CZ298118B6 - Zpusob kosmetické reprodukce vlasu a pouzití vlasových folikulových bunek - Google Patents

Zpusob kosmetické reprodukce vlasu a pouzití vlasových folikulových bunek Download PDF

Info

Publication number
CZ298118B6
CZ298118B6 CZ0313499A CZ313499A CZ298118B6 CZ 298118 B6 CZ298118 B6 CZ 298118B6 CZ 0313499 A CZ0313499 A CZ 0313499A CZ 313499 A CZ313499 A CZ 313499A CZ 298118 B6 CZ298118 B6 CZ 298118B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hair
cells
cultured
hair follicle
cell line
Prior art date
Application number
CZ0313499A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ313499A3 (cs
Inventor
Ghosal Gho@Conradus
Original Assignee
Ghost Holding B. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ghost Holding B. V. filed Critical Ghost Holding B. V.
Publication of CZ313499A3 publication Critical patent/CZ313499A3/cs
Publication of CZ298118B6 publication Critical patent/CZ298118B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A61K8/985—Skin or skin outgrowth, e.g. hair, nails
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0627—Hair cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Indexing, Searching, Synchronizing, And The Amount Of Synchronization Travel Of Record Carriers (AREA)
  • Toys (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
  • Massaging Devices (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)

Abstract

Zpusob kosmetické reprodukce vlasu podle kterého se odeberou vlasové folikulové bunky, které se pestují za takových podmínek, ze jsou schopné mnozenía potom se takto vypestované vlasové folikulové bunky implantují do recepcních oblastí. Folikulové bunky se odeberou vytrhnutím vlasu v anagenní fáziz nejméne jedné donorové oblasti tak, ze cibulka charakteristická pro vlas v anagenní fázi je stálepripojena k odstranenému vlasu, nacez se vyberou vhodné vlasy v anagenní fázi. Vlasové folikulové bunky se pestují v kultivacním prostredku, který seprípadne doplní alespon jednou lidskou sloupcovou bunecnou linií anebo autologovanými vypestovanými bunkami CD34+ nebo jedním nebo více výtazky z jedné rady lidské zírné bunky anebo autologovaných bunek CD34+ anebo cinidly povzbuzujícími rust a vypestované folikulární vlasové bunky anebo autologované vypestované bunky CD34+ jsou implantovány do póru recepcní oblasti. Pouzití vlasových folikulových bunek vypestovaných z vlasu v anagenní fázi jako aktivní slozky pro prípravu injekcní suspenze pro reprodukci vlasu.

