CZ290445B6 - Urethany a močoviny, způsoby jejich přípravy a farmaceutické přípravky na jejich bázi - Google Patents

Abstract

Urethany a mo oviny obecn ho vzorce I, kde R.sub.1.n. je (C.sub.1.n.-C.sub.20.n.)alkyl, (C.sub.3.n.-C.sub.6.n.)cykloalkyl nebo (C.sub.7.n.-C.sub.15.n.)aralkyl, p°i em ka d z t chto skupin je pop° pad substituovan ; R.sub.a.n. a R.sub.3.n. je nez visle H nebo pop° pad substituovan² (C.sub.1.n.-C.sub.6.n.)alkyl; a R.sub.2.n., R.sub.b.n. a R.sub.c.n. je nez visle karboxy, methyloxykarbonyl, fenyloxykarbonyl nebo benzyloxykarbonylskupina; X je O nebo NH; R.sub.4.n. je H, fenylmethoxykarbonyl nebo 1,1-dimethylethoxykarbonyl; p°i em substituenty ve v² e uveden²ch substituovan²ch skupin ch jsou vybr ny ze souboru sest vaj c ho z halogenu, OH, (C.sub.1.n.-C.sub.6.n.)alkylu, (C.sub.1.n.-C.sub.6.n.)alkoxylu, amino, mono- nebo di- (C.sub.1.n.-C.sub.6.n.)alkylamino, karboxy, formylu a (C.sub.1.n.-C.sub.6.n.)alkoxykarbonylu, a jejich farmaceuticky p°ijateln soli a optick izomery. Zp soby p° pravy t chto slou enin a farmaceutick p° pravky na jejich b zi vhodn pro indukci produkce r stov²ch faktor IL-6 a CSF.sup.25.n., kter reguluj produkci neutrofil v kostn d°eni savc .\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká určitých urethanů a močovin, způsobů jejich přípravy a farmaceutických přípravků na jejich bázi. Tyto sloučeniny indukují produkci cytokinu.

Dosavadní stav techniky

Cytokiny jako je G-CSF, M-CSF, GM-CSF („colony stimulating factor“) a IL-1, IL-3, IL-6 (interleukiny) mohou stimulovat hematopoiesis v chorobách spojených s poškozením kostní dřeně a urychlovat tak vyléčení neutropenie, jak popisuje Metcalf D., Science, 529 (1991), a H. G. Klingemann a H. J. Deeg, CIPS, 14, 243 (1989), jakož i G. Mortsym a A.W. Burgess, Cancer Research 48, 5624 (1988). Podíly přirozených bakteriálních buněčných stěn a syntetických lipopeptidů, které napodobují buněčnou stěnu byly označeny jako mající imunostimulační vlastnosti, jak popsal J. Freund, Adv. Tubercl. Res., 1, 130 (1956), F. Ellouz, A. Adam, R. Ciobaru a E. Ledere, Biochem. Biophys. Res. Commun., 59, 1317 (1974), V. St. Georgiev, Medicinal Res. Rev., 11, 81 (1991) a L. Azuma, Int. J. Immunopharmac., 14, 487 (1992). Specifičtěji, určité sloučeniny byly identifikovány jako indukující tvorbu CSF a mohou vyvolávat restauraci kostní dřeně po myelosupresi způsobené chemoterapií nebo zářením. Tyto zahrnují sloučeniny, jako je pimelautide (RP 40639), jak popisuje F. Floch'h, J. Bouchandon, C. Fizames, A. Zerial, G. Dutruc-Rosset a G. H. Werner, CIPS, 763 (1984) a v patentu č. FR-2482961 (1981); muroctasin (Daiichi Seiyaku Co.), /jak popisuje I. Azuma, Ing. J. Immunopharmac., 14, 487 (1992); R. Nakajima, Y. Yshida, K. Akahane, M. Sekiguchi a Y. Osada, Arzneim.-Forsch., 41, 60 (1991); Scrip, 22, 1655 (1991) a patent č. EP 135778 (1985)/ a FK-156 a FK-565 (Fujisawa) /jak uvádí S. Izumi, K. Nakahara, T. Gotoh, S. Hashimoto, K. Kino, M. Okuhara, H. Aoki a H. Imanaka, J. Antibiotics, 566 (1983); K. Nakamura, K. Nakahara, H. Aoki, Agric. Biol. Chem., 48, 2579 (1984); H. Keiji, H. Takeno. S. Okada, O. Nakguchi, Y. Kitaura a M. Hashimoto, Tetrahedron Lett., 23, 693 (1982) a US patenty č. 4349466 a 4666890/.

US patent 4666890 popisuje syntetické tripeptidy, o kterých uvádí, že mají aktivitu jako imunomodulátory, pro použití jako antitumorová činidla spíše než jako přísady k chemoterapii. Uváděné složky buněčné stěny a jejich syntetické analogy jsou všechny peptidy, obsahující skupinu D-glutamové kyseliny (D-Glu) γ-připojenou buď k lysinu (Lys) nebo ke kyselině diaminopimelové (A₂pm), s dalšími peptidovými vazbami nebo mastnými acylskupinami, lemujícími dva konce.

Nové urethany a močoviny popsané v tomto vynálezu jsou prvními příklady nepeptidových analogů složek bakteriálních buněčných stěn a postrádají D-Glu skupinu běžnou v předchozím stavu techniky. Dále, zatímco předcházející stav techniky neposkytoval žádné rozvětvení na peptidovém řetězci, zahrnuje předložený vynález rozvětvené analogy, které si udržují požadovanou aktivitu, jsou-li syntetizovány ve specifické konfiguraci, a způsob syntézy těchto chirálních rozvětvených analogů.

Podstata vynálezu

Vynález se týká urethanů a močovin obecného vzorce I

kde

Ri je vybrán ze souboru sestávajícího z popřípadě substituované (Ci-C?o)alkylskupiny, popřípadě substituované (C₃-C₆)cykloalkylskupiny a popřípadě substituované (Cr-C^aralkylskupiny,

R_a a R₃ jsou nezávisle vybrány z vodíku a popřípadě substituované (Ci-C₆)alkylskupiny a

R₃, Rb a Rc jsou nezávisle vybrány z karboxyskupiny, methyloxykarbonylskupiny, fenyloxykarbonylskupiny a benzyloxykarbonylskupiny,

X je kyslík nebo skupina NH,

Rj je vodík nebo chránicí skupina aminoskupiny vybraná z fenylmethoxykarbonylskupiny a 1,1-dimethylethoxykarbonylskupiny, přičemž substituenty ve výše uvedených substituovaných alkyl-, cykloalkyl- a aralkylskupinách jsou vybrány ze souboru sestávajícího z halogenu, hydroxyskupiny, (C]-C₆)alkylskupiny, (C^-Céjalkoxyskupiny, aminoskupiny, mono- nebo di(Ci-C6)alkylaminoskupiny, karboxyskupiny, formylskupiny a (Ci-Céjalkoxykarbonylskupiny, a jejich farmaceuticky přijatelných solí a optických izomerů.

Konkrétní výše uvedené definice a specifické příklady, spadající do těchto definic jsou uváděny dále:

a) (C₁-C₂o)alkylová skupina může být alkylová skupina s přímým nebo rozvětveným nižším alkylem, majícím od 1 do 20 atomů uhlíku jako je methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina, izopropylová skupina, butylová skupina, izobutylová skupina, sek. butylová skupina, terc.butylová skupina, pentylová skupina, neopentylová skupina, izopentylová skupina, hexylová skupina, izohexylová skupina a další.

b) Cykloalkylovou skupinou může být cykloalkylová skupina, mající 3 až 6 atomů uhlíku jako je cyklopropylová skupina, cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina nebo cyklohexylová skupina.

c) Aralkylovou skupinou může být aralkylová skupina, mající 7 až 15 atomů uhlíku jako je benzylová skupina, 1-naftylmethylová skupina, 2-naftylmethylová skupina, 5,6,7,8-tetrahydro-l-naftylová skupina, 5,6,7,8-tetrahydro-2-naftylová skupina, fenethylová skupina, 3-fenylpropylová skupina nebo 4—fenylbutylová skupina.

