CZ293631B6

CZ293631B6 - Kosmetický prostředek

Info

Publication number: CZ293631B6
Application number: CZ2001886A
Authority: CZ
Inventors: Ronni Lynn Weinkauf; Uma Santhanam; Laura Rose Palanker; Thomas Eugane Januario; Anita Marie Brinker
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1998-09-10
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2004-06-16
Also published as: AU4259799A; CN1205914C; AU740627B2; JP2002524482A; BR9913589A; PL196079B1; PL346866A1; ZA200101828B; MXPA01002531A; WO2000015179A2; CA2343130C; EP1109527A2; CA2343130A1; WO2000015179A3; DE69902473T2; EP1109527B1; ES2181501T3; US6022896A; ID29403A; KR20010086399A

Abstract

Prostředky obsahující alfa hydroxykyseliny a dále obsahující kyselinu petroselinovou jako činidlo, působící proti podráždění a/nebo proti pálení.ŕ

Description

Předkládaný vynález se týká použití kyseliny petroselinové v kosmetickém prostředku a ve způsobu ke snížení nebo odstranění podráždění pokožky nebo pálení, indukovaných alfa hydroxykyselinami.

Dosavadní stav techniky

Bylo ověřeno, že alfa hydroxykyseliny (tzv. AHA) poskytují kosmetický přínos, jako je zlepšení vzhledu světelným zářením poškozené nebo přirozeně zestárlé pokožky, vylehčení pokožky, úprava stařeckých skvrn a podobně. Bohužel jejich použití ve vysokých koncentracích může být příležitostně spojeno s podrážděním pokožky, např. zarudnutím kůže a pocitem pálení po nanesení. Viz např. A. M. Kligman: J. Geriatr. Dermatol. 5(3), 128-131, 1997. Podráždění může být zlepšeno snížením množství aktivní přísady v prostředku, anebo snížením průstupu aktivní látky pokožkou. Vážnou nevýhodou obou přístupů je to, že dochází k oslabení účinnosti. Podráždění působené AHA může být omezeno zvýšením pH prostředku, avšak tento způsob poskytuje menší účinnost vzhledem ke sníženému pronikání AHA pokožkou. Žádoucí je snížit nebo odstranit schopnost AHA vyvolávat podráždění za současného zachování jejich účinnosti.

Evropská patentová přihláška č. 0 631 722 (Johnson & Johnson) předkládá použití kyseliny glykolové ke snížení podráždění pokožky retinolem. Patent US 5 516 793 (Duffy) předkládá použití kyseliny askorbové pro zlepšení podráždění, vyvolaného různými místně nanášenými přísadami, včetně AHA.

Použití olejů, bohatých na petroselinovou kyselinu, například oleje ze semen koriandru, v kosmetických prostředcích určených pro pokožku, bylo již dříve uvedeno (EP 0709084 A2). EP 0709084 předkládá použití oleje z koriandrových semen jako zvlhčujícího činidla, ale neobjevuje schopnost kyseliny petroselinové snižovat podráždění. Navíc je zmiňována volitelná přítomnost různých přísad, například keratolytických činidel jako hydroxykyselin (kyseliny n-oktanoyl-5salicylové). Kyselina salicylová je beta hydroxykyselinou, o níž je známo, že účinkuje jiným způsobem než alfa hydroxykyseliny a předpokládá se, že je méně dráždivá.

Výše diskutovaný stav techniky nepředkládá kombinace AHA s olejem z koriandrových semen nebo kyselinou petroselinovou v kosmetických prostředcích a nezdá se navrhovat použití kyseliny petroselinové pro snížení podráždění nebo pálení, spojených s použitím alfa hydroxykyselin.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje, z jedné části, prostředek obsahující alfa hydroxykyselinu (AHA) a obsahující dále kyselinu petroselinovou.

Vynález rovněž zahrnuje způsob kosmetického snížení podráždění nebo pálení, indukovaného místním nanesením prostředku obsahujícího AHA, přičemž tento způsob zahrnuje místní nanesení kyseliny petroselinové ke snížení podráždění, indukovaného prostředkem. V souladu s vynalezeným způsobem může být kyselina petroselinové přítomna společně sAHA ve stejném prostředku, anebo může být nanášena z odděleného prostředku.

Podle předkládaného vynálezu je díky místnímu nanesení kyseliny petroselinové sníženo nebo odstraněno podráždění či pálení, indukované místní nanesením AHA. Bylo zjištěno, jako součást

-1 CZ 293631 B6 předkládaného vynálezu, že ne všechna známá činidla, působící proti podráždění, zlepšují podráždění indukované působením AHA.