Description

Způsob kosmetické reprodukce vlasů a použití vlasových folikulových buněk
Oblast techniky
Předmětný vynález sc týká způsobu kosmetické reprodukce vlasů podle kterého se odeberou vlasové folikulové buňky, pěstují se vlasové folikulovč buňky za takových podmínek, že jsou schopné množení a implantují se vypěstované vlasové folikulové buňky do recepčních oblastí. Vynález se také týká použití vlasových fol i kulových buněk vypěstovaných z vlasů v anagenní fázi.
Dosavadní stav techniky
Způsob reprodukce vlasů je popsán v evropské patentové přihlášce 0 236 014. v níž jsou 15 epidermální folikulovč buňky požadovaného vlasového typu odebrány z pacientovy kůže na temeni hlavy. Epidermální folikulovč buňky jsou potom kultivovány v kultivačním prostředku, který obsahuje přednostně růstové faktory'. V následující fázi sc provede otvor v cpidermis pacientovy kůže na temeni hlavy, tímto otvorem jsou zavedeny vypěstované epidermální folikulovc buňky do kůže v blízkosti epidermis. Nevýhodou tohoto způsobu je to, ze je invazívní a že 20 buňky nejsou umístěny cíleně, výsledkem čehož je velká potřeba mnoha buněk a nižší pravděpodobnost vlasové regenerace. V tomto způsobu se nevyužilo autologovaných vypěstovaných buněk CD341.
Hlavní růstové struktury vlasů jsou tzv. vlasové folikuly, které jsou přítomny v pokožce. Vlasové 25 folikulovč buňky nebo kcratinocyty se reprodukují z těchto vlasových folikulů a během jejich cesty na povrch pokožky je přeměněna cytoplazma zmíněných buněk velkým počtem komplexních procesů v pevnou a pružnou hmotu, která je známa jako vlas. Růstový cyklus vlasu může být rozdělen do tří fází: anagenní neboli růstová fáze, katagenní neboli přechodová fáze a tclogenní neboli odumírací fáze. Vlasový folikul jc jedinečný svou cyklickou povahou tvorby vlasu a 30 vlasového růstu. Zvláštností je, že vlasový folikul je jedinou částí lidského těla, která obsahuje růstové jádro, z něhož mohou být produkovány nove vlasy po odstranění vlasu starého.
Je známo, že vlasové folikulovč buňky mohou být vypěstovány z vytrženého lidského vlasu. Je také známo, že je možné použít takto pěstovaných buněk k vytvoření diferenciovaného nebo plně 35 rozvinutého epidermis. oba in vilro a in vivo. Vlasové folikulovč buňky vypěstované u myší mohou stimulovat vlasový růst, když jsou zmíněné buňky implantovány do testovaných zvířat. Nicméně dodnes se neukázalo jako možné docílit nového růstu vlasů u člověka na takovém místě, kde již (dlouho) není žádný vlas za pomoci vypěstovaných autologovaných vlasových folikulových buněk.
Tidé vždy považovali ztrátu vlasů z kosmetického a estetického hlediska za nežádoucí. Avšak holohlavost sc vyskytuje často a je známým faktorem, který' začíná zvláště u stárnoucích mužů. Tato forma ztráty vlasů je známa jako alopecia androgenctica. Dodnes není přesně známo, proč některé části pokožky na hlavě jsou náchylné k této alopecii andragogenetice a jiné ne. Avšak u 45 žen se také pravidelně objevuje to, že vlasy jsou slabší a dokonce do značné míry hrozí jejich vypadávání. Hlavně pro ženy je to velmi nepříjemné z kosmetického a estetického hlediska.
Známým způsobem boje proti ztrátě vlasů je transplantace vlasů. Tímto postupem se odejme včetně kůže část vlasy pokryte donorové oblasti, která se často nachází v týle hlavy, a rozřeže se 50 na malé kousky, které mají obvykle jen jeden až tři vlasy. Tyto části jsou pak implantovány do ztrátou vlasů postižené oblasti (recepční oblasti). Velkou nevýhodou tohoto způsobuje fakt, zeje na úkor donorové oblasti. Vlas je odebrán z této oblasti a znovu už sc tam neobjeví. Transplantační způsob proto nabízí jen omezené možnosti.
-1CZ 298118 B6
Cílem předmětného vynálezu je poskytnout způsob, pomocí kterého se mohou na holých místech znovu objevit vlasy, ale který nemá nevýhody vlasové transplantace, jak bylo zmíněno výše. Druhým cílem vynálezu je poskytnout způsob, díky němuž by bylo dosaženo nového růstu vlasů u člověka, pomocí vypěstovaných vlasových folikulových buněk. Dalším cílem vynálezu je poskytnout způsob, jehož provádění je relativně jednoduché.
Podstata vynálezu
Zmíněných cílů je dosaženo pomocí způsobu podle vynálezu, podle kterého je vlas jako takový reprodukován. Podle vynálezu je vlas odebrán zdonorové oblasti takovým způsobem, že se na toto místo vrátí nové vlasy, zatímco jsou pěstovány nové vlasové folikulové buňky z odebraných vlasů, zjejichž buněk se zase tvoří nové vlasy.
Vynález se tudíž týká způsobu kosmetické reprodukce vlasů, který obsahuje následující kroky;
1) odeberou se vlasové folikulové buňky,
2) pěstují sc vlasové folikulové buňky za takových podmínek, že jsou schopné množení a
3) implantují sc vypěstované vlasové folikulové buňky do recepčních oblastí, přičemž podle vynálezu
- se folikulové buňky odeberou vytrhnutím vlasu v anagenní fázi z nejméně jedné donorovc oblasti tak, že cibulka charakteristická pro vlas v anagenní fázi je stále připojena k odstraněnému vlasu, načež se vyberou vhodné vlasy v anagenní fázi.
- vlasové folikulové buňky se pěstují v kultivačním prostředku, který' se případně doplní
a) alespoň jednou lidskou sloupcovou buněčnou linií anebo autologovanými vy pěst o vánými buňkami CD34 nebo
b) jedním nebo více výtažky z jedné řady lidské žírné buňky anebo autologovaných buněk CD34 nebo
c) činidly povzbuzujícími růst a
- vypěstované folikulární vlasové buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34 jsou implantovány do pórů recepční oblasti.
Způsob se s výhodou provádí tak. že řada lidské žírné buňky jc jedna řada žírné buňky, její subklon anebo autologované vypěstované buňky CD34 anebo činidla podporující růst.
Způsob se dále s výhodou provádí tak, že řada lidské žírné buňky jc jedna řada lidské žírné buňky anebo řada autologovaných vypěstovaných buněk CD34*.
Způsob se dále s výhodou provádí tak, že vlasové folikulové buňky jsou pěstovány při teplotě od 30 do 40 °C v atmosféře, která je nasycena vodou a obsahuje 3 až 10 % objemových CCK
