylace aminoskupin kyanátem, pyridoxylace lysinu pyridoxal-5-fosfátem, po které následuje redukce NaBH»; redukční alkylace reakcí s aldehydem, po které následuje redukce NaBELt a trinitrobenzylace aminoskupin kyselinou 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou (TNBS).

Karboxylová skupina může být modifikována aktivací karbodiimidu přes tvorbu O-acylisomočoviny s následnou derivatizací např. na odpovídající amid.

! I i I ! ί ί ί # ·

Guanidinová skupina argininových zbytků může být modifikována tvorbou heterocyklických kondenzačních produktů za použití činidel, jako je 2,3-butandion, fenylglyoxal a glyoxal.

Sulfhydrylové skupiny mohou být modifikovány způsoby, jako je např. oxidace kyselinou mravenčí na kyselinu cysteovou; tvorba merkuryderivátů pomocí kyseliny 4-chloromerkuryfenylsulfonové, 4-chloromerkurybenzoátu, 2-chloromerkury-4-nitrofenolu, fenylmerkurychloridu a dalších derivátů rtuti; tvorba směsných disulfidů s jinými thiolovými sloučeninami; reakce simidem kyseliny maleinové, anhydridem kyseliny maleinové nebo jinými substituovanými imidy kyseliny maleinové; karboxymethylace jodooctovou kyselinou, jodoacetamidem a karbamoylace kyanátem v alkalickém pH.

Tryptofanové zbytky mohou být modifikovány např. alkylací indolového kruhu 2-hydroxy-5-nitrobenzylbromidem nebo sulfonylhalogenidem nebo oxidací N-bromsukcinimidem.

Tyrosinové zbytky mohou být modifikovány nitrací tetranitromethanem za vzniku

3- nitrotyrosinových derivátů.

Imidazolový kruh histidinového zbytku může být modifikován N-karbethoxylací diethylpyrokarbonátem nebo alkylací deriváty kyseliny jodooctové.

Příklady začlenění přirozených aminokyselin a derivátů během syntézy peptidů zahrnují, avšak nejsou jimi limitovány, použití kyseliny 4-aminomáselné, kyseliny 6-aminohexanové, kyseliny

4- amino-3-hydroxy-5-fenylpentanové, kyseliny 4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanové, t-butylglycinu, norleucinu, norvalinu, fenylglycinu, omithinu, sarkosinu, 2-thienylalaninu a/nebo D-izomerů aminokyselin. Seznam nepřirozených aminokyselin, předpokládaných v předmětném vynálezu, je uveden v tab. 2.

Tabulka 2

Nekonvenční aminokyselina	Nekonvenční aminokyselina
α-aminomáselná kyselina a-amino-a-methylbutyrát aminocyklopropankarboxylát aminoisomáselná kyselina aminonorbomylkarboxylát cyklohexylalanin	L-N-methylalanin L-N-methylarginin L-N-methylasparagin L-N-methylasparágová kyselina L-N-methylcystein L-N-methylglutamin

ř r ·* e* r f » f r p r «· r r r r r

cyklopentylalanin L-N-methylisoleucin D-alanin D-arginin D-asparágová kyselina D-cystein D-glutamát D-glutamová kyselina D-histidin D-isoleucin D-leucin D-lysin D-methionin D-omithin D-fenylalanin D-prolin D-serin D-threonin D-tryptofan D-tyrosin D-valin D-a-methylalanin D-a-methylargjnin D-a-methylasparagin D-a-methylaspartát D-a-methylcystein D-a-methylglutamin D-a-methylhistidin D-a-methylisoleucin D-a-methylleucin

L-N-methylglutamová kyselina L-N-methylhistidin L-N-methylleucin L-N-methyllysin L-N-methylmethionin L-N-methylnorleucin L-N-methylnorvalin L-N-methylomithin L-N-methylfenylalanin i L-N-methylprolin i L-N-medlylserin i L-N-methylthreonin j L-N-methyltryptofan L-N-methyltyrosin L-N-methylvalin L-N-methylethylglycin L-N-methyl-t-butylglycin L-norleucin L-norvalin a-methylaminoi sobutyrát a-methyl-y-aminobutyrát a-methylcyklohexylalanin a-methylcyklopentylalanin i α-methyl-a-naftylalanin j α-methylpenicilamin i N-(4-aminobutyl)glycin ί N-(2-aminoethyl)glycin j N-(3-aminopropyl)glycin I N-amino-a-methylbutyrát j α-naftylalanin j

e »

D-a-methyllysin

D-a-methylmethionin

D-a-methylomithin

D-a-methylfenylalanin

D-a-methylprolin

D-a-methylserin

D-a-methylthreonin

D-a-methyltryptofan

D-a-methyltyrosin

L-a-methylleucin

L-a-methylmethionin

L-a-methylnorvatin

L-a-methylfenylalanin

L-a-methylserin

L-a-methyltryptofan

L-a-methylvalin

N-(N-(2,2-difenylethylkarbamylmethyl)glycin 1-karboxy-1-(2,2difenylethylamino)cyklopropan

N-benzylglycin

N-(2~karbamylediyl)glycin

N-(karbamylmethyl)glycin

N-(2-karboxyethyl)glycin

N-(karboxymethyl)glycin

N-cyklobutylglycin

N-cykloheptylglycin

N-cyklohexylglycin

N-cyklodecylglycin

L-a-methyllysin

L-a-methylnorleucin

L-a-methylomithin

L-a-methylprolin

L-a-methylthreonin

L-a-methyltyrosin

L-N-methylhomofenylalanin

N-(N-(3,3 -difenylpropylkarbamylmethyl)glycin

Vynález rovněž předpokládá kovalentní modifikaci polypeptidů, fragmentu nebo varianty podle vynálezu dinitrifenolem, s cílem učinit ho u lidí imunogenním.

Vynález výhodněji obsahuje polypeptid, vybraný z jakéhokoliv polypeptidů podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21.

Polypeptidy podle vynálezů mohou být připraveny jakýmkoliv vhodným způsobem, který je známý odborníkům v dané oblasti. Polypeptidy mohou být například připraveny způsobem, který zahrnuje následující kroky:

(a) přípravu rekombinantní nukleové kyseliny, obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle jakékoliv sekvence s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21 nebo jeho fragment nebo jejich variantu či derivát, přičemž nukleotidová sekvence je operativně spojena s transkripční a translační regulátorovou nukleovou kyselinou;

(b) transfekci nebo transformaci vhodné hostitelské buňky rekombinantní nukli kyselinou;

(c) kultivaci hostitelské buňky s cílem exprimovat ze zmíněné rekombinantní nuk kyseliny rekombinantní polypeptid a (d) izolaci rekombinantního polypeptidu.

Uvedená nukleotidová sekvence je vhodně vybrána ze skupiny, která je tvořena sekvéncemi s identifikačními čísly 1, 3,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20.

Pod pojmem “rekombinantní polypeptid” je míněn polypeptid, připravený pomocí rekombinantních technik např. přes expresi rekombinantní nukleové kyseliny. i

Termín “rekombinantní nukleová kyselina” je zde používán v souvislosti s nukleovou i J kyselinou, vytvořenou manipulací nukleové kyseliny in vitro do takové formy, která se běžně v přírodě nevyskytuje. V této souvislosti rekombinantní nukleová kyselina obsahuje výhodněji expresní vektor, který může být buď samoreplikující se extra-chromozomální vektor jako je např. pLsmid nebo to může být vektor, který se integruje do genomu hostitele. Obecně tyto expresní ve<tory zahrnují transkripční a translační regulátorovou nukleovou kyselinu, operativně spojeriou se zmíněnou nukleotidovou sekvencí. j

Pod pojmem “operativně spojený” je míněno to, že trankripční a translační regulátorová nukleová kyselina je umístěna vzhledem k nukleotidové sekvenci, která kóduje zmíněný polypeptid, i

fragment, variantu nebo derivát v takové pozici, že tato transkripce může být zahájena. Obecně bude transkripční a translační regulátorová nukleová kyselina vhodná pro hostitelskou buňku, používanou pro expresi. V dané oblasti techniky jsou pro řadu různých hostitelských buněk známy různé typy odpovídajících expresních vektorů a vhodné regulátorové sekvence. i

Transkripční a translační regulátorová nukleová kyselina může většinou zahrnovat, aniž by tím však byla nějak limitována, promotorové sekvence, vedoucí- nebo signální sekvence, ribožomálni vazebná místa, transkripční start a stop sekvence, translační start a stop sekvence a zesilující nebo aktivační sekvence.

Vynález předpokládá konstitutivní nebo induktabilní promotory, které jsou v dané!oblasti techniky známé. Promotory mohou být buď přirozeně se vyskytující promotory nebo hybridní promotory, které kombinují prvky více než jednoho promotoru.

ovou eove

Ve výhodnějším provedení obsahuje expresní vektor značkový gen, který umožňuje selekci transformovaných hostitelských buněk. Selekční geny jsou v dané oblasti techniky dobře známé a liší se v závislosti na použité hostitelské buňce.

Expresní vektor může také zahrnovat fuzního partnera (většinou poskytovaného expresním vektorem) a to tak, že rekombinantní polypeptid podle vynálezu je exprimován jako fuzní polypeptid se zmíněným fuzním partnerem. Hlavní výhodou fuzních partnerů je to, že se uplatňují při identifikaci a/nebo přečišťování zmíněného fuzního polypeptidu.

Aby byl zmíněný fuzní polypeptid exprimován, je nezbytné ligovat nukleotidovou sekvenci podle vynálezu do expresního vektoru tak, aby se translační čtecí rámce fuzního partnera a nukleotidová sekvence vynálezu shodovaly.

Mezi dobře známé příklady fuzních partnerů patří, avšak nejsou v žádném směru limitující, glutathion-S-transferáza (GST), Fc řetězec lidských IgG, protein vážící maltózu (MBP) a hexahistidin (HISe), které jsou užitečné konkrétně při izolaci fuzního polypeptidu afinitní chromatografií. Pro účely přečištění fuzního polypeptidu afinitní chromatografií jsou odpovídajícími matricemi pro afinitní chromatografií glutathion-, amylóza-, pryskyřice, konjugované s kobaltem nebo niklem. Řada z těchto matricí je dostupná v “soupravách” jako např. QIAexpress™ systém (Qiagen), používaný pro (HISó) fuzní partnery a systém pro přečištění Pharmacia GST.

Dalším fuzním partnerem, který je v dané oblasti techniky dobře známý, je zelený fluorescenční protein (GFP). Tento fuzní partner slouží jako fluorescenční “značka”, která umožňuje identifikaci fuzního polypeptidu podle vynálezu fluorescenční mikroskopu nebo průtokovou cytometrií. GFP je užitečný při určování subcelulámí lokalizace fuzního polypeptidu vynálezu nebo při izolaci buněk, které exprimují fuzní polypeptid vynálezu. V této aplikaci jsou konkrétně užitečné průtoková cytometrie jako např. FACS.

Výhodněji mají fuzní partneři také místa pro štěpení proteázami jako např. pro Faktor X nebo Thrombin, která umožňují dané proteáze částečně naštěpit fuzní polypeptid vynálezu a tím z něj uvolnit rekombinanntí polypeptid vynálezu. Uvolněný polypeptid může být poté izolován od fuzního partnera následnou chromatografickou separací.

V rámci svého rozsahu fuzní partneři podle vynálezu také zahrnují “epitopové značky”, což jsou obvykle krátké peptidové sekvence, pro které existuje specifická protilátka. Mezi dobře známé příklady epitopových značek, pro které jsou snadno dostupné specifické monoklonální protilátky, patří c-myc, virus chřipky haemagglutinin a FLAG značky.

Rekombinantní polypeptidy vynálezu mohou být připravovány kultivací hostitelské buňky, tranformované expresním vektorem, který obsahuje nukleovou kyselinu, kódující polypeptid, fragment, variantu nebo derivát podle vynálezu. Podmínky, které jsou vhodné pro expresi proteinu, se budou lišit v závislosti na výběru expresního vektoru a hostitelské buňky a odborníci v dané oblasti je mohou snadno zjistit pomocí rutinních pokusů.

Hostitelské buňky, vhodné pro expresi, mohou být prokaryotické i eukaryotické. jednou !

hostitelskou buňkou, která je výhodnější pro expresi polypeptidu podle vynálezu, je bakterie. Bakterie, která může být použita, je Escherichia coli. Hostitelskou buňkou může být také hmyzí buňka jako jsou např. SFe buňky, které mohou být využívány bakulovirálním expresním systémen.

Rekombinantní protein může být odborníkem připraven pomocí příslušných standártních i

protokolů jako jsou např. popsány v Sambrook a kol., MOLECULAR CLONINC. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989), který je zde zahrnut jako ioilkaz, konkrétně Sekce 16 a 17; v Ausubel a kol., CURRENT PROTOČOLS IN MOLECjULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, lne. 1994 až 1998), rovněž zahrnutý jako odkaz, korkrétně Kapitoly 10 a 16 a Coligan a kol., CURRENT PROTOČOLS IN PROTEIN SCIENCE (John' Wiley & Sons, lne. 1995 až 1997), který je zde také zahrnut jako odkaz, konkrétně Kapitoly 1, 5 a 6.

Nukleotidové sekvence

Tento vynález dále poskytuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, fragment, i

variantu nebo derivát, které jsou definovány výše. Uvedená sekvence je vhodně vybrána ze skupiny, kterou tvoří: sekvence s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20; fragment jakékoliv i

nukleotidové sekvence s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20 a hónolog předcházejících nukleotidových sekvencí. Tyto sekvence výhodněji kódují produkt, zobrazující imunologickou aktivitu, jak je definováno výše.

Jak bude podrobněji popsáno dále, sekvence s identifikačním číslem 1 odpovídá genu hiaNm, získanému z N. meningitidis kmen MC58. Tento gen kóduje nový povrchový polypeptid se sekvencí s identifikačním číslem 2 a o velikosti 62 kDa (přibližně). Sekvence s identifikačním číslem 3 odpovídá sekvenci otevřeného čtecího rámce hiaNm kmene MC58, HiaNm. Sekvence i

s identifikačními čísly 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20 odpovídají homologům sekvencí otevřeného čtecího rámce hiaNm, získaných z N. meningitidis kmenů BZ10, BZ198, EG327, H15, H38, H41,

P20aPMC21.

Termín “nukleotidová sekvence”, jak je zde používán, označuje mRNA, RNA, cRNA, cDNA nebo DNA.

Termín “homolog nukleotidové sekvence” se obecně vztahuje k nukleotidovým sekvencím, které za podstatně stringentních podmínek hybridizují s wild-type (divokou) nukleotidovou sekvencí podle vynálezu. Vhodné hybridizační podmínky budou diskutovány později.

Homology nukleotidové sekvence vynálezu mohou být pňpraveny následujícím postupem:

(i) zisk extraktu nukleové kyseliny z vhodného hostitele;

(ii) vytvoření primerů, které mohou být degenerovány, přičemž každý obsahuje část wild-type nukleotidové sekvence vynálezu; a (iii) použití zmíněných primerů pro amplifikaci, prostřednictvím technik pro amplifikaci nukleových kyselin, jednoho nebo více amplifikačních produktů ze zmíněného extraktu nukleové kyseliny.

Vhodným hostitelem může být bakterie. Výhodněji je hostitel z rodu Neisseria, ještě výhodněji ze N. meningitidis. .

Primery jsou výhodněji vybrány ze skupiny, kterou tvoří:

(1) 5'- TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3 '(sekvence s identifikačním číslem 22);

(2) 5'- CTTCCCTTCAAACCTTCC-3'(sekvence s identifikačním číslem 23);

(3) 5 -GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATAGCGCAT-3 (sekvence s identifikačním číslem 24);

(4) 5 -TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACC ACTGATAAC-3' (sekvence s identifikačním číslem 25);

(5) 5'- CCAAACCCCGATTTAACC-3' (sekvence s identifikačním číslem 26);

(6) 5'- AATCGCCACCCTTCCCTTC-3' (sekvence s identifikačním číslem 27);

(7) 5'- TTTGCAACGGTTC AGGC A-3' (sekvence s identifikačním číslem 28);

(8) 5'- TATTCAGCAGCGTATCGG-3' (sekvence s identifikačním číslem 29);

(9) 5 - TGCCTGAACCGTTGCAAA-3' (sekvence s identifikačním číslem 30) a (10) 5'- CCGATACGCTGCTGAATA-3' (sekvence s identifikačním číslem 31).

Techniky, vhodné pro amplifikaci nukleových kyselin, jsou odborníkům dobře známé a zahrnují polymerázovou řetězovou reakci (PCR), která je popsána např. v knize Ausubel kol., (1994 až 1998, supra, Kapitola 15), která je zde začleněna jako odkaz; amplifikaci nahrazováním vlákna DNA (SDA) jako je popsáno např. v US patentu č. 5 422 252, který je zde začleněn jako odkaz; replikaci cestou valivé kružnice (RCR) jako je popsáno např. v Liu a kol., (1996, Chem. Soc. 118:1587 až 1594 a v Mezinárodní přihlášce WO 92/01813) a v Lizardi

j. Am. a kol., (Mezinárodní přihláška WO 97/19193), které jsou zde začleněny jako odkaz; amplifikaci, za oženou na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA) jako je např. popsáno v Sooknanan a kol., (1994,

Biotechniques 17:1077 až 1080), který je zde začleněn jako odkaz a amplifikaci s pomocí replikázy Q-β, což je popsáno např. v Tyagi a kol., (1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:5395 až 5400), který je zde zahrnut jako odkaz.

Zde používaný “amplifikační produkt” znamená nukleovou kyselinu, vytvořenou pomocí technik pro amplifikaci nukleových kyselin.

Termíny “hybridizovat” nebo “hybridizace” je zde používány pro označení párování komplementárních bází vzdálených nukleotidových sekvencí podle pravidel o párování bází s cílem připravit hybrid DNA-DNA, hybrid DNA-RNA nebo hybrid RNA-RNA

V DNA jsou komlementámí báze:

(i) AaT;a (ii) C a G.

V RNA jsou komlementámí báze:

(i) AaU; a (ii) C a G.

V RNA-DNA hybridech jsou komplementární báze:

(i) AaU;

(ii) A a T; a (iii) G a C.

Podstatně komplementární nukleotidové sekvence jsou většinou identifikovány blotovacími

I | technikami, které zahrnují krok, ve kterém jsou nukleotidy imobilizovány na matrici (Výhodněji syntetickou membránu jako je nitrocelulóza), hybridizační krok a detekční krok. Southern blot je používán pro identifikaci komplementární sekvence DNA; Nothem blot je používán pro identifikaci

Jitif komplementární sekvence RNA Dot blot a Slot blot mohou být použity pro identifikaci komplementárních DNA/DNA, DNA/RNA nebo RNA/RNA polynukleotidových sekvencí. Tyto techniky jsou odborníkům v dané oblasti techniky velmi dobře známé ajsou popsány v Ausubel a kol.

(1994 až 1998, supra) na stranách 2.9.1 až 2.9.20.

Podle těchto metod zahrnuje Southern blot separaci molekul DNA na základě velikosti gelovou elektroforézou, přenos DNA, rozdělených podle velikosti, na syntetickou membránu a hybridizaci DNA, vázané na membránu, s komplementární nukleotidovou sekvencí, označenou radioaktivně, enzymem nebo fluoroscencí. Při Dot a Slot biotech jsou vzorky DNA před tím, než dojde k hybridizaci jako je uvedena výše přímo aplikovány na syntetickou membránu.

V případě identifikace komplementárních nukleotidových sekvencí v cDNA nebo knihovně genomické DNA je použit alternativní blotovací krok jako např. hybridizace kolonii a plaků. Typický příklad tohoto postupuje popsán v Sambrook a kol., (1989, supra), Kapitoly 8 až 12.

Pro stanovení hybridizačních podmínek může být většinou použit následující obecný postup. Nukleotidové sekvence jsou blotovány/přeneseny na syntetickou membránu, což je popsáno výše. Wild-type nukleotidová sekvence vynálezu je označena, jak je popsáno výše, a je analyzována schopnost této značené nukleotidové sekvence hybridizovat s mobilizovanou nukleotidovou sekvencí.

Odborníci rozpoznají, že hybridizaci ovlivňuje řada faktorů. Aby byl získán detékovatelný signál, měla by být specifická aktivita radioaktivně značené polynukleotidové sekvence většinou vyšší nebo rovna přibližně 10⁸ dpm/mg. Radioaktivně značená nukleotidová sekvence se specifickou aktivitou 10⁸ až 10⁹ dpm/mg může detekovat přibližně 0,5 pg DNA. V dané oblasti techniky je velmi dobře známo, že, aby byla umožněna detekce, musí být na membránu mobilizováno dostatečné množství DNA. Je žádoucí mít mobilizovanou DNA v přebytku, obvykle 10 pg. Citlivost hybridizace může také zvýšit přídavek inertního polymeru jako je 10 hmotn./obj.% síran déxtranu (Mw 500 000) nebo polyethylenglykol 6000 během hybridizace (viz Ausubel supra na 2.10.10).

Aby byly získány dobré výsledky hybridizace mezi nukleotidovou sekvencí, mobilizovanou na membráně a značenou nukleotidovou sekvencí, musí být na mobilizovanou nukleotidovou sekvenci hybridizováno dostatečné množství značené nukleotidové sekvence a musí následovat promytí: Promytí zajišťuje, aby byla značená nukleotidová sekvence hybridizována na mobilizovanou nukleotidovou sekvenci pouze se žádoucím stupněm komplementarity vůči značené nukleotidové sekvenci.

“Stringentnost” ve smyslu v jakém je zde používána znamená podmínky, zahrnující teolotu a iontovou sílu a přítomnost či nepřítomnost určitých organických rozpouštědel v průběhu hybridizace. Čím vyšší stringentnost, tím vyšší bude stupeň komplementarity mezi imobilizo/anými nukleotidovými sekvencemi a značenou polynukleotidovou sekvencí.

“Stringentní podmínky” označují takové podmínky, za kterých budou hybridizovat pouze nukleotidové sekvence s vysokou frekvencí komplementárních bází.