Vynález tedy rovněž zahrnuje použití kyseliny petroselinové v kosmetickém prostředku pro snížení podráždění nebo pálení, indukovaného působením AHA.

Pokud není uvedeno jinak, jsou veškerá množství uváděna hmotnostně vzhledem k prostředku.

Kyselina petroselinová /CH₃(CH2)ioCH=CH(CH₂)₄COOH/ je nezbytnou přísadou prostředků podle vynálezu.

Množství kyseliny petroselinové v prostředcích podle vynálezu se obecně pohybuje od 0,05 % do 20 % hmotnosti prostředku, lépe od 0,1 % do 10 % a nejlépe od 0,5 do 5 % hmotnosti prostředku.

AHA zesilují proliferaci a zvyšují biosyntézu ceramidů v keratinocytech, zvyšují tloušťku epidermu a zvyšují otupování a uvolňování buněk normální pokožky, výsledkem čehož je hladší, mlaději vyhlížející pokožka.

Alfa hydroxykyselina může být kombinací stereoizomerů (DL, D nebo L).

Alfa hydroxykyseliny (AHA) mají obecnou strukturu (1):

OH

I

MCHCOOH (1), kde M je vodík nebo nasycený či nenasycený, rovný nebo větvený uhlovodíkový řetězec, obsahující od 1 do 27 atomů uhlíku.

Ještě lépe je hydroxykyselina zvolena z kyseliny mléčné, kyseliny 2-hydroxyoktanové, kyseliny hydroxylaurové, kyseliny glykolové a jejich směsí. Pokud existují stereoizomery těchto kyselin, přednost se dává L-izomeru.

Rozumí se, že v závislosti na pH prostředku může být hydroxykyselina přítomna jako sůl, například amonná, draselná nebo sodná sůl.

Ačkoli prostředky podle vynálezu mohou mít jakékoli pH v obecném rozmezí od 2,5 do 10, jsou prostředky podle vynálezu zvláště výhodné, pokud mají kyselé pH (zejména pokud obsahují hydroxykyselinu), nejlépe pH 3 až 4, neboť takové prostředky jsou zvláště účinné. Bohužel, při tomto pH prostředky rovněž vyvolávají podráždění.

Zvláštní výhodou prostředků podle vynálezu je možnost použití vyšších množství hydroxykyselin nebo retinoidů, aniž by způsobily podráždění pokožky. Množství hydroxykyselinové složky přítomné v prostředku podle vynálezu s výhodou činí 0,01 až 20 %, lépe 0,1 až 12 % a nejlépe 2 až 12 % hmotnosti prostředku.

Prostředky podle vynálezu, jimž se dává největší přednost a které obsahují jako činidlo působící proti podráždění kyselinu petroselinovou, zahrnují kyselinu glykolovou a/nebo kyselinu mléčnou, neboť bylo zjištěno, že tyto přísady vyvolávají podráždění, nicméně bylo ověřeno, že jsou zvláště účinné při poskytování kosmetických výhod.

Prostředky pro péči o pokožku podle vynálezu také zahrnují kosmeticky přijatelné vehikulum (pojidlo) nebo nosič, které je inertní, obvykle přísadu přítomnou v největším množství a sloužící k dodání aktivních nebo výkonných přísad.

-2CZ 293631 B6

Vehikula jiná než voda mohou zahrnovat kapalná nebo pevná změkčovadla, rozpouštědla, zvlhčující činidla, zahušťovadla a prášky. Zvláště upřednostňovaných nevodným nosičem je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Silikony podle tohoto vynálezu mohou být ty, jimž viskozita se pohybuje kdekoli mezi přibližně 1x10’ m²/s (lOcSt) až lOnr/s (10 000 000 cSt) při 25 °C. Zvláště žádoucí jsou směsi silikonů o nízké a vysoké viskozitě. Tyto silikony jsou dostupné od firmy Generál Electric Company pod zapsanými značkami Vicasil, SE a SF a od firmy Dow Coming Company jako 200 a 550 Serie. Množství silikonů, která mohou být použita v prostředcích podle předkládaného vynálezu, se pohybují kdekoli v rozmezí od 5 do 95 % a lépe od 25 do 90 % hmotnosti prostředku. Množství vehikula se může pohybovat v rozmezí přibližně od 2 do 99 %, lépe přibližně od 50 do 99 % a nejlépe přibližně od 80 do 99 % hmotnosti celého prostředku.