Způsob sc dále s výhodou provádí tak, že vypěstované vlasové folikulové buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34 jsou zavedeny do každého póru jako dávka suspenze tak. ze dávka suspenze obsahuje dostatek vlasových folikulových buněk anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34\ že to umožňuje rozvoj vlasového folikulu.
Způsob se dále s výhodou provádí tak, že množství suspenze, které se zavádí do póru je od 0,01 μΐ do 5 μΐ.
Způsob se dále s výhodou provádí lak. žc množství suspenze, které se zavádí do póru je od 0,1 μΐ až do 0,5 μΐ.
Způsob se dále s výhodou provádí tak. že suspenze je vstříknuta jednotlivě do každého póru pomocí dávkovači pipety, která je opatřena dutou jehlou přednostně jehlou 18 až 40 Gauche.
Způsob se dále s výhodou provádí tak, že suspenze je vstříknuta pomocí opakovači ho dávkovač ího vstřikovacího aparátu.
Způsob sc dále s výhodou provádí tak. že se používá zaváděcí folikulová jehla.
to Vynález dále spočívá v použití vlasových folikulových buněk vypěstovaných z vlasů v anagenní fázi jako aktivní složky pro přípravu injekční suspenze pro reprodukci vlasů, přičemž vlasy se odstraňují z alespoň jedné donorové oblasti tak. že cibulka charakteristická pro vlas v anagenní fázi je stále připojena k vlasu a vlas se odstraňuje vytržením vlasu z alespoň jedné donorové oblasti, načež se vyberou vhodné vlasy v anagenní fázi, přičemž vlasové folikulové buňky se 15 pěstují z vhodných vlasu v anagenní fázi za podmínek, při kterých se vlasové folikulové buňky množi a vlasové folikulové buňky se pěstují v kultivačním prostředku, který má
a) alespoň jednu lidskou sloupcovou buněčnou linii anebo autologované vypěstované buňky CD34’ nebo
b) alespoň jeden výtažek z řady lidskc žírné buňky anebo buněk CD34* anebo
2() c) činidla povzbuzující růst.
Použití je s výhodou takové, že řada lidskc žírné buňky je jedna řada žírné buňky, její subklon anebo autologované vypěstované buňky CD34 anebo činidla podporující růst.
Použití je dále s výhodou takové, že řada lidské žírné buňky je jedna řada žírné buňky anebo autologovaná vypěstovaná řada buněk CD34 .
Použití je dále s výhodou takové, že se vlasové folikulové buňky pěstují při teplotě od 30 do 40 °C v atmosféře, která je nasycena vodou a obsahuje 3 až 10 % objemových CO?.
Ve shodě s vynálezem může být zavedena pouze jedna vlasová folikulová buňka nebo jedna autologovaná vypěstovaná buňka CD34 nebo kombinace těchto dvou buněk, třebaže se v popisu obvykle uvádí buňky v množném čísle.
Způsob podle vynálezu má tu hlavní výhodu, že na holých místech může být dosaženo znovu růstu vlasů, aniž by to bylo na úkor donorové oblasti.
Krok (1) způsobu podle vynálezu zahrnuje odebrání vlasu v anagenní fázi z donorové oblasti, kde se vyskytují takové vlasy. Jak bylo vysvětleno výše, růst vlasu má tři fáze: anagenní, katagenní a 40 telogenní. Pouze vlasy v anagenní fázi jsou vhodné pro způsob podle vynálezu. Vc srovnání s vlasy v katagenní a telogenní fázi jsou vlasy v anagenní fázi charakteristické tím. že mají v dolní části vlasu (často pigmentovanou) cibulku tvaru, jenž je charakteristický pro vlasy v anagenní fázi. Toto jc obecně známo, a proto pro zkušené oko je vlas v anagenní fázi ihned rozpoznatelný podle tvaru cibulky. V případě pochybnosti poskytne konečnou odpověď mikro45 skop. Odebrání vlasů v anagenní fázi může proto být prováděno různými způsoby, zůstane-li v anagenní fázi charakteristická cibulka vlasů na odebíraném vlasu.
Počet vlasů v anagenní fázi potřebných k vypěstování přiměřeného množství vlasových folikulových buněk není omezený, protože v podstatě může být vypěstován nekonečný počet vlasových 50 folikulových buněk z jediného vlasu. Subkultury mohou být postupné vypěstovány z první kultury' a postupně může být vypěstováno několik kultur z každé subkultury . V praxi budou rozmnoženy 3 vlasy na 10 vlasů v anagenní fázi. Vlasy, které se konečně vytvoří v recepční oblasti z vypěstovaných vlasových folikulových buněk, přejímají vlastnosti vlasů z donorové oblasti.
-3CZ 298118 B6 z nichž byly vypěstovány vlasové folikulové buňky. Proto oblast, která není náchylná k alopecii androgenetica. je považována za vhodnou donorovou oblast. Avšak to není podstatné. Jelikož rozdíl mezi vlasy v různých stádiích růstu je nejlépe viděn jakmile jsou vlasy odebrány, z donorové oblasti jsou vytrhnuty a vybrány vhodné vlasy v anagenní fázi. Pro vytrhávání vlasů z donorové oblasti jsou velmi vhodné například pinzety.
Při kroku (2) způsobu podle vynálezu jsou vlasy pěstovány z odebraných vlasu za takových podmínek, že vlasové folikulové buňky jsou schopné množení. V podstatě vlasové folikulové buňky mohou být vypěstovány z vlasů známým způsobem. Kultivační prostředky pro tento účel jsou obchodně dostupné stejně tak jakékoliv přídavné růstové doplňky. Takovými kultivačními prostředky jsou také takzvané keratinocytové kultivační prostředky neobsahující sérum a obvykle obsahující esenciální a neesenciální aminokyseliny, vitamíny, stopové prvky, organické složky a anorganické soli. Tyto kultivační prostředky mohou být kombinovány také s růstovými doplňkovými činidly, která obsahují růstové faktory, hormony, antibiotika a extrakty tkáně jako např. BPE (extrakt hovězí hypofýzy), inzulín, hydrokortizon, HF.GP (lidský ep i dermální růstový faktor), TGF (transformační růstový faktor), 1-cystein. L-leucin a gentamicin. Ve shodě s vynálezem byly získány zvláště dobré výsledky, pokud pří kroku (2) způsobu podle tohoto vynálezu se použilo kultivačního prostředku, který je kromě známých výše popsaných kultivačních prostředků doplněn případně jedním nebo více růstovými doplňkovými činidly anebo je doplněn jednou řadou lidské žírné buňky anebo autologovými vypěstovanými buňkami CD34 (pozitivními buňkami CD34) nebo jedním nebo více extrakty z řady (řad) lidské žírné buňky anebo z buněk CD34 anebo