Typickými stringentními podmínkami jsou např. (1) 0,75 M fosforečnan disodný/0,5 M fosforečnan sodný/ 1 mM EDTA (sodná sůl)/l% sarkosyl při teplotě asi 42 °C po dobu alespaň 30 min.; nebo (2) 6,0 M močovina/0,4% laurylsulfát sodný/0,lx SSC při teplotě asi 42 °C po dobu alespoň 30 min.; nebo (3) 0,lx SSC/0,1% SDS při teplotě asi 68 °C po dobu alespoň 20 min.] nebo (4) lx SSC/0,1% SDS při teplotě asi 55 °C po dobu asi 60 min; nebo (5) lx SSC/0,1% SI)S při teplotě asi 62 °C po dobu asi 60 min; nebo (6) lx SSC/0,1% SDS při teplotě asi 68 °C po dobu 60 min; nebo (7) 0,2x SSC/0,1% SDS při teplotě asi 55 °C po dobu asi 60 min, nebo (8) 0,2x SSC/0,1% SDS při teplotě asi 62 °C po dobu asi 1 h; nebo (9) 0,2x SSC/0,1% SDS při teplotě asi'68 ³C po dobu asi 60 min. Podrobnější příklady jsou uvedeny v CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR

BIOLOGY, supra, na stranách 2.10.1 až 2.10.16 a v Sambrook a kol., MOLECULAR CLOííING.

í

A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbour Press, 1989) v sekcích 1.101 až 1.104. Obě citace jsou zde začleněny jako odkaz.

Ačkoliv promytí při stringentních podmínkách většinou probíhá při teplotách od asi 42 °C do 68 °C, odborní pracovníci ocení, že pro stringentní podmínky mohou být vhodné i jiné teploty. V °Caž25 entámí případě tvorby hybridu DNA-DNA dojde k maximální hybridizaci většinou při teplotě asi 20 °C pod T_m. Je dobře známo, že T_m je teplota tání nebo teplota, při které disociují dvě komplerin polynukleotidové sekvence. Způsoby stanovení T_m jsou v dané oblasti techniky dobře znáfrté (viz CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra na straně 2 10.8). U hybridu DNA-RNA dojde k maximální hybridizaci většinou při teplotě asi 10 °C až 15 °C pod T_m. j

V této oblasti techniky jsou dobře známé i jiné stringentní podmínky. Odborní pracovníci jistě pochopí, že při optimalizaci specifity hybridizace mohou být upraveny různé faktory. Optiihalizace stringentnosti závěrečných promytí může sloužit k zajištění vysokého stupně hybridizace.

Způsoby detekce značených nukleotidových sekvencí, hybridizovaných na imobiližovanou i

nukleotidovou sekvenci, jsou pracovníkům v dané oblasti techniky dobře známé. Mezi tyto j metody patří autoradiografie, chemiluminicsenční, fluorescenční a kolorimetrická detekce.

Protilátky

Vynález rovněž předpokládá protilátky proti dříve zmíněným polypetidům, fragmentům, variantám a derivátům. Tyto protilátky mohou zahrnovat jakékoliv vhodné protilátky, které se vážou na polypeptid, fragment, variantu nebo derivát vynálezu nebo s ním vytvářejí konjugát. Mezi protilátky mohou patřit například polyklonální protilátky. Tyto protilátky mohou být připraveny například aplikací polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu formou injekce do druhů, kde dochází k produkci protilátek, s cílem získat polyklonální antisérum. Mezi tyto produkční druhy patří myš nebo králík. Způsoby produkce polyklonálních protilátek jsou pracovníkům v dané oblasti techniky dobře známé. Příkladné protokoly, které mohou být použity, jsou popsány například v Colligan a kol., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons, lne., 1991), který je zde začleněn jako odkaz a v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra) konkrétně Sekce ΙΠ Kapitoly 11.

Místo polyklonálního antiséra, získaného v produkčních druzích, mohou být pomocí standartního postupu produkovány monoklonální protilátky. Tento postup je popsán např. v článku Kohler a Milstein (1975, Nátuře 256, 495 až 497), který je zde začleněn jako odkaz. Je možno použít také modifikované postupý jako jsou popsány např. v Coligan a kol., (1991, supra) a to pomocí nesmrtelných slezinných buněk nebo jiných buněk, které produkují protilátku. Dané buňky pocházejí z produkčních druhů, které byly zaočkovány jedním nebo více polypeptidy, fragmenty, variantami nebo deriváty vynálezu.

Vynález v rámci svého rozsahu zahrnuje také protilátky, které obsahují Fc nebo Fab fragmenty polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, které byly zmíněny výše. Protilátky mohou příležitostně obsahovat protilátky proti peptidům podle vynálezu s jediným Fv řetězcem (scFvs). Tyto scFvs mohou být připraveny například v souladu s postupy, které jsou popsány v US patenteu č. 5 091 513, v EP patentu č. 239 400 nebo v článku autorů Winter a Milstéin (1991, Nátuře, 349 293), které jsou zde začleněny jako odkazy.

Protilátky podle vynálezu mohou být využity při izolaci přirozených nebo rekombinantních polypeptidů z N. meningitidis afinitní chromatografií. Například je možno odkázat na imunoafinitní chromatografické postupy, popsané v Kapitole 9.5 v knize Coligana a kol., (1995 až 1997, supra).

může

Protilátky mohou být použity pro testování expresních knihoven na varianty polypeptidů vynálezu. Protilátky vynálezu mohou být také použity pro detekci infekce bakterií N. meningitidis, což bude popsáno níže.

Detekce N. meningitidis

Přítomnost nebo nepřítomnost N. meningitidis u pacientů může být stanovena tak, že je od pacienta izolován biologický vzorek, poté je smíchán s protilátkou nebo fragmentem protilátky, které jsou popsány výše, za vzniku směsi. Poté je ve směsi detekována specificky navázaná protilátka nebo navázaný fragment, což naznačuje přítomnost N meningitidis ve vzorku.

Termín “biologický vzorek”, který je zde používán, označuje vzorek od pacienta, který být extrahovaný, neošetřený, ošetřený, zředěný nebo zahuštěný. Biologický vzorek je vhodně, vybrán ze skupiny, kterou tvoří krev, sérum, plasma, sliny, moč, pot, ascitická tekutina, peritoneální tekutina, synoviální tekutina, amniotická tekutina, cerebrospinální tekutina, vzorek z biopsie kůže a podjobné.

I

Pro stanovení tvorby komplexu může být použita jakákoliv vhodná technika. Například protilátka nebo fragment protilátky podle vynálezu, které obsahují připojenou značku, moTou být využity v imunostanoveních. Mezi tato imunostanovení mohou patřit, aniž by tím však by a nějak limitována, radioimunostanovení (RIA), heterogenní enzymoimunoanalýza (ELIŠA) a imunochromatografické techniky (ICT). Všechna tato stanovení jsou pracovníkům v dané oblasti techniky dobře známá. Například je možno odkázat na “CURRENT PROTOCOLS IN i

IMMUNOLOGY” (1994, supra), kde je uvedena řada imunostanovení, která mohou být použita v i

souladu s předmětným vynálezem. Imunostanovení mohou zahrnovat kompetitivní stanovení, což je známo v dané oblasti techniky. j

I

Značky, které jsou připojovány na protilátku nebo fragment protilátky, mohou záhjmovat následující:

i. přímé připojení značky na protilátku nebo fragment protilátky;

ii. nepřímé připojení značky na protilátku nebo fragment protilátky tzn. připojení ;mačky na jinou měřenou látku, která se následně váže na protilátku nebo fragment prói ilátky; a iii. připojení protilátky nebo fragmentu protilátky na následný reakční produkt.

Značka může být vybrána ze skupiny, která zahrnuje chromogen, katalyzátor, enzym, fluorofor, chemiluminiscenční molekulu, lanthanidový ion jako je Europium (Eu³⁴), radioizotop a přímou vizuální značku.

V případě přímé vizuální značky je možno použít koloidní kovovou a nekovovou částici, barevnou částici, enzym nebo substrát, organický polymer, latex, liposom nebo jinou částici, obsahující látku, poskytující signál apod.

Řada enzymů, které je možno použít jako značky, je odhalena v US patentových specifikacích US 4 366 241, US 4 843 000 a US 4 849 338, které jsou zde všechny začleněny jako odkazy. Mezi vhodné enzymové značky, které jsou užitečné v předmětném vynálezu, patří alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza, luciferáza, β-galaktosidáza, glukosaoxidáza, lysozym, malátdehydrogenáza apod. Enzymová značka může být použita buď samostatně nebo v kombinaci s druhým enzymem, který je v roztoku.

Fluorofor je vhodně vybrán ze skupiny, která zahrnuje fluoresceinizothiokyanát (FITC), tetramethylrhodaminizothiokyanát (TRITL) nebo R-Phycoerythrin (RPE).

Vynález je rovněž rozšířen na způsob detekce infekce N. meningitidis u pacientů. Zmíněný postup zahrnuje krok, během kterého dojde ke kontaktu biologického vzorku od pacienta s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem vynálezu a krok, kdy je stanovena přítomnost nebo nepřítomnost komplexu mezi zmíněným polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem a protilátkami, specifickými vůči N. meningitidis, které jsou ve zmíněném séru, přičemž přítomnost zmíněného komplexu je indikátorem zmíněné infekce.

Ve výhodnějším provedení je detekce výše uvedeného komplexu zvýšena detekovatelnou modifikací zmíněného polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu pomocí vhodné značky, dobře známé v dané oblasti. Tato modifikovaná sloučenina je použita ve vhodném ímunostanovení jako je např. popsáno výše.

Podle dalšího aspektu poskytuje vynález také způsob detekce bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku, u kterého je podezření, že obsahuje zmíněnou bakterii. Zmíněný postup zahrnuje izolaci biologického vzorku od pacienta, detekci sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu ve zmíněném vzorku, což naznačuje přítomnost zmíněné bakterie.

Detekce zmíněné sekvence nukleové kyseliny může být provedena pomocí jakékoliv vhodné techniky. Například značená sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může být použita jako próba při Southern blotu extraktu nukleové kyseliny, který byl získán od pacienta. Tento postup je v dané coz je (1996, hníky oblasti techniky dobře znám. Značená sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může být také využita jako próba při Nothem blotu extraktu RNA od pacienta. Extrakt nukleové kyseliný od pacienta je výhodněji využit při amplifikaci nukleové kyseliny jako je PCR nebo při ligázové řetězové reakci (LCR), které jsou popsány např. v Mezinárodní přihlášce WO89/09385, která je zde zač leněna jako ndka*_t v souladu s oligonukleotidovými příměry, odpovídajícími sense a antisense sekvencím k sekvenci nukleové kyseliny podle vynálezu nebo s přesahujícími sekvencemi.

Vhodné jsou rovněž automatizované techniky detekce na bázi pevné fáze. Například pro detekci nukleových kyselin jsou použity řady souprav mobilizovaných primerů (VLSIPS™), popsáno např. v publikaci Fodor a kol., (1991, Science 251.767 až 777) a v Kazal a kol.,

Nátuře Medicine 2:753 až 759). Výše uvedené techniky jsou pracovníkům v dané oblasti tec dobře známé.

Farmaceutické prostředky

Dalším charakteristickým rysem vynálezu je využití polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu vynálezu (“imunogenní činidla”) jako aktivních složek farmaceutického prostředku pro i

ochranu pacientů před infekcí bakterií N. meningitidis. Farmaceutický prostředek vhodně obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič.

Pod pojmem “farmaceuticky přijatelný nosič” je míněna pevná nebo kapalná náplň, ředidlo

I nebo enkapsulovaná látka, které mohou být bez rizika použity v systemickém podávání. V závislosti i

na konkrétním způsobu podávání mohou být použity různé farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou dobře známé v dané oblasti techniky. Tyto nosiče mohou být vybrány ze skupiny, která zahrnuje cukry, škroby, celulózu a její deriváty, slad, želatinu, talek, síran vápenatý, rostlinné oleje, syntetické oleje, polyoly, kyselinu alginovou, roztoky, pufrované fosfátem, emulgátory, izotonický fyziologický i

roztok a vodu bez obsahu pyrogenu. ί

Pro poskytnutí prostředku vynálezu pacientovi může být použita jakákoliv vhodná cesta aplikace například orální, rektální, parenterální, sublinguální, bukální, intravenózní, intraartikulámí, intramuskulámí, intradermální, subkutaneózní, inhalační, intraokulámí, intraperitoneální, intracerebroventrikulámí, transdermální a podobné. Např. pro podávání imunogenních prostředků, vakem a DNA vakcín je vhodná intramuskulámí a subkutaneózní aplikace.

Mezi formy, které jsou podávány patří tablety, disperze, suspenze, injekce, roztoky, sirupy, pastilky, kapsule, čípky, aerosoly, transdermální náplasti apod. Mezi tyto formy dávky mohou také patřit injekční a implantační zařízení s regulovaným uvolňováním, navržené specielně pro tyto účely nebo jiné formy implantátů, které jsou upraveny tak, aby pracovaly konkrétním způsobem. Regulované uvolňování terapeutického činidla může být ovlivněno potažením činidla např. hydrofobními polymery včetně akrylových pryskyřic, vosků, vyšších alifatických alkoholů, polymléčných a polyglykolových kyselin a určitých celulózových derivátů jako je hydroxypropylmethylcelulóza. Regulované uvolňování může být dále ovlivněno použitím jiných polymemích matricí, lipozómů a/nebo mikrosfér.

Farmaceutické prostředky předmětného vynálezu, které jsou vhodné pro orální nebo parenterální podávání, mohou být prezentovány jako samostatné jednotky jako jsou kapsule, sáčky nebo tablety, z nichž každá obsahuje předem stanovené množství jednoho nebo více terapeutických činidel vynálezu, jako prášek nebo granule nebo jako roztok či suspenze ve vodné kapalině, bezvodé kapalině, v emulsi olej ve vodě nebo v emulsi voda v oleji. Tyto prostředky mohou být připraveny jakýmkoliv farmaceutickým postupem, avšak všechny postupy zahrnují krok, kdy dochází ke spojení jednoho nebo více imunogenních činidel, které jsou popsány výše, s nosičem, který obsahuje jednu nebo více nezbytných přísad. Prostředky jsou obecně připravovány uniformním a známým smícháváním imunogenních činidel vynálezu s kapalnými nosiči nebo s finálně rozdělenými pevnými nosiči nebo s oběmi a poté, je-li to třeba, je produkt vytvarován do žádoucí formy.

Výše uvedené prostředky mohou být podávány způsobem, který je slučitelný s dávkovači formulací a v takovém množství, které je imunogenně účinné pro ochranu pacientů od infekce N. meningitidis. Dávka, podávaná pacientovi, by měla být v kontextu předmětného vynálezu dostatečná pro získání účinné odpovědi jako je např. snížení hladiny N. meningitidis, ke které by mělo u pacienta dojít, nebo pro inhibici infekce bakterií N. meningitidis. Množství imunogenního činidla (činidel), které má být podáváno, může záviset na subjektu, který je léčen, včetně jeho věku, pohlaví, hmotnosti a celkového zdravotního stavu. S ohledem na toto závisí přesná množství imunogenního činidla (činidel), která je třeba podávat, na posouzení lékaře. Při určování účinného množství imunogenního činidla proti N. meningitidis, které má být podáváno v průběhu léčby nebo profylaxe, může lékař stanovit hladiny cirkulující plasmy, vývoj onemocnění a tvorbu protilátek proti N. meningitidis. V každém případě mohou být vhodné dávky imunogenních činidel vynálezu snadno stanoveny odborníky v dané oblasti. Tyto dávky se mohou pohybovat v nanogramech až miligťamech imunogenních činidel vynálezu.

Výše uvedené prostředky mohou být použity jako terapeutické nebo profylaktické vákcíny. Kromě toho je vynález rozšířen na výrobu vakcín, obsahujících jako aktivní složku jedno nebo více imunogenních činidel vynálezu. Pro přípravu těchto vakcín se předpokládá jakýkoliv vhodný p ostup. Příkladné postupy jsou popsány např. v NEW GENERATION VACCINES (1997, Levine a kol., Marcel Dekker, lne. New York, Basel Hong Kong), který je zde začleněn jako odkaz.

Imunogenní činidlo podle vynálezu může být smícháno, konjugováno nebo fúzováno s jinými antigeny včetně B a T buněčných epitopů jiných antigenů. Kromě toho může být činidlo také konjugováno na nosič, což je popsáno níže.

V případě, že je použit haptenový peptid vynálezu (tzn. peptid, který reaguje se stejnými protilátkami, ale sám o sobě nemůže vyvolat imunitní odpověď), může být konjugovan s imunogenním nosičem. Použitelné nosiče jsou v dané oblasti techniky dobře známé a patří mezi ně např.; thyroglobulin; albuminy jako je lidský sérový albumin; toxiny; toxoidy nebo jakýkoliv mutantní materiál, vykazující křížovou reaktivitu (CRM), toxínu tetanu, záškrtu, černého kašle, Pseudoiwncis, E. coli, Staphylococcus a Streptococcus·, polyaminokyseliny jako je poly(lysin:kyselina glutamová); chřipka; Rotavirus VP6, Parvovirus VP1 a VP2; jaderný protein viru hepatitidy B; rekombinantní vakcína viru hepatitidy B apod. Rovněž může být použit fragment nebo epitop nosičového pioteinu nebo jiný imunogenní protein. Například haptenový peptid vynálezu může být připojen na epit 3p T buňky bakteriálního toxínu, toxoidu nebo CRM. V souvislosti s tím je možno odkázat na US patent č. 5 785 973, který je zde začleněn jako odkaz.

Polypeptid, fragment, varianta nebo derivát vynálezu mohou kromě toho pracovat jako nosičový protein ve vakcínách, zaměřených proti Neisseria nebo proti jiným bakteriím či virům.

Imunogenní činidla vynálezu mohou být podávána jako multivalentní podjednotkové vakcíny v kombinaci s antigeny N. meningitidis nebo s antigeny jiných organismů včetně pathogenních bakterií H. influenzae, M. catarrhalis, N gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae atd. Příležitostně nebo dále mohou být imunogenní činidla podávána v souladu s oligosacharidovými! lebo polysacharidovými komponentami N. meningitidis.

Vakcíny mohou také obsahovat fyziologicky přijatelné ředidlo nebo vehikulum jako je voda, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok a fyziologický roztok.

... ,γ- -.- · ._κ

Vakcíny a imunogenní prostředky mohou zahrnovat adjuvants, které je v dané oblasti techniky dobře známé. Mezi vhodná adjuvants patří, aniž by tím však byla limitována: povrchově aktivní látky jako je hexadecylamin, oktadecylamin, oktadecyestery aminokyselin, lysolecithin, dimethyldiaoktadecylamoniumbromid, N,N-dioktadecyl-N',N'bis(2-hydroxyethylpropandiamin), methoxyhexadecyíglycerol a polyoly kyseliny pluronové; polyaminy jako je pyran, síran dextranu, póly IC karbopol; peptidy jako jsou muramyldipeptid a deriváty, dimethylglycin, tuftsin; olejové emulse a minerální gely jako je fosfát hlinitý, hydroxid hlinitý nebo alum; lymfokiny, QuilA a imunostimulační komplexy (ISCOMS).

Imunogenní činidla vynálezu mohou být exprimována oslabenými virovými hostiteli. Pod pojmem “oslabený virový hostitel” jsou míněny virové vektory, které jsou buď přirozeně podstatně avirulentní nebo jimi byly učiněny. Virus může být učiněn podstatně avirulentním jakoukoliv vhodnou fyzikální (např. působením tepla) nebo chemickou cestou (např. působením formaldehydu). Jako “podstatně avirulentní” je označován virus, jehož schopnost infikovat byla zničena. V ideálním případě je nakažlivost viru zničena tak, aby nedošlo k nežádoucímu ovlivnění proteinů, které zajišťují imunogenicitu viru. Na základě výše uvedených fakt bude oceněno, že oslabení viroví hostitelé mohou obsahovat živé viry nebo inaktivované viry.

Oslabení viroví hostitelé, které je možno použít ve vakcínách podle vynálezu, mohou obsahovat virové vektory a to včetně adenoviru, cytomegaloviru a výhodněji virů neštovic jako je virus kravských neštovic (viz např. Paoletti a Panicali, US patent č. 4 603 112, který je zde začleněn jako odkaz) a oslabených kmenů Salmonella (viz např. Stocker, US patent č. 4 550 081, který je zde začleněn jako odkaz). Živé vakcíny jsou výhodné konkrétně proto, že vedou k prodlouženému podnětu, což může způsobit podstatně dlouhodobou imunitu.

Multivalentní vakcíny mohou být připraveny z jednoho nebo více mikroorganismů tak, že exprimují odlišné epitopy N. meningitidis (např. jiné povrchové proteiny nebo epitopy N. meningitidis). Epitopy jiných pathogeních mikroorganismů mohou být začleněny do vakcíny.

Ve výhodnějším provedení bude tento postup zahrnovat konstrukci rekombinantního viru neštovic pro expresi sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu. Po vpravení do hostitele exprimuje rekombinantní virus neštovic imunogenní činidlo a tím vyvolává odezvu u hostitele. Například je možno odkázat na US patent č. 4 722 848, začleněný zde jako odkaz, který popisuje vektory neštovic a způsoby, které jsou užitečné v imunizačních protokolech.

f I

Na základě předmětného odhalení bude odborníkům v dané oblasti techniky zřejmá existence řady různých jiných vektorů, užitečných pro terapeutické podávání nebo imunizaci imunogenními činidly vynálezu.

V dalším provedení může být nukleotidová sekvence použita jako vakcína ve formě vakcíny “samotné DNA” , což je v dané oblasti známé. Například expresní vektor vynálezu může být včleněn do savce, kde způsobí produkci polypeptidu in vivo, proti kterému hostitel vytváří imunitní odpověď, jako je to například popsáno v Barry, M. a kol., (1995, Nátuře, 377:632 až 635), který jo zde začleněn jako odkaz.

Detekční soupravy

Předmětný vynález také poskytuje soupravy pro detekci N. meningitidis v biologickém vzorku. Tyto soupravy budou obsahovat jedno nebo více konkrétních činidel, popsaných výše a to v závislosti na povaze použitého testovacího způsobu. V této souvislosti mohou soupravy obsahovat jeden nebo více polypeptidů, fragmentů, variant, derivátů, protilátek, fragmentů protilátek nebo nukleových kyselin podle vynálezu. Soupravy mohou také příležitostně obsahovat činidla, vho< !r á pro detekci značek, pozitivní a negativní kontroly, promývací roztoky, pufry pro ředění apod. Například detekční souprava na bázi nukleové kyseliny může obsahovat (i) nukleovou kyselinu podle výr álezu (která může být použita jako pozitivní kontrola), (ii) oligonukleotidový primer podle vynálezu a někdy také DNA polymerázu, DNA ligázu a další a to v závislosti na použité technice pro amplifikaci nukleové kyseliny.