Podle předkládaného vynálezu je vehikulum s výhodou představováno alespoň z 60 % hmotn. vodou, vzhledem k hmotnosti vehikula. Prostředky podle vynálezu jsou s výhodou emulzemi oleje ve vodě pro zlepšení dodávání hydroxykyselin do pokožky. (Viz A. Sah: An in-vitro study of the effect of formulation variablet and product structure on the delivery of alpha-hydroxy acid (Lactic acid) to skin, MS Thesis, Departement of Pharmaceutical Sciences of the College of Pharmacy, University of Cincinnai, OH, červenec 1996). Takové zlepšené podávání je často doprovázeno zvýšeným podrážděním nebo pálením, což činí použití kyseliny petroselinové v takových emulzích zvláště kritických. V upřednostňovaných emulzích typu olej ve vodě podle předkládaného vynálezu voda tvoří alespoň 50 % hmotn. emulze podle vynálezu a nejlépe 50 až 70 % hmotn. vzhledem ke hmotnosti prostředku.

Volitelné látky prospívající pokožce a kosmetické doplňky

V kosmetických prostředcích podle předkládaného vynálezu mohou být přítomné různé typy aktivních přísad. Aktivní látky jsou definovány jako pokožce prospěšná činidla, lišící se od změkčovadel, a jiná než přísady, které jen zlepšují fyzikální charakteristiky prostředku. Ačkoli se neomezují na tuto kategorii, obecné příklady zahrnují sloučeniny působící proti vráskám, ochranná činidla proti slunečnímu záření a samoopalovací činidla.

Ochranná činidla proti slunečnímu záření zahrnují materiály, běžně používané k blokování ultrafialového záření. Ilustrativními sloučeninami jsou oxid titaničitý, deriváty PABA (kyseliny paraaminobenzoové), kyseliny skořicové a salicylové. Použít lze například oktylmethoxyskořičnan (cinnamát) a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon (známý také jako oxybenzon). Oktylmethoxyskořičnan a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon jsou obchodně dostupné pod zapsanými značkami Parsol MCX a Benzophenone-3. Přesné množství ochranného činidla proti slunečnímu záření, použitého v emulzích, se může lišit v závislosti na stupni požadované ochrany před UV zářením.

Jinou kategorií funkčních přísad v kosmetických prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou zahušťovadla. Zahušťovadlo bude obvykle přítomno v množstvích kdekoli mezi 0,1 a 20% hmotn. a s výhodou přibližně mezi 0,5 % a 10% hmotnosti prostředku. Příkladnými zahušťovadly jsou zesíťované polyakrylátové materiály, dostupné pod zapsanou značkou Carbopol od B.F. Goodrich Company. Mohou být použity také gumy, jako xanthanová guma, karagen, želatina, karaya, pektin a karubová guma. Za určitých okolností může být zahušťovací funkce zajišťována materiálem, který rovněž slouží jako silikon nebo změkčovadlo. Například silikonové gumy v přebytku 1.10'⁵ m²/s (10 cSt) a estery jako stearát glycerolu mají dvojí funkčnost.

Do kosmetického prostředku podle vynálezu mohou být začleněny prášky. Tyto prášky zahrnují talek, křídu, Fullersovu hlinku, kaolin, škrob, smektitové jíly, chemicky modifikovaný křemičitan hořečnato-hlinitý, organicky modifikovaný montmorillonitový jíl, hydratovaný křemičitan hlinitý, kouřovou siliku, hlinitý škrobový oktenylsukcinát a směsi těchto látek.

Další doplňkové menší složky mohou být rovněž začleněny do kosmetických prostředků. Takové přísady mohou zahrnovat barvicí činidla, zneprůhledňující činidla a parfemační činidla. Množství

-3CZ 293631 B6 těchto jiných složek se mohou pohybovat kdekoli v rozmezí od 0,001 % do 20% hmotnosti prostředku.

Použití prostředku

Prostředek podle vynálezu je prvotně zamýšlen jako výrobek pro místní nanášení na lidskou pokožku, zvláště jako činidlo pro zjemnění pokožky a jako kondicionér a pro prevenci nebo snížení vrásčitosti či vzhledu zestárlé kůže.

Při používání se malé množství prostředku, například 1 až 10 ml. nanese na vystavené plochy pokožky z vhodného zásobníku nebo aplikátoru a pokud je to nezbytné, je potom rozetřeno a/nebo vmasírováno do pokožky za použití ruky, prstů nebo vhodného zařízení.