činidly podporujícími růst. Přednostně jsou používány pouze vypěstované buňky CD34 . protože pocházejí z těla. Lidské žírné buňky jsou obecně známy. Obsahují různé růstové faktory a jsou produkovány a spotřebovávány v různých místech těla. Výtažky z řady lidských žírných buněk anebo autologované vypěstované buňky CD34 anebo činidla podporující růst obsahují růstové faktory; Nicméně dodnes tyto extrakty z řady lidské žírné buňky anebo z autologovaných vypěstovaných buněk CD341 anebo činidel podporujících růst nebyly použity v prostředku pro pěstování vlasových folikulových buněk. Rada lidské žírné buňky, z níž se použije extrakt, je HMC-1 (řada lidské žírné buňky 1) nebo buněčná řada zní odvozená, jako jsou subklony 5C6 a KU812. Řady žírných buněk jako HMC-1 a její subklony jsou proto obchodně dostupné. Ve shodě s vynálezem může být použito místo žírných buněk autologovaných vypěstovaných buněk CD34 nebo kombinace dvou nebo více těchto buněčných typů.
Extrakty zrady lidské žírné buňky anebo z autologované vypěstované buňky CD34 anebo činidla podporující růst mohou být zavedeny do prostředku přidáním alespoň jednoho degranulačního činidla do keratinocytového kultivačního prostředku bez séra a obsahujícího řadu lidské žírné buňky, jeho subklon anebo autologované vypěstované buňky CD34 anebo činidla podporující růst. Mohou být také přidány anorganické soli pro lepší využití působení degranu lační ho činidla. V tomto spojení je vhodnou solí CaC'L. Dcgranulační prostředek potom takřka rozřeže žírné buňky a autologované vypěstované buňky CD341 na menší části (degranuláce), výsledkem čehož je uvolnění růstových faktorů do prostředku. Po degranulaci jsou zbytky žírných buněk a autologovaných vypěstovaných buněk CD34 odstraněny např. odstředěním. Výsledný upravený prostředek lze pak použít k pěstování vlasových folikulových buněk.
Dcgranulační činidla jsou obecně známa a mohou být rozdělena zhruba do tří skupin:
- hormony jako estrogeny a brady kin i n,
- nervové mediátory a antigeny jako apiloxin; substance P a Ig E. a
- syntetická činidla jako Compound 48/80 (kondenzační produkt N-methyl-p-niethoxy fenethylaminu s fonnaldchydem) a Inophore A23187 (calcimycin).
Tato degranulační činidla, která jsou schopna degranuláce případně použitých žírných buněk, jsou vhodná pro použití u způsobu podle předmětného vynálezu.
-41./ ZVO1 1O DO
Alternativou je nejprve oddělená příprava extraktu žírných buněk a autologovaných vypěstovaných buněk CD34 anebo růstových činidel a přidání těchto extraktu do keratinocytového kultivačního prostředku neobsahujícího sérum.
Podmínky , za nichž mohou být pěstovány vlasové folikulové buňky v kroku (2) se mohou podstatně lišit a jsou závislé mimo jiné na použitém prostředku. Nicméně bylo zjištěno, že pěstování vlasových foli kulových buněk při teplotě od 30 do 40 °C, přednostně v inkubátoru, kde teplota může být udržována konstantní, v atmosféře, která jc nasycena vodou a která obsahuje 3 až 10% objemových procent CO? kromě jiných obvyklých složek vzduchu v obvyklých kvantitách, přináší dobré výsledky. Avšak tyto podmínky nejsou nijak omezující a i jiné podmínky mohou být také využity. Doba pěstování se liší od kultur), obvykle od 1 hodiny do 40 dnů. Pro získání dobrého výsledku se upřednostňuje nahrazení prostředku čerstvým prostředkem každé 2 až 5 dnů.
Krok (2) způsobu podle vy nálezu může být proveden v jednom stupni pěstování, ale také v několika podstupních pěstováni subkultur z původní kultur}' nebo kultur. To může být uskutečněno odebráním dostatečného počtu vlasových folikulových buněk ze základní kultur}', když tato obsahuje dostatek vlasových folikulových buněk. Vlasové folikulové buňky ze základní kultury jsou vypěstovány postupně, přednostně - ale ne nezbytně - ve stejném kultivačním prostředku jako byla pěstována původní základní kultura. V průběhu času je možné, ne-li žádoucí, vypěstovat ještě další kultury od zmíněných subkultur, atd.atd.
Poté, co byly vlasové folikulové buňky vypěstovány, musí být odděleny od substrátu, na němž rostly. To se provádí známými způsoby např. užitím roztoku trypsinu (0,1 až 0.5 % hmotnostních procent vc vodě) případně v kombinaci s roztokem EDTA (0,1 až 0,5 % hmotnostních procent) v PBS (fosfátový puProváný fyziologický roztok). Takové způsoby jsou obecně známy. Před použitím vypěstovaných vlasových folikulových buněk v kroku (3) mohou být žírnc buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34 odstraněny, ale ne nezbytně.
V kroku (3) způsobu podle tohoto vynálezu jsou vypěstované vlasové folikulové buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34 implantovány do pokožky v recepční oblasti. Bylo zjištěno, že velmi dobré výsledky jsou získány, když jsou vypěstované vlasové folikulové buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34' implantovány přímo do pórů recepční oblasti. Pokud jsou póry špatně vidět, což se může stát hlavně u bledé barvy kůže, mohou být zviditelněny aplikací tekutiny (obvykle žlutě zbarvené) na pokožku v recepční oblasti, která ztmavne tam. kde jsou pór}', což je výsledek vyloučení potu z pot nich žláz přítomných v pórech. Příkladem takového roztoku je I až 10% roztok o-ftaldialdehydu např. v xylenu nebo ethyletheru, jak ho popsali L. Juliím a W. B. Suelley v Nátuře, 28. ledna 1967, strana 408.