Příprava imunoreaktivních fragmentů

Vynález je rovněž rozšířen na způsob identifikace imunoreaktivniho fragmentu polypeptidu, varianty nebo derivátů podle vynálezu. Tento způsob musí obsahovat vytvořeni fragmentu polypeptidu, varianty nebo derivátu, podávání fragmentu savci a detekci imunitní odpovědi u slávce. Tato odpověď bude zahrnovat produkci prvků, které specificky vážou N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát a/nebo působí jako ochrana vůči infekci N. meningitidis.

Před testováním imunoreaktivity konkrétního fragmentu ve výše uvedeném postupu, muže být použita řada metod, které umožňují předpovídat, je-li možno konkrétní fragment použít pro získání protilátky, která vykazuje křížovou reaktivitu s nativním antigenem. Tyto předpovědní metody mohou být založeny na sekvenci aminokonce nebo karboxykonce jako je to např. popsáno v Kapitole

11.14 v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra). Tyto předpovědní metody mohou být založeny na předpovědi hydrofilicity jako je to popsáno např. v Kyte a Doolittle (1982, J. Mol. Biol. 157:105 až 132) a v Hopp a Woods (1983, Mol. Immunol. 20:483 až 489), které jsou zde začleněny jako odkazy nebo na predikcích sekundární struktury, jako popisují např. Choo a Fasman (1978, Atm. Rev. Biochem. 47:251 až 276), který je zde začleněn jako odkaz.

Optimální výsledky obecně poskytují peptidové fragmenty, obsahující 10 až 15 zbytků. Peptidy menší než 6 nebo větší než 20 zbytků pracovaly uspokojivě. Tyto peptidové fragmenty mohou být poté chemicky připojeny na nosičovou molekulu jako je hemocyahin (keyhole limpet hemocyanin, KLH) nebo hovězí sérový albumin (BSA) jako je např. popsáno v Sekcích 11.14 a

11.15 v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra).

Peptidy mohou být použity pro imunizaci zvířete jako je diskutováno výše. Titry protilátky proti nativnímu nebo rodičovskému polypeptidu, ze kterého byl peptid vybrán, mohou být poté stanoveny např. radioimunostanovením nebo metodou ELISA, což je popsáno např. v Sekcích 11.16 a 114 v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra).

Protilátky mohou být poté přečištěny z vhodné biologické tekutiny zvířete pomocí srážení síranem amonným nebo chromatograficky, což je v dané oblasti techniky dobře známo. Příkladný protokol na přečištění protilátek je uveden v Sekcích 10.11 a 11.13 v Ausubel a kol., (1994 až 1998, supra).

Imunoreaktivita protilátky proti nativnímu nebo rodičovskému polypeptidu může být stanovena jakýmkoliv vhodným postupem jako je např. Western blot.

Funkcionální blokátory

U polypeptidů podle sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21 se předpokládá, že mají vlastnosti adhesinu. Fakticky mají určitou podobnost s adhesiny z Haemophilus influenzae, což jsou povrchové antigeny. Specificky jsou přibližně ze 67 % homologní s Hia proteinem z H. influenzae (Barenkamp, S. a St. Geme ΠΙ, J. 1996 Molecular Microbiology 19:1215 až 1233) a ze 74 % homologní s Hsf proteinem z H. influenzae (St. Geme ΙΠ, J. a kol., 1996, Journal of Bacteriology 178: 6281 až 6287; a US patent č. 5 646 259). Pro tato porovnávání byla použita mezera 3 a délka 0,01 a program GAP (Deveraux, 1984, supra). Seřazené sekvence těchto proteinů jsou ukázány na obr. 6. Přerušení funkce těchto polypeptidů by mělo mít významný terapeutický přínos, protože by mělo zabraňovat bakterii N. meningitidis přisednout a napadnout buňky. Přerušení funkce může být ovlivněno několika cestami.

Např. mohou být podávány skupiny jako chemické reaktanty nebo polypeptidy, které b ókují receptory na povrchu buňky a které interagují s polypeptidy podle sekvencí s identifikačními čís y 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21. Tyto kompetují u infekčního organismu s receptorovými místy. Tyto skupiny mohou obsahovat např. polypeptidy vynálezu, konkrétně fragmenty, nebo jejich funkcionální ekvivalenty imimetiky. |

Termín “mimetiky” je zde používán pro označení chemikálií, které jsou navržený pro napodobení konkrétních funkcionálních oblastí proteinů nebo peptidů. Rovněž mohou být pot žity antiidiotypické protilátky, vytvořené proti výše popsaným protilátkám, které blokují vazbu bakterie í

na povrch buňky. Skupiny, které interagují s receptorovými vazebnými místy v polypeptidech podle i

sekvencí s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21, mohou účinně zabraňovat infekci buňky bakterií N. meningitidis. Tyto skupiny mohou obsahovat blokovací protilátky, peptidy nebo jiné chemické látky.

Všechny tyto skupiny, farmaceutické prostředky, ve kterých jsou skupiny kombinovány s farmaceuticky přijatelnými nosiči a způsoby léčby pacientů, kteří jsou postiženi infskcí N. meningitidis a kterým jsou podávány tyto skupiny nebo prostředky, tvoří další aspekt vynálezíu

Polypeptidy vynálezu mohou být použity při testování a výběru sloučenin, které by moh y použity ve výše uvedených metodách. Např. polypeptidy vynálezu mohou být kombinovaly se značkou a vystaveny buněčné kultuře v přítomnosti testované látky. Poté může být pozorována schopnost látky inhibovat vazbu značeného polypeptidu na povrch buňky. V takovémto testu mohou být značené polypeptidy použity přímo na organismus jako je E. coli. Příležitostně může být s una N. meningitidis upravena tak, aby exprimovala modifikovanou a detekovatelnou formu polypeptidu.

být

Použití upravených kmenů N. meningitidis v tomto postupu je výhodnější, protože je lepší, když terciární struktura proteinu bude podobnější než je to v případě exprimovaném ve wild-type bakteiii.

Aby byl vynález srozumitelný a aby byl uveden do praktických souvislostí, budou nyní popsána konkrétní výhodnější provedení a to prostřednictvím následujících neomezujících příkladů.

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje mapy plasmidů a strategii klonování. K amplifikací oblasti, identifikované v databázi TIGR jako homolog AIDA-I, z MC58 byly použity primery A3A a A3B (sekvence s identifikačními čísly 28 a 29). Aby byl získán pNMAIDA3, byl klonován produkt PCR. K amplifikací Eagl fragmentu o velikosti 3 kbp, který obklopuje hiaNm, byly použity při inverzním PCR primery A3C (sekvence s identifikačním číslem 30) a A3D (sekvence s identifikačním číslem 31). Tento produkt byl klonován a byl získán piEAGA3. piEAGA3 byl subklonován za vzniku piEagA3.8 a piEagA3.9. K amplifikací přilehlé oblasti z MC58 byly použity primery HiaNnrM a HiaNmrP (sekvence s identifikačními čísly 22 a 23) a produkt byl klonován za vzniku pHiaNm. K amplifikací otevřeného čtecího rámce hiaNm byly použity primery Hia-MBPA (sekvence s identifikačním číslem 24) a Hia-MBPB (sekvence s identifikačním číslem 25) a produkt byl klonován do pMALC2 za vzniku pMBP-KfiaNm;

Obr. 2 je Southern blot genomické DNA mnoha kmenů N. meningitidis. 2A: kmeny séroskupiny B. Dráha 1 PMC28, dráha 2 PMC27, dráha 3 PMC25, dráha 4 PMC24, dráha 5 PMC16, dráha 6 PMC13, dráha 7 PMC12, dráha 8 standardy molekulové hmotnosti, dráha 9 2970, dráha 10 1000, dráha 11 528, dráha 12 SWZ107, dráha 13.H41, dráha 14 H38, dráha 15 NGH36, dráha 16 H15, dráha 17 NGG40, dráha 18 NGF26, dráha 19 NGE30, dráha 20 NGE28. 2B: Kmeny jiných séroskupin než B. Dráha 1 PMC3, dráha 2 PMC17, dráha 3 PMC20, dráha 4 PMC23, dráha 5 PMC8, dráha 6 PMC9, dráha 7 PMCli, dráha 8 PMC14, dráha 9 PMC18, dráha 10 PMC21, dráha 11 PMC29, dráha 12 standardy molekulové hmotnosti, dráha 13 PMC19, dráha 14 PMC1, dráha 15 PMC6, dráha 16 PMC10, dráha 17 PMC22, dráha 18 PMC26, dráha 19 PMC2. Standardy molekulové hmotnosti jsou uváděny v kilobazíčh (kb). Genomická DNA byla hybridizována s próbou, odpovídající ntp 276-2054 sekvence s identifikačním číslem 1.

Obr. 3 ukazuje gel MBP-HiaNm, obarvený Coomassie modří, buňky, obsahující pMALC2 (dráha 2) nebo pMBP-HiaNm (dráha 3) po indukci pomocí BPTG. V dráze 1 jsou standardy molekulové hmotnosti (kDa). Šipky označují MBP a MBP-HiaNm.

Obr. 4 je Western blot proteinů MC58 a MC58AHiaNm, inkubovaný s králičím antisérem. Dráha 1 jsou standardy molekulové hmotnosti v kDa, dráha 2 jsou celkové buněčné proteiny MC58, dráha 3 jsou celkové buněčné proteiny MC58AHiaNm, dráha 4 je OMC preparát MC58, dráha 5 je OMC preparát MC58ÁHiaNm. Každá dráha obsahovala 50 μΐ suspenze proteinů s A₂go - 3,75.

Obr. 5 ukazuje gel, který probíhal paralelně s gelem pro Western blot na obr. 4. Tento gel byl obarven Coomassie modří. Dráhy jsou stejné jako na obr. 4.

Obr. 6 ukazuje porovnání sekvencí polypeptidů HiaNm, Hia, Hsf pomocí programu PILEUP. Obr. 7 ukazuje porovnání polypeptidových sekvencí HiaNm z 10 kmenů N memngitidis pomocí programu PILEUP.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1. Molekulární klonování a subklonování a konstrukce mutantu hiaNm

Gen hiaNm byl nejprve izolován PCR amplifikaci pomocí standartnich způsobů. Stručně řečeno, vzhledem k naší předcházející práci na homolozích proteinu AIDA-I z E. coli (Jennings, M. a i

kol., 1995, Microbial Pathogenesis, 19:391 až 407), Peak, I. a kol., Microbial Pathogenesis, v tisku) jsme provedli výběr homologů, identifikaci sledované sekvence v dřívějších datech, pocházejících z projektu na sekvenování genomu MC58f3 (The Institute for Genomic Resetrch, ftp://ftp.tigr.Org/pub/data/n meningitidis/) a amlifikovali jsme homologní oblast pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce) s použitím oligonukleotidů A3A (5 -TTTGCAACGGTTCAGG3A-3', sekvence s identifikačním číslem 28) a A3B (5'- TATTCAGCAGCGTATCGG-3', sekvence s identifikačním číslem 29). Vznikající produkt o 449 párech bází (bp) byl klonován do pT7Blu; za vzniku plasmidu pNMAIDA3. Aby byl klonován celý gen, byly navrženy další oligonukleotidy á použity v inverzní PCR reakci. Tyto oligonukleotidy byly A3C (sekvence s identifikačním číslem a A3D (sekvence s identifikačním číslem 31) a odpovídaly komplementární sekvenci A3A (sekvé t>yly 30) ce s identifikačním číslem 28) a A3B (sekvence s identifikačním číslem 31). Templátem pro tuto reakci byla chromozomální DNA MC58, která byla naštěpena restrikčními enzymy Eagl a poté samoligována. Vznikající produkt PCR s velikosti 3 kbp byl klonován do vektoru pCRII (Invitrcgen), produkujícího plasmid piEagA3. Ten byl naštěpen Eagl a EcoKl a vznikající fragmenty o velikosti 1,4 i

kbp a 1,6 kbp, obsahující klonovanou DNA, byly klonovány do pBluescriptSKIL, M13mmus (Stratagene), za vzniku piEagA3.8 a piEagA3.9. Plasmid pHiaNm byl vytvořen amplifikaci f CR hiaNm a sekvenováním 5' a 3' k němu pomocí oligonukleotidových primerů HiaNn:P (5-TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3', sekvence s identifikačním číslem 22) a HiaNm:M (5'-CTTCCCTTCAAACCTTCC-3', sekvence s identifikačním číslem 23), odpovídajících v sekvenci

I i

S identifikačním číslem 1 nukleotidové pozici (ntp) 113 až 133 a 2102 až 2085. Produkt byl klonován do pŤ7Blue. Plasmid pHiaNmAKan byl vytvořen inzercí úseku, nesoucího resistenci vůči kanamycinu, do místa BglII v pHiaNm, odpovídajícího v sekvenci s identifikačním číslem 1 ntp 680. Úsek, nesoucí resistenci vůči kanamycinu, byl z pUC4Kan (Pharmacia) odstraněn pomocí BamHl. pHiaNmAKan byl transformován do N. meningitidis kmen MC68 pomocí inkubace bakterie s plasmidovou DNA po dobu 3 h na agaru Brain Heart Infusion (Acumedia Manufactureťs lne), který byl obohacen 10% zahřátou koňskou krví (“BHI misky”). Inkubace probíhala při 37 °C v 5% CO2. Jednotlivé kolonie byly přeneseny na čerstvá selektivní média, byly kultivovány a použity pro další studium. Tento mutantní kmen byl označen jako MC58ÁH3aNm. Porušení genu hiaNm v tomto kmeni bylo potvrzeno Southern blotem pomocí próby, odpovídající v sekvenci s identifikačním číslem 1 ntp 276 až 2054.

Příklad 2. Analýza nukleotidové sekvence

Nukleotidová sekvence byla analyzována pomocí sekvenační soupravy PRISM Dye terminátor s AmpliTaq DNA polymerázou FS nebo pomocí soupravy BigDye terminátor, jak je doporučováno v návodech od výrobce (Perkin Elmer), ve spojení s automatickým sekvenátorem model 373a (Applied Biosystems). Pro každý kmen byl amplifikován hiaNm ve 3 nezávislých PCR reakcích s použitím primerů HiaNm5'A2:5'-CCAAACCCCGATTTAACC-3' (sekvence s identifikačním číslem 26) a HiaNm3'A:5'-AATCGCCACCCTTCCCTTC-3' (sekvence ¹ s identifikačním číslem 27), což je naznačeno na obr. 1. Primery odpovídají v sekvenci s identifikačním číslem 1 ntp 230 až 247 a 2114 až 2097. Vznikající produkty byly přečištěny a shromážděny. Toto bylo použito jako templát pro přímé sekvenování obou řetězců. Data byla analyzována pomocí programů GCG (Deveraux a kol. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387 až 395) a AssemblyLIGN (Oxford Molecular). Bylo vytvořeno také několik nukleotidů nezbytných pro kompletní sekvence. Sekvence hiaNm 10 kmenů jsou ukázány v sekvencích s identifikačními čísly 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 20, odvozené aminokyselinové sekvence těchto genů jsou ukázány v sekvencích s identifikačními čísly 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 a 21.

Srovnání hiaNm z těchto kmenů naznačilo, že sdílejí 90 až 99% identitu s hiaNm z MC58.

Kromě toho hiaNm z MC58 vykazuje 62% až 68% homologii s hia a hsf z Haemophillus influenzae.

V testovaných kmenech má však hiaNm délku 1770 až 1800 bp. Toto je odlišné od hia a hsf jejichž délka je 3294 a 7059 bp. Předpovězený polypeptid z hiaNm, HiaNm, rovněž vykazuje homole gii s několika dalšími bakteriálními proteiny včetně AIDA-I, s adhesinem zahrnutým v difózní adhleenci ί

diaroické Escherichia coli kmen 2787 (O126:H27), HMW1, s dalším adhesinem z Haemophillus, !

UspAl, s vysokomolekulámím proteinem z Moxarella catarrthalis a se SepA, zahrnutým do napadání tkáně Shigella flexneri (Benz, I. a Schmidt, M. A, 1992, Molecular Microbiology 6: 539 až 1546, Barenkamp, S. J. a Leininger, E. 1992, Infection and Immunity 60: 1302 až 1313, Aébi, C.

a kol. 1997, Infection and Immunity 65: 4367 až 4377, Benjelloun-Touimi, Z. a kol.

1995, ů) se

Molecular Microbiology 17:123 až 135). Homologie těchto (a několika dalších protein, vyskytuje v rámci prvních 50 aminokyselin HiaNm. Analýza této sekvence ukázala přítomnost předpovídané signální sekvence s místy štěpení v aminokyselině 50 ve všech testovaných sekver cích HiaNm. Tyto dlouhé signální sekvence jsou běžné u proteinů, lokalizovaných ve vnější membráně gramnegativní bakterie (Henderson, I a kol., 1998, Trends in Microbiology 6:370 až 378). ί Výše zmíněné proteiny, se kterými vykazuje homologii prvních 50 aminokyselin HiaNm, jsou jeleny proteinové rodiny “autotransportních” proteinů vnější membrány (Henderson, I, supra). Toto striktně udává, že HiaNm je umístěn ve vnější mebráně N meningitidis.

Příklad 3. Analýza Southern blotem

Analýza Southern blotem byla provedena standartními technikami (Sambrook a kol., supra, Ausubel a kol., supra). Stručně řečeno, genomická DNA byla připravena ze 70 kmenů N. meningitidis několika séroskupin, byla naštěpena restrikčními enzymy a elektroforéticky separována na agarózovém gelu. Poté byla kapilárou převedena na nylonovou membránu. Il yto i

membrány byly hybridizovány se značenou próbou. Použitá próba odpovídala v sekvehci s identifikačním číslem 1 ntp 276 až 2054, obklopující celý otevřený čtecí rámec hiaNm kmene MC58. Tato byla označena DIG (dioxygeninem) podle návodů výrobce (Boehringer Mannheim). K pronytí byly použity stringentní podmínky (dvojnásobné promytí 5 min. při 22 °C v roztoku 2x SSC/0,1% i

SDS, následované dvěma promytími po dobu 30 min. při 68 °C, 0,2x SSC/0,1% SDS). Hybridizace byla detekována kolorimetricky pomocí nitrobluetetrazolium/bromo-chloryl-indolyl-fosfátu (NBT/BCIP) jak je doporučováno výrobcem. Signály byly detekovány ve všech testovaných kmensch (např. obr. 2). Kromě prototypního kmene MC58 byly testovány následující kmeny:

Tabulka 3

Název kmene	Zdroj	Séroskupina	Název kmene	Zdroj	Séroskupina
PMC 3 (J1079)	2^a	A	NGF26	1	B
PMC 17 (K874)	2	A	NGG40	1	B
PMC20 (H79)	2	A	H15	1	B
PMC23 (K750)	2	A	SWZ107	1	B
PMC12(K852)	2	B	528	1	B
PMC 13 (K859)	2	B	2970	1	B
PMC 16 (K873)	2	B	1000	1	B
PMC 24 (K782)	2	B	MPJB28	3^C	B
PMC 25 (K791)	2	B	MPJB56	3	B
PMC 27 (K816)	2	B	MPJB88	3	B
PMC 28 (K837)	2	B	MPJB157	3	B
BZ10	1^B	B	MPJB328	3	B
BZ47	1	B	MPJB627	3	B
BZ83	1	B	MPJB820	3	B
BZ133	1	B	MPJB945	3	B
BZ147	1	B	PMC 8 (K157)	2	C
BZ163	1	B	PMC 9 (K497)	2	C
BZ169	1	B	PMC 11 (K848)	2	c
BZ198	1	B	PMC 14 (K860)	2	c
BZ232	1	B	PMC 18(K879)	2	c
NG3/88	1	B	PMC 21 (K656)	2	c
NG4/88	1	B	PMC 29 (K841)	2	c
NG6/88	1	B	MPJC05	3	c
EG327	1	B	MPJC14	3	c
EG329	1	B	MPJC154	3	c
DK353	1	B	MPJC302	3	c
179/82	1	B	MPJC379	3	c
66/84	1	B	PMC19	2	w
DK24	1	B	MPJW025	3	w

NGH36	1	B	PMC 1 (J603)	2	X
H38	1	B	PMC6(K131)	2	X
H41	1	B	PMC 10 (K526)	2	Y
NGE28	1	B	PMC 22 (K685)	2	Y
NGE30	1	B	PMC 26 (K810)	2	Y
NGP20	1	B	PMC 2 (J1049)	2	z

^A World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Meningococci, Oslo, Norsko ^B Public Health Laboratory Service Meningococcal Reference Laboratory, Manchester, Velká Británie ^c Brisbane Hospitals, nyní ve sbírce kmenů M.P.Jenningse, Ustav Mikrobiologie, University of Queensland, Brisbane, Austrálie.

Příklad 4. Exprese a částečné přečištění MBP-HiaNm

Plasmidový vektor byl konstruován tak, že umožňoval expresi proteinu, který obsahoval fúzi proteinu, vážícího maltózu a HiaNm (MBP-HiaNm). Plasmid pHiaMBP byl vytvořen amplifikací hiaNm z MC58 pomocí příměrů Hianm-MBPA 5-GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATACCG-CAT-3' (sekvence s identifikačním číslem 24) a HiaNm-MBPB 5'-TCACCCAAGCTTAACCCrT-ACCACTGATAAC-3' (sekvence s identifikačním číslem 25). Tyto primery obklopují start á stop kodóny hiaNm z N. meningitidis kmen MC58 a modifikovaná restrikční místa pro snadné klonóvání. Plasmidové restrikční mapy a pozice oligonukleotidů jsou ukázány na obr. 1. Vzniklý produkt ICR byl ligován do plasmidů pMALC2, naštěpeného BamHUHindiU (New England Biolabs) a vzniklý plasmid pHiaMBP (viz obr. 1) byl začleněn zpět do E. coli kmen DH5a. Tento kmen E. \ coli,

I obsahující pHiaMBP, byl indukován pro expresi fuzního proteinu HiaNm-MBP za podmínek, k eré doporučuje výrobce (New England Biolabs). Buněčné extrakty z kultur, obsahujících pHiAM3P, byly separovány SDS-PAGE v 10% gelu a ťuzní protein byl částečně přečištěn elucí v zařízení Mini-Gel Electro-eluter (BioRad) podle pokynů výrobce. Frakce, obsahující fuzní protein HiaNm-M3P, byly detekovány Western blotem s použitím králičího séra proti MBP (New England Biolabs). Čistota fuzního proteinu HiaNm-MBP byla stanovena pomocí SDS-PAGE s následným barvením pomocí Coomassie modři. Množství získaného proteinu bylo stanoveno stanovením s BCA (Sigma) nebo měřením absorbance při vlnové délce 280 nm.