Z výše popsaných sloučenin vzorce I jsou preferovány ty, kde:

Ri je vybrán ze souboru sestávajícího zn-hexylové skupiny a 4-n-pentylcyklohexylové skupiny,

R_a a R₃ jsou methylskupiny,

R₂, Rb a Rc jsou karboxyskupiny,

X je kyslík a

Ri je vodík.

Zvláště výhodné jsou ty sloučeniny vzorce I, mající D-allo.threonin konfiguraci uvedenou dále:

kde R₃ je methyl a R_t a R₂ mají výše definovaný význam.

Také jsou zvláště výhodné ty sloučeniny, které mají následující stereochemii v diaminopimelylalaninové části molekuly:

kde R_a je methyl a Rb, Rc a Rj mají výše definovaný význam.

Vzhledem ke stereochemii jsou sloučeniny následujícího obecného vzorce nej výhodnější:

^R 2

kde R₃ a R_a jsou methyl, X je kyslík, R_b, R_c, R_b R₂, R4 mají dříve uvedený význam.

-3CZ 290445 B6

Urethany a močoviny typu 1, které jsou subjektem předloženého vynálezu, jsou konstruovány konvergentní syntézou popsanou dále.

Schéma I

(Y = odštěpitelná skupina;

R skupiny a X jak jsou popsány u vzorce I)

Fragmenty na levé straně (X=O, alkohol 2b, nebo X=NH, amin 2c) a na pravé straně (amin 3), nesoucí vhodné chránící skupiny (příklady obvykle používaných amin-chránicích skupin jsou uvedeny v práci T. Greene-a, „Protecting Groups in Organic Synthesis,“ J. Wiley and Sons, 1981, str. 218-287) na více funkčních skupinách, se připraví odděleně. Sloučenina 2 se nejprve nechá reagovat s aktivovaným karbonylovým ekvivalentem, YC(=O)Y, jako je fosgen, trifosgen, adukt fosen/pyridin, trichlormethylchlorformiát nebo Ι,Γ-karbonyldiimidazol, obvykle při O °C a výsledný meziprodukt 2y se kopuluje se 3 za vzniku urethanu la (X=O) nebo močoviny lb (X=NH). Alternativně se amin 3 nejprve nechá reagovat s YC(=O)Y a výsledný meziprodukt se kopuluje se 2 za vzniku la nebo lb. Jsou-li použity, odstraní se chránící skupina za standardních podmínek za vzniku sloučenin typu 1 s nemaskovanými funkčními skupinami.

Fragmenty na levé straně: pro syntézu fragmentu 2a na levé straně, se selektivní N-acylace aminoalkoholů 5 provede za použití vhodného acylačního činidla 4 za bazických podmínek. Pokud není dostupné, připraví se požadované acylační činidlo zodpovídající kyseliny 4a, která naopak může být připravena oxidací 6 nebo oxidační degradací 2c-l konvenčními metodami.

-4CZ 290445 B6

Schéma II

j>^2’^3’^· podle vzorce I

4b

Sloučeniny 2c (2a, kde R₂ = CO₂H) se převedou na ester 2e nebo amid 2f za kyselých podmínek, za použití vhodného alkoholu (ROH) nebo aminu (R”NH₂). Alternativně se 2c esterifikuje za 5 použití alkylačního činidla R”Y za bazických podmínek.

Schéma III

+ R”ZH ----(Z=O nebo NH

2« (z-o)Ra

R”-H(je-li Z=NH) 21 (^Z’^NH) alkylskupina nebo chráněná skupina)

2c + R”Y ----------->

Y = Cl, 3r, I nebo

jiná odštěpitelná skupina

Alkoholy 2c s různými R₃ alkylovými rozvětveními se připraví podle schéma IV. Alkohol 2j se maskuje vhodnou chránící skupinou (zatímco NH zůstává volný, je chráněn jako cyklický

-5CZ 290445 B6

Ν,Ο-acetal spolu s OH, neboje blokován separátní amin chránící skupinou) a ester 8 se redukuje na aldehyd 9 v jednom stupni (Gamer a Park, J. Org. Chem., 1987, 52, 2361) nebo ve dvou stupních před redukci na alkohol a reoxidací za použití konvenčních metod. Přídavek vhodných organokovových činidel R₃M k aldehydu poskytne 10 jako jediný diastereomer nebo směs dvou diastereomerů, jestliže výchozí materiál 2j je neracemický.

Odstraněním chránící skupiny primárního alkoholu (a NH, je-li blokován) se získá 11 s následující selektivní oxidací (podle Skarzewskiho a spol., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2177) následovanou standardní oxidací na výsledný aldehyd (podle Mehltrettera a spol., J. Amer. 10 Chem. Soc., 1950, 73, 2424) poskytující 2c. Alternativně je sekundární alkohol 10 chráněn a primární alkohol (a NH, je-li blokován) v poloze 12 je zbaven chránící skupiny za poskytnutí 13. Použitím obvyklých technik se tento posledně uvedený oxiduje na 14, který se převede na 2c. Funkční skupiny primárního a sekundárního alkoholu v 11 jsou také postupně chráněny za vzniku 12 (W=H). Transformace z 2j na 2c zahrnuje inverzi konfigurace na uhlíku alfa na 15 karboxylovou skupinu, transpozicí karboxylové a alkoholové skupiny a zavedením R₃ skupiny do polohy beta, s chiralitou. Diastereomery 10, 12 nebo 13 mohou být odděleny chromatografií. 2j s R konfigurací v poloze alfa může poskytnout 2c diastereomery S,R (alfa, beta) a S,S (alfa, beta) konfiguraci a 2j s S konfigurací může poskytnout 2c diastereoizomery R,R (alfa, beta) a R,S (alfa, beta) konfigurace.

Schéma IV

/M= Li, MgX nebo jiný organoalkyl

R‘, R -neekvivalentní OH chránící skupiny

W=H nebo N chr. skupina nebo R‘, W=N, O-alkyliden ketal nebo acetyl/

Alternativně může být 11 nebo 12 připraven z 5j podle schéma V. Amin je plně blokován dvěma 30 chránícími skupinami nebo cyklickou chránící skupinou na 15. Konverze 15 na 16 na 17 na 19 je stejná reakční sekvence jak je popsána pro 8 na 9 na 10 na 12 výše. Aminové chránící skupiny v 17 nebo 19 se odstraní za vzniku 18 nebo 20. Posledně jmenovaná sloučenina se acyluje na 11 nebo 12.

-6CZ 290445 B6

Schéma V

/W,W'=H, stejné nebo rozdílné N chr. skupiny nebo společně jedna cyklická chr. skupina, nebo R', W=N, O-alkylen, ketal nebo acetal/

Pro syntézu levostranného fragmentu 2b se acylací aminu 21 za bazických podmínek získá 22. Primární amid se přeskupí na amin 2b (podle Loudona a spol., J. Org. Chem., 1984, 49, 4272; Wakiho a spol., Synthesis, 1981,53, 266, nebo Kosera a spol., J. Org. Chem., 1988, 53, 5158).

Schéma VI

CONHg

Sloučeniny 2g (2b, kde R₂=CO₂H) se převedou na ester 2h nebo amid 2i (uvedeno ve schématu VII) za kyselých podmínek za použití vhodného alkoholu (R''OH) nebo aminu (R''NH₂). Alternativně se amin 2g chrání jako urethan jako je BOC nebo CBZ; kyselina se převede na ester nebo amid za bazických podmínek a chránící skupina se odstraní a získá se 2h nebo 2i.