Podle předkládaného způsobu dle tohoto vynálezu je podráždění pokožky, indukované aktivní přísadou, sníženo nebo odstraněno místním nanesením petroselinové kyseliny. Kyselina petroselinová může být společně přítomna s aktivní přísadou, nebo může být na pokožku nanášena odděleně od aktivní přísady.

Forma výrobku a balení

Prostředek k místnímu ošetření pokožky podle vynálezu může být formulován jako pleťová voda, tekutý krém, krém nebo gel. Prostředek může být balen ve vhodném zásobníku, vyhovujícím jeho viskozitě a zamýšlenému použití zákazníkem. Například pleťová voda nebo tekutý krém mohou být baleny do lahve nebo aplikátoru s otočnou kuličkou, nebo do kapsle či hnacím plynem poháněného aerosolového zařízení, anebo do zásobníku vybaveného pumpičkou, vhodnou pro ovládání prsty. Pokud je prostředek ve formě krému, může být jednoduše skladován v nedeformovatelné lahvičce nebo ve vytlačovacím zásobníku, jako je tuba nebo zavíčkovaná nádobka.

Vynález rovněž poskytuje uzavřený zásobník, obsahující kosmeticky přijatelný prostředek, jak je zde definován.

Kyselina petroselinová může být balena odděleně od prostředku, obsahujícího alfa hydroxykyseliny.

Následující specifické příklady dále ozřejmí vynález, ovšem vynález se na ně neomezuje.

Příklady provedení vynálezu

Srovnávací příklad 1

Byl připraven emulzní základ, mající následující složení.

plný chem. název či název dle CFTA	firemní název a % aktivní složky jak je získána	% hmotnostní
voda, deionizovaná		46,54
dvoj sodná sůl EDTA	Sequesterene Na2	0,05
křemičitan hořečnato-hlinitý	Veegum Ultra	0,6
methylparaben	Methyl Paraben	0,15
dimethicon	DC Antifoam Emulsion	0,01
butylenglykol 1,3	Butylene Glycol 1,3	3,0
hydroxyethylcelulóza	Natrosol 250HHR	0,5

-4CZ 293631 B6

plný chem. název či název dle CFTA	firemní název a % aktivní složky jak je získána	% hmotnostní
glycerin, podle US lékopisu	Glycerine USP	2,0
xanthanová guma	Keltrol 1000	0,2
triethano lamin	Triethanolamine 99 (%)	1,2
kyselina stearová	Pristerene 4911	3,0
propylparaben, nehořlavý	Propylparaben NF	0,1
glycerylhydrostearát	Naturechem GMHS	1,5
stearylalkohol	Lanette 18DEO	1,5
izostearylpalmitát	Protachem ISP	6,0
oktanoát C12-C15 alkoholů	Hetester FAO	3,0
dimethicon	Silicone Fluid 200 (50 %)	1,0
cholesterol, nehořlavý	Cholesterol NF	0,5
stearát sorbitanu	Sorbitanstearát	1,0
butylovaný hydroxytoluen	Embanox BHT	0,05
tokoferylacetát	Acetát vitaminu E	0,1
stearát PEG-100	MYRJ 59	2,0
solium stearoyllaktylát	Pationic SSL	0,5
retinylpalmitát	Palmitát vitaminu A 84 %	0,06
kyselina hydroxykaprylová	kyselina hydroxykaprylová	0,01
voda, deionizovaná		dle potřeby do 99,80
alfa-bisabolol	alfa-bisabolol	0,2
J>H		7-8

EDTA = kyselina ethylendiamintetraoctová

Dimethicone = protipěnivá emulze na bázi dimethylpolysiloxanu, vyrábí firma Dow Coming jako Dow Coming245 Fluid

PEG = polyethylenglykol

Přídavné přísady uváděné níže v tabulce 1 byly přidávány namísto vody.

Subjekty byly testovány metodou testu podráždění, popsanou níže.

Metoda testu podráždění

Test čtyřnásobného použití náplasti: Cílem bylo srovnat úroveň podráždění vyvolaného různými testovanými materiály po opakovaných použití náplasti. Testované materiály byly uvedeny do styku s pokožkou v uzavřených podmínkách. Zevní horní část paže hodnotícího byla určena jako oblast nanášení. Páskový obvaz (páska Scanpor®) byl použit k upevnění polštářkových náplastí (25 mm Hill Top® Chamber, doplněno kotoučem vycpávky Webril® o průměru 18 mm) na místo. Použity byly obě paže hodnotícího. Náplasti byly upevňovány v symetrickém náhodném pořadí.