Příklad 5. Příprava polyklonálního séra

Částečně přečištěný fuzní protein HiaNm-MBP, získaný v Příkladu 4, byl použit pro přípravu polyklonálního séra v králíkovi. Vzorky eluovaného ťuzního proteinu HiaNmMBP byly dialyzovány proti sterilnímu fyziologickému roztoku, kteiý byl pufrován fosfátem, o pH 7,4 (PBS) (Sigma). Poté byl vzorek smíchán v koncentraci 50 až 150 ug/ml s adjuvants (MPL+TDM+CWS, Sigma) a zaočkován ve dvou týdenních intervalech do bílých novozélandských králíku (New Zealand White). Z těchto králíků byla shromážděna krev. Sérum bylo extrahováno vysrážením při laboratorní teplotě po dobu 1 h, následovala inkubace přes noc při 4 °C a odstředění při 4000 rpm při 4 °C. Supematant byl získán opětovným odstředěním. Sérum bylo skladováno v alikvotních podílech při -80 °C. Získaná séra byla použita při baktericidních stanoveních a Western blotech (viz níže).

Pro testování specifity získaného séra byl proveden Western blot. Stručně, proteiny z N. meningitidis kmenů MC58 a MC58ÁHianm byly separovány elektroforeticky SDS-PAGE a poté byly elektroforeticky převedeny na nitrocelulózovou membránu pomocí zařízení Semi-Dry Blotter (BioRad). Poté byly inkubovány postupně se sérem a alkalickou fosfatážou konjugovanou s IgG proti králičím IgG (Sigma) a kolorimetricky detekovány s NBT/BCIP (Sigma). Tyto pokusy ukázaly, že protilátky byly fuzním proteinem HiaNm-MBP vyvolány, jsou specifické pro MC58 a jsou detekované v MC58, ale nikoliv v MC58AHiaNm(v/z obr. 4). Předpovězená molekulová hmotnost odvozeného polypeptidu HiaNm je 62,3 kDá. Proužek, detekovaný sérem, migruje u zdánlivé Mw vyšší než 150 kDa. Tuto anomální migraci rovněž vykazují alespoň tři homologní “autotransportní” proteiny, uvedené v literatuře: vysokomolekulánií proteiny vnější membrány UspAl a UspA2 z Moxarella catarrhalis mají předpovídané molekulové hmotnosti 62,5 kDa a 88,3 kDa, ale migrují u 85 kDa a 120 kDa a jako komplex UspA mezi 350 kDa a 720 kDa (Aebi, C. a kol., 1997, Infection andImmunity, 65. 4361 až 4377, Klingman, K. L a Murphy, T. F., 1994, Infection and Immimity, 62. 1150 až 1155). Podobně Hia z Haemophilus influenzae má předpovídanou molekulovou hmotnost 116 kDa, ale je-li exprimována ve fagu, migruje Hia u hodnot vyšších než 200 kDa (Barenkamp, S. a St. Geme ΠΙ, J. 1996 Molecular Microbiology 19:1215 až 1233).

Aby bylo potvrzeno, že HiaNm je spojen s vnější membránou N. meningitidis, byly připraveny komplexy vnější membrány (omc), jako bylo popsáno dříve (van der Ley, P. a kol., 1991, Infection and Immunity, 59:2963 až 2971). Stručně, bakterie byly kultivovány přes noc na BHI miskách s i I agarem Brain Heart Infusion (Acumedia Manufacturers lne), který byl obohacen 10% zahřátou koňskou krví, byly resuspendovány v 10 mM Tris pH 8,0 a povařením usmrceny. Poté byl vzorek sonikován, aby byla porušena membrána. Zbytky buněk byly odstraněny odstředěním při 10 000 g (rcf relativní odstředivá síla) a supernatant byl znovu odstředěn při 50 000 g. Peleta byla resuspendována v 1% sarkosyl/10 mM Tris pH 8,4 a suspenze byla odstředěna při 10 (í)C 0 g. Supernatant byl odstředěn při 75 000 g a peleta byla před spektrofotometrickou kvantifikací při vlnové délce 280 nm resuspendována v Tris pH 8,4. Část frakce, nerozpustné v sarkosylu, Icterá obsahovala proteiny vnější mebrány (50 μΙ s A₂go=3,75), byla podrobena SDS-PAGE a Wertem blotu, které jsou popsány výše. Výsledky, ukázané na obr. 4, ukazují, že reaktivita s antisérem sroti HiaNmMBP je pozorována v případě wild-type MC58, ale nikoliv u MC58AHiaNm, ve kterem byl hiaNm inaktivován. Zvýšení reaktivity se sérem proti HiaMBP, pozorované mezi vzorky celých buněk a omc vzorky, které obsahují stejné celkové množství proteinu, v kulturách MC58 je v souladu s membránovým spojením HiaNm.

Příklad 6. Stanovení baktericidity

Aby bylo stanoveno, zdali obsahuje antisérum proti HiaMBP baktericidní protilátky specifické pro HiaNm, byla provedena stanovení baktericidity u wild-type MC58 a MC58AHiaNm. oto stanovení bylo uskutečněno modifikovaným postupem, který popsal Hoogerhout a kol. (1995, Infection and Immunity, 63: 3473 až 3478). Stručně, MC58 a MC58AHiaNm byly kultivovány ?řes noc na BHI miskách při 37 °C v 5% CO₂. Bakterie z této kultury, kultivované přes noc, byly před tím, než byly suspendovány v 1 ml PBS subkultivovány za stejných podmínek po dobu 4 až ? h. Počet bakterií byl stanoven na základě lýze vzorku v roztoku 0,2 N NaOH/1% SDS a podle absorbance při vlnové délce 260 nm, přičemž A₂<so =1 = 10⁹cfii/ml. Bakteriální suspenzei byla , . ! I upravena PBS na koncentraci přibližně 10 cfu/ml. Testovaná králičí séra byla zahřátím na 56 °C po dobu 45 min. inaktivována. Sérum ze čtyři týdny starých novozélandských bílých králíků j bylo shromážděno a použito jako zdroj komplementu (Central Animal Breeding House, University of

Queensland). Stanovení bylo provedeno ve sterilních polystyrénových mikrotitračních destičkách s 96 jamkami ve tvaru T. Celkový objem v každé jamce byl 24 μΐ: 12 μΐ dvakrát po sobě zředěného séra v PBS a 6 μΐ bakteriální suspenze (obsahující 300 až 900 bakterií). Séra a bakterie byly inkubovány při labotaromí teplotě po dobu 10 min a poté bylo přidáno 6 μΐ 80% komplementu v PBS (konečná koncentrace 20 obj. %). Kontroly byly: a) PBS, bakterie a komplement, b) PBS, bakterie a sérum. Po přídavku všech složek a zamíchání bylo na misku s BHI rozetřeno 7 μΐ z každé kontrolní jamky. Mikrotitrační destička byla poté inkubována při 37 °C v 5% CO₂ po dobu 60 min. Po této inkubaci bylo na misky s BHI rozetřeno 7 μΐ z každé jamky. Všechny misky s BHI byly inkubovány po dobu 14až 18hpri37°Cav5% CO₂ a poté byly spočítány bakteriální kolonie. Jako baktericidně zabíjející sérum je uváděno nejvyšší reciproční ředění, při kterém je usmrceno alespoň 90 % baktérií. Použité sérum bylo ze stejného králíka a ze stejného vykrvení jako v případě Western blotu, který je uveden v Příkladu 5. Tyto pokusy shodně ukazují snížené titry (přibližně 3 krát, tab. 4) usmrcení proti MC58ÁHiaNm ve srovnání swild-type kmenem MC58, což naznačuje, že antiséra proti HiaMBP obsahovala baktericidní protilátky, specifické pro HiaNm.

Tabulka 4

Kmen	TITR^a
MC58	12 (+/- 4,6)
MC58ÁHiaNm	3,5 (+/- 1)

^a znamená čtyři nezávislé pokusy

Diskuse

U některých pathogenních bakterií byla s determinantami virulence spojena repetitivní DNA. Pomocí Southern blotů, odhalil motiv repetitivní DNA přítomnost alespoň 3 míst v N. meningitidis kmen MC58, která obsahovala tento motiv (Peak, I. a kol., 1996, FEMS Microbiology Letters, 137:109 až 114). Tyto geny byly klonovány a sekvenční analýza dvou z těchto opakovaných míst (nmrep2 a nmrep3) odhalily otevřené čtecí rámce přibližně 670 aminokyselin (Jennings, M. a kol., 1995, Microbial Pathogenesis, 19:391 až 407, Peak, I. a kol., Microbial Pathogenesis, v tisku). Tyto vykazovaly homologii jeden s druhým a homologii s karboxykoncem adhesinu AIDA-I v E. coli. AIDA-I má délku 1286 aminokyselin. Oblast C-konce tvoří zdánlivou transportní doménu vnější membrány a aminokoncová doména zralého proteinu tvoří adhesínovou doménu.

Aminokoncová doména křižuje membránu přes zdánlivou transportní doménu a je označována passenger doména.

Protože Nmep2 a Nmep3 sdílejí sekvenční homologii s transportní doménou AIDA jako jsou považovány za součásti tvořící membránové póry. Nmrep2 a Nmrep3 mají přibližně poloviční ívám velikost AIDA-I a jsou homologní s membránovou překlenovací doménou AIDA-I. Domníváme se, že v N. meningitidis existuje místo, které vykazuje homologii s aminokoncovou doménou AiLa-I. Provedli jsme výběr těchto homologů v datech z projektu na sekvenování N. meningitidis lonen MC58q3 (TIGR, supra) a nalezli jsme jednu oblast homologní s genem, označeným v Haemophilus influenzae kmenRd (Hll 732) jako AIDA-I, protože je homologní s AIDA-I v E. coli (Fleischmann a kol., 1995, Science 269:496 až 512). Z pohledu homologii, které jsou uvedeny výše, se přihlašovatelé rozhodli pokračovat v objevování dále.

Gen byl nejdříve izolován pomocí PCR amplifikace DNA, odpovídající fragmentu o 471 párech bází, označeném gnmaa84r, z N. meningitidis MC583 a sekvence byla potvrzena. Další PCR umožnily amplifikaci delších fragmentů. Ty byly klonovány a byla provedena sekvenční analýza jako je na obr. 1. Gen vykazoval homologii s aminokoncovou oblastí AIDA-I z E. coli a my jsme ho označili aida3, protože reprezentoval třetí homolog AIDA-I v N. meningitidis (s nmrep2 a nmrep3). Protože byl publikován objev dvou dalších genů hia a hsf z H. influenzae (Barenkamp, S. a St. Geme

ΙΠ, J. 1996 Molecular Microbiology 19:1215 až 1233, St. Geme ΠΙ, J. a kol., 1996, Journal of i

Bacíeriology 178: 6281 až 6287), kterým je aida3 podobnější, přeoznačili jsme tento gen na hiaNm. (HI1732, gen H. influenzae poprvé identifikovaný jako homolog AIDA-I byl rovněž vzhledem ke zprávám Barenkampa a St. Geme ΙΠ znovu přeoznačen na hia). j i

I

Cílem bylo prostřednictvím specifikace popsat výhodnější provedení vynálezu bez omezení vynálezu na jakékoliv provedení nebo specifický soubor údajů. Odborníci v dané oblasti techniký jistě i I ocení, že vzhledem k nynějšímu odhalení, mohou být provedeny různé modifikace a změny konkrétních provedení, uvedených jako příklady, aniž by tím došlo k odchýlení se od rožsahu předmětného vynálezu. Předpokládá se, že všechny tyto modifikace a změny budou zahrnutý do i

rozsahu dodatečných nároků. j

SEZNAM SEKVENCÍ

<110> Peafc, lan R. i	i (pouze US) (pouze US) (pouze US) (kromě US) (kromě US)
	Jennings, Michael P. i Moxom, Edward R. i University of Queensland i Isis Innovations Limited i
<120>	Nový povrchový antigen
<130>	Neisseria meningitidis HiaNm antigen
<140>	PCT/AU 9?/01031
<141>	1998-12-14
<150>	GB 9726398.2
<151>	1997-12-12
<160>	31
<170>	Patentlr. Ver. 2.0
<210>	1
<211>	2308
<212>	ONA
<213>	Neisseria meningitidis
<220> <221>	CDS
<222>	(276,..(2054)
<400>	1
gaaaaaccac agcaatttat cagcaaaaac	agaaacccca	ccgccgtcat	tcccgcaaaa	60
gcgggaatcc aaacccgtcg gcacggaaaa	cttaccgaat	aaaacagttt	ccttagattc	120
cacgtcccag attcccgcct tcgcggggaa	tgacgagatt	ttaagttggg	cgaatttatc	180
agaaaacccc caacccccaa aaaccgggcg	gatgccgcac	catccgcccc	caaaccccga	240
tttaaccatt caaacaaacc aaáagaaaaa	acaaa atg aac aaa ata	tac cgc	293
		Met i	'.sn Lys Ile	Tyr Arg
		1		*5

atc att tgg

aat Asn 10

agt Ser

gcc Ala

ctc aat

gcc tgg gtc gtc gta tcc gag ctc

341

Ile

Trp

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Val

Ser 20

Glu

Leu

a ca

cgc

aac

CSC

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gča

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta

389

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

25

30

35

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

gca

agt

gct

aac

aat

gaa

437

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

Ais

Ser

Ala

Asr.

Asn

Glu

40

45

50

aga

cca

aga

aaa

gat

tta

tat

tta

gac

ccc

Gva

caa

cgc

act

gtt

485

Arg

Pro

Arg

Lys

Aso

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

Val

Gin

Arg

Thr

Val

55

60

65

70

gcc

gtg

ttg

ata

gtc

aat

tcc

gat

aaa

gaa

gac

acg

gga

gaa

aaa

gaa

533

Ala

Val

Leu

ite

Val

Asn

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu

75

80

85

94

F,.^r

i i

aaa

gta

gaa

aat

tea

gat

tgg

gca

gta

tat

ttc

aac

gag

aaa

gga

58 lj

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asn

Glu

Lys

Gly

9C

95

100

qta

cta

aca

gcc

aga

gaa

atc

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

ctg

aaa

629

Val

Leu

Thr

Ala

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

105

110

115

atc

aaa

caa

aac

ggc

aca

aac

ttc

acc

tac

tcg

ctg

aaa

gac

ctc

677

Ile

Lys

Gin

Asr.

Gly

Thr

Asn

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

120

125

130

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gga

act

gaa

aaa

tta

tcg

ttt

age

oca

aac

725

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

135

140

145

150

ggc

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

age

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

773

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

155

160

165

aaa

gaa

acg

get

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

gtt

cat

ctg

aac

qat

821

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

i

no

175

180

att

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

acg

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

869

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

185

190

195

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

a3il

aaa

cgt

gcg

gca

917 ί

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

200

205

210

age

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

get

ggc

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

965 I

Ser

Val

Lys

Asc

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

1

215

220

225

230

1

ccc

ggt

aca

get

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

gtc

ege

act

tac

gac

1 1013j i

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

val

Arg

Thr

Tyr

Asp

235

240

245

i

aca

gtc

gag

ttc

ttg

age

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

1 1061!

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

1 i |

250

255

260

i j

gaa

age

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gtg

aag

! ί 1109 !

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly·

Val

Lys

: i

265

270

275

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

gac

1157

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

i

280

285

290

aaa

ggc

gag

aat

ggt

tet

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

1205

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

295

300

305

310

i

gca

aaa

gaa

gtg

att

qat

gca

gta

aac

aag

get

ggt

tgg

aga

atg

aaa

1253

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

315

320

325

aca

acc

get

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

get

gac

aag

ttt

gaa

acc

1301 ί

Thr

Aia

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

1 i

330

335

340

!

I p r r r ér ι· r <

	iii	f r t - c	ř r r r r	r- r
gtt aca tca ggc aca	aat gta acc ttt gct	agt ggt aaa ggt aca	act	1349
Val Thr Ser Gly Thr	Asn Val Thr Phe Ala	Ser Gly Lys Gly Thr	Thr
345	350	355
gcg act gta agt aaa	gat gat caa ggc aac	atc act gtt atg tat	gat	1397
Ala Thr Val Ser Lys	Asp Asp Gin Gly Asn	Ile Thr Val Met Tyr	Ašp
360	365	370
gta aat gtc ggc gat	gcc cta aac gtc aat	cag ctg caa aac agc	ggt	1445
Val Asn Val Gly Asp	Ala Leu Asn Val Asn	Gin Leu Gin Asn Ser	Gly
375	380	385	390
tgg aat ttg gat tcc	aaa gcg gtt gca ggt	tet tcg ggc aaa gtc	atc	1493
Trp Asn Leu Asp Ser	Lys Ala Val Ala Gly	Ser Ser Gly Lys Val	Ile
395	400	405
agc ggc aat gtt tcg	ccg agc aag gga aag	atg gat gaa acc gtc	aac	1541
Ser Gly Asn Val Ser	Pro Ser Lys Gly Lys	Met Asp Glu Thr Val	Asn
410	415	420
att aat gcc ggc aac	aac atc gag att acc	ege aac ggt aaa aat	atc	1589
Ile Asn Ala Gly Asn	Asn Ile Glu Ile Thr	Arg Asn Gly Lys Asn	Ile
425	4 30	435
gac atc gcc act tcg	atg aCc ccg cag ttt	tcc agc gtt tcg ctc	ggc	1637
Asp Ile Ala Thr Ser	Met Thr Pro Gin Phe	Ser Ser Val Ser Leu	Gly
440	445	450
gcg ggg gcg gat gcg	ccc act ttg agc gtg	gat ggg gac gca ttg	aat	1685
Ala Gly Ala Asp Ala	Pro Thr Leu Ser Val	Asp Gly Asp Ala Leu	Asn
455	4 60	465	470
gtc ggc agc aag aag	gac aac aaa ccc gtc	ege att acc aat gtc	gcc	1733
Val Gly Ser Lys Lys	Asp Asn Lys Pro Val	Arg Ile Thr Asn Val	Ala
475	480	485
ccg ggc gtt aaa gag	ggg gat gtt aca aac	gtc gca caa ctt aaa	qgc	1781
Pro Gly Val Lys Glu	Gly Asp Val Thr Asn	Val Ala Gin Leu Lys	Gly
490	495	500
gtg gcg caa aac ttg	aac aac ege atc gac	aat gtg gac ggc aac	gcg	1829
Val Ala Gin Asn Leu	Asn Asn Arg Ile Asp	Asn Val Asp Gly Asn	Ala
505	510	515
cgt gcg ggc atc gcc	caa gcg att gca acc	gca ggt ctg gtt cag	gcg	1877
Arg Ala Gly Ile Ala	Gin Ala Ile Ala Thr	Ala Gly Leu Val Gin	Ala
520	525	530
tat ttg ccc ggc aag	agt atg atg gcg atc	ggc ggc ggc act tat	ege	1925
Tyr Leu Pro Gly Lys	Ser Met Met Ala Ile	Gly Gly Gly Thr Tyr	Arg
535	540	545	550
ggc gaa gcc ggt tac	gcc atc ggc tac tcc	agt att tcc gac ggc	gga	1973
Gly Glu Ala Gly Tyr	Ala Ile Gly Tyr Ser	Ser Ile Ser Asp Gly	Gly
555	560	565
aat tgg att atc aaa	ggc acg gct tcc ggc	aat tcg ege ggc cat	ttc	2021
Asn Trp Ile Ile Lys	Gly Thr Ala Ser Gly	Asn Ser Arg Gly His	Phe
570	575	580
ggt gct tcc gca tet	gtc ggt tat cag tgg	taa gggctttatc gcctqtctgc	2074
Gly Ala Ser Ala Ser	Val Gly Tyr Gin Trp
585	590

tgttgggaca ggcggaaggt ttgaagggaa gagtggcgac ttgccgcctg aqacctttgc 2134 v

řv aaaatccccc caaaatcccc taaattccca ccaagacatt tagggaattt ccttcttccg gcaaaccgcg caagccatga ttgccaaaca catcaaccat tgaagttgga ccaagtgatt gattggcagc cgatcgagca gtacctgaac <210> 2 <211> 592 <212> PRT

I ctcatgagca 2194 ttcccactar 2254 cgtc 2308

<213> Neisseria

meningitidis

<400> 2

Met

Asn

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Ala

Ser

Ala

Asn

Glu

Arg

Pro

Arg

Lys

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

50

55

60

Pro

Val

Gin

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Leu

Ile

Val

Asn

Ser

Asp

Lys

Glu

65

70

75

80

Gly

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

85

90

95

Tyr

Phe

Asn

Glu

Lys

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu

Lys

100

105

110

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe

Thr

Tyr

115

120

125

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

Lys

130

135

140

Leu

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

145

150

155

160

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

165

170

175

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

180

185

190

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

195

200

205

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

210

215

220

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

225

230

235

240

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

245

250

255

Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu 260 265 270 r c

V

V-

Val	Lys	Ile 275	Gly Val	Lys Thr Ser 280	Val	Ile Lys Glu Lys 285	Asp	Gly	Lys
Leu	Val	Thr	Gly Lys	Asp Lys Gly	Glu	Asn Gly Ser Ser	Thr	Asp	Glu
	290			295		300
Gly	Glu	Gly	Leu Val	Thr Ala Lys	Glu	Val Ile Asp Ala	Val	Asn	Lys
305				310		315			320
Ala	Gly	Trp	Arg Met	Lys Thr Thr	Thr	Ala Asn Gly Gin	Thr	Gly	Gin
			325			330		335
Ala	Asp	Lys	Phe Glu	Thr Val Thr	Ser	Gly Thr Asn Val	Thr	Phe	Ala
			340		345		350
Ser	Gly	Lys	Gly Thr	Thr Ala Thr	Val	Ser Lys Asp Asp	Gin	Gly	Asn
		355		360		365
Ile	Thr	Val	Met Tyr	Asp Val Asn	Val	Gly Asp Ala Leu	Asn	Val	Asn
	370			375		380
Gin	Leu	Gin	Asn Ser	Gly Trp Asn	Leu	Asp Ser Lys Ala	Val	Ala	Gly
385				390		395			4 00
Ser	Ser	Gly	Lys Val	Ile Ser Gly	Asn	Val Ser Pro Ser	Lys	Gly	Lys
			405			410		415
Met	Asp	Glu	Thr Val	Asn Ile Asn	Ala	Gly Asn Asn Ile	Glu	Ile	Thr
			420		425		430
Arg	Asn	Gly	Lys Asn	Ile Asp Ile	Ala	Thr Ser Met Thr	Pro	Gin	Phe
		435		440		445
Ser	Ser	Val	Ser Leu	Gly Ala Gly	Ala	Asp Ala Pro Thr	Leu	Ser	Val
	450			455		460
Asp	Gly	Asp	Ala Leu	Asn Val Gly	Ser	Lys Lys Asp Asn	Lys	Pro	Val
4 65				470		475			480
Arg	Ile	Thr	Asn Val	Ala Pro Gly	Val	Lys Glu Gly Asp	Val	Thr	Asn
			485			490		495
Val	Ala	Gin	Leu Lys	Gly Val Ala	Gin	Asn Leu Asn Asn	Arg	Ile	Asp
			500		505		510
Asn	Val	Asp	Gly Asn	Ala Arg Ala	Gly	Ile Ala Gin Ala	Ile	Ala	Thr
		515		520		525
Ala	Gly	Leu	Val Gin	Ala Tyr Leu	Pro	Gly Lys Ser Met	Met	Ala	Ile
	530			535		540
Gly	Gly	Gly	Thr Tyr	Arg Gly Glu	Ala	Gly Tyr Ala Ile	Gly	Tyr	Ser
545				550		555			560
Ser	Ile	Ser	Asp Gly	Gly Asn Trp	Ile	Ile Lys Gly Thr	Ala	Ser	Gly
			565			570		575
Asn	Ser	Arg	Gly His	Phe Gly Ala	Ser	Ala Ser Val Gly	Tyr	Gin	Trp
			580		585		590