Schéma VII

b ^R3

R”ZH

/Z=O nebo NH

R=H( je-li Z=NH),

2h (Z=O) alkylskupina nebo chrániči skup./

2i (Z=NH)

Aminy 2g s různými R₃ alkylovými rozvětveními se připraví podle schémat VIII. Alkohol 10 se získá podle schéma IV nebo redukcí vhodné kyseliny 2c s následujícím chráněním vzniklého primárního alkoholu 11. Sloučenina 10 se pak převede konvenčními metodami na azid 24 přes meziprodukt 23. Azidová skupina se redukuje na amin (25) katalytickou hydrogenací a tento se maskuje na 26. Alternativně standardní oxidace 10 poskytne 27. Redukční aminace ketonu vhodným aminem (W'NH₂) poskytne 28, který se naopak převede na 26 (W'=alkyl, W=alkoxykarbonyl) další ochrannou jako karbamát nebo na 26 (W'''=alkoxykarbonyl, W'=H) deprotekcí (na 25) a reprotekcí. Nemaskování primárního alkoholu ve 26) a amidového NH, je-li blokován) se získá 29 a následující oxidace poskytne 30 jako ve schématu IV pro konvenzi 13 na 14. Aminchránicí skupina (y) se odstraní a získá se 2g, Diastereomery z 10 nebo 28 mohou být odděleny chromatografií v jednom z mezistupňů (28, 26 nebo 29).

Schéma VIII

/G=OTs, OMs, OTf, halogen nebo ether odštěpující skupina,

W,W'=H, N chrán. skup.,

W=N oc. skup, odlišná od W/

Alternativně může být 26 připraven ze 17 podle schéma IX. Konverze 17 na 31 na 32 na 33 na 34 nebo 17 na 35 na 36 na 34 jsou stejné reakční sekvence jak jsou popsány dříve pro 10 na 23 na 24 na 25 na 26 nebo 10 na 27 na 28 na 26. Aminchránicí skupiny W a W' se odstraní za vzniku 37. Tento acylací poskytne 26.

-8CZ 290445 B6

Schéma IX

(W-H)

/W=N chránící skup, odlišná od W,W'/

Pravostranné fragmenty: Fragment 3 se připraví kopulací kyseliny (nebo chráněné kyseliny) 38 se vhodným aminem 39 s následující selektivní deprotekcí meziproduktu 40.

Schéma X

/W=N. .chr-skup^ ’

R=H, kar boxy chr. skup neba aktivační skup./

Kyseliny 38 nebo amidy 40 se připraví podle Kolodziejczyka a spol. (Int. J. Pept. Prot. Res., 1992, 39, 392 a uvedené odkazy), Jungense (Tetrahedron Lett., 1992, 33, 4727 a uvedené odkazy), Williamse (J. Org. Chem., 1992, 33, 4727 a uvedené odkazy), Hashimoto-a (Tetrahedron Lett., 1982, 23, 693 a uvedené odkazy) nebo podle schématu XI. Glutamová kyselina (41, chirální nebo racemická) je chráněna, za standardních podmínek, pro přechod na 42, který kondenzuje s formaldehydem za vzniku 43. Posledně uvedený se redukuje na aldehyd 44 postupem v jedné nádobě. Kondenzace Wittig-Homer-Emmonsova typu aldehydu s činidlem typu 45 (připraveno podle Schmidta a spol., Synthesis, 1984, 53) poskytne 46. Reakce laktonu se vhodným aminem, 39 (není-li dostupný, připraví se podle metod z „Synthesis of Optically Active alfa-Amino Acids“, R.M. Williams, Ed., Pergamon Press, 1989 a uvedené odkazy) se ztrátou formaldehydu poskytne 47. Katalytická hydrogenace dvojné vazby poskytne 40. Jestliže se jako výchozí materiál použije chirální 41 rozdělí se diastereomery 40 frakční krystalizací nebo

-9CZ 290445 B6 chromatografií. Poměry diastereomerů, které byly získány, závisí na volbě chránících skupin, hydrogenačním katalyzátoru a reakčních podmínkách /Knowles a spol., J. Amer. Chem. Soc., 99,

5947 (1977); Ojima a Suzuki, Tetrahedron Lett., 21, 1239 (1980)/. Takto 41 S konfigurace poskytne diastereomery 40 nesoucí S,S a S,R konfiguraci na A₂pm a 41 R konfigurace může poskytnout diastereomery 40 nesoucí R,S, a R,R konfiguraci na A₂pm.

Schéma XI

Reakce se provádějí v rozpouštědle vhodném pro reaktanty a získané materiály a vhodném pro prováděnou transformaci. Odborníkům v oboru organické chemie bude zřejmé, že různé funkční skupiny přítomné na molekule musí být konzistentní s předpokládanými chemickými transformacemi. Často je nezbytné zvážení pokud jde o stupně syntézy, chránící skupiny, jsou-li žádoucí a o podmínky jejich odstranění. Substituenty na výchozích materiálech mohou být nekompatibilní s některými reakčními podmínkami. Omezení na substituenty, které jsou kompatibilní s reakčními podmínkami bude zřejmé odborníkům v oboru.

Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují jak kovové (anorganické soli) tak organické soli; jejich seznam je uveden v Remington's Pharmacetical Sciences, 17. vyd. str. 1418 (1985). Odborníkům v oboru je zřejmé, že vhodná forma soli se volí podle fyzikální a chemické stability, tekutosti, hygroskopičnosti a rozpustnosti. Výhodné soli podle vynálezu pro výše citované účely zahrnují draselné, sodné, vápenaté, hořečnaté a amonné soli.

Některé sloučeniny s dříve uvedených schémat mají centra asymetrie. Předložený vynález zahrnuje všechny stereoizomery sloučenin, prosté jiných stereoizomerů ne o smíšených s dalšími stereoizomery v jakémkoliv poměru a zahrnuje tak, například, racemické směsi enantiomerů jakož i diastereomerní směsi izomerů.

Nové sloučeniny podle vynálezu jsou vhodné pro svoji schopnost indukovat tvorbu cytokinu a obnovovat kostní dřeň po chemoterapii, jak je prokázáno následujícími testy.

Popis biologických zkouše interleukin 6 (IL—6) zkoušky pro strukturní funkční analýzu

Testovaná sloučenina se rozpustí ve vodě a podá se subkutánně v 0,2 ml pro doručení dávky 0,1 až 10 mg/kg. Méně rozpustné sloučeniny se nejprve rozpustí ve 100% ethanolu, a potom se uvedou do vhodné koncentrace ve vodě. Čtyři hodiny po injekci se myším odebere krev a získá

-10CZ 290445 B6 se sérum. IL-6 závislá buněčná linie 7TD1 se použije ke zkoušce sériových ředění séra na obsah IL—6. 7TD1 buňky (1 x 10⁴) se umístí do mikrotitračních jamek a inkubují se při 32 °C 72°C hodin se standardním rekombinantním myším IL-6 nebo se ředěními testovaného séra. Po posledních 6 hodin se buňky pulzují Ή-Tdr (pci). Buňky se pak shromáždí a stanoví se stupeň proliferace podle příjmu Έ-Tdr, měřeno kapalinovou scintilační spektrometrií. Koncentrace IL-6 v séru se vypočte z křivek standardu za použití rekombinantního IL-6 od R and D Systems lne., a tyto koncentrace jsou uváděny v jednotkách IL-6 aktivity, jak je definováno výrobcem.

Zkouška granulocytové kolonie stimulujícího faktoru (GCSF)

Provede se biozkouška na GCSF stejným způsobem jako pro IL-6 s tím rozdílem, že se použije závislá buněčná linie NFS-60 místo IL-6 závisle 7TD1 buněčné linie. Neutralizační monoklonální protilátka k myšímu GCSF se použije pro důkaz specifity zkoušky.