Přednostně je množství suspenze vypěstovaných vlasových folikulových buněk anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34 zavedeno do každého póru tak. že zmíněné množství obsahuje dostatek vlasových folikulových buněk anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34ý aby to umožnilo rozvoj vlasového folikulu, z něhož může vyrůst vlas. Počet vypěstovaných vlasových folikulových buněk anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34 potřebných k tomu, aby se vytvořil vlasový folikul, je velmi závislý na stupni diferenciace nebo růstovém potenciálu vypěstovaných buněk. Přirozeně bude zapotřebí méně vypěstovaných buněk, když vypěstované vlasové folikulové buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34’ budou mít relativně vysoký stupeň diferenciace, než když vypěstované buňky mají tento stupeň relativně nízký. Existuje velký počet faktorů, které ovlivňují stupeň diferenciace vypěstovaných vlasových folikulových buněk anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34 . Například použitý prostředek a doba pěstování jsou takovými důležitými faktor}'. Přednostně se používá suspenze vypěstovaných vlasových folikulových buněk anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34 v prostředku, v němž zmíněné buňky byly pěstovány. Suspenze má přednostně takovou koncentraci vlasových folikulových buněk, že 0,01 μΙ až 5 μΙ. lépe však 0.1 μΙ až 5 μΙ suspenze stačí na jeden pór. l oto malé množství je vstříknuto do póru pomocí
-5LZ zval 13 tso dávkovacího zařízení, které Je opatřeno dutou jehlou, přednostně jehlou 18 až 40 Gauclie (G). Použitým dávkovačím zařízením může být např. elektronický dávkovači systém pro pipetu, jehla 18 - 40 G je na konci vybavena dávkovači hadičkou nebo pipetou. Pro průměr póru se hlavně u skalpu užívá přednostně dutá jehla 34 G. Nicméně menší nebo větší jehly mohou být také použity 5 v jiné části těla. Je také možné a lepší, aby byla suspenze aplikována pomocí (elektronického) opakovacího dávkovacího vstřikovacího aparátu, jakým je inzulínové pero. V tom případě se také užívá speciálně pro tento účel vyvinuté jehly, tzv. „zaváděcí foli kulové jehly pro zavedení buněk na požadované místo, poškození kůže je zde téměř nemožné. Zaváděcí folikulová jehla jc pružná a miniaturní jehla, kterou může vlasový folikul projít.
Během vstřikování suspenze mohou být zároveň zaváděny látky, které udržují buňky déle naživu. Příkladem takové látky jsou M inoxidi I a jiná činidla podporující růst.
Vynález se také týká způsobu pěstování vlasových foli kulových buněk z vlasů v anagenní fázi; iš jeden nebo více vlasu v anagenní fázi je umístěno do prostředku, který jc doplněn jedním vhodným keratinocytovým kultivačním prostředkem neobsahujícím sérum a případně jehlou řadou lidské žírnc buňky anebo autologovanými vypěstovanými buňkami CD34' nebo jedním nebo více extrakty z jedné nebo více řad lidské žírné buňky buněk anebo buněk CD34' anebo činidly podporujícími růst. Způsob, jakým může být takový prostředek získán, byl již popsán výše.
Pokud jde o přednosti různých použitých látek prostředku a podmínek pěstování, jsou stejné jako ty pro prostředek a podmínky užité v kroku (2) způsobu již popsaného výše. Proto jc lepší použít jednu řadu žírné buňky, subklon téže anebo autologované vypěstované buňky CD34 anebo činidla podporující růst. Vhodné kultivační podmínky zahrnují teplotu od 30 do 40 °C v atmosfé25 ře. která je nasycena vodou a obsahuje 3 až 10 % objemových C()2.
Vynález se také týká prostředku pro pěstování vlasových tolikulových buněk z vlasů v anagenní fázi a způsobu přípravy zmíněného prostředku. Prostředek podle vynálezu obsahuje nejméně jeden keratinocytový kultivační prostředek neobsahující sérum, případně doplněný jednou řadou 30 lidské žírné buňky anebo autologovaným vypěstovanými buňkami CD34' nebo extrakty z jedné nebo více řad lidské žírné buňky buněk anebo buněk CD34’ anebo činidly podporujícími růst. Zvláštním význačným rysem takového prostředku jc hlavně to. že obsahuje růstové faktory pocházející z jedné nebo více lidských žírnvch buněk anebo auto logo váných vypěstovaných buněk CD34 .
Upřednostňovaný prostředek obsahuje keratinocytový kultivační prostředek neobsahující sérum a extrakty zrady lidské žírné buňky HMC 1 nebo z buněčné řady zní odvozené jako 5(6 nebo KU812 nebo autologované vypěstované buňky CD34 . Další podrobnosti o základních složkách prostředku podle vynálezu byly už uvedeny výše.
Způsob přípravy zmíněného prostřed ku obsahuje následující kroky:
a) přidá se nejméně jedna řada žírnc buňky, subklonu téže anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34 anebo činidel podporujících růst a případně degranulačního činidla případně v kombinaci s organickou solí jako např. CaCb do keratinocytového kultivačního prostředku ? n eo b sa h uj í c í h o sc ru m,
b) degranuluje se řada (řady) žírných buněk, subklonu téže anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34 , takže růstové faktory se uvolní do prostředku.
c) případné se odstraní žírné buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34 z prostředku např. odstředěním, po kterém získáme upravený prostředek.
Podle vynálezu sc žírné buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34 anebo jejich zbytky odstraní z prostředku.
-6CZ 29SIIÍÍ 156
Podmínky, za kterých může byt způsob proveden, nejsou nijak kritické a budou zřejmé pro každého odborníka zdané oblasti techniky. Degranulačním činidlem použitým ve fázi a) jc přednostně Compound 48/80 v kombinaci s CaCl··
Nakonec se vynález týká výchozího prostředku pro pěstování vlasových folikulových buněk z vlasů vanagenní fázi, který obsahuje nejméně jedno vhodné keratinocytové kultivační činidlo neobsahující sérum a které je případně doplněno jednou řadou lidské žírné buňky anebo autologovanými vypěstovanými buňkami CD34 nebo jedním nebo více extrakty z jedné nebo více řad lidské žírné buňky anebo buněk CD34 anebo činidly podporujícími růst anebo degranulačním činidlem. Zmíněné výchozí činidlo muže být užito pro přípravu vhodného upraveného činidla pro pěstování vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi. To může být provedeno jednoduše uskutečněním degranulace. jestliže rada lidských žírných buněk anebo auto logo váné vypěstované buňky CD34’ jsou obě přítomny právě tak jako degranulační činidlo. Pokud jedna z nich chybí, to jest žírné buňky anebo buňky CD34' a degranulační činidlo, musí být nejprve chybějící komponent přidán před provedením degranulace žírných buněk.