<210> 3 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis qf νά <400> 3

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctcggt	cgtcctštcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtatcggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaacaatg	aaagaccaag	aaagaaagat	180 1
ttatatttag	accccgtaca	acgcactgtt	gccgtgttga	tagtcaattc	cgataaagaa	240
ggcacgggag	aaaaagaaaa	agtagaagaa	aattcagatt	gggcagcata	tttcaacgaq	300i
aaaggagtac	taacagccag	agaaatcacc	ctcaaagccg	gcgacaacct	gaaaaifaaa	3 60 i
caaaacggca	caaacttcac	ctactcgctg	aaaaaagacc	tcacaoatct	gaccaytgtt	420
ggaactqaaa	aattatcgtt	tagcgcaaac	ggcaataaag	tcaacatcac	aagcaacacc	480
aaaggcttga	attttgcgaa	agaaacggct	gggacgaacg	gcgacaczac	ggttcatctg	540
aacggtattg	gttcgacttt	gaccgatacg	ctgctgaata	ccggaccgac	caeaaatgta	600
accaacgaca	acgttaccga	tgacgagaaa	aaacgtgcgg	caagccctaa	agacctatía	660
aacgctggct	ggaacattaa	aggcgttaaa	cccggtacaa	cagcttccga	taacgttgat	720
ttcgtccgca	cttacgacac	agtcgagttc	ttgagcgcag	atacgaaaac	aacaactgtt	780
aatgtggaaa	gcaaagacaa	cggcaagaaa	accgaagtta	aaatccgcgt	gaagaetcct	840
gttattaaag	aaaaagacgg	taagttggtt	actggtaaag	acaaacgcga	gaatoglcct	900
tctacagacg	aaggcgaagg	cttagtgact	gcaaaagaag	tgattgatgc	agtaaacaag	960
gctggttgga	gaatgaaaac	aacaaccgct	aatggtcaaa	caggtcaagc	tgaceagctt	1020
gaaaccgtta	catcaggcac	aaatgtaacc	tttgctagtg	gtaaaogtac	aactgcjact	1080
gtaagtaaag	atgatcaagg	caacatcact	gttatotatg	atgtaaatgt	cggcgatgcc	1140
ctaaacgtca	atcagctgca	aaacagcggt	tggaatttgg	attccaaagc	ggttgcaggt	1200
tcttcgggca	aagtcatcag	cggcaatgtt	tcgccgagca	aggaaaagat	ggatgaaacc	1260
gtcaacatta	atgccggcaa	caacatcgag	attacccgca	acggtaaaaa	tatcjscatc	1320
gccacttcga	tgaccccgca	gttttccagc	gtttcgctcg	gcgcgcgggc	ggatgcgccc	1380
actttgagcg	tggatgggga	cgcattgaat	gtcggcagca	agaagcacaa	caaacccgtc	1440
cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	gagggggatg	ttacaaacgt	cgcacaactt	1500
aaaggcgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	atcgacaatg	tggacggcaa	cgcgcgtgcg	1560
ggcatcgccc	aagcgattgc	aaccgcaggt	ctggttcagg	cgtatccacc	cggcaagagt	1620
atgatggcga	tcggcggcgg	cacttatcgc	ggcgaagccg	gttaccccat	cggctactcc	1680
agtatttccg	acggcggaaa	ttggattatc	aaaggcacgg	cttccgccaa	ttcgcgcggc	1740
catttcggtg	cttccgcatc	tgtcggttat	cagtggtaa			1779

<210> 4 <211> 1797 * t· r r

tt vil

<212> DNA <213> Neisseria	meningitidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1”97)
<400> 4
atg aac aaa ata	tcc cgc atc att tgg aat agc gcc ctc aat gcc tcg
Met Asn Lys Iie	Ser Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp
1	5 10 15
gtc gtc gta tcc	gag ctc aca cgc aac cac acc aaa cgc gcc tcc gca
Val Val Val Ser	Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala
20	25 30
acc gtg gcg acc	gcc gta ttg gcg aca ctg ttg ttt gca acg gct cag
Thr Val Ala Thr	Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin
35	40 45
gcg aat gct acc	gat gac gač gat tta tat tta gaa ccc gca caa cgc
Ala Asn Ala Thr	Asp Asp Asp Asp Léu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Aro
50	55 60
act gct gtc gtg	ttg agc ttc cgt tcc gat aaa gaa ggc acg gga gaa
Thr Ala Val Val	Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu
65	70 75 ec
aaa gaa ggt aca	gaa gat tca aat tgg gca gta tat ttc gac gag aaa
Lys Glu Gly Thr	Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys
	85 90 ‘ 95
aga gta cta aaa	gcc gga gca atc acc ctc aaa gcc ggc gac aac ctg
Arg Val Leu Lys	Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu
100	105 ' 110
aaa atc aaa caa	aac acc aat gaa aac acc aat gaa aac acc aat gac
Lys Ile Lys Gin	Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp
115	120 125
agt agc ttc acc	tac tcc ctg aaa aaa gac ctc aca gat ctg acc agt
Ser Ser Phe Thr	Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser
130	135 140
gtt gaa act caa	aaa tta tcg ttt ggc gca aac ggt aat aaa gtc aac
Val Glu Thr Glu	Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn
145	150 155 160
atc aca agc gac	acc aaa ggc ttg aat ttt gcg aaa gaa acg gct ggg
Ile Thr Ser Asp	Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly
	165 170 175
acg aac ggc gac	ccc acg gtt cát ctg aac ggt atc ggt tcg act ttg
Thr Asn Gly Asp	Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Léu
ISO	185 ISO
acc gat acg ctg	ctg aat acc gga gcg acc aca aac gta acc aac gac
Thr Asp Thr Leu	Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp
195	200 205
aac gtt acc cat	gac gag aaa aaa cgt gcg gca agc gtt aaa gac gta
Asn Val Thr Asp	Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val
210	215 ’ 220

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624 €72 tta aac gca ggc tgg aac att aaa ggc: gtt aaa ccc ggt aca aca gct 720 r r

768

νϋ-i

* * r* r

Γ

Leu

Asn

Ala Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

' Tne Thr

Ala

225

230

235

240

tcc

gat

aac gtc

gat

ttc

gtc

ege

act

tac

gac

aca

gtc

gag tcc

ttg

Ser

Asp

Asn Vč).

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu Phe

Leu

245

250

255

agc

gca

gat acc

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

agc

aaa gac

aac

Ser

Ala

Ásp T^ř

Lys

Thr

Val

Asn

Val

G1 u

Ser

Lvs Asp

Asn

26 3

265

270

ggc

aag

aga acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt att

aaa

Gly

Lys

Arg Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val Ile

Lys

275

280

285

gaa

aaa

gac get

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

ggc

gag aat

ggt

Glu

Lys

Asp GLv

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu Asn

Gly

290

295

300

tet

aca gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa gtg

att

Ser

Thr Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu Val

Ile

305

310

315

320

gat

gca

gta aac

aag

get

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc get

aat

Asp

Ala

Val Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Thr Ala

Asn

325

330

335

ggt

caa

aca gcc

caa

get

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea ggc

aca

Gly

Gin

Thr GLy

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser Gly

Thr

340

345

350

aaa

gta

acc tet

get

agt

ggt

aat

ggt

aca

act

gcg

act

gta agt

aaa

Lys

Val

Thr Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

Thr

Ala

Thr

Vai Ser

Lys

355

360

365

gat

caa ggc

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc ggc

gat

Asp

Gin Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val Gly

Asp

370

375

380

gcc

cta

aac gtc

aat

cag

cta

caa

aac

agc

ggt

tgg

aat

ttg gat

tcc

Ala

Leu

Asn V=i

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu Asp

Ser

385

390

395

400

aaa

gcg

gtt gca

ggt

tet

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

agc

ggc

aat gtt

tcg

Lys

Ala

Val Ala

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn Val

Ser

405

410

415

ccg

agc

aag gca

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc ggc

aac

Pro

Ser

Lys Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala Gly

Asn

423

425

430

aac

atc

gag act

acc

ege

aac

ggc

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc act

tcg

Asn

Ile

Glu Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ale Thr

Ser

435

440

445

atg

acc

ccg caa

ttt

tcc

agc

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg gat

gcg

Met

Thr

Pro Gin

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala Asp

Ala

450

455

4 60

ccc

act

tta acc

gtg

gat

gac

gag

ggc

gcg

tta

aat

gtc

ggc agc

aag

Pro

Thr

Leu Ser

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly Ser

Lys

465

470

475

480

gat

gcc

aac aaa

CCC

gtc

ege

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

gcc gtt

aaa

Asp

Ala

Asn Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly Val

Lys

816 ί i

i i

864 !

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1440

1488 ř ·» ti i-χ485 490 495

gag ggg gat Glu Gly Asp

gt: Val 50C

aca aac

gtc Val

gca caa ctt aaa ggt gtg

gcg Ala 510

caa Gin

aac Asn

1536

Thr

Asn

Ala

Gin 505

Leu

Lys

Gly

Val

ttg aac aac

cac

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

ege

gcg

ggt

atc

1584

Leu Asn Asn

Are

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arq

Ala

Gly

Ile

515

520

525

gcc caa gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ttg

get

cag

gcc

tat

ttg

ccc

ggc

1632

Ala Gin Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

530

535

540

aag agt atg

atg

gcg

atc

ggc

ggt

act

tat

ege

ggc

gaa

gcc

ggt

1680

Lys Ser Met

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

545

550

555

560

tac gcc atc

ggc

tac

tcg

age

att

tet

gac

act

ggg

aat

tgg

gtt

atc

1728

Tyr Ala Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

565

570

575

aag ggc acg

get

tcc

ggc

aat

tcg

ege

ggt

cat

ttc

ggt

act

tcc

gca

1776

Lys Gly Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Thr

Ser

Ala

580

585

590

tet gtc ggt

tac

cag

tgg

taa

1797

Ser Val Gly

Tyr

Gin

Trp

595 <210> 5 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 5

Met 1

Asn

Lys

Ile

Ser 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Val

Ser 20

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn 25

His

Thr

Lys

Arg

Ala 30

Ser

Ala

Thr

Val

Ala 35

Thr

Ala

Val

Leu

Ala 40

Thr

Leu

. Leu

Phe

Ala 45

Thr

Val

Gin

Ala

Asn 50

Ala

Thr

Asp

Asp 55

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu 60

Pro

Val

Gin

Arg

Thr 65

Ala

Val

Leu

Ser 70

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys 75

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu 80

Lys

Glu

Gly

Thr

Glu 85

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala 90

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu 95

Lys

Arg

Val

Leu

Lys 100

Ala

Gly

Ala

Ile

Thr 105

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp 110

Asn

Leu

Lys

Ile

Lys 115

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu 120

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn 125

Thr

Asn

Asp

Ser

Ser 130

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu 135

Lys

Asp

Leu

Thr 140

Asp

Leu

Thr

Ser

Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asň v

je

145 150 155 160

Ile	Thr	Ser	Asp	Thr Lys Gly Leu 165	Asn	Phe Ala Lys Glu Thr 170	Ala 175	Gly
Thr	Asn	Gly	Asp	Pro Thr Val His	Leu	Asn Gly Ile Gly Ser	Thr	Leu
			180		185	190
Thr	Asp	Thr	Leu	Leu Asn Thr Gly	Ala	Thr Thr Asn Val Thr	Asn	Asp
		195		200		205
Asn	Val	Thr	Asp	Asp Glu Lys Lys	Arg	Ala Ala Ser Val Lys	Asp	Val
	210			215		220
Leu	Asn	Ala	Gly	Trp Asn Ile Lys	Gly	Val Lys Pro Gly Thr	Thr	Ala
225				230		235		240
Ser	Asp	Asn	Val	Asp Phe Val Arg	Thr	Tyr Asp Thr Val Glu	Phe	Leu
				245		250	255
Ser	Ala	Asp	Thr	Lys Thr Thr Thr	Val	Asn Val Glu Ser Lys	Asp	Asn
			260		265	270
Gly	Lys	Arg	Thr	Glu Val Lys Ile	Gly	Ala Lys Thr Ser Val	Ile	Lys
		275		280		285
Glu	Lys	Asp	Gly	Lys Leu Val Thr	Gly	Lys Gly Lys Gly Glu	Asn	Gly
	290			295		300
Ser	Ser	Thr	Asp	Glu Gly Glu Gly	Leu	Val Thr Ala Lys Glu	Val	Ile
305				310		315		320
Asp	Ala	Val	Asn	Lys Ala Gly Trp	Arg	Met Lys Thr Thr Thr	Ala	Asn
				325		330	335
Gly	Gin	Thr	Gly	Gin Ala Asp Lys	Phe	Glu Thr Val Thr Ser	Gly	Thr
			340		345	350
Lys	Val	Thr	Phe	Ala Ser Gly Asn	Gly	Thr Thr Ala Thr Val	Ser	Lys
		355		360		365
Asp	Asp	Gin	Gly	Asn Ile Thr Val	Lys	Tyr Asp Val Asn Val	Gly	Asp
	370			375		380
Ala	Leu	Asn	Val	Asn Gin Leu Gin	Asn	Ser Gly Trp Asn Leu	Asp	Ser
385				390		395		400
Lys	Ala	Val	Ala	Gly Ser Ser Gly	Lys	Val Ile Ser Gly Asn	Val	Ser
				405		410	415
Pro	Ser	Lys	Gly	Lys Met Asp Glu	Thr	Val Asn Ile Asn Ala	Gly	Asn
			420		425	430
Asn	Ile	Glu	Ile	Thr Arg Asn Gly	Lys	Asn Ile Asp Ile Ala	Thr	Ser
		435		440		445
Met	Thr	Pro	Gin	Phe Ser Ser Val	Ser	Leu Gly Ala Gly Ala	Asp	Ala
	4 50			455		460
Pro	Thr	Leu	Ser	Val Asp Asp Glu	Gly	Ala Leu Asn Val Gly	Ser	Lys
465				470		475		480
Asp	Ala	Asn	Lys	Pro Val Arg Ile	Thr	Asn Val Ala Pro Gly	Val	Lys

485 490 495

D

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

500

505

510

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

515

520

525

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

530

535

540

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Giy

545

550

555

560

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

565

570

575

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Thr

Ser

Ala

580

585

590

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

595 <210> 6 <211> 1785 <212> DNA

<213> Neisseria

meningitidis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..

(1785)

<400> 6

atg

aac

aaa

ata

tac

cgc

acc

att

tgg

aat

agt

gcc

ctc

aat

gcc

tgg

48

Met

Asn

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

gtc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

96

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

gcg

acc

gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

144

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gcg

aat

gct

acc

gat

gac

gat

tta

tat

tta

gaa

CCC

gta

caa

cgc

192

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

ASp

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gin

Arg

50

55

60

act

gct

gtc

gtg

ttg

agc

ttC

cgt

tcc

gat

aaa

gaa

ggc

acg

gga

gaa

240

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Sér

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

aaa

gaa

ggt

aca

gaa

gat

tca

aat

tgg

gca

gta

tat

ttc

aac

gag

aaa

288

Lys

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

85

90

95

aga

gta

cta

aaa

gcc

gga

gca

atc

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

ctg

336

Arg

Val

Leu

Lys

Ala

Gly

Ála

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

100

105

110

aaa

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gac

agt

agc

ttc

acc

384

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Asp

Ser

Phe

Thr

115

120

125

tac

tcc

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gaa

act

gaa

432

x-n

Tyr

Ser 130

Leu

Lys

Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val

Glu

Thr GIj

135

140

aaa

tta

tcg

ttt

ggc

gca

aac

ggt

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

age

gac

480

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

145

150

155

160

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

gct

ggg

acg

aac

ggc

gac

528

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

165

170

175

ccc

acg

gtt

cat

ctg

aac

agt

atc

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

acg

ctg

576

Pro

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

180

185

190

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

624

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

195

200

205

gac

gag

aaa

cgt

gcg

gca

age

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

gca

ggc

672

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

210

215

220

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

gct

tcc

gat

aac

gtt

720

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

val

225

230

235

240

gat

ttc

gtc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

age

gca

gat

acg

768

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

245

250

255

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

816

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

260

265

270

gaa

gtt.

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

864

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

GÍy

275

280

285

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

gac

gag

aat

ggt

tet

aca

gac

912

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Asp

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

290

295

300

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

960

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

305

310

315

320

aag

gct

ggt

tgg

aga

atg

-aáa

aca

acc

gct

aat

ggt

caa

aca

ggt

1008

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

325

330

335

caa

gct

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca

aat

gta

acc

ttt

1056

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

340

345

350

gct

agt

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

1104

Ala

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

355

360

365

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

cta

aac

gtc

1152

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

370

375

380

aat

cag

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

1200

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Γ2 χϋΐ

i

385

390

395

400

ggt

tet

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

age

ggc aat

gtt

tcg

ccg

age

aag

gga

124?

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

i

405

410

415

i

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat gcc

ggc

aac

atc

gag

att

129§

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

420

425

430

acc

cgc

aac

ggt

aaa

aat

atc

gac

atc gcc

act

tcg

atg

gcg

ccg

cag

1344

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile Ala

Thr

Ser

Met

Ala

Pro

Gin

435

440

445

ttt

tcc

age

gtt

tcg

ctc

ggt

gcg

ggg gcg

gat

gcg

ccc

act

ttg

age

1392

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

450

455

4 60

gtg

gat

gac

gag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc ggc

age

aag

gat

acc

aac

aaa

1440

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val Gly

Ser

Lys

Asp

Thr

Asn

Lys

465

470

475

480

ccc

gtc

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

1488

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

485

490

495

aca

aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

1536

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

500

505

510

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

1584

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

515

520

525

gca

acc

gca

ggt

cta

gtt

cag

gcg

tat ctg

ccc

ggc

aag

agt

atg

1632

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

530

535

540

gcg

atc

ggc

gac

act

tat

cgc

ggc gaa

gcc

ggt

tac

gcc

atc

ggc

1680

Ala

Ile

Gly

Asp

Thr

Tyr

Arg

Gly Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

545

550

555

560

tac

tea

agt

att

tcc

gac

ggc

gga

aat tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

gct

1728

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

565

570

575

tcc

ggc

aat

tcg

cgc

ggc

cat

ttc

ggt gct

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

1776

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly Ala

Ser

Ala

Ser

val

Gly

Tyr

580

585

590

caa

tgg

taa

1735

Gin Trp

595 <210> 7 <211> 594 <212> PRT

<213> Neisseria meningitidis
<400> 7 Met Asn Lys Ile	Tyr Arg Ile Ile	Trp	Asn	Ser	Ala	Leu	Asn	Ala	Trp
1	5		10					15
Val Val Val Ser	Glu Leu Thr Arg	Asn	His	Thr	Lys	Arg	Ala	Ser	Ala

&

JfcťV

20

25

30

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gin

Arg

50

55

60

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

bys

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

85

90

95

Arg

Val

Leu

Lys

Ala

Gly

Ala

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

100

105

110

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Asp

Ser

Phe

Thr

115

120

125

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Glu

Thr

Glu

130

135

140

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

145

150

155

160

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

165

170

175

Pro

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

180

185

190

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

195

200

205

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

210

215

220

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

225

230

235

240

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

245

250

255

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

260

265

270

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

275

280

285

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Ásp

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

290

295

300

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

305

310

315

320

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

325

330

335

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

340

345

350

Ala

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

355

360

365

$

* < c * *

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

370

375

380

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

385

390

395

400

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

405

410

415

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

420

425

430

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Ala

Pro

Gin

435

440

445

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

450

455

4 60

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Thr

Asn

Lys

465

470

475

480

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

485

490

495

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

500

505

510

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Al a

Ile

515

520

525

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

530

535

540

Ala

Ile

Gly

Asp

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

545

550

555

560

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

565

570

575

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

580 585 590

Gin Trp <210> 8 <211> 1785 <212> DNA

<213>	Neisseria	meningitidis
<220>
<221>	CDS
<222>	(1)..<1785)
<400>	8
atg aac aaa ata	tac cgc atc att tgg aat agt gcc ctc aat gcc tag 48
Met Asn Lys Ile	Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp
1		5 10 15
gtc gcc gta tcc	gag ctc aca cgc aac cac acc aaa cgc gcc tcc gca 96
Val Ala Val Ser	Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala
	20	25 30
acc gtg gcg acc	gcc gta ttg gcg aca ctg ttg ttt gca acg gtt cag 144
Thr Val Ala Thr	Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin

XVŤ

40 45 gcg agt act acc gat gac gac gat tta

Ala	Ser 50	Thr	Thr	Asp	Asp	Asp 55	Asp	Leu
act	get	gtc	gtg	ttg	age	ttc	cgt	tcc
Thr 65	Ala	Val	Val	Leu	Ser 70	Phe	Arg	Ser
aaa	gaa	gtt	aca	gaa	gat	tea	aat	tgg
Lys	Glu	Val	Thr	Glu 85	Asp	Ser	Asn	Trp
gga	gta	cta	aca	gcc	gga	aca	atc	acc
Gly	Val	Leu	Thr 100	Ala	Gly	Thr	Ile	Thr 105
aaa	atc	aaa	caa	aac	acc	aat	gaa	aac
Lys	Ile	Lys 115	Gin	Asn	Thr	Asn	Glu 120	Asn
tac	tcg	ctg	aaa	aaa	gac	ctc	aca	gat
Tyr	Ser 130	Leu	Lys	Lys	Asp	Leu 135	Thr	Asp
aaa	tta	tcg	ttt	age	gca	aac	age	aat
Lys 145	Leu	Ser	Phe	Ser	Ála 150	Asn	Ser	Asn
acc	aaa	ggc	ttg	aat	ttc	gcg	aaa	aaa
Thr	Lys	Gly	Leu	Asn 165	Phe	Ala	Lys	Lys
acc	acg	gtt	cat	ctg	aac	ggt	atc	ggt
Thr	Thr	Val	His 180	Leu	Asn	Gly	Ile	Gly 185
ctg	aat	acc	gga	gcg	acc	aca	aac	gta
Leu	Asn	Thr 195	Gly	Ala	Thr	Thr	Asn 200	Val
gac	gag	aaa	aaa	cgt	gcg	gca	age	gtt
Asp	Glu 210	Lys	Lys	Arg	Ala	Ála 215	Ser	Val
tgg	aac	att	aaa	ggc	gtt	aaa	ccc	ggt
Trp 225	Asn	Ile	Lys	Gly	Val 230	Lys	Pro	Gly
gat	ttc	gtc	ege	act	tac	gac	aca	gtc
Asp	Phe	Val	Arg	Thr 245	Tyr	Asp	Thr	Val
aaa	aca	acg	act	gtt	aat	gtg	gaa	age
Lys	Thr	Thr	Thr 2 60	Val	Asn	Val	Glu	Ser 265
gaa	gtt	aaa	atc	ggt	gcg	aag	act	tet
Glu	Val	Lys 275	Ile	Gly	Ala	Lys	Thr 2Θ0	Ser
aag	ttg	gtt	act	ggt	aaa	gac	aaa	ggc
Lys	Leu 290	Val	Thr	Gly	Lys	Asp 295	Lys	Gly

tat Tyr	tta Leu	gaa Glu 60	ccc gta	caa Gin	ege Arg	192
Pro	Val
gat	aaa	gaa	ggc	acg	gga	gaa	240
Asp	Lys 75	Glu	Gly	Thr	Gly	Glu 90
gga	gta	tat	ttc	gac	aag	aaa	288
Gly 90	Val	Tyr	Phe	Asp	Lys 95	Lys
ctc	aaa	gcc	ggc	gac	aac	ctg	336
Leu	Lys	Ala	Gly	Asp 110	Asn	Leu
acc	aat	gcc	agt	age	ttc	acc,	384
Thr	Asn	Ala	Ser 125	Ser	Phe	Thr
ctg	acc	agt	gtt	gga	act	gaa	432
Leu	Thr	Ser 140	Val	Gly	Thr	Glu
aaa	gtc	aac	atc	aca	age	gac	480
Lys	Val 155	Asn	Ile	Thr	Ser	Asp 160
acg	get	gag	acc	aac	ggc	gac	528
Thr 170	Ala	Glu	Thr	Asn	Gly 175	Asp
tcg	act	ttg	acc	gat	acg	ctg	576
Ser	Thr	Leu	Thr	Asp 190	Thr	Leu
acc	aac	gac	aac	gtt	acc	gat	62 4
Thr	Asn	Asp	Asn 205	Val	Thr	Asp
aaa	gac	gta	tta	aac	gca	gcc	672
Lys	Asp	Val 220	Leu	Asn	Ala	GÍy
aca	aca	get	tcc	gat	aac	gtt	720
Thr	Thr 235	Ala	Ser	Asp	Asn	Val 240
gag	ttc	ttg	age	gca	gat	acg	768
Glu 250	Phe	Leu	Ser	Ala	Asp 255	Thr
aaa	gac	aac	ggc	aag	aga	acc	616
Lys	Asp	Asn	Gly	Lys 270	Arg	Thr
gtt	atc	aaa	gaa	aaa	gac	ggt	864
Val	Ile	Lys	Glu 285	Lys	Asp	Gly
gag	aat	aat	tet	tet	aca	gac	912
Glu	Asn	Asp	Ser	Ser	Thr	Asp

300

zvři

^Γ- r i i i i 1

aaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

i 960 !

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

305

310

315

320

1 1

aag

gct

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

gct

aat

ggt

caa

aca

ggt

1008

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

325

330

335

caa

gct

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tca

ggc

aca

aat

gta

acc

ttt

1056

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

340

345

350

gct

agt

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

1104

Ala

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

355

360

365

aac

atc

act

gtt

atg

tat

gat

gta

aat

qtc

ggc

gat

gcc

cta

aac

gt=

1152

Asn

Ile

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

370 375 380

aat Asn 385

cag ctg caa

aac agc ggt Asn Ser Gly 390

tgg aat

ttg gat Leu Asp 395

tcc Ser

aaa Lys

gcg gtt

gca Ala 400

1200Í

Gin

Leu Gin

Trp

Asn

Ala

Val

ggt

tet

tcg ggc

aaa

gtc

atc

agc

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

agc

aag

gga

1248

Gly

Ser

Ser Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

405

410

415

i I

aag

atg

gat gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

1 1296

Lys

Met

Asp Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

420

425

430

acc

cgc

aac ggc

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

atg

acc

ccg

caa

1344

Thr

Arg

Asn Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

435

440

445

ttt

tcc

agc gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

tta

agc

1392

Phe

Ser

Ser Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

450

455

4 60

gtg

gat

gac gag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

gat

gcc

aac

aaa

1440

Val

Asp

Asp Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

465

470

475

480

ccc

gtc

cgc att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

1488

Pro

Val

Arg Iie

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly Asp

Val

485

490

495

aca

aac

gtc gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cac

1536

Thr

Asn

Val Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

His

5C0

505

510

atc

gac

aat gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

1584

Ile

Asp

Asn Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

515

520

525

gca

acc

gca ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ctg

ccc

ggc

aag

agt

atg

1632

Ala

Thr

Ala Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

530

535

54 0

gcg atc ggc ggc ggc Ala Ile Gly Glv Gly 54 5 act tat cgc ggc gaa Thr Tyr Arg Gly Glu 550 gcc ggt tat gcc Ala Gly Tyr Ala 55S atc ggc 1680 Ile Gly

560 i

xvřli

tac

tca

age

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

acg

get

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

565

570

575

tcc

ggc

aat

tcg

ege

ggc

cat

ttc

ggt

get

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

580

585

590

cag

tgg

taa

1728

1776

1785

Gin Trp

595 <210> 9 <211> 594 <212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 9

Met

Asn

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

Val

Ala

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Ala

Ser

Thr

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gin

Arg

50

55

60

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

Lys

Glu

Val

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Gly

Val

Tyr

Phe

Asp

Lys

85

90

95

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Gly

Thr

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

100

105

110

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Ala

Ser

Phe

Thr

115

120

125

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

130

135

140

Lys

Leu

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

Ser

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Šer

Asp

145

150

155

160

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Thr

Ala

Glu

Thr

Asn

Gly

Asp

165

170

175

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

180

185

190

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

195

200

205

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

210

215

220

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

225

230

235

240

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr

J7

XtX

24S 250 255

Lys Thr Thr Thr

Val Asn

Val

Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg

Thr

260

265

270

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

275

280

285

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys

Gly

Glu

Asn

Asp

Ser

Thr

Asp

290

295

300

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn !

305

310

315

320 i

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

325

330

335

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

340

345

350

Ala

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

355

360

365

Asn

Ile

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

370

375

380

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

385

390

395

400

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

405

410

415

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Iie

42C

425

430

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

435

440

445

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

450

455

460

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

4 65

470

475

480 ί

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val |

485

490

495

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

His

500

505

510

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

515

520

525

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

530

535

540

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

545

550

555

560

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

565

570

575

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

530

585

590

Gin Trp <210> 10 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1)..(1776) <400> 10

atg Met 1

aac Asn

gaa Glu

ata Ile

ttg Leu 5

cgc atc att

tgg aat agc

gcc Ala

ctc aat gcc Leu Asn Ala 15

tgg Trp

48

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

gtc

gtt

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

96

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta

ttg

gcg

act

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

144

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gca

agt

gct

aac

aat

gaa

gag

caa

gaa

gat

tta

tat

tta

gac

ccc

192

Ala

Ser

Ala

Asn

Glu

Gin

Glu

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

50

55

60

gtg

cta

cgc

act

gtt

gcc

gtg

ttg

ata

gtc

aat

tcc

gat

aaa

gaa

ggc

240

Val

Leu

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Leu

Ile

val

Asn

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

65

70

75

80

acg

gga

gaa

aaa

gaa

aaa

gta

gaa

aat

tca

gat

tgg

gca

gta

tat

288

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

Tyr

85

90

95

ttc

aac

gag

aaa

gga

gta

cta

aca

gcc

aga

gaa

atc

acc

ctc

aaa

gcc

336

Phe

Asn

Glu

Lys

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

100

105

110

ggc

gac

aac

ctg

aaa

atc

aaa

caa

aac

ggc

aca

aac

ttc

acc

tac

tcg

384

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe

Thr

Tyr

Ser

115

120

125

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gga

act

gaa

aaa

tta

432

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

Lys

Leu

130

135

140

tcg

ttt

agc

gca

aac

ggc

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

agc

gac

acc

aaa

480

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

145

150

155

160

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

gct

ggg

acg

aac.

ggc

gac

acc

acg

528

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

165

170

175

gtt

cat

ctg

aac

ggt

att

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

acg

ctg

aat

576

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

180

185

190

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

624

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

195

200

205

r r 9 ^r f * r

(oO

aaa

cat

gcg

gca

age

gtt

aaa

gac gta

tta

aac

get

ggc

tgg

aac

í 672

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

aca get

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

72θ'

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Thr Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

i |

225

230

235

24 0

!

gtc

ege

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc ttg

age

gca

gat

acg

aaa

aca

7 68

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

•

245

250

255

!

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

816

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

!

260

265

270

i

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

i 864

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

280

285

!

gtt

act

ggt

aaa

gac

aaa

ggc

gag

aat ggt

tet

aca

gac

gaa

ggc

i 912 ί

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys

Gly

Glu

Asn Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

290

295

300

!

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg att

gat

gca

gta

aac

aag

get

960

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

305

310

315

320

•

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

get aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

get

íooé

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

i

325

330

335

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc aca

aat

gta

acc

ttt

get

agt

105Ó

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly Thr

Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

ί

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

1104

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser Lys

Asp Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

í

355

360

365

i i

act

gtt

atg

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc gat

gcc

cta

aac

gtc

aat

cag

1152:

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

!

370

375

380

i

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

1 1200

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

ί

385

390

395

400

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

age

ggc

aat

gtt tcg

ccg

age

aag

gga

aag

atg

1248

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc aac

aac

atc

gag

att

acc

ege

1296;

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly Asn

Asň

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

i

420

425

430

:

aac

ggt

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act tcg

atg

acc

ccg

cag

ttt

tcc

1344

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

age

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat gcg

ccc

act

ttg

age

gtg

gat

1392^

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

i

450

455

4 60

ggg

gac

gca

ttg

aat

gtc

ggc

age

aag aag

gac

aac

aaa

ccc

gtc

ege

1440

I r r

* 1 xx±l

1- Γ

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys Lys

Asp

Asn

Lys

?ro

Val

Arg

465

470

475

4 30

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa gag

ggg

gat

gtt

aac

gtc

1488

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

485

490

495

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

aac ttg

aac

cgc

5LC

gac

aat

1536

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn Leu

Asn

Arg

íie

Asp

Asn

500

505

510

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc gcc

caa

gcg

att

CCd

acc

gca

1584

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

515

520

525

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ttg

CCC

ggc aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

1632

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly Lys

Ser

Met

Ile

Gly

530

535

540

ggc

act

tat

cgc

ggc

gaa

gcc

ggt tac

gcc

atc

ggc

tac

tcc

agt

1680

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

545

550

555

560

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

atc aaa

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

1728

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Ile Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

565

570

575

tcg

cgc

ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

1776

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

590

<210> 11 <211> 591 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 11

Met 1

Asn

Glu

Ile

Leu 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Val

Ser 20

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn 25

His

Thr

Lys

Arg

Ala 30

Ser

Ala

Thr

Val

Lys 35

Thr

Ala

Val

Leu

Ala 40

Thr

Leu

Phe

Ala 45

Thr

Val

Gin

Ala

Ser 50

Ala

Asn

Glu

Glu 55

Gin

Glu

Asp

Leu 60

Tyr

Leu

Asp

Pro

Val 65

Leu

Arg

Thr

Val

Ala 70

Val

Leu

Ile

Val

Asn 75

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly 80

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu 85

Lys

Val

Glu

Asn 90

Ser

Asp

Trp

Ala

Val 95

Tyr

Phe

Asn

Glu

Lys 100

Gly

Val

Leu

Thr

Ala 105

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu 110

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn 115

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin 120

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe 125

Thr

Tyt

Ser

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu 130 135 140 χχ·i i i

Ser 145

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly Asn Lys 150

Val

Asn

Ile 155

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys ; 160

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

Thr i

165

170

175

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn ;

180

185

190

ί

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

195

200

205

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

225

230

235

240

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

255

i

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

270

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

280

285

Val

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

290

295

300

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

305

310

315

320

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

325

330

335

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

355

360

365

Thr

Vaí

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

370

375

380

i

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

400

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

420

425

430

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

450 455 460

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

465

470

475

480

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

435

490

495

DS p r f f rr r /· p Γ Γ r- r p r· r· r r r f

P r · Γ P

ČS G ^r ' xxřv

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Zisr.

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

500

505

510

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

A_ 3

Tnr

Ala

515

520

525

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

H-. Q

Ile

Gly

530

535

540

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

545

550

555

560

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

565

570

575

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

550

<210> 12 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> <1).. 1797) <400> 12

atg Met 1

aac Asn

aaa Lys

ata Ile

tac cgc atc att

tgg Trp

aat Asn 10

agt Ser

gcc Ala

ctc Leu

Asn

gcc Ala 15

tgg Trp

48

Tyr Arg 5

Ile

gtc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

96

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

acc

gtg

gcc

acc

gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

144

Thr

val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gcg

aat

gct

acc

gat

gac

gat

tta

tat

tta

gaa

CCC

gta

caa

cgc

192

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Leu

Tyr

Leu

Glu

Pro

Val

Gin

Arg

50

55

60

act

gct

gtc

gtg

ttg

agc

ttc

cgt

tcc

gat

aaa

gaa

ggc

acg

gga

gaa

240

Thr

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Arg

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

Thr

Gly

Glu

65

70

75

80

aaa

gaa

ggt

aca

gaa

gat

tca

aat

tgg

gca

gta

tat

ttc

cac

gag

aaa

288

Lys

Glu

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

Asn

Trp

Ala

Val

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

85

90

95

aga

gta

cta

aaa

gcc

gga

gca

atc

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

ctg

336

Arg

Val

Leu

Lys

Ala

Gly

Ala

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

100

105

110

aaa

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

33t

gaa

aac

acc

aat

gac

384

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Asp

115

120

125

agt

agc

ttc

acc

tac

tcc

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

432

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

130 135 140 j«tv

gtt

gaa

act

gaa

aaa

tta

tcg

ttt

ggc

gca

aac

ggt

aat aaa

gtc

aac

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asr.

Gly

Asn lys

Val

Asn

145

150

'155

160

atc

aca

agc

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa acg

gct

agq

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu Thr

Ala

Gly

165

170

17<

acg

aac

ggc

gac

ccc

acg

gtt

cat

ctg

aac

ggt

atc

ggt tcg

act

ttg

Thr

Asn

Gly

Asp

Pro

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly Ssr

Thr

Leu

180

185

-90

acc

gat

acg

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta acc

aac

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val Thr

Asn

Asp

195

200

205

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

aaa

cgt

gcg

gca

agc

gtt aaa

gac

gta

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

Lys

Arg

Ala

Ser

Val Lys

Asp

Val

210

215

220

tta

aac

gca

ggc

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt aca

aca

gct

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly Thr

Thr

Ala

225

230

235

240

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

atc

ege

act

tac

gac

aca

gtc cag

ttc

ttg

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val Glu

Phe

Leu

245

250

255

agc

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

agc aaa

gac

aac

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser Lys

Asp

Asn

260

265

270

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aac

act

tet gtt

att

aaa

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser Val

Ile

Lys

275

280

285

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

gac cag

aat

ggt

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Asp Glu

Asn

Gly

290

295

300

tet

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa gaa

gtg

att

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Th::

Ala

Lys Glu

Val

Ile

305

310

315 t

320

gat

gca

gta

aac

aag

gct

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

aca acc

gct

aat

Asp

Ala

Val

Asn.

.Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Thr Thr

Ala

Asn

325

330

335

ggt

caa

aca

ggt

caa

gct

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca tea

ggc

aca

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Ťhr

Val

Thr Ser

Gly

Thr

340

345

350

aaa

gta

acc

ttt

gct

agt

ggt

aat

ggt

aca

1 act

gcg

act gta

agt

aaa

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

Thr

Thř

Ala

Thr Val

Ser

Lys

355

360

365

gat

caa

ggc

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat gtc

ggc

gat

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn Val

Gly

Asp

370

375

380

gcc

cta

aac

gtc

aat

cag

ctg

caa

aac

agc

ggt

tgg

aat ttg

gat

tcc

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn Leu

Asp

Ser

385

390

395

400

80

523

576

62-1

672

72Q

6£

816

864

912

96C

1008

1056

1104

1152

1200 xxvi

aaa Lys

gcg gtt

cca Ala

ggt Gly 405

tet Ser

tcg Ser

ggc aaa

gtc atc agc ggc aat

gtt Val 415

tcg Ser

1248

Ala

Val

Gly

Lys

Val 410

Ile

Ser

Gly

Asn

ccg

agc

aag

ega

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

1296

Pro

Sér

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

420

425

4 30

aac

atc

gag

att

acc

CQC

aac

ggc

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

134 4

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

435

440

445

atg

acc

ccg

caa

ttt

tcc

agc

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

1392

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

450

455

460

ccc

act

tta

agc

gtg

gat

gac

gag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

1440

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

4 65

470

475

480

gat

gcc

aac

aaa

ccc

gtc

ege

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

14 68

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

485

490

4 95

gag

ggg

gat

gtt

aca

doC

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggt

gtg

gcg

caa

aac

1536

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

500

505

510

ttg

aac

ege

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

ege

gcg

ggt

atc

1584

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

515

520

525

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ttg

get

cag

gcg

tat

ttg

ccc

ggc

1632

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

530

535

540

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

ggt

act

tat

ege

ggc

gaa

gcc

ggt

1680

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

545

550

555

560

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcg

agc

att

tet

gac

act

ggg

aat

tgg

gtt

atc

1728

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

565

570

575

aag

ggc

acg

get

tcc

ggc

aat

tcg

ege

ggc

cat

ttc

ggt

get

tcc

gca

1776

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

580

585

590

tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

1797

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

595 <210> 13 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 13

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

x-Kvi-á-i

Ala 385

Leu Asn Val

Asn Gin Leu 390

Gin

Asn

Ser Gly 395

Trp Asn Leu

Asp

Ser 400

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

405

410

415

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

420

425

4 30

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

435

440

445

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

4 50

455

460

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

465

470

475

480

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

485

490

495

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

500

505

510

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

515

520

525

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

530

535

540

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

545

550

555

560

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

565

570

575

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

590

585

590

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

595 <210> 14 <211> 1800 <212> DNA

<213>	Neisseria	meningitidis
<220>
<221>	CDS
<222>	(1)..(1800)
<400>	14
atg aac aaa ata	tac cgc atc att tgg aat agt gcc ctc aat ccc tgg
Met Asn Lys Ile	Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp
1		5 10 15 ’
gtc gcc gta tcc	gag ctc aca cgc aac cac acc aaa cgc gcc ccc gca
Val Ala Val Ser	Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala
	20	25 30
acc gtg aag acc	gcc gta ttg gcg acg ctg ttg ttt gca acg ctt cag
Thr Val Lys Thr	Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin

40 45

144

6Ϊ

gcg

aat

gct

acc

gat

gaa

aat

gaa

gag

tta

gaa

CCC

gta

Ala

Asn 50

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp 55

Glu

Leu 60

Glu

Pro

Val

cgc

tet

gct

ctg

gtg

ttg

caa

ttc

atg

atc

gat

aaa

gaa

ggc

aat

gga

Arg 65

Ser

Ala

Leu

Val

Leu 70

Gin

Phe

Met

Ile

Asp 75

Lys

Glu

Gly

As.t

Gly 8 6

gaa

aac

gaa

tet

aca

gga

aat

ata

ggt

tgg

agt

ata

tat

tac

gac

aať.

Glu

Asn

Glu

Ser

Thr 85

Gly

Asn

Ile

Gly

Trp 90

Ser

Ile

Tyr

Asp 9 =

Asn

cac

doC

act

cca

cac

ggc

gca

acc

gtt

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

His

Asn

Thr

Leu 100

His

Gly

Ala

Thr

Val 105

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly 110

Asp

Asr.

ctg

aaa

atc

aaa

caa

aac

acc

aat

aaa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

Leu

Lys

Ile 115

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn 120

Lys

Asn·

Thr

Asn

Glu 125

Asn

Thr

Asr.

gac

agt

age

ttc

acc

tac

tcg

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

Asp

Ser 130

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser 135

Leu

Lys

ASp

Leu 140

Thr

Asp

Leu

Thr

agt

gtt

gaa

act

gaa

aaa

tta

tcg

ttt

ggc

gca

aac

ggc

aat

aaa

gtc

Ser 145

Val

Glu

Thr

Glu

Lys 150

Leu

Ser

Phe

Gly

Aia 155

Asn

Gly

Asn

Lys

Val 16C

aac

atc

aca

age

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

ttc

gcg

aaa

gaa

acg

gct

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp 165

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn 170

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr 175

Ala

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

gtt

cat

ctg

aac

ggt

att

ggt

tcg

act

Gly

Thr

Asn

Gly 180

Asp

Thr

Val

His 185

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly 190

Ser

Thr

ttg

acc

gat

acg

ctg

aat

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

Leu

Thr

Asp 195

Thr

Leu

Asn

Thr 200

Gly

Ala

Thr

Asn 205

Val

Thr

Asn

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

aag

aaa

cgt

gcg

gca

age

gtt

aaa

gac

Asp

Asn 210

Val

Thr

Asp

Lys 215

Lys

Arg

Ala

Ala 220

Ser

Val

Lys

Asf?

gta

tta

aac

gca

ggc

tgg

aac

att

aaa

ggc

gtt

aaa

CCC

ggt

aca

Val 225

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp 230

Asn

Ile

Lys

Gly

Val 235

Lys

Pro

Gly

Thr

Thr 24 0

gct

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

gtc

cac

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

Ala

Ser

Asp

Asn

Val 245

Asp

Phe

val

His

Thr 250

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu 255

Phe

ttg

age

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

Leu

Ser

Ala

Asp 260

Thr

Lys

Thr

Thr 265

Val

Asn

Val

Glu

Ser 270

Lys

Asp

aac

ggc

aag

aga

acc

gaa

gtt

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

Asn

Gly

Lys 275

Arg

Thr

Glu

Val

Lys 280

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr 285

Ser

Val

Ile

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

ggc

gag

aat

Lys

Glu 290

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu 295

Val

Thr

Gly i

Lys

Gly 300

Lys

Gly

Glu

Asr.