Náplasti byly upevněny v 9,00 hodin v pondělí ráno a odstraněny v 9,00 hodin v úterý ráno (24 hodin vystavení účinkům). Nová sada náplastí byla upevněna v 15,00 hodin v úterý odpoledne a odstraněna ve středu ráno v 9,00 hodin (18 hodin vystavení účinkům). Třetí sada náplastí byla upevněna v 15 hodin ve středu odpoledne a odstraněna v 9,00 hodin ve čtvrtek ráno (18 hodin vystavení účinkům). Konečná sada náplastí byla upevněna v 15,00 hodin ve čtvrtek odpoledne a odstraněna v 9,00 hodin v pátek ráno (18 hodin vystavení účinkům).

Při každém odstranění náplastí byla místa omyta teplou vodou a poklepáváním vysušena. Poté byla testována místa označena chirurgickou tužkou pro označování kůže k zajištění polohy pro

-5CZ 293631 B6 hodnocení a následné upevnění náplasti. Testovaná místa byla hodnocena v 15,00 hodin v úterý, středu, čtvrtek a pátek v průběhu studie, před dalším upevněním náplasti.

Podráždění kůže jako mírné zarudnutí, vysušenost a/nebo svědění testovacích míst se očekává. Otok testovacích míst je možný. Pokud některé testovací místo vykazovalo mírné zarudnutí nebo jakýkoliv otok při jakémkoli vy hodnocení, nebylo toto určité místo znovu přelepováno náplastí.

Testovací místa na obou rukou byla vizuálně hodnocena dvěma zkušenými posuzovateli při odpovídajícím osvětlení. Testovací místa byla rozdělena podle závažnosti příznaků. Posuzovatel hodnotící odpovědi v první části stanovení pokračoval v posuzování i po všechny další dny průběhu studie.

V hodnocení reakcí získala místa s nejzávažnější odpovědí nejnižší bodové hodnocení (skóre). Místa s druhou nejzávažnější odpovědí získala druhé nejnižší skóre a tak dále. Nebylo používáno žádné povinné hodnocení. Pokud dvě či více míst nevykazovala odpověď nebo měla stejnou odpověď (místa se nelišila), byl určen průměr umístění (skóre). Pokud místo nebylo vzhledem ke stupni podráždění dále hodnoceno, místo si podrželo umístění (skóre), které získalo v době přerušení dávkování.

Statistická analýza

Výsledky hodnocení nalepení náplastí byly statisticky srovnány neparametrickými statistickými metodami. Testované materiály, obsahující látky působící proti podráždění, byly srovnány s odpovídajícími kontrolními látkami, obsahujícími pouze hydroxykyselinu a/nebo retinoid. Použita byla Freidmanova suma umístění. Působení byla srovnávána se složením 2 (kontrola) v každém bodu stanovení za použití Freidmanovy analýzy, přičemž testující osoba působila jako seskupení (tj. každá testovaná osoba byla testována vzhledem ke každému sledovanému působení). Hodnota „p“ menší než 0,1 byla brána jako statisticky významná.

Prostředky, obsahující složky, jak jsou uvedeny v tabulce 1, byly testovány za použití metody testu podráždění. Testováno bylo 20 subjektů. Čím vyšší je součet umístění (skóre), tím menší je podráždění.

Tabulka 1

Výsledky z testu podráždění

prostředek	přísady	suma umístění (den 4)
1	základní složení	68,5*
2	kontrola: zákl. složení + 8% kys. glykolová a 0,075% retinol	46,5
3	prostředek č. 2 + 3% olej ze semen černého rybízu	58,0
4	prostředek č. 2 + 1% sambucus	44,5

* významně méně dráždící než prostředek č. 2 Sambucus canadensis = bezinka

Z výsledků v tabulce 1 je zřejmé, že po čtyřech přelepeních byla 8% kyselina glykolová spolu s 0,075 % retinolem (č. 2) významně dráždivější než základní složení č. 1 1% bezinky nebo 3% olej ze semen černého rybízu podráždění významně nesnížily. Nicméně podráždění vyvolávané alfa hydroxykyselinou je problémem, který nelze řešit nanesením ani tak dobře známých protidráždivých činidel, jak je bezinka a černý rybíz.

-6CZ 293631 B6

Srovnávací příklad 2

Prostředky 1, 5 a 11 až 14, obsahující přísady uvedené v tabulce 2, byly testovány za použití metody testu podráždění, popsané v příkladu 1. Testováno bylo sedmnáct jedinců. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. Čím vyšší je součet umístění (skóre), tím menší je podráždění.