Claims (14)

1) odeberou se vlasové folikulové buňky,
1. Způsob kosmetické reprodukce vlasů, který obsahuje následující kroky:
2. Způsob podle nároku I. vyznačující se tím, že řada lidské žírné buňky jc jedna řada žírné buňky, její subklon anebo autologované vypěstované buňky CO34 anebo činidla podporující růst.
2) pěstují se vlasové folikulové buňky za takových podmínek, že jsou schopné množení a
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím. že řada lidské žírné buňky je jedna řada lidské žírné buňky anebo řada autologovaných vypěstovaných buněk CL)34 .
3) implantují se vypěstované vlasové folikulové buňky do recepčních oblastí, vyznačující se tím, že
- se folikulové buňky odeberou vytrhnutím vlasu v anagenní fázi z nejméně jedné donorové oblasti tak. že cibulka charakteristická pro vlas v anagenní fázi je stále připojena k odstraněnému vlasu, načež sc vyberou vhodné vlasy v anagenní fázi, vlasové folikulové buňky se pěstují v kultivačním prostředku, který' se případně doplní
a) alespoň jednou lidskou sloupcovou buněčnou linií anebo autologovanými vypěstovanými buňkami CD34' nebo
b) jedním nebo více výtažky z jedné řady lidské žírné buňky anebo autologovaných buněk CD34 anebo
c) činidly povzbuzujícími růst a
- vypěstované folikulámí vlasové buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34’ jsou implantovány do pórů recepční oblasti.
4. Způsob podle nároků 1 až 3. vyznačující se tím. že vlasové folikulové buňky jsou pěstovány při teplotě od 30 do 40 °C v atmosféře, která je nasycena vodou a obsahuje 3 až 10 % objemových C'CK
5. Způsob podle nároku 1. vyznačující se tím, že vypěstované vlasové folikulové buňky anebo autologované vypěstované buňky CD34 jsou zavedeny do každého póru jako dávka suspenze tak, že dávka suspenze obsahuje dostatek vlasových folikulových buněk anebo autologovaných vypěstovaných buněk CD34*. že to umožňuje rozvoj vlasového folikulu.
6. Způsob podle nároku 5. vyznačující se tím, že množství suspenze, které se ? zavádí do póru je od 0,01 μΐ do 5 μΙ.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že množství suspenze, které se zavádí do póru je od 0,1 μΐ až do 0,5 μΙ.
ίο
8. Způsob podle nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že suspenze je vstříknuta jednotlivě do každého póru pomocí dávkovači pipety, která je opatřena dutou jehlou přednostně jehlou 18 až 40 Gauche.
9. Způsob podle nároků 5 až 7. vyznačující se t í m , že suspenze je vstříknuta
15 pomocí opakovacího dávkovacího vstřikovacího aparátu.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím. že se používá zaváděcí folikulová jehla.
20
11. Použili vlasových folikulových buněk vypěstovaných z vlasů v anagenní fázi jako aktivní složky pro přípravu injekční suspenze pro reprodukci vlasů, přičemž vlasy se odstraňují z alespoň jedné donorové oblasti tak. že cibulka charakteristická pro vlas v anagenní fázi jc stále připojena k vlasu a vlas sc odstraňuje vytržením vlasu z. alespoň jedné donorové oblasti, načež se vyberou vhodné vlasy v anagenní fázi, přičemž vlasové folikulové buňky sc pěstují z vhodných vlasů
25 v anagenní fázi za podmínek, při kterých se vlasové folikulové buňky množí a vlasové folikulové buňky se pěstují v kultivačním prostředku, který' má
a) alespoň jednu lidskou sloupcovou buněčnou linii anebo autologované vypěstované buňky CD34 nebo
b) alespoň jeden výtažek z řady lidské žírné buňky anebo buněk CD34 anebo .tu c) činidla povzbuzující růst.
12. Použití podle nároku 11. kde řada lidské žírné buňky je jedna řada žírné buňky, její subklon anebo aulo logo vaně vypěstované buňky CD34 anebo činidla podporující růst.
35
13. Použití podle nároku 12, kde řada lidské žírné buňky je jedna řada žírné buňky anebo autologovaná vypěstovaná řada buněk CD34 .
14, Použití podle nároku 1 I až 13, kde se vlasové folikulové buňky pěstují při teplotě od 30 do 40 °C v atmosféře, která je nasycena vodou a obsahuje 3 až 10 % objemových CO?.
CZ0313499A 1997-03-05 1998-03-05 Zpusob kosmetické reprodukce vlasu a pouzití vlasových folikulových bunek CZ298118B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1005445A NL1005445C2 (nl) 1997-03-05 1997-03-05 Werkwijze voor het vermenigvuldigen van haar.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ313499A3 CZ313499A3 (cs) 2000-02-16
CZ298118B6 true CZ298118B6 (cs) 2007-06-27