: 1)92

240

289

336

384

432

30

528

5*76

624

672

7Ž0

68 ' I ' i

I

I : I

8.6

864

912 ·· ·· ř .· pí c ^r ♦ · p r r r xx-x

ggt

tet

aca

gac

gaa

ggc

gaa

ggc

tta

gtg

act

. gca

i aaa

gaa gtg

960

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

i Lys

Glu Val

305

310

315

320

att

gat

gca

gta

aac

aag

get

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc get

1008

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Thr Ala

325

330

335

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

get

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea ggc

1056

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser Gly

340

345

350

aca

aat

gta

acc

ttt

get

agt

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta agt

1104

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val Ser

355

360

365

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc ggc

1152

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val Gly

370

375

380

gat

gcc

cta

aac

gtc

aat

cag

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg gat

1200

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu Asp

385

390

395

400

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

age

ggc

aat gtt

1248

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Sér

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn Val

405

410

415

tcg

ccg

age

aag

gga

aag

atg

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc ggc

1296

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala Gly

420

425

430

aac

atc

gag

att

acc

ege

aac

ggt

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc act

1344

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

ASn

Ile

Asp

Ile

Ais Thr

435

440

445

tcg

atg

acc

ccg

cag

ttt

tcc

age

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg gat

1392

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala Asp

450

455

4 60

gcg

ccc

act

ttg

age

gtg

gat

gac

aag

ggc

gcg

ttg

aat

gtc

ggc age

1440

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Lys

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly Ser

465

470

475

480

aag

gat

gcc

aac

aaa

ccc

gtc

ege

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc gtt

1488

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

val

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly Val

485

490

495

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg caa

1536

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala Gin

500

505

510

aac

ttg

aac

ege

atc

gac

aat

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

acc ggc

1584

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Álš Gly

515

520

525

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ctg ccc

1632

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu Pro

530

535

540

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

act

tat

ege

ggc

gaa gcc

1680

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Giu Ala

545

550

555

560

ggt

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcc

agt

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg att

1728

• e

1776 e *· * * *· ^r

Gly Tyr

X7CXÍ

flsp Gly

Gly

Asn Trp Jle 57‘

Ala

Ile

Gly 565

Tyr Ser

Ser

Ile Ser 570

atc

aaa

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

tcg ege

gct

cat

ttc

ggt

gct

t cc

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

580

585

590

gca

tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

595 600

1800 <210> 15 <211> 599 <212> PRT

<213> Neisseria

meningitidis

<400> 15

Met

Asn

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Trp

Asn

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala

Trp

1

5

10

15

Val

Ala

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

?hr

Lys

Are

Al i

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Glr.

35

40

45

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp

Glu

Leu

Glu

Pro

Val

50

55

60

Arg

Ser

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Phe

Met

Ile

Asp

Lys

Glu

Gly

Asn

Gly

65

70

75

80

Glu

Asn

Glu

Ser

Thr

Gly

Asn

Ile

Gly

Trp

Ser

Ile

Tyr

Asp

Asn

85

90

95

His

Asn

Thr

Leu

His

Gly

Ala

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

100

105

110

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Lys

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

115

120

•

125

Asp

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

130

135

140

Ser

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

145

150

155

160

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

165

170

175

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

180

185

190

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

195

200

205

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Lys

Arg

?\la

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

210

215

220

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

225

230

235

240

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

Val

His

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

245

250

255

D9 • r λ e * re . e c r r •e* f » « r f f x-xx-ii

Leu

Ser

Ala

Asp 2 60

Thr

Lys

Thr

Thr 265

Val

Asn

Val

Glu

Ser 2?C-

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys 275

Arg

Thr

Glu

Val

Lys 280

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr 285

Ser

Val

Ile

Lys

Glu 290

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu 295

Val

Thr

Gly

Lys

Gly 300

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly 305

Ser

Thr

Asp

Glu 310

Gly

Glu

Gly

Leu

Val 315

Thr

Ala

Lys

Glu

Val 320

Ile

Asp

Ala

Val

Asn 325

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg 330

Met

Lys

Thr

Thr 335

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr 340

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys 345

Phe

Glu

Thr

Val

Thr 350

Ser

Gly

Thr

Asn

Val 355

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly 360

Lys

Gly

Thr

Ala 365

Thr

Val

Ser

Lys

Asp 370

Asp

•Tin

Gly

Asn

Ile 375

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp 380

Val

Asn

Val

Gly

Asp 385

Ala

Leu

Asn

Val

Asn 390

Gin

Leu

Gin

Asn

Ser 395

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp 400

Ser

Lys

Ala

Val

Ala 405

Gly

Ser

Gly

Lys 410

Val

Ile

Ser

Gly

Asn 415

Val

Ser

Pro

Ser

Tys 420

Gly

Lys

Met

Asp

Glu 425

Thr

Val

Asn

Ile

Asn 430

Ala

Gly

Asn

Ile 435

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn 440

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp 445

Ile

Ala

Thr

Ser

Met 4 50

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser 455

Ser

Val

Ser

Leu

Gly 4 60

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala 465

Pro

Thr

Leu

Ser

Val 470

Asp

Lys

Gly

Ala 475

Leu

Asn

Val

Gly

Ser 480

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys 485

Pro

Val

Arg

Ile

Thr 490

Asn

Val

Ala

Pro

Gly 4 95

Val

Lys

Glu

Gly

Asp 500

Val

Thr

Asn

Val

Ala 505

Gin

Leu

Lys

Gly

Val 510

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn 515

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn 520

Val

Asp

Gly

Asn

Ala 525

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala 530

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr 535

Ala

Gly

Leu

Val

Gin 540

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly 545

Lys

Ser

Met

Ala 550

Ile

Gly

Thr 555

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala 560

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly 565

Tyr

Ser

Ile

Ser 570

Asp

Gly

Asn

Trp 575

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

580 585 590

Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp

I • ·

7Zxxxi i i

595 <210> 16 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1, . . (1779, <400> 16

atg

aac

33 a

ata

tac

cgc

atc

att

tgg

aat

agt

gcc

ctc

aat

gcc

tgg

Met 1

Asn

Lys

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

gtc

gcc

gta

tcc

gag

ctc'

* aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Ala

Val

Ser 20

Glu -J

Leu

Thr

Arg

Asn 25

His

Thr

Lys

Arg

Ala 30

Ser

Ala

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cac

Thr

Val

Lys 35

Thr

Ala

Val

Leu

Ala 40

Thr

Leu

Phe

Ala 45

Thr

Val

Glň

gcg

aat

gct

acc

gat

gaa

gat

gaa

gag

tta

gaa

tcc

gta

caa

Ala

Asn 50

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp 55

Glu

Leu 60

Glu

Ser

Val

Glr.

cgc

tet

gtc

gta

ggg

age

att

caa

gcc

agt

atg

gaa

ggc

age

gtc

gaa

Arg 65

Ser

Val

Gly

Ser 70

Ile

Gin

Ala

Ser

Met 75

Glu

Gly

Ser

Val

Glu 80

ttg

gaa

acg

ata

tea

tta

tea

atg

act

aac

gac

age

aag

gaa

ttt

gta

Leu

Glu

Thr

Ile

Ser 85

Leu

Ser

Met

Thr

Asn 90

A-sp

Ser

Lys

Glu

Phe 95

Val

gac

cca

tac

ata

gta

gtt

acc

ctc

aaa

jcc

ggc

gac

aac

ctg

aaa

atc

Asp

Pro

Tyr

Ile 100

Val

Thr

Leu

Lýs 105

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu 110

Lys

Ile

aaa

caa

aac

acc

aat

gaa

aac

acc

aat

gcc

agt

age

ttc

acc

tac

tcg

Lys

Gin

Asn 115

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr 120

Asn

Ala

Ser

Phe 125

Thr

Tyr

Ser

ctg

aaa

gac

ctc

aca

ggc

ctg

atc

aat

gtt

gaa

act

gaa

aaa

tta

Leu

Lys 130

Lys

Asp

Leu

Thr

Gly 135

Leu

Ile

Asn

Val

Glu 140

Thr

Glu

Lys

Leu

tcg

ttt

ggc

gca

aac

ggc

aag

aaa

gtc

aac

atc

ata

age

gac

acc

aaa

Ser 145

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly 150

Lys

Val

Asn

Ile 155

Ile

Ser

Asp

Thr

Lys 160

ggc

ttg

aat

ttc

gcg

aaa

gaa

acg

gct

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala 165

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly 170

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr 175

Thř

gtt

cat

ctg

aac

ggt

atc

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

atg

ctg

Val

His

Leu

Asn 180

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr 185

Leu

Thr

Asp

Met

Leu 190

Leu

Asn

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

Thr

Gly

Ala ¹⁵⁵

Thr

Asn

Val

Thr 200

Asn

Asp

Asn

Val

Thr 205

Asp

Giu

144

192

288

336

384

432

480

528

576

624

240

I • · f Γ

^3 X4«rtV

Λ - -

aaa

cgt

gcg

gca

agc

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

gca

ggc

tgg

3ÓC

672

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Le-

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

get

tce

gat

aac

gtt

gat

ttc

720

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

225

230

·>- =.

240

gtc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

agc

aca

gat

acg

3có

aca

768

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

255

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

agc

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

816

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Giy

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

270

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ctg

864

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

280

285

gtt

act

ggt

aaa

ggc

aaa

ggc

gag

aat

ggt

tet

aca

gac

aaa

ggt

912

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

ciy

290

295

300

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

3óC

get.

960

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asc

Ala

Val

Ašn

Lys

Ala

305

310

315

320

ggt

tgg

aga

atg

aaa

aca

acc

get

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

get

1008

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Ašn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

325

330

335

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca

aaa

gta

acc

ttt

get

agt

1056

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

ggt

aat

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

1104

Gly

Asn

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin Gly

Asn

Iie

355

360

365

act

gtt

aag

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

cta

aac

gtc

aat

cag

1152

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

370

375

380

ctg

caa

aac

agc

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

gat

tet

1200

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

355

400

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

agc

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

agc

aag

gga

aac

atc

1248

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Ašn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

acc

cgc

1296

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

420

425

430

aac

ggc

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

atg

acc

ccg

caa

ttt

tcc

1344

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

agc

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

CCC

act

tta

agc

gtg

gat

1392

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

450

455

4 60

gac gag ggc gcg ttg aat gtc ggc agc aag gat gcc aac aaa ccc gtc 1440

1488 rt

JttWV

Asp Glu 465

Gly

Ala

Leu Asr. 47 3

Val

Gly

Ser

Lys Asp Ala 475

Asn

Lys

Pro

Val 4 GC

cgc

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

Arg

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asr.

485

490

4 95

gtc

gcg

caa

ctt

aaa

gg-

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

atc

gac

Val

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

500

505

510

aat

gtg

aac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

Asn

Val

Asn

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

515

520

525

gca

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ctg

CCC

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

530

535

540

ggc

act

tat

ctc

ggc

gaa

gcc

ggt

tat

gcc

atc

ggc

tac

tea

Gly

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Ala

Gly

Ťyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

545

550

555

56'.’

agc

att

tcc

gcc

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa

ggc

a cg

gct

tcc

ggc

Ser

Ile

Ser

Ala

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gi y

565

570

57 5

aat

tcg

cgc

ggc

cat

tcc

ggt

gct

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

cag

cgc

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

590

taa

1536

1584

I

I ; i

4:632 i

1680

1728

1776 :1779 <210> 17 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 17

Met 1

Asn

Lys

Ile Tyr Arg 5

Ile Ile

Trp Asn Ser 10

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Tr?

Val

Ala

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

i Ala

20

25

30

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

i Glh :

35

40

45

I

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp

Glu

Leu

Glu

Ser

Val

: 1 Gin ;

50

55

60

Arg

Ser

Val

Gly

Ser

Ile

Gin

Ala

Ser

Met

Glu

Gly

Ser

Val

GlU

65

70

75

e·:

Leu

Glu

Thr

Ile

Ser

Leu

Ser

Met

Thr

Asn

Asp

Ser

Lys

Glu

Phe

Val

85

90

95

Asp

Pro

Tyr

Ile

Val

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

100

105

110

Lys

Gin

Asn

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Asn

Ala

Ser

Phe

Thr

Tyr

Ser

115

120

125

r <* r · * tr r r <- eerr e r _r - e e r r r r .- - r· e r r r<-c x-x*vi r -

Leu Lys

Lys

Asp Leu Thr

Gly 135

Leu

Ile

Asn Val

Glu 140

Thr

Glu

Lys

Leu

130

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly

Lys

Val

Asn

IJe

Ile

Ser

Asp

Thr

Lys

145

150

155

160

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

165

170

175

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Met

Leu

Asn

180

185

190

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Asp

Glu

195

200

205

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

225

230

235

240

Vsi

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

255

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Sér

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

270

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Šer

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

280

285

Val

Thr

Gly

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

290

295

300

Glu

Gly

Leu

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

305

310

315

320

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

325

330

335

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Set

Gly

Thr

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

Gly

Asn

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

355

360

365

Thr

Val

Lys

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

370

375

-

380

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

400

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

420

425

430

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

450

455

460

Asp

Glu

Gly

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

4 65

470

475

48C

Arg	ile Thr	Asn	Val 485	Ί4 X*JW-Í	i Glu	Gly	Asp	r Va)	ř < Thr 495	Asn
Ala	Pro Gly Val Lys 490
Val	Ala Gin	Leu 500	Lys	Gly	Val Ala Gin Asn 505	Leu	Asn	Asn	Arg 510	Ile	Asp
Asn	Val Asn 515	Gly	Asn	Ala	Arg Ala Gly Ile 520	Ala	Gin	Ala 525	Ile	Ala	Thr
Ala	Gly Leu 530	Val	Gin	Ala	Tyr Leu Pro Gly 535	Lys	Ser 540	Met	Met	Ala	Ile
Gly 54 5	Gly Gly	Thr	Tyr	Leu 550	Gly Glu Ala Gly	Tyr 555	Ala	Ile	Gly	Tyr	Ser 560
Ser	Ile Ser	Ala	Gly 565	Gly	Asn Trp Ile Ile 570	Lys	Gly	Thr	Ala	Ser 575	Gly
Asn	Ser Arg	Gly	His	Phe	Gly Ala Ser Ala	Ser	Val	Gly	Tyr	Gin	Trp

530 585 590 <210> 18 <211> 1770 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1) . . (1770) <400> 18

atg Met 1

aac aaa Asn Lys

ata Ile

tac cgc atc att

tgg aat agt

gcc Ala

ctc Leu

aat Asn

gcc Ala 15

tgg Trp

48· i

Tyr Arg 5

Ile

Trp

Asn 10

Ser

gta

gtc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac'

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

96

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

i

20

25

30

i i ί

acc

gtg

gcg

acc

gcc

gta

ttg

gcg

aca

ctg ctg

tcc

gca

acg

gtt

cag

14ÍS

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Val

Gin

: 1

25

40

45

; 1

gcg

aat

get

acc

gat

acc

gat

gaa

gat

gaa

gag

tta

gaa

tec

gta

gca

192

Ala

Asn

Ala

Thr

Asp

Thr

Asp

Glu

Asp

Glu

Leu

Glu

Ser

Val

Ala

50

55

60

cgc

tet

get

ctg

gtg

ttg

caa

ttc

atg

atc

gat

aaa

gaa

ggc

aat

gga

24 )

Arg

Ser

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Phe

Met

Ile

Asp

Lys

Glu

Gly

Asn

Gly

65

70

7 5

80

gaa

atc

gaa

tet

aca

gga

gat

ata

ggt

tgg

agt

ata

tat

tac

gac

gat

28 é

Glu

Ile

Glu

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Gly

Trp

Ser

Ile

Tyr

Asp

85

90

95

cac

aac

act

cta

cac

ggc

gca

acc

gtt

acc

ctc

aaa

gcc

ggc

gac

aac

336

His

Asn

Thr

Leu

His

Gly

Ala

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

100

105

110

ctg

aaa

atc

aaa

caa

age

ggc

aaa

gac

ttc

acc

tac

tcg

ctg

aaa

dďo

304

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Ser

Gly

Lys

Asp

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

115

120

125

i e e <> ·- r- e f f r r : - fi Γ r .'· c

gag Glu

7? x-*xv±-ii

aaa Lys 140

tta Leu

r tcg Ser

ttt Phe

gac Gly

432

ctg Leu 130

3óó Lys

gac ctg

acc Thr

agt Ser 135

gtt gaa Val Glu

act Thr

gaa Glu

Asp

Leu

gca

aac

ggt

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

age

gac

acc

aaa

ggc

ttg

aat

480

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

145

150

155

160

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

get

ggg

acg

aac

ggc

gac

ccc

acg

gtt

cat

ctg

528

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Pro

Thr

Val

His

Leu

165

170

175

aac

ggt

atc

ggt

tcg

act

ttg

acc

gat

acg

ctt

gcg

ggt

tet

get

576

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Ala

Gly

Ser

Ala

180

185

190

tet

cac

gtc

gat

gcg

ggt

aac

caa

agt

aca

cat

tac

act

cgt

gca

624

Ser

His

Val

Asp

Ala

Gly

Asn

Gin

Ser

Thr

His

Tyr

Thr

Arg

Aia

Ala

195

200

205

agt

att

aag

gat

gtg

ttg

aat

gcg

ggt

tgg

aat

att

aag

ggt

gtt

33c

672

Ser

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

210

215

220

act

ggc

tea

aca

act

ggt

caa

tea

gaa

aat

gtc

gat

ttc

gtc

ege

act

720

Thr

Gly

Ser

Thr

Gly

Gin

Ser

Glu

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

225

230

235

240

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

age

gca

gat

acg

aaa

aca

acg

act

gtt

7 68

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Val

245

250

255

aat

gtg

gaa

age

aaa

gac

aac

ggc

aag

aga

acc

gaa

gtt

aaa

atc

gat

816

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Arg

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

260

265

270

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

gtt

act

ggt

864

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

275

280

285

aaa

ggc

dác.

ggc

gag

aat

ggt

tet

aca

gac

gaa

gac

gaa

ggc

tta

912

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

GÍy

Glu

Gly

Leu

290

295

300

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

aag

get

ggt

tgg

aga

960

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

305

310

315

320

atg

aaa

aca

áca

acc

get

aat

ggt

caa

aca

ggt

caa

get

gac

aag

ttt

1008

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe

325

330

335

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca

aaa

gta

acc

ttt

get

agt

ggt

aat

ggt

1056

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

340

345

350

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa

gat

caa

ggc

aac

atc

act

gtt

aag

1104

Thr

Ala

Thr

Val

Šer

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

355

360

365

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat

gcc

cta

aac

gtc

aat

cag

ctg

caa

aac

1152

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly Asp Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Glň

Leu

Gin

Asn

370

375

380

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc

aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

tcg

ggc

aaa

1200

1248

Ser 385

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp 390

Ser Lys

Ala

Val Ala Gly 395

Ser

Gly

Lys 4 00

gtc

atc

agc

ggc

aat

gtt

tcg

ccg

agc

aag

gga

aag

atg

gat

gaa

acc

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

405

410

415

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac

atc

gag

att

acc

cgc

aac

ggc

aaa

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

420

425

430

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg

atg

acc

ccg

caa

ttt

tcc

agc

gtt

tcg

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

Ser

435

440

445

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg

ccc

act

tta

agc

gtg

gat

gac

gag

ggc

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp Asp

Glu

Gly

450

455

4 60

gcg

ttg

aat

gtc

ggc

agc

aag

gat

gcc

aac

aaa

ccc

gtc

cgc

att

acc

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

465

470

475

480

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag

ggg

gat

gtt

aca

aac

gtc

gca

caa

Asn

val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

485

490

495

ctt

aaa

ggt

gtg

gcg

caa

aac

ttg

aac

cgc

atc

gac

aat

gtg

aac

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asn

500

505

510

ggc

aac

gcg

cgc

gcg

ggt

atc

gcc

caa

gcg

att

gca

acc

gca

ggt

ttg

Gly

Asn

Alá

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

515

520

525

gct

cag

gcc

tat

ttg

ccc

ggc

aag

agt

atg

gcg

atc

ggc

ggt

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530

535

540

act

tat

ctc

ggc

gaa

gcc

ggt

tac

gcc

atc

ggc

tac

tcg

agc

att

tet

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

545

550

555

560

gac

act

ggg

aat

tgg

gtt

atc

aag

ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

tcg

cgc

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

565

570

575

ggt

cat

ttc

ggt

act

tcc

gca

tet

gtc

ggt

tat

cag

tgg

taa

Gly

His

Phe

Gly

Thr

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

590

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1770 <210> 19 <211> 589 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 19

Met 1

Asn

Lys

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Val

Ser 20

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn 25

His

Thr

Lys

Arg

Ala 30

Ser

Ala

Thr

Val

Ala

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

Ala

Thr

Val

Gin

ř r r

40 45

Ala Asn

Ala

Thr

Asp

Thr

Asp Glu Asp Glu 55

Glu

Leu 60

Glu

Ser

Val

Ala

50

Arg

Ser

Ala

Leu

Val

Leu

Gin

Phe

Met

Ile

Asp

Lys

Glu

Gly

Asn

Gly 8 ·.'

65

70

75

Glu

Ile

Glu

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Gly

Trp

Ser

Ile

Tyr

Asp

Ass»

85

90

95

His

Asn

Thr

Leu

His

Gly

Ala

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

100

105

110

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Ser

Gly

Lys

Asp

Phe

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys

115

120

125

Glu

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Gly

130

135

140

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

Gly

Leu

Asn

145

150

155

16C

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Pro

Thr

Val

His

Letx

165

170

17S

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Ala

Gly

Ser

Sér

Ala

180

185

190

Ser

His

Val

Asp

Ala

Gly

Asn

Gin

Ser

Thr

His

Tyr

Thr

Arg

Ala

195

200

205

Ser

Ile

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

210

215

220

Thr

Gly

Ser

Thr

Gly

Gin

Ser

Glu

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thť

225

230

235

24 :

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

Vat

245

250

255

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Arg

Thr

Glu

Val

Lys

Ile

Gly

260

265

270

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

275

280

285

Lys

Gly

Lys

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly

Glu

Gly

Leu

290

295

300

Val

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Ile

Asp

Ala

Val

Asn

Lys

Ala

Gly

Trp

Arg

305

310

315

32·:

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

Asp

Lys

Phe.