Tabulka 2

Výsledky testu podráždění

prostředek č.	přísady	součet umístění (den 4)
1	základní složení	74,5^a
5	zákl. složení + 8% kys. glykolová + 0,075% retinol	61,5
11	prostředek č. 5 + 1% zelený čaj	51,0
12	prostředek č. 5 + 0,1% K₂ kyselina glycyrrhetinová	54,5
13	prostředek č. 5 + 3% Quench T*	58,5
14	prostředek č. 5 + 3% Polyolový prepolymer-2**	57,0

^a statisticky méně dráždivý než prostředek č. 5 * činidlo působící proti podráždění od firmy Centerchem (obsahující vodu, butylenglykol, extrakt z kovových zrn, guaranový extrakt, extrakt z maté).

** činidlo působící proti podráždění od firmy Penederm, lne. (název podle CFTA je polypropylenglykol-12/SMDI kopolymer).

Jak je zřejmé z výsledků uvedených v tabulce 2, žádné ze známých testovaných činidel působících proti podráždění nebylo schopno významně snížit podráždění, indukované prostředkem č. 5 (obsahujícím 8% kyselinu glykolovou a 0,075% retinol).

Příklad 3

Tento příklad ukazuje, že místní nanesení alfa hydroxykyselin uvolňuje interleukin 1-alfa (ILla) ze stratům corneum, rohovité vrstvy pokožky.

Je známo, že stratům corneum je „skladem“ prozánětlivého cytokinu IL-Ια (L. Wood, P. Elias, C. Calhoun, J. Tsai, C. Grunfeld, K. Feingold: Barries Disruption Stimulates Interleukin - la Expression and Release from Pre-Formed Pool in Murine Epidermis. J. Invest. Dermatol. 106, 397-403, 1996). Následující příklad dokresluje, že místní nanesení alfa hydroxykyselin indukuje uvolnění IL-Ια v lidské pokožce.

Ex vivo imunohistochemické barvení IL-1 a:

Pokožka zemřelého byla po dobu 30 minut v ledu ovlivňována prostředkem o základním složení (viz srovnávací příklad 1), který dále obsahoval 8% kyselinu glykolovou (GA) o pH 3,8; nebo krém vehikula (základní složení), nebo vodný roztok 8% kyseliny mléčné (LA) o pH 3,8; nebo pufr Tris (pH 7,6). Biopsie o průměru otvoru 8 mm byly odebrány a fixovány ve formaldehydu. Řezy 5μ byly inkubovány spolu s polyklonálním anti-lidským IL-Ια (R&D Systems, zředění 1/50) a rozvíjeny za použití komplexního postupu s avidinem-biotinem-křenovou peroxidázou podle instrukcí výrobce (Vector Labs) a 3-amino-9-ethylkarbazolem jako chromogenem. Intenzita pozitivního označení (% nabarvené plochy) IL-Ια byla kvantifikována za použití zařízení ImagePro Plus, verse 3 (Media Cybemetics, Silver Spring, MD). Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

	8% kys. mléčná	pufr Tris	8% glykolový krém	krém vehikula
% zabarvené plochy	42,7 ± 12*	14,2 ± 10,4	48,4+15,4**	2,0 ± 1,7

* významné ve srovnání s pufrem Tris v t-testu, p<0,01 ** významné ve srovnání s vehikulem v t-testu, p<0,03

Z výsledků uvedených v tabulce 3 je zřejmé, že působení 8% kyselinou mléčnou zvýšilo barvení IL-Ια ve srovnání s kontrolou, pufrem Tris. Nadto 8% krém kyseliny glykolové vyvolal významný nárůst barvení IL-Ια ve srovnání s vehikulem. Místní nanesení alfa hydroxykyselin (kyseliny glykolové a kyseliny mléčné) se zdálo stimulovat okamžité uvolnění IL-Ια v pokožce (epidermu). Rohovitá vrstva, stratům corneum, se zdá být nejpochopitelnějším zdrojem, neboť je známo, že velká množství IL-Ια jsou uchovávána v korneocytech a/nebo v jejich okolí.

IL-Ια, uvolněný po ovlivnění alfa hydroxykyselinou, je schopen spustit kaskádu kyseliny arachidonové, která přeměňuje kyselinu arachinovou na množství metabolitů zánětu, jako je prostaglandin E2 (PGE2). Prostaglandiny hrají centrální roli v zánětu a týkají se proto patogeneze a ovlivnění podráždění (T. Kupper v Immunology: The Role of Cells and Cytokines in immunity and Inflammation, J.J. Oppenheim a E.J. Schevach, editoři, Oxford University Press, New York, 1990, str. 283-305).