Zkoušky kolonie tvořících granulocyt-makrofágů (CFU-GM)

Myši se ušetří 150 mg/kg 5-Fu a ošetření testovanou sloučeninou začne o 24 hodin později. V následujících dnech se myši usmrtí cervikální dislokací a femury se vyjmou za sterilních podmínek. Femury se zalijí 1 ml ledově studeného média (Iscove-ovo, doplněné 20 % FCS, 1 % penicilin-streptomycinu, 1 % glutaminu a 5 x 10'³M 2-merkaptoethanolu). Buňky kostní dřeně (5xl0⁵) se pak umístí do 12 x 75 mm tkáňových kultivačních ploten ve 3 ml teplé agarózy (3%) v Icsove-ově médiu se 100 jednotkami/ml rekombinantního myšího GM-CSF získaného od Genzyme (Boston, MA). Plotny se inkubují 7 dnů při 37 °C v 5% CO₂. Po 7 dnech se spočtou kolonie o 50 buňkách nebo větší pomocí disekčního mikroskopu.

Sérová zkouška kolonie stimulujícího faktoru (CSF)

Zkouška, která deteguje aktivitu kolonie stimulujícího faktoru, ale nerozlišuje mezi různými typy kolonie stimulujících faktorů, se použije pro detekci přítomnosti CSF aktivity v séru myši, injikované testovanými sloučeninami. Buňky kostní dřeně se připraví, jak je dříve popsáno pro CFU-GM zkoušku. Buňky se pak inkubují na měkkém agaru s 0,3% konečnou koncentrací v séru, odebraném myším 4 hodiny po injekci testovaných sloučenin. Po 7 dnech inkubace při 37 °C se stanoví počet kolonie tvořících (CFU) buněk na 10⁵ na plotně umístěných buněk kostní dřeně spočtením kolonií o více než 50 buňkách pod disekčním mikroskopem. Data se uvádějí jako CFU/10⁵ buňky kostní dřeně.

Zkouška cirkulace neutrofilů

Myši se ošetří 5-FU (150 mg/kg) a od 24 h později se denně ošetřují testovanou sloučeninou. Myším se denně odebírá krev retroorbitální punkturou do heparinizovaných kapilárních zkumavek. Počty cirkulujících WBC se stanoví Coulter čítačem. Krevní skvrny se vybarví Wright-Geimsa roztokem a procenta cirkulujících neutrofilů se stanoví diferenciálním sčítáním pod mikroskopem.

5-Fluorouracilem (5-FU) indukovaná neutropenie u myší

Myši se ošetří ip pomocí 150 mg/kg chemoterapeutického činidla 5-Fu, které indukuje těžkou ztrátu neutrofilů v periferální krvi 5-6 dnů později. Dvacetčtyři hodiny po dávce započne ošetřování testovanými sloučeninami. Účinek testovaných sloučenin na obnovu neutrofilních progenitorových buněk v kostní dřeni se stanoví CFU-GM zkouškou. Obnovení cirkulujících neutrofilů je následováno diferenciálním vybarvením periferní krve.

- 11 CZ 290445 B6

Delta zkouška

Myši se ošetří jedinou dávkou 5-FU (150 mg/kg). O dvacetčtyři hodiny později se odstraní buňky kostní dřeně a rozdělí do dvou podílů. Jeden podíl se umístí přímo na měkký agar s 15 ng/ml IL-1 a 250 j/ml GM-CSF. Po 14 dnech se stanoví počet kolonií (CFU-I). Druhý podíl buněk se umístí do kapalné kultury s jedním růstovým faktorem nebo léčivem nebo jejich kombinací pro zkoušku schopnosti těchto činidel expandovat kolonie tvořící buněčný pool. Po 7 dnech v kapalné kultuře se tyto buňky shromáždí a umístí do měkkého agaru s IL-1 a GM-CSF jako první podíl. Po 14 dnech se stanoví počet kolonií v druhém podílu (CFU-2). Poměr nebo delta je vypočten jako CFU-2/CFU-1 a tento poměr se použije pro hodnocení schopnosti růstových faktorů a/nebo léčiv použitých v kapalné fázi indukovat růst kolonie tvořících buněk (CFU) nebo diferenciace pre-CFU na CFU.

Výsledky

Testované sloučeniny jsou schopny indukovat IL-6 produkci v séru myši během 4 hodin po jediné subkutánní injekci (tabulka 1). Podobně je sérová CFS aktivita také detegována těmito sloučeninami u myší (tabulka 2). IL-6 zkouška se provádí v kvantitativním provedení a je použita pro stanovení relativní potence. CSF zkouška se provádí v jediné sérové koncentraci a je proto kvalitativního charakteru.

Reprezentativní sloučenina (příklad 28) také indukuje GCSF v séru injikované myši (tabulka 3). Reprezentativní sloučeniny (příklad 28, 32 a 84) jsou uváděny jako indukující obnova neutrofilů v 5-FU ošetřené myši (tabulka 4). Reprezentativní sloučenina (příklad 28) zvyšuje obnovu periferních krevních neutrofilů, která je předcházena zvýšením CFU-GM, neutrofilní prekurzory v kostní dřeni (tabulka 5) takto ukazují, že testované sloučeniny působí v kostní dřeni.

Reprezentativní sloučenina (příklad 28) také indukuje IL-6 a GCSF produkci v séru 5-Fu ošetřených primátů (tabulka 6). Reprezentativní sloučenina (příklad 32) urychluje obnovu neutrofilů u primátů ošetřených chemoterapeutickým činidlem cytoxanem (tabulka 7).Testovanou sloučeninou ošetřené skupiny obnovují kontrolní hladiny 7. den oproti 10. dnu obnovy u skupiny pouze s cytoxanem. Takto testované sloučeniny indukují podobné spektrum cytokinů a zvýšenou obnovu neutrofilů jak u primátů tak u myší.

Reprezentativní sloučenina (příklad 28) působí synergicky in vitro s c-kit ligandem hemopoietického růstového faktoru (KL) pro zvýšení růstu progenitorových buněk kostní dřeně (tabulka 8). Toto dále potvrzuje nároky na to, že tyto sloučeniny působí zvýšení růstu neutrofilních progenitorových buněk v kostní dřeni. Testované sloučeniny jsou také aktivní v urychlení obnovy neutrofilů v 5-Fu ošetřené myši, jsou-li podány orálně (tabulka 9) jak je to prokázáno s reprezentativními sloučeninami (příklady 28 a 32).

Klinický význam

Hodnoty získané v testech sloučenin popsaných dříve ukazují, že tyto jsou schopny indukovat endogenní produkci růstových faktorů (IL-6 a GCSF), které jsou známé jako regulující produkci neutrofilů v kostní dřeni. Tyto sloučeniny mohou být použity terapeuticky pro obnovu neutrofilů po rakovinové terapii, radiační terapii, transplantaci kostní dřeně nebo infekcích. Dále mohou být sloučeniny použity v kombinaci s rekombinantními růstovými faktory k potenciaci aktivity rekombinantních molekul. Tyto sloučeniny mohou být také použity při léčbě rakoviny, AIDS, plastické anemie, myelodysplatického syndromu, infekčních chorob a zvýšení imunitní odezvy. Na rozdíl od rekombinantních růstových faktorů jsou testované sloučeniny účinné při orálním podání.

- 12CZ 290445 B6

Tabulka 1

Vliv testovaných sloučenin na IL-6 produkci u myší

Příklad č.	dávka (mg/kg)	11-6 (j/ml)
28	10,0	1718
	1,0	3844+482
	0,1	48021804
29	10,0	537
	1,0	203
	0,1	0
30	10,0
	1,0	-
	0,1	3281107
31	10,0	_
	1,0	-
	0,1	294124
32	10,0
	1,0	17971284
	0,1	13401134
33	10,0
	1,0	37671457
	0,1	16511100
34	10,0
	1,0	50631302
	0,1	36101347
80	10,0	36241611
	1,0	17121168
	0,1	-
81	10,0	199123
	1,0	56119
	0,1	-
82	10,0	31881345
	1,0 0,1	2181192
83	10,0	18181243
	1,0 0,1	332138
84	10,0	2512+209
	1,0	3865+688
	0,1	1963197

-13 CZ 290445 B6

Tabulka 2

Vliv testovaných sloučenin na CSF produkci u myši	CFU/10000 buněk kostní dřeně
Příklad č.	dávka (mg/kg)
28	10,0
	1,0	10118
	0,1	95+16
29	10,0
	1,0	101+46
	0,1	0±0
32	10,0
	1,0	137+15
	0,1	154+5
80	10,0	121+9
	1,0 0,1	91+3
81	10,0	101+7
	1,0 0,1	69114
82	10,0	115±3
	1,0 0,1	108±l1
83	10,0	123122
	1,0 0,1	204+9
84	10,0	131+10
	1,0	118±15
	0,1	129+14

Tabulka 3 Vliv testovaných sloučenin na GCSF produkci u myší	GCSF (pg/ml)
Příklad č.	dávka pg/kg
28	50,00	12491138
	25,00	33521907
	12,50	13421289
	6,25	644+267
	3,12	470159
	1,56	442+52
	0,00	0,00+0

-14CZ 290445 B6

Myším (10/skupina) se podá jediná subkutánní injekce testované sloučeniny a odebere krev o 4 hodiny později. GCSF hladiny v séru se stanoví biozkouškou za použití GCSF závislé buněčné linie NFS-60.

Tabulka 4

Vliv testovaných sloučenin na obnovu neutrofilů u 5-FU ošetřených myší

Příklad č.	Pg/kg	* neutrofily/cu.
28	100,00	26131364
	50,00	17161284
	25,00	18041408
	12,50	13141267
	6,25	7581249
	3,12	4241115
	1,56	7221199
	0,00	**157152
***32	1000	18921293
	100	9821150
	0	144136
****34	100	21941629
	10	5701224
	1	4271211
	0	54122

* Data od skupiny 10 myší 7. den po ošetření 150 mg/kg 5-Fu. Počátek 24 h po 5-FU dávce, myši ošetřovány denně testovanou sloučeninou v uvedených koncentracích. Počet neutrofilů pro normální myš (n=5) je 32361301.

** Myši ošetřeny 5-FU a pouze vehikulem.

*** 8. den po 5-FU **** n=6 myší/skupina

Tabulka 5

Vliv testovaných sloučenin na kostní dřeň CFU-GM u 5-FU ošetřených myší

Příklad č.	skupina CFU-GM/femur
28	normální myši 3018413677 ošetřeno 5-FU 8051512 5-FU+př. 28 60551534

Skupiny 5 myší byly ošetřeny 5-Fu v dávce 150 mg/kg a o 24 hodin později se započalo s testovanou sloučeninou denně s.c. při 0,1 mg/kg. Hodnoty jsou ze 3. dne po 5-FU ošetření.

-15 CZ 290445 B6

Tabulka 6

Vliv testovaných sloučenin na sérový IL-6 a GCSF u 5-FU ošetřených opic

Příklad č.	skupina	IL-6 Cj/ml)	GCSF (pg/ml)
28	normální opice	0	0
	ošetř. 5-FU	0	0
	5-FU+28	2579+318	3962+2178

Skupiny 3 opic cynomolgus se ošetří 5-FU v dávce 125125 mg/kg a počínaje 24 hodinou později se ošetří testovanou sloučeninou s.c. 0,05 mg/kg. Hodnoty, které jsou uváděny jsou ze séra odebraného 4 hodiny po ošetření testovanou sloučeninou.

Tabulka 7

Vliv testovaných sloučenin na obnovu neutrofilů u cytoxanem ošetřených primátů

Absolutní počet neutrofilů/Cu.mm krve

Př. č,dny po cytoxanu cytoxan cytoxan + př. 32

0	3640+1058	3554+1194
1	4900+971	7849+1592
2	2689+156	4679+867
«»	1935+126	1080+264
4	1442+344	370+171
5	856+295	455+208
6	1009+292	518+218
7	852+301	1304+1046
8	542+233	1596+1000
9	441+194	2041+423*
10	1244+509	3506+1130
11	2053+1002	4576+673
12	1885+678	3761+1394
13	3502+2297	3751+1278
14	3816+1674	3106+520

Skupiny 4 opic cynomolgus se ošetří v den 1 a v den 0 cytoxanem v dávce 60 mg/kg. 24 hodin po druhé dávce se jedna skupina ošetří denně s.c. 50 pg/kg testované sloučeniny a druhá pouze vehikulem.

^xp < 0,05 proti cytoxanu, kontrola pouze Studentovým testem.

-16CZ 290445 B6

Tabulka 8

Testované sloučeniny působí synergicky s c- kit ligandem (KL) v expanzi progenitorových buněk kostní dřeně in vitro

Příklad č.

kultura in vitro násobek zvýšení v CFU samotné médium test, sloučenina KL

KL + test, sloučenina

Buňky kostní dřeně od 5-FU ošetřených myší se použijí k obohacení časných progenitorových buněk. Buňky se rozdělí na dva podíly, jak je popsáno v „delta zkoušce“. Násobek zvýšení se stanoví měřením účinku 7. den in vitro inkubace buněk s médiem pro tkáňové kultury plus testovaná sloučenina a/nebo růstový faktor KL na buňky tvořící kolonie (CFU). Počet CFU se pak porovná s tvorbou kolonií z čerstvé kostní dřeně, které nebyly inkubovány in vitro pro stanovení násobku zvýšení. Testovaná sloučenina se použije in vitro při 0,5 μg/ml.

Tabulka 9

Účinek orálního dávkování testované sloučeniny na obnovu neutrofilů u 5-FU ošetřené myši

Příklad č.

dávka (mg/kg) neutrofily/cu.mm.

*32

0	178±64
10	1391±350
1	765±209
0,1	81±35
10	1844±814
1	547±232
0	67±22

Skupiny 5 myší se ošetří 150 mg/kg 5-FU. O den později se započne s denním orálním dávkováním a pokračuje se po 10 dnů. Uvedené údaje jsou ze 6. dne po ošetření.

*den 7. po 5-FU.

Jestliže se sloučeniny používají pro výše uvedené účely, mohou být kombinovány sjedním farmaceuticky přijatelným nosičem, například, rozpouštědly, ředidly a podobně a mohou být podávány orálně ve formě tablet, kapslí, dispergovatelných prášků, granulí nebo suspenzí, obsahujících například od asi 0,05 do 5 % suspendačního činidla, sirupy, obsahující, například od asi 10 do 50 % cukru a elixíry, obsahující, například od asi 20 do 50 % ethanolu a podobně, nebo parenterálně ve formě sterilních injikovatelných roztoků nebo suspenzí, obsahujících od asi 0,05 do 5 % suspendačního činidla v izotonickém médiu. Takové farmaceutické přípravky mohou obsahovat od asi, například, 0,05 do asi 90 % aktivní složky v kombinaci s nosičem, obvykleji mezi asi 5 % a 60 % hmotn.

Účinná dávka aktivní složky, která je použita, bude záviset na určité použité sloučenině, způsobu podání a obtížnosti léčeného stavu. Nicméně obecně se získají bezpečné výsledky při podání sloučeniny podle vynálezu v denní dávce od asi 15 pg do asi 100pg/kg tělesné hmotnosti živočicha, výhodně se podávají v rozdělených dávkách dva až čtyřikrát denně, nebo ve formě

s udržovaným uvolňováním. Pro většinu savců je celková denní dávka od asi 1 do 50 pg, výhodně od asi 1 do 20 pg. Dávkové formy vhodné pro vnitřní podání obsahují od asi 5 pg do 25 pg aktivní sloučeniny v těsné směsi s pevným nebo kapalným nosičem. Tento dávkový režim může být upraven pro poskytnutí optimální terapeutické odezvy. Například některé dělené dávky mohou být podávány denně nebo dávka může být odpovídajícím způsobem snížena jak je indikováno podle terapeutické situace.

Tyto aktivní sloučeniny mohou být podávány orálně jakož i intravenózně, intramuskulámě nebo subkutánně. Pevné nosiče zahrnují škrob, laktosu, fosfát vápenatý, mikrokrystalickou celulózu, sacharózu a kaolin, zatímco kapalné nosiče zahrnují sterilní vodu, polyethylenglykoly, neiontové povrchově aktivní látky a jedné oleje jako je kukuřičný, podzemnicový a sezamový olej, podle vhodnosti pro charakter aktivní složky a určitou formu požadovaného podání. Výhodně mohou být použity přísady běžně používané při přípravě farmaceutických přípravků, jako jsou ochucovací činidla, barvicí činidla, chránící činidla a antioxidanty, například vitamin E, kyselina askorbová, BHT a BHA.

Preferovanými farmaceutickými přípravky z hlediska snadnosti přípravy a podání jsou pevné kompozice, výhodně tablety a tvrdě plněné nebo kapalinou plněné kapsle. Orální podání sloučenin je preferováno.

Tyto aktivní sloučeniny mohou být také podávány parenterálně nebo intreperitoneálně. Roztoky nebo suspenze těchto aktivních sloučenin jako vodných bází nebo farmakologicky přijatelných solí mohou být připraveny ve vodě vhodně smísením s povrchově aktivní látkou jako je hydroxypropylcelulóza. Disperze mohou také být připraveny v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech a jejich směsích v olejích. Za obvyklých podmínek skladování a použití obsahují tyto přípravky ochranné látky pro zabránění růstu mikroorganismů.

Farmaceutické formy vhodné pro injekční použití zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro přípravu sterilních injekčních roztoků nebo disperzí. Ve všech případech musí být forma sterilní a musí být kapalná a umožňovat snadnou manipulaci se stříkačkou. Musí být stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněna vůči kontaminujícímu působení mikroorganismů jako jsou bakterie a plísně. Nosič může být rozpouštědlo nebo dispergační médium, obsahující například, vodu, ethanol, polyol (např. glycerol, propylenglykol a kapalné polyethylenglykoly), jejich vhodné směsi a rostlinné oleje.

Zkratky:

IL: interleukin

CSF: faktor, stimulující kolonie (G-granulocyty)-, M(makrofágů)- a GM(granulocytůmakrofágů)-CSF.

Ala: alanin

A₂pm: 2,6-diaminopimelová kyselina

Lys: lysin

Ser: serin

Thr: threonin

BOC: terc.butoxykarbonyl

BOP: benzotriazolyloxytris(dimethylamino)fosfonium-hexafluorofosfát

CBZ: karbobenzyloxy

TFA: kyselina trifluoroctová

MS: molekulová síta

TEA: triethylamin

DMAP: dimethylaminopyridin

TFA: kyselina trifluoroctová

G(granulocyty)-, M(makrofágy)- a

GM(granulocyty-makrofágy)-CSF

- 18CZ 290445 B6

Sloučeniny podle vynálezu a jejich příprava mohou být lépe pochopeny z následujících příkladů, tyto však nejsou míněny nikterak jako omezující.

V následujících příkladech, pokud není uvedeno jinak, se produkty separují rychlou chromatografií na Silikagelu 60 (230 až 400 mesh). Čistota produktů se stanoví pomocí TLC na silikagelu GF (250 mm). Teploty tání byly získány na Mel-Temp aparátu a jsou nekorigovány (všechny teploty ve °C). Pokud není uvedeno jinak, 1 H NMR (300 MHz) spektra se získají z deuterochloroformových roztoků (1% vnitřní standard, Me₄Si; kopulační konstanty jsou uváděny v Hz jednotkách). Reakce, vyžadující bezvodé podmínky jsou prováděny pod atmosférou argonu za použití rozpouštědel v uzávěrem zavřených lahvičkách. Organické roztoky jsou sušeny nad síranem hořečnatým nebo síranem sodným a rozpouštědla se odstraní ve vakuu na rotační odparce.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

N-(l-Oxoheptyl)-D-allo-threonin (2c—1)

Roztok n-heptanoylchloridu (440 ml, 2,83 mmol) v THF (250 ml) se přikape během 30 minut, ke studené (-5 až 0 °C), intenzivně míchané směsi D-allo-Thr (300 mg, 2,51 mmol) a 2N vod. NaOH (3,5 ml, 7,0 ekv.) v THF (4,0 ml).

Výsledná směs se míchá 2 h při téže teplotě a přes noc při teplotě místnosti. Těkavé látky se odstraní a zbytek se zředí vodou a okyselí, použije se konc. HC1. Směs se extrahuje EtOAc a spojený organický roztok se promyje solankou, suší, filtruje a zahuštění se získá surový 2c-l (420 mg, obsahující 10% přebytek heptanoylového činidla), který stáním tuhne.

NMR δ 1,28 (d, J = 6,5, 3H), 4,20 (m, 1H), 4,61 (dd, J = 3,4, 6,6, 1H), 6,56 (š, d. J= 6,9, 1H); /a/²⁶ _D=-38±2 (CHCIj).

Příklad 2

N-(l-Oxoheptyl)-D-threonin (2c-2)

D-Thr (2,50 g, 20,99 mmol) se konvertuje na 2c-2 podle postupu popsaného v příkladu 1: NMR 1,22 (d, J=6,4, 3Η), 4,45 (m, 1H), 4,55 (dd, J= 1,9, 8,3, 1H), 6,30-6,80 (š s, variabilní, 2H), 6,88 (š d, J=8?3, 1H); MS (HR-EI) m/z 321, 1939 (M vypočt. pro C,₈H₂₇NO₄, 321, 1940).

Příklad 3

N-(l-Oxoheptyl)-L-allo-threonin (2c—3)

L-allo-Thr (150 mg, 1,26 mmol) se převede na 2c-3 postupem popsaným v příkladu 1: NMR stejná jako pro 2c-l.

Příklad 4

N-(l-Oxoheptyl)-L-thereonin (2c-4)

-19CZ 290445 B6

L-THR (300 mg, 2,51 mmol) se převede na 2c^l postupem podle příkladu 1: NMR stejná jako pro 2c-2.

Příklad 5

N-(l-Oxoheptyl)-D-serin (2c—5)

D-Ser (6,00 g, 57,09 mmol) se převede na 2c-5 postupem podle příkladu 1. Surový· produkt se čistí chromatografií (2x21 cm kolona, gradient 1 % CH₃OH a 0,5 % HOAc až 3 % CH₃OH a 2 % HOAc v CH₂C1₂): NMR (CD₃OD) δ 0,90 (t, J = 6,8, 3H), 1,32 (m, 6H), 1,63 (m, 2H), 2,27 (zjevný t, J Ξ 7,5, 2H), 3,81 a 3,89 (AB zABX, Jab = 11,2, Jax = 4,1, J BX = 5,0, 2H), 4,49 (X z ABX, J 4,2, 4,8, 1H), MS (Cl, NH₄) m/z 218 (M+H), 235 (M+NH₄)/, /a/²⁶ _D -8±1 (MeOH).

Příklad 6

N-/trans-(4-pentylcyklohexyl)karbonyl/-D-allo-threonin (2c-6)

Roztok kyseliny trans-4-pentylcyklohexankarboxylové (198 mg, 1,0 mmol) v suchém toluenu (1 ml) se zpracuje s oxalylchloridem (760 mg, 5,9 mmol) při 0 °C a směs se míchá po 2 h při téže teplotě a 1 h při teplotě místnosti. Přebytek činidla se odstraní ve vakuu. Roztok surového chloridu kyseliny v suchém acetonitrilu (2 ml) se přidá do směsi D-allo-Thr (100 mg, 0,85 mmol), 2N vod. NaOH (600 μΐ, 1,20 mekv.) a TEA (85 mg, 0,85 mmol) v THR (1,5 ml), dále se postupuje podle příkladu 1. Surový produkt 2c-6 se čistí chromatograficky (1,5x18 cm kolona, 5% CH₃OH a 0,4% HOAc v CH₂C1₂): NMR δ 0,88 (t, J = 7, 3H), 4,15 (m,l H), 4,54 (m, 1H), 6,49 (d, 1H); MS (Cl, CH₄) m/z 300 (M+H).

Příklad 7

N-//4-Butoxyfenyl)acetyl/-D-allo-threonin (2c-7)

Kyselina 4-butoxyfenyloctová (288 mg, 1,38 mmol) se převede na chlorid kyseliny a přidá se k D-allo-Thr (150 mg, 1,26 mmol) a získá se 2c-9, postupem podle příkladu 6. Surový produkt se čistí chromatografií (2,5 x 18 cm kolona, gradient 4% CH₃OH a 0,3% HOAc v CH₂C1₂): NMR δ 0,96 (t, J=7,4, 3H), 1,14 (d, J=5,8,3H), 1,47 (m, 2H),

1,74 (m, 2H), 3,53 (š s, 2H), 3,91 (t, J= 6,5, 2H), 4,10 (šs, 1H), 4,53 (šs, 1H), 4,90 (šs, > 2H), 6,76 (š d, J=6,0, 1H), 6,84 (d, J=8,4,2H), 7,13 (d, J=8,4, 2H); MS (HR-EI) m/z 309, 1567 (m vyp. pro C_]6H₂₃NO₅ 309, 1576), /a/²⁶ _D -26±2 (CHC1₃), t.t. 90 až 94 °C.

Příklad 8

N-(l-Oxoheptyl)-D-allo-threonin, fenylmethylester (2e—1)

Surový 2c—1 (420 mg, 1,82 mmol) se rozpustí v DMF (18 ml) a zpracuje se s pevným NaHSO₃ (321 mg, 3,82 mmol), a výsledná směs se míchá 1 h při 70 až 75 °C. Směs se ochladí na 40 až 50 °C a zpracuje se s benzylbromidem (1,13 ml, 9,31 mmol). V míchání se pokračuje 2h při 40 °C a 18 h při teplotě okolí. Těkavé látky se odstraní a zbytek se vyjme do H₂O/EtOAc. Organická vrstva se oddělí, promyje se solankou, suší, filtruje a zahustí. Čištěním surového produktu se pomocí chromatografie (2x24 cm kolona) (3:1 hexany/EtOAc) získá bílá pevná

-20CZ 290445 B6 látka, která je charakterizována jako 2e-l (506 mg, 1,57 mmol): NMR δ 0,88 (zjevný T, J=6,8,

3H), 1,09 (d, J=6,4, 3H), 1,20-1,40 (m, 6H), 1,55-1,74 (m, 2H), 2,27 (zjevný t, J= 7,5, 2H),

3,20-3,80 (š s, variabilní, 1H), 4,21 (dq, J=3,3, 6,4,1 1H), 4,74 (dd, J=3,3, 6,8, 1H), 5.20 a 5,23 (AB, J=12,2, 2H), 6,43 (šd, J=6,5, 1H), 7,36 (m, 5H); MS (HR-EI) m/z 321, 1939 (M vvpoč. pro

C₁₈H₂₇NO₄, 321, 1940), /a/²⁶ _D-29±2 (CHC1₃), t.t. 70 až 73 °C.

Příklad 9

Fenylmethylester N-(l-oxoheptyl)-D-threoninu

Benzylace surového 2c-2 metodou podle příkladu 10 se získá 2e-2. Surová pevná látka se čistí chromatografíí (3,0x39 cm kolona, 3:1 hexan/EtOAc): NMR δ 0,88 (zjevný t, Ja 6,8, 3H), 1,20 (d, J=6,4,3H), 1,23-1,38 (m, 6H), 1,60-1,71 (m, 2H), a 1,55-1,95 (přesahující š s, variabilní, > 1H), 2,28 (zjevný t, J=7,6, 2H), 4,37 (dq, J=2,4, 6,4, 1H), 4,67 (dd, J=2,4, 8,9, 1H), 5,19 a 5,22 (AB, J=12,3, 2H), 6,21 (šd, J= 9, 1H), 7,35 (m, 5H), MS (HR-EI) m/z 322,2011 (M+H vypočt. pro C,₈H₂₈NO₄, 322, 2019), /cc/²⁶ _D+ 9± 1 (CHC1₃), t.t. 77 až 80 °C.

Příklad 10

Fenylmethylester N-(l-oxoheptyl)-L-allo-threoninu (2e-3)

Benzylace surového 2c-3 postupem podle příkladu 10 poskytne 2e-3. Surová pevná látka se čistí chromatografíí (2,5 x 28 cm kolona, 4:1 hexan/EtOAc): NMR stejné jako u 2e—1, MS (HR-EI) m/z 321, 1935 (M vypočt. pro C_I8H₂₇NO₄, 321, 1940), /a/²⁶ _D +25±2 (CHCI₃), t.t. 70 až 73 °C.

Příklad 11

Fenylmethylester N-(l-oxoheptyl)-L-threoninu (2e-4)

Benzylace surového 2c-4 podle metody z příkladu 10 poskytne 2e-4. Pevná látka se čistí chromatografíí (2,0x20 cm kolona, gradient 4:1 až 3:1 hexan/EtOAc): NMR stejné jako pro 2e-2, MS (HR-EI) m/z 321, 1947 (M vypočt. pro C₁₈H₂₇NO₄, 321,1940), /a/²⁶ _D -9±2 (CHC1₃), t.t. 78 až 80 °C.

Příklad 12

Fenylmethylester N-(l-oxoheptyl)-D-serinu (2e-5)

Benzylací 2c-5 postupem podle metody z příkladu 10 se získá 2e-5. NMR δ 0,88 (zjevný t, J = 7,7,2H), 2,45 a 2,80 (š s, 1H), 3,92 a 3,99 (AB a ABX, Jab = 11,2, Jax = 3,4, J_BX = 4,0, 1H), 4,72 (ddd, zjevný kvintet, J_x_nh = 7,3, Jax = Jbx 3,7, 1H), 5,21 (zjevný s, malé AB postranní signály, 2H), 6,46 (šd, J=7,l, 1H), 7,36 (m, 5H), MS (HR-EI) m/z 307, 1792 (M vypočt. pro Ci₇H₂₅NO₄, 307, 1801),/a/²⁶ _D-11 + 1 (CHC1₃), t.t. 62 až 66 °C.

Příklad 13

Fenylmethylester N-/trans(4-pentylcyklohexyl)karbonyl/-E)-allo-threoninu (2e—6)

-21 CZ 290445 B6

Benzylací 2c-6 podle metody z příkladu 10 s následující chromatografii (2 x 18 cm kolona, 0,5%

CH₃OH v CH₂C1₂) se získá 2e-6. NMR δ 0,88 (m, 5H), 1,07 (d, J=6,4, 3H), 1,10-1,35 (m, 8H),

1,35-1,55 (m, 2H), 1,64 (šs, 1,97 (m, 4H), 2,14 (m, 1H), 3,67 (šs, 1H), 4,20 (m, 1H), 4,73 (dd, 1=3,2 a 6,7, 1H), 5,18 a 5,25 (AB, J_AB = 12,2, 2H), 6,44 (d, J=6,6, 1H), MS (HR-EI) m/z

389,2566 (m, vypočt. pro C^HjsNCh, 389,2566), /a/²⁶ _D -24±2 (CHC1₃), t.t. 130 až 34 °C.

Příklad 14

Fenylmethylester N-/(4-butoxyfenyl)acetyl/-D-allo-threoninu (2e—7)

Benzylací 2c-7 se postupem podle příkladu 10 s následující chromatografii (2 x 20 cm kolona, 3:1 hexan/EtOAc) získá 2e-7. NMR δ 1,00 (m, 6H), 1,50 (m, 2H), 1,76 (m, 2H), 3,38 (šs, 1H), 3,56 (zjevný s, malé AB postranní signály, 2H), 3,95 (zjevný t, J=6,5, 2H), 4,15 /m, 1H), 4,72 (dd, J=7,0 a 3,4, 1H), 5,13 a 5,19 (AB, J=12,2, 2H), 6,38 (šd, J=6,8, 1H), 6,87 (d, J=8,7, 2H), 7,15 (d, J= 8,6, 2H), MS (Cl, CH₄) m/z 400 (M+H), /a/_D ²⁶-18±2 (CHC1₃), t.t. 80 až 83 °C.

Příklad 15

Fenylmethylester (R)-3-(hydroxy-N-(l-oxoheptyl)-D-norvalinu (2e-8)

Benzylací 2c-8 z příkladu 51 se mohou podle příkladu 10 získá 2e-8.

Příklad 16

Fenylmethylester (S)-3-(hydroxy-N-(l-oxoheptyl)-D-norvalinu (2e-9)

Benzylací 2c-9 z příkladu 52 se metodou podle příkladu 10 získá 2e-9.

Příklad 17

Fenylmethylester N-/N²-/( 1,l-dimethylethoxy)karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6/(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (40b)

Směs 4-nitrofenylmethylesteru N-/N²-/( 1,1 -dimethylethoxy )karbonyl/-N⁶-/( feny lmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(methoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (40a, Kolodziejczyk a spol., Int. J. Pent. Prot. Res., 1992, 39, 382, 683 mg, 1,06 mmol), 4-molekulová síta (2,15 g, lámané), THF (10,5 ml) a benzylalkohol (11,0 ml, 105,6 mmol) se míchá 30 min a potom se zpracuje s izopropoxidem titaničitým (82 μΐ, 0,27 mekv.). Výsledná směs se zahřívá 24 hodin na 85 až 90 °C. Pevné látky se odfiltrují přes diatomickou hlinku a rozpouštědlo se odstraní. Přebytek benzylalkoholu se odstraní destilací na Kugelrohr-aparátu (přibližně 1000 μ tlak, 50 až 75 °C). Surový oranžový olej se chromatografuje (2,5 x 31 cm kolona), gradient 4:1-2:1 hexan/EtOAc) a získá se 40b (633 mg, 88% výtěžek): NMR δ 1,39 (d, J=7,2, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,40-1,67 (m, 4H), 1,84 (šs, 2H), 4,07 (šs, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,58 (zjevný kvintet, 1H), 5,0 (šd, 1H), 5,07-5,25 (m, 6H), 5,43 (šd, J=7,9, 1H), 6,68 (šd, 1H), 7,33 (m), MS (HR-FAB) m/z 678, 3232 (M+H, vypočt. pro C37H46N3O9, 676, 3234).

-22CZ 290445 B6

Příkladu 18

Fenylmethylester N-/N⁶-(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysylD-alaninu (3b)

Roztok 40b (251 mg, 0,37 mmol) v TFA (870 μΐ se míchá 30 min při 0 °C. TFA se odstraní a olej se vyjme do EtOAc a promyje se nasyceným roztokem NaHCO₃. Sušením a odstraněním rozpouštědla se získá 3b (225 mg, slabý přebytek), který se použije v následujících reakcí bez dalšího čištění: NMR 1,39 (d, 3H), a 1,20-1,70 (přesahující m, 4H), 1,82 (šs, 2H), 3,23 (šs, variabilní, 2H), 3,33 (šs, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,47 (zjevný kvintet, 1H), 5,03 - 5,13 (m, 6H), 5,27 (šd, 1H), 7,35 (m, 15H), 7,95 (šd, 1H), MS (FAB) m/z (M+H), 598 (M+Na).

Příklad 19

Fenylmethylester R-(R^x,R^x)/-N-/N²-//3-oxo-2-/(l-oxoheptyl)amino/-l-methyl-3-(fenylmethoxy)-propoxy/karbonyl-N⁶-/(fenylmethoxy)-propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (1 a-1)

Roztok 2e-l (173,6 mg, 0,54 mmol) v THF /spolehlivě uzavřené rozpouštědlo přesušené nad 3-MS, 1,45 ml) se přidá k přebytku studeného fosgenu (1,92M roztok v toluenu, 1,40 ml, 2,63 mmol), alternativně s TEA (81 μΐ, 0,58 mmol) během 15 min při 0 °C. Výsledná mléčná směs se míchá dalších 15 min při téže teplotě a 5 h při teplotě místnosti. Směs se odplyní argonem po dobu 30 min a míchá se pod aspirátorovým tlakem po dobu 30 min. Zbytek se zpracuje s roztokem čerstvě připraveného 3b (0,37 mmol) v CH₃CN (přesušený jako u THF, 2,9 ml) a potom TEA (81 μΐ, 0,58 mmol), oba se přidají najednou. Bílá kaše se míchá přes noc při teplotě okolí. Vodná fáze se extrahuje dvakrát EtOAc a spojené organické fáze se promyjí solankou, suší, filtrují a odpaří. Čištěním produktu chromatografií (3x30 cm kolona, gradient 2:1-1:2 hexan/EtOAc) se získá bílý vosk, který je identifikován jako 1 a—1: NMR δ 0,86 (m, 3H), 1,11 (d, J=6,4, 3H), 1,20-1,40 (m, 8H), 1,42 (d, J=7,3, 3H), 1,50-1,75 (m, 4H, s přesahem H₂O signálu), 1,75-2,05 (šd, 2H), 2,20 (m, 2H), 4,15 (šs, 1H), 4,47 (šs, 1H), 4,62 (zjevný kvintet, 1H), 4,87 (zjevný šd, Ja6, 1H), 5,00-5,20 (m, 9H), 5,23 (m, 1H), 5,37 (šd, 1H), 6,40 (šd, 1H), 7,33 (m, 20H), 7,77 (šd, 1H), MS (HR-FAB) m/z 923, 4420 (M+H, vypočt. pro C₅iH₆₃N₄O₁₂, 923, 4442).

Příklad 20

Fenylmethylester /S-(R^x,S^x)/-N-/N²-//3-oxo-2-/(l-oxoheptyl)amino/-l-methyl-3-(fenylmethoxy)-propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-Llysyl/-D-alaninu (1 a—2)

Sloučenina 2e-2 (20 mg, 0,062 mmol) se kopuluje se 3b (0,043 mmol) postupem podle příkladu 19. Čištěním surového produktu (1,5 x 21 cm kolona, 2:1 hexan/EtOAc) se získá bílý vosk, který je charakterizován jako la-2: NMR δ 0,87 (m, 3H), 1,25 a 1,23-1,38 (přesah d, J=6,2, 3H a m, 8H), 1,40 (d, J=7,2, 3H), 1,55-1,75 (m, 4H, s přesahem H₂O signálu), 1,75-1,90 (m, 2H), 2,29 (m, 2H), 4,08 (šs, 1H), 4,83 (šs, 1H), 4,58