Family

ID=19764538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0313499A CZ298118B6 (cs) 1997-03-05 1998-03-05 Zpusob kosmetické reprodukce vlasu a pouzití vlasových folikulových bunek

Country Status (23)

Country Link
US (1) US6399057B1 (cs)
EP (1) EP0971679B1 (cs)
JP (1) JP2001526560A (cs)
CN (1) CN1254277A (cs)
AT (1) ATE219654T1 (cs)
AU (1) AU732729B2 (cs)
BR (1) BR9808190A (cs)
CA (1) CA2283172A1 (cs)
CZ (1) CZ298118B6 (cs)
DE (1) DE69806232T2 (cs)
DK (1) DK0971679T3 (cs)
EA (1) EA199900799A1 (cs)
ES (1) ES2176977T3 (cs)
HK (1) HK1025052A1 (cs)
ID (1) ID22700A (cs)
IL (1) IL131740A (cs)
NL (1) NL1005445C2 (cs)
NO (1) NO312805B1 (cs)
NZ (1) NZ337640A (cs)
PL (1) PL335723A1 (cs)
PT (1) PT971679E (cs)
TR (1) TR199902184T2 (cs)
WO (1) WO1998047471A1 (cs)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1472501A (en) * 1999-11-05 2001-05-14 Gerigene Medical Corporation Augmentation and repair of age-related soft tissue defects
KR20020005331A (ko) * 2000-07-10 2002-01-17 정상훈 모낭 세포의 배양 방법 및 모발 이식용 키트
AU2001279209B2 (en) 2000-08-08 2006-08-24 Aderans Research Institute, Inc. Scaffolds for tissue engineered hair
KR100371274B1 (ko) * 2000-08-09 2003-02-06 정상훈 모발 이식용 키트
US20030161815A1 (en) * 2002-02-12 2003-08-28 Intercytex Limited Cell delivery system
US7785876B2 (en) * 2002-11-14 2010-08-31 Aderans Research Institute, Inc. Cultivation of hair inductive cells
JP2008508888A (ja) * 2004-08-05 2008-03-27 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 細胞活性化のための方法および組成物
US20060073117A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-06 Stowers Institute For Medical Research Methods and compositions for controlling hair follicle stem cell fate
KR100616752B1 (ko) * 2004-11-29 2006-08-31 박정극 모낭 유도 능력이 있는 모유두 조직의 제조방법
NL1030484C1 (nl) 2005-11-22 2007-05-23 Hair Science Inst Werkwijze voor in vivo haarvermenigvuldiging.
US20070148138A1 (en) 2005-11-22 2007-06-28 Aderans Research Institute, Inc. Hair follicle graft from tissue engineered skin
EP1986731A4 (en) 2006-02-09 2012-11-07 Aderans Res Inst Inc APPARATUS AND METHODS FOR DELIVERING FLUID AND MATERIAL TO A SUBJECT
EP2007877B1 (en) 2006-02-28 2013-04-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for compact aggregation of dermal cells
GB0605450D0 (en) 2006-03-17 2006-04-26 Intercytex Ltd Cell co-culture
KR100771171B1 (ko) * 2006-07-05 2007-10-29 재단법인서울대학교산학협력재단 모낭 줄기세포의 분리, 증식 및 분화 방법 및 대머리치료용 조성물
EP1964519B1 (en) * 2007-03-01 2009-09-02 Sony Corporation Method for extracting a biosubstance from hair and hair sampling device useful in the method
JP2010540425A (ja) * 2007-09-21 2010-12-24 インターサイテックス リミテッド 毛包形成を増強するための表皮刺激
CN103476360B (zh) * 2011-04-26 2015-09-23 李喜永 毛发移植材料
NL2009971C2 (en) 2012-12-12 2014-06-16 Hair Science Inst Method for in vivo hair multiplication.
NL2010225C2 (en) * 2013-02-01 2014-08-04 Conradus Ghosal Gho Composition and method for preserving, transporting and storing living biological materials.
NL2010222C2 (en) * 2013-02-01 2014-08-04 Conradus Ghosal Gho Composition and method for generating a desired cell type and/or tissue type from hair follicular stem cells.
GB201816902D0 (en) * 2018-10-17 2018-11-28 Hairclone Ltd Hair Rejuvenation
CN112245454A (zh) * 2020-10-16 2021-01-22 潍坊卡多娜生物科技有限公司 一种细胞疤痕修复方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ281802B6 (cs) * 1993-07-23 1997-02-12 L'oreal Kosmetické prostředky pro udržování účesu, které mají zlepšenou fixační sílu
CZ287104B6 (en) * 1993-10-15 2000-09-13 Merck & Co Inc Pharmaceutical preparation for treating androgenic alopecia