325

330

335

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Lys

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

Giy

340

345

350

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Lys

355

360

365

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Gin

Leu

Gin

Asn

370

375

380

r r

• p p P

ř - r r

Λ

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

Giy

Lys

385

390

395

400

Val

Ile

Ser

C-ly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

Asp

Glu

Thr

405

410

415

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

420

425

4 30

Asn

Ile

Asp

I le

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Va)

Ser

435

440

445

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Glu

Gly

4 50

455

4 60

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Ala

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

465

470

475

4 80

Asn

val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

485

490

4 95

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asn

500

505

510

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

515

520

525

Ala

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530

535

540

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

545

550

555

560

Asp

Thr

Gly

Asn

Trp

Val

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

565

570

575

Gly

His

Phe

Gly

Thr

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580 585 <210> 20 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> CDS <222> (1)..(1776)

<400> 20

aat gca

tgg Trp

atg Met 1

aac aaa Asn Lys

ata Ile

tac cgc Tyr Arg 5

atc att

tgg Trp

aat Asn 10

agt Ser

gcc Ala

ctc Leu

Ile

Asn

Ala 15

gtc

gta

tcc

gag

ctc

aca

cgc

aac

cac

acc

aaa

cgc

gcc

tcc

gca

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ale

20

25

30

acc

gtg

aag

acc

gcc

gta

ttg

gcg

act

ctg

ttg

ttt

gca

acg

gtt

cag

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

gca

agt

gct

aac

aat

gaa

gag

caa

gaa

gat

tta

tat

tta

gac

CCC

Ala

Ser

Ala

Asn

Glu

Gin

Glu

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

50

55

60

r- r ! 4 4. C r f C r c r e r r «- r <-

xli-i

gta Val 65

caa Gin

cgc act

gtt gcc gtg ttg ata gtc

aat Asn 75

tcc Ser

gat Asp

aaa Lys

gaa Glu

ggc Gly 80

240

Arg

Thr

Val

Ala 70

Val

Leu

Ile

Val

acg

gga

gaa

aaa

gaa

333

gta

gaa

aat

tea

gat

tgg

gca

gta

tat

288

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu 85

Lys

Val

Glu

Asn 90

Ser

Asp

Trp

Ala

Val 95

Tyr

ttc

aac

gag

aaa

gga

gta

cta

aca

gcc

aga

gaa

atc

acc

ctc

aaa

gcc

336

Phe

Asn

Glu

Lys 100

Gly

Val

Leu

Thr

Ala 105

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu 110

Lys

Ala

ggc

gac

aac

ctg

aaa

atc

aaa

caa

, aac

ggc

aca

aac

ttc

acc

tac

tcg

384

Gly

Asp

Asn 115

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin 120

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe 125

Thr

Tyr

Ser

ctg

aaa

gac

ctc

aca

gat

ctg

acc

agt

gtt

gga

act

gaa

aaa

tta

432

Leu

Lys 130

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp 135

Leu

Thr

Ser

Val

Gly 140

Thr

Glu

Lys

Leu

tcg

ttt

agc

gca

aac

ggc

aat

aaa

gtc

aac

atc

aca

agc

gac

acc

aaa

480

Ser 145

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly 150

Asn

Lys

Val

Asn

Ile 155

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys 160

ggc

ttg

aat

ttt

gcg

aaa

gaa

acg

get

ggg

acg

aac

ggc

gac

acc

acg

528

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala 165

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly 170

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr 175

Thr

gtt

cat

ctg

aac

ggt

att

ggt

tcg

ačt

ttg

acc

gat

acg

ctg

aa t

576

Val

His

Leu

Asn 180

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr 185

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu 190

Leu

Asn

acc

gga

gcg

acc

aca

aac

gta

acc

aac

gac

aac

gtt

acc

gat

gac

gag

624

Thr

Gly

Ala 195

Thr

Asr.

Val

Thr 200

Asn

Asp

Asn

Val

Thr 205

Asp

Glu

aaa

cgt

gcg

gca

agc

gtt

aaa

gac

gta

tta

aac

get

ggc

tgg

aac

672

Lys

Lys 210

Arg

Ala

Ser

Val 215

Lys

Asp

Val

Leu

Asn 220

Ala

Gly

Trp

Asn

att

aaa

ggc

gtt

aaa

ccc

ggt

aca

get

tcc

gat

aac

gtt

gat

ttc

720

Ile 225

Lys

Gly

Val

Lys

Pro 230

Gly

Thr

Ala

Ser 235

Asp

Asn

Val

Asp

Phe 240

gtc

cgc

act

tac

gac

aca

gtc

gag

ttc

ttg

agc

gca

gat

acg

aaa

aca

768

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp 245

Thr

Val

Glu

Phe

Leu 250

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys 255

Thr

acg

act

gtt

aat

gtg

gaa

agc

aaa

gac

aac

ggc

aag

aaa

acc

gaa

gtt

816

Thr

Val

Asn 260

Val

Glu

Ser

Lys

Asp 265

Asn

Gly

Lys

Thr 270

Glu

Val

aaa

atc

ggt

gcg

aag

act

tet

gtt

att

aaa

gaa

aaa

gac

ggt

aag

ttg

864

Lys

Ile

Gly 275

Ala

Lys

Thr

Ser

Val 280

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp 285

Gly

Lys

Leu

gtt

act

ggt

aaa

gac

aaa

ggc

gag

aat

ggt

tet

aca

gac

gaa

ggc

912

Val

Thr 290

Gly

Lys

Asp

Lys

Gly 295

Glu

Asn

Gly

Ser

Ser 300

Thr

Asp

Glu

Gly

gaa

ggc

tta

gtg

act

gca

aaa

gaa

gtg

att

gat

gca

gta

aac

aag

get

960

Glu 305

Gly

Leu

Val

Thr

Ala 310

Lys

Glu

Val

Ile

Asp 315

Ala

Val

Asn

Lys

Ala 320

ggt Gly

tgg aga

atg Met

aaa Lys 325

aca Thr

acc Thr

gct Ala

aať ggt Asn' Gly 330

caa Gin

ΰΖά Thr

ggt Gly

caa Glr. 325

gct Ais

Trp

Arg

gac

aag

ttt

gaa

acc

gtt

aca

tea

ggc

aca aat

gta

acc

ttt

gct

agt

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

ggt

aaa

ggt

aca

act

gcg

act

gta

agt

aaa gč<t

gat

caa

ggc

aac

atc

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys¹Asp

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

355

360

365

act

gtt

atg

tat

gat

gta

aat

gtc

ggc

gat gcc

cta

aac

gtc

aat

cag

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Glr.

370

375

380

ctg

caa

aac

age

ggt

tgg

aat

ttg

gat

tcc aaa

gcg

gtt

gca

ggt

tet

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser 'Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

40C

tcg

ggc

aaa

gtc

atc

age

ggc

aat

gtt

tcg ccg

age

aag

gga

aag

atc

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

gat

gaa

acc

gtc

aac

att

aat

gcc

ggc

aac aac

atc

gag

att

acc

ege

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

A.rg

420

425

430

aac

ggt

aaa

aat

atc

gac

atc

gcc

act

tcg atg

acc

ccg

cag

ttt

ret

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

age

gtt

tcg

ctc

ggc

gcg

ggg

gcg

gat

gcg ccc

act

ttg

age

gtg

gat

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asc

450

455

4 60

ggg

gac

gca

ttg

aat

gtc

ggc

age

aag

aag gac

aac

aaa

ccc

gtc

cgc

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Lys Asp

Asn

Lys

Pro

Val

Are

4 65

470

475

48Ó

att

acc

aat

gtc

gcc

ccg

ggc

gtt

aaa

gag agg

gat

gtt

aca

aac

gtc

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

485

490

495

gca

caa

ctt

aaa

ggc

gtg

gcg

caa

aac

ttg aac

aac

cgc

atc

gac

aat

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu Asn

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

500

505

510

gtg

gac

ggc

aac

gcg

cgt

gcg

ggc

atc

gcc caa

gcg

att

gca

acc

gca

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

515

520

525

ggt

ctg

gtt

cag

gcg

tat

ttg

ccc

ggc

aag agt

atg

gcg

atc

ggc

Gly

Leu

val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530

535

540

ggc

act

tat

cgc

ggc

gaa

gcc

ggt

tac gcc

atc

ggc

tac

tcc

agt

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr Ala Ile

Gly

Tyr

Ser

545

550

555

56C

att

tcc

gac

ggc

gga

aat

tgg

att

atc

aaa ggc

acg

gct

tcc

ggc

aat

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asr.

565

570 ‘

575

tcg

cgc

ggc

cat

ttc

ggt

gct

tcc

gca

tet gtc

ggt

tat

cag

tgg

táč

1008

1056

1104

1152

Í200

124 8

134 4

1392

1440

1488

1536 : ι

1584

1632

1680

1721

177(

1296 r ee rc r r · e * r f / -'L

Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trn 580 585 590 <210> 21 ' <211> 591 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 21

Met X

Asn Lys

Ile

Tyr 5

Arg Ile Ile Trp

Asn Ser Ala Leu Asn Ala

Trp

10

5 5 A

Val

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn

His

Thr

Lys

Arg

Ala

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Val

Lys

Thr

Ala

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Phe

Ala

Thr

Val

Gin

35

40

45

Ala

Ser

Ala

Asn

Glu

Gin

Glu

Asp

Leu

Tyr

Leu

Asp

Pro

50

55

60

Val

Gin

Arg

Thr

Val

Ala

Val

Leu

Ile

Val

Asn

Ser

Asp

Lys

Glu

Gly

65

70

75

80

Thr

Gly

Glu

Lys

Glu

Lys

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Trp

Ala

Val

Tyr

85

90

95

Phe

Asn

Glu

Lys

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Arg

Glu

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

100

105

110

Gly

Asp

Asn

Leu

Lys

Ile

Lys

Gin

Asn

Gly

Thr

Asn

Phe

Thr

Tyr

Ser

115

120

125

Leu

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp

Leu

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Glu

Lys

Leu

130

135

140

Ser

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Lys

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys

145

150

155

160

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

165

170

175

Val

His

Leu

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Asn

180

185

190

Thr

Gly

Ala

Thr

Asn

Val

Thr

Asn

Asp

Asn

Val

Thr

Ašp

Asp

Glu

195

200

205

Lys

Arg

Ala

Ser

Val

Lys

Asp

Val

Leu

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn

210

215

220

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Pro

Gly

Thr

Ala

Ser

Asp

Asn

Val

Asp

Phe

225

230

235

240

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr

Lys

Thr

245

250

255

Thr

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Asn

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

260

265

•

270

Lys

Ile

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser

Val

Ile

Lys

Glu

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

275

280

285

Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly

290 295 300

Glu Gly Leu 305

Val

Thr Ala Lys Glu 310

Val

Ile

Asp Ala 315

Val

Asn

Lys

Ala 320

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Thr

Ala

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly

Gin

Ala

325

330

335

Asp

Lys

Phe

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Phe

Ala

Ser

340

345

350

Gly

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Val

Ser

Lys

Asp

Gin

Gly

Asn

Ile

355

360

365

Thr

Val

Met

Tyr

Asp

Val

Asn

Val

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Asn

Glr.

370

375

380

Leu

Gin

Asn

Ser

Gly

Trp

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Ala

Gly

Ser

385

390

395

400

Ser

Gly

Lys

Val

Ile

Ser

Gly

Asn

Val

Ser

Pro

Ser

Lys

Gly

Lys

Met

405

410

415

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Arg

420

425

430

Asn

Gly

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

435

440

445

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

450

455

4 60

Gly

Asp

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

465

470

475

480

Ile

Thr

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

485

490

495

Ala

Gin

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

500

505

510

Val

Asp

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

515

520

525

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

530

535

540

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

545

550

555

560

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

565

570

575

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

580

585

590

<210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> Popis uměle vytvořené sekvence: 5' oligonukleotidový primer pro PCR jr xTvi <400> 22 ttagattcca cgtcccagat t <210> 23 <211> 13 <212> DNA < 213 > Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> Popis uměle vytvořené sekvence: 3' ‘oligonukleotidový primer pro PCR <400> 23 cttcccttca aaccttcc 18 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Uměle vytvořená sekvence <220>

<22 3> Popis uměle vytvořené sekvence: 5' oligonukleotidový primer pro PCR <400> 24 ggtcgcggat ccatgaacaa aatataccgc at 32 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> iPopis uměle vytvořené sekvence: 3'

Oligonukleotidový primer pro PCR <400> 25 tcacccaagc ctaagccctt accactgata ac 32 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213 > Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> Popis uměle vytvořené sekvence:

5' oligonukleotidový primer pro PCR <400> 26 ccaaaccccg atttaacc 18 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Uměle vytvořená sekvence <220>

<2 2 3 > Popis uměle vytvořené sekvence: 3' oligonukleotidový primer pro PCR & / - :

-xívii <400> 27 aatcgccacc cttcccttc <210> 28 <211> 18 <212> DNA < 213 > 'Uměle vytvořená sekvence

I <220>

<2 2 3> Popis uměle vytvořené sekvence: oligonukleotidový přiměř pro PCR <400> 28 tttgcaacgg ttcaggca <210> 29 <211> 18 <212> DNA < 213 > Uměle vytvořená sekvence <220>

< 2 2 3> Popis uměle vytvořené sekvence:

oligonukleotidový přiměř pro PCR <400> 29 tattcagcag cgtatcgg <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> Popis uměle vytvořené sekvence: oligonukleotidový primer pro PCR <400> 30 tgcctgaacc gttgcaaa <210> 31 <211> 18 <212> DNA < 213 > Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> Popis uměle vytvořené sekvence: oligonukleotidový primer pro PCR <400> 31

Claims

1) kontakt biologického vzorku od pacienta s polypeptidem, fragmentem, variantou nebo derivátem podle nároku 1; a · ;

1) polypeptid podle nároku 1;

1) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 1;

1. Izolovaný polypeptid nebo jeho fragment nebo jejich varianta či derivát, vyznačující s e tím, že zmíněný polypeptid je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

a) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 2;

b) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 5;

c) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 7;

d) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 9;

e) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 11;

f) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 13;

g) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 15;

h) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 17;

i) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 19 a

j) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 21.

2) stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti komplexu mezi zmíněným polypeptiděm, fragmentem, variantou nebo derivátem a protilátkami, specifickými pro ,N. meningitidis, ve zmíněném vzorku, přičemž přítomnost zmíněného komplexu je indikátorem zmíněné infekce.

2) fragment zmíněného polypeptidů;

2) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 3;

2. Polypeptid, fragment, varianta nebo derivát podle nároku 1,vyznačující se tím, že vyvolává imunitní odpověď proti jednomu nebo více členům, kteří jsou vybráni ze skupiny, kterou tvoří:

i) N. meningitidis, ii) zmíněný polypeptid;

iii) zmíněný fragment;

iv) zmíněná varianta; a

v) zmíněný derivát.

3) varianta zmíněného polypeptidů nebo zmíněného fragmentu; a

3·

-43*

ϋ) iii) zisk extraktu nukleové kyseliny z vhodného hostitele; vytvoření primerů, které jsou příležitostně degenerovány, přičemž každý z obsahuje část sekvence nukleové kyseliny podle nároku 5 nebo nároku 7; a použití zmíněných primerů pro amplifikací, prostřednictvím techniky amplifikací nukleové kyseliny, jednoho nebo více amplifikačních produktu zmíněného extraktu nukleové kyseliny.

nich pro ze

3) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 4;

!

3. Polypeptid, fragment, varianta nebo derivát podle nároku 1,vyznačující se tím, že vyvolává imunitní odpověď proti N. meningitidis.

4) derivát zmíněného polypeptidů nebo zmíněného fragmentu.

4) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 6;

4. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny, kódující polypeptid nebo jeho fragment, nebo jejich variantu či derivát, vyznačující se tím, že zmíněný polypeptid je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

ί/ +r

a) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 2;

b) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 5;

c) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 7;

d) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 9;

e) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 11;

f) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 13;

g) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 15;

h) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 17;

i) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 19 a

j) polypeptid podle sekvence s identifikačním číslem 21.

5) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 8;

, ρ /,υ/ :

/Λ'

5. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 4, vyznačující se tím, že j ί kóduje produkt, který vyvolává imunitní odpověď proti jednomu nebo více Členům, kteří jsou vybráni ze skupiny, kterou tvoří:

i) N. meningitidis·, ii) zmíněný polypeptid;

iii) zmíněný fragment;

iv) zmíněná varianta; a

v) zmíněný derivát.

6) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 10;

6. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 4, vyznačující kóduje produkt, který vyvolává imunitní odpověď proti N. meningitidis.

s e tím;

že

7) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 12;

7. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že je vybrána ze skupiny, kterou tvoří:

8. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7, vyznačující se tím, že kóduje produkt, který vyvolává imunitní odpověď proti jednomu nebo více členům, kteří jsou vybráni ze skupiny, kterou tvoří:

i) N. meningitidis·, ii) zmíněný polypeptid;

iii) zmíněný fragment;

iv) zmíněná varianta; a

v) zmíněný derivát.

8) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 14;

9. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7, vyznačující se tím, že kóduje produkt, který vyvolává imunitní odpověď proti N. meningitidis.

9) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 16;

10. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7, vyznačující se tím, že zmíněný homolog je získán z rodu Neisseria.

10) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 18;

11. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 5 nebo nároku 7, vyznačující s' etím, že zmíněný homolog je získán z kmene TV. meningitidis.

11) nukleotidová sekvence s identifikačním číslem 20;

12. Způsob získávání homologu nukleotidové sekvence, vyznačující se tím, že se skládá z kroků:

I

12) fragment jakékoliv nukleotidové sekvence s identifikačním číslem 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18 a 20; a

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že zmíněný extrakt nukleové kyséliny je získán z rodu Neisseria.

13) homolog jakékoliv výše uvedené nukleotidové sekvence.

14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že zmíněný extrakt nukleové kyseliny je získán z kmene N. meningitidis.

15. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že zmíněné primery jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří sekvence s identifikačním číslem 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 a 31. i

16. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že technikou pro amplifikací nukleové kyseliny je PCR. , ; I

17. Expresní vektor, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 4 nebo nároku 7, přičemž zmíněná sekvence je operativně spojena s transkripční |a translační regulátorovou nukleovou kyselinou. ; i

18. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transfektována nebo transformována expresním vektorem, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 4 nebo nároku 7, přičemž zmíněná sekvence je operativně spojena s transkripční a translační regulátorovou nukleovou kyselinou.

19. Způsob přípravy rekombinantního polypeptidů, vyznačující se tím, že zahrnuji : ί kroky: ; j gy _γ - γ

44Α) kultivaci hostitelské buňky podle nároku 18 tak, že zmíněný rekombinantní polypeptid je ze zmíněné nukieové kyseliny exprimován; a

B) izolaci zmíněného rekombinantního polypeptidů.

20. Protilátka nebo fragment protilátky, vyznačující se tím, že se váže na jednoho nebo více členů, které jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří:

21. Protilátka podle nároku 20, vyznačující se tím, že zmíněná protilátka nebo fragment protilátky váže N. meningitidis.

22. Způsob detekce N. meningitidis v biologickém vzorku, u kterého je podezření, že obsahuje N meningitidis, vyznačující se tím, že zmíněný způsob zahrnuje kroky:

A) izolace biologického vzorku od pacienta;

B) smíchání protilátky nebo fragmentu protilátky podle nároku 20 nebo nároku 21 s biologickým vzorkem za vzniku směsi a

C) detekce specificky navázané protilátky nebo fragmentu ve směsi, což naznačuje přítomnost N. meningitidis.

23. Způsob detekce bakterie N. meningitidis v biologickém vzorku, u kterého je podezření, že obsahuje zmíněnou bakterii, vyznačující se tím, že zmíněný způsob zahrnuje kroky:

I) izolace biologického vzorku od pacienta

II) detekce sekvence nukieové kyseliny podle nároku 4 nebo nároku 7 ve zmíněném vzorku, což naznačuje přítomnost zmíněné bakterie.

24. Způsob diagnostiky infekce N. meningitidis u pacientů, vyznačující se tím, že zmíněný způsob zahrnuje kroky:

25. Použití polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu podle nároku 1 pro výrobu soupravy pro detekci nebo diagnózu infekce N. meningitidis u lidí. ' j

26. Použití sekvence nukleové kyseliny podle nároku 4 nebo nároku 7 pro výrobu pro detekci nebo diagnózu infekce N. meningitidis u lidí.

soupřa .vy

27. Použití jednoho nebo více oligonukleotidových primerů, vybraných ze skupiny, ktér tvoří SEQ ID č. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 a 31 a příležitostně termostabilní polymeráza soupravě pro detekci nebo diagnózu infekce N meningitidis u lidí.

*u v

28. Použití protilátky nebo fragmentu protilátky podle nároku 20 nebo nároku 21 pro výronu soupravy pro detekci nebo diagnózu infekce N. meningitidis u lidí. : |

29. Použití farmaceuticky účinného množství polypeptidu, fragmentu, varianty nebo derivátu podle nároku 1 pro prevenci nebo léčbu infekce N. meningitidis u lidí.

30. Použití farmaceuticky účinného množství protilátky nebo fragmentu protilátky podle nároku 20 nebo nároku 21 pro prevenci nebo léčbu infekce N. meningitidis u lidí.

31. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje izolovaný polypeptid i

nebo jeho fragment nebo jejich variantu či derivát podle nároku 1.

32. Farmaceutický prostředek podle nároku 31,vyznačující se tím, že to je vakcína. *

I ý?

4ťT

33. Způsob prevence nebo léčby infekce N. meningitidis u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy je podáváno farmaceuticky účinné množství vakcíny podle nároku 32.

34. Způsob identifikace imunoreaktivního fragmentu polypeptidů, varianty nebo derivátů podle λ

nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) vytvoření fragmentu zmíněného polypeptidů, varianty nebo derivátu;

b) podávání zmíněného fragmentu savci; a

c) detekci imunitní odpovědi u zmíněného savce, přičemž odpověď zahrnuje produkci prvků, které specificky vážou N. meningitidis a/nebo zmíněný polypeptid, variantu nebo derivát a/nebo působí jako ochrana proti infekci N. meningitidis.