Příklad 4

Následující příklad ukazuje, že kyselina petroselinová může účinně inhibovat indukci PGE2, vyvolanou IL-Ια, který je naopak uvolňován alfa hydroxykyselinami. Kyselina petroselinová by tedy mohla být účinná při snižování podráždění, vyvolaného alfa hydroxykyselinami.

Neonatální (novorozenecké) lidské kožní fibroblasty (5 až 9 pasáží) byly nasazeny pro pěstování při hustotě 7500 buněk na jamku do 96-jamkových destiček pro tkáňové kultury (ComingCostar, Coming, NY). Použitým médiem bylo podle Dulbecca modifikované Eaglovo médium (DMEM) s vysokým obsahem glukózy (dodává firma Gibci/Life Technologies, Geithersburg, MD), doplněné 2 mmol.1'¹ L-glutaminem, 10% fetálním hovězím sérem, antimykotickým roztokem a roztokem antibiotik (vše rovněž od Life Technologies). Po 48 hodinách byla každá jamka dvakrát promyta 200 μΐ DMEM bez obsahu séra a buňkám byly v DMEM s L-glutaminem přidány v objemu 200 μΐ IL-Ια v koncentraci 1 ng/ml a/nebo aktivní látka. Po 6 hodinách byly buňky mikroskopicky testovány vzhledem ke kvalitativní životnosti a médium bylo sebráno a zamraženo až do provedení analýzy. Každé ovlivnění se provádělo ve čtverném spořádání.

Enzymové imunostanovení (imunoassay) se provádělo za použití obchodní sady PGE2 (Amersham, Buckinghamshire, Anglie). Specifickými protilátkami vůči PGE2 se předem povleče sada mikrotitračních jamek. Stanovení spočívá v kompetici (soutěži) mezi neoznačených PGE2 (standard nebo vzorek) a určeným pevným množstvím peroxidázou označeného PGE2 o omezené množství specifických protilátek vůči PGE2, vázaných na jamky. Standardy s obsahem 0, 1,2, 4, 8, 16 a 32 pg/jamku nebo 50 μΐ média/jamku byly aplikovány s 50 μΐ/jamku 0,1 mol.1'¹fosfátového pufru o pH 7,5 a ponechány 3 hodiny při 4 °C. Po skončení této inkubace bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ křenové peroxidázy, konjugované s PGE2 a destička byla inkubována 1 hodinu při 4 °C. Pak byla destičky čtyřnásobně promyty 0,01 mor’-l fosfátovým pufrem o pH 7,5, obsahujícím 0,5% Tween 20, v množství 300 μΐ na jamku. Poté byl přidán substrát 3,3,5,5tetramethylbenzidin/peroxid vodíku ve 20% dimethylformamidu v množství 150μ1 na jamku a destičky byly inkubovány přesně 30 minut při teplotě místnosti. Reakce byla zastavena přidáním 1 mol. T¹ kyseliny sírové v objemu 100 μΐ na jamku. Ke kvantifikování barvy v jamkách

-8CZ 293631 B6 i

odečtení absorbance při 450 nm byl použit spektrofotometr pro mikrotitrační destičky Dynatech

MR7000 (Dynatech, Chantilly, VA). Byla vynesena standardní křivka a z ní extrapolováno množství PGE2 ve vzorcích.

Protizánětlivý potenciál testovaných sloučenin byl hodnocen schopností sloučeniny inhibovat PGE2, indukovaný působením IL-Ια. Statistická významnost byla stanovena za použití Studentova t-testu. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4

ovlivnění	PGE 2 (pg/ml)	% snížení vzhledem k IL-la
kontrola	267,6 ± 48,6
IL-la	598,2 ± 118,3
IL-la + 0,01% kys. petroselinová	201,2 ±40,1	120%*
IL-la + 0,001% kys. petroselinová	308,3 ± 97,2	80%

* statisticky významné při p<0,05 ve srovnání s hodnotou pro IL-Ια samotný

Z výsledků v tabulce 4 je zřejmé, že kyselina petroselinová může účinně inhibovat indukci PGE2, vyvolanou účinkem IL-Ια, který je naopak uvolňován působením alfa hydroxykyselin. Kyselina petroselinová by tedy mohla být účinná při snížení podráždění, působeného alfa hydroxykyselinami.

Příklady 5 až 8 ozřejmují místně nanášené prostředky podle předkládaného vynálezu. Prostředky mohou být zpracovávány běžným způsobem a jsou vhodné pro kosmetické použití. Zvláště se tyto prostředky hodí pro nanášení na vrásčitou, drsnou, suchou, šupinkovatou, zestárlou a/nebo UV zářením poškozenou pokožku ke zlepšení vzhlede a pocitu v pokožce, stejně jako pro nanášení na zdravou pokožku k prevenci nebo zpoždění nástupu takových poškození.

Příklad 5

Typická emulze typu olej ve vodě, patřící do rozsahu vynálezu, je následovná:

chemický název% hmotn.

propylenglykol	1
glycerin	1
hydroxyethylcelulóza	0,5
křemičitan hořečnato-hlinitý	0,5
imidazolidinylmočovina	0,5
čtyřsodná sůl EDTA	0,05
vazelína	2
izopropylpalmitát	5
dimethicon	0,5
cholesterol	0,5
cetylalkohol	0,5
kyselina izostearová	3
retinylpalmitát	0,1
PEG-40 stearát	1
PEG-100 stearát	1
sorbitanstearát	1
kyselina petroselinová	0,5

-9CZ 293631 B6

chemický název	% hmotn.
kyselina glykolová	7
hydroxid amonný	do pH 4,0
voda deionizovaná	dle potřeby do 100 %
PEG = polyethylenglykol
Příklad 6
Jinou typickou emulzí typu olej ve vodě, patřící do rozsahu vynálezu, je následovná:
chemický název	% hmotn.
propylenglykol	1
hydroxyethylcelulóza	0,5
křemičitan hořečnato-hlinitý	0,5
imidazolidinylmočovina	0,2
vazelína	2
izopropylpalmitát	5
dimethicon	0,5
cholesterol	0,5
kyselina stearová	3
kyselina izostearová	1,5
glycerolstearát	1,5
PEG-40 stearát	1
PEG-100 stearát	1
sorbitanstearát	1
cetylalkohol	0,5
kyselina petroselinová	2
kyselina glykolová	10
hydroxid amonný	do pH 3,8
voda deionizovaná	dle potřeby do 100 %
Příklad 7
Typickou emulzí typu voda v oleji, patřící do rozsahu vynálezu, je následovná:
chemický název	% hmotn.
izostearylneopentanoát	20
PEG-8 kaprylové/kaprinové glyceridy	6
cetyloktanoát	17
polyglyceryl-6-d ioleát	15
cyklomethicon	20
glycerylizostearát	0,5
kyselina izostearová	0,5
ceramid III	0,1
PPG-5-ceteth-20	3
kyselina L-mléčná/mléčnan draselný	6
kyselina hydroxykaprylová	0,1
voda deionizovaná	1,3
kyselina petroselinová	0,5

-10CZ 293631 B6 »

cyklomethicon = změkčovadlo na bázi tetrameru či pentameru těkavých silikonů ceteth = cetostearylalkohol C16H34O

Příklad 8

Příprava byla následovná emulze typu olej ve vodě, patřící do rozsahu vynálezu:

chemický název______ xanthanová guma dvojsodná sůl EDTA sodná sůl kys. chloristé diazodinylmočovina oxid titaničitý kyselina stearová cyklomethicon cetylalkohol glycerylstearát PEG-100 stearát steareth-2 lecithin tokoferol oktylmethoxyskořičnan kyselina petroselinová kyselina glykolová kyselina jablečná kyselina mléčná extrakt zeleného čaje triethanolamin voda deionizovaná % hmotn._____

0,2

0,1

0,5

0,03

0,3

0,5

0,2

0,5

0,2

0,5 do pH 3,8 dle potřeby do 100% steareth-2 = polyoxyethylen-2-stearylether

Rozumí se, že specifické formy vynálezu, které jsou zde ozřejměny a popsány, jsou zamýšleny pouze jako reprezentativní příklady.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje:

(i) alfa hydroxykyselinu v množství od 0,01 % do 20 % hmotnosti prostředku;

(ii) kyselinu petroselinovou v množství od 0,05 % do 20 % hmotnosti prostředku; a (iii) kosmeticky přijatelné vehikulum.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství hydroxykyseliny činí 0,1 % až 12 % hmotnosti prostředku.

-11 CZ 293631 B6
3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydroxykyselina je zvolena ze skupiny, sestávající z kyseliny glykolové, kyseliny mléčné a směsí těchto sloučenin.
4. Způsob kosmetického snížení pálení nebo podráždění, indukovaného místním nanesením
5 prostředku, obsahujícího alfa hydroxykyselinu, vyznačující se tím, že zahrnuje místní nanesení kyseliny petroselinové v množství, které je účinné ke zmírnění podráždění, indukovaného prostředku.