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8604360D0 (en) * 1986-02-21 1986-03-26 Univ Dundee Stimulation of hair growth
US5635387A (en) * 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
AU8196891A (en) * 1990-06-25 1992-01-23 Immunex Corporation Mast cell growth factor
US5130142A (en) * 1990-10-31 1992-07-14 The Practer & Gamble Company Hair growth regulating composition comprising epithelium cell supernatant-derived growth factor
US5556783A (en) * 1991-03-27 1996-09-17 Trustees Of Univ. Of Penna Methods of culturing and modulating the growth of hair follicular stem cells
JP3573488B2 (ja) * 1994-04-11 2004-10-06 独立行政法人 科学技術振興機構 毛乳頭細胞の長期継代培養法
JPH11504016A (ja) * 1995-04-20 1999-04-06 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 毛髪の成長を調節する組成物及び方法
US6050990A (en) * 1996-12-05 2000-04-18 Thermolase Corporation Methods and devices for inhibiting hair growth and related skin treatments

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ281802B6 (cs) * 1993-07-23 1997-02-12 L'oreal Kosmetické prostředky pro udržování účesu, které mají zlepšenou fixační sílu
CZ287104B6 (en) * 1993-10-15 2000-09-13 Merck & Co Inc Pharmaceutical preparation for treating androgenic alopecia

Also Published As

Publication number Publication date
CZ313499A3 (cs) 2000-02-16
NO994311L (no) 1999-11-03
DK0971679T3 (da) 2002-07-22
NO312805B1 (no) 2002-07-08
WO1998047471A1 (en) 1998-10-29
NO994311D0 (no) 1999-09-06
BR9808190A (pt) 2000-05-16
EA199900799A1 (ru) 2000-02-28
PL335723A1 (en) 2000-05-08
DE69806232D1 (de) 2002-08-01
EP0971679A1 (en) 2000-01-19
HK1025052A1 (en) 2000-11-03
CA2283172A1 (en) 1998-10-29
PT971679E (pt) 2002-11-29
US6399057B1 (en) 2002-06-04
ATE219654T1 (de) 2002-07-15
IL131740A (en) 2003-12-10
EP0971679B1 (en) 2002-06-26
NZ337640A (en) 2001-02-23
AU732729B2 (en) 2001-04-26
TR199902184T2 (xx) 1999-12-21
CN1254277A (zh) 2000-05-24
JP2001526560A (ja) 2001-12-18
ID22700A (id) 1999-12-09
ES2176977T3 (es) 2002-12-01
NL1005445C2 (nl) 1998-09-21
AU6638898A (en) 1998-11-13
DE69806232T2 (de) 2003-02-06
IL131740A0 (en) 2001-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ298118B6 (cs) Zpusob kosmetické reprodukce vlasu a pouzití vlasových folikulových bunek
RU2507254C2 (ru) Способы получения волосяных микрофолликулов и de novo сосочков и их применение для in vitro тестов и in vivo имплантаций
JP6215216B2 (ja) 毛包外毛根鞘からメラノサイトを誘導する方法および移植のための調製
ES2387617T3 (es) Cultivo de células inductoras de cabello
JPH07274950A (ja) 毛乳頭細胞の長期継代培養法
JP2001509064A (ja) 真皮、皮下、および声帯組織欠損の増大および修復
US20030198646A1 (en) Compositions and methods for inducing new hair follicle formation and hair growth in a desired orientation
JPH11180878A (ja) 発毛誘導剤および発毛方法
EP1337624B1 (de) Zellkonstrukte erhältlich aus mesenchymalen stammzellen und davon ableitbaren zellen und ihre verwendung
US8870905B2 (en) Method for in vivo multiplication of hair
CN111417717A (zh) 真皮乳头和毛囊等同物的体外制备方法
US20090148416A1 (en) Angiogenically induced transplants and methods for their use and manufacture
JP2010241756A (ja) 毛包の毛成長能回復方法および細胞移植器具
MXPA99008149A (en) Method for the propagation of hair
CN117337185A (zh) 包含缺端胶原和真皮鞘杯(dsc)细胞的组合物、用于将毛发再生的试剂盒、制造用于将毛发再生的组合物的方法和将毛发再生的方法
KR20230149166A (ko) 동종이식을 위한 면역적합성 모유두 세포의 분리 및 배양 방법, 및 이의 용도
JP2003180819A (ja) 移植用材料及び細胞保持担体
Raposio et al. Follicular bisection in hair transplantation surgery

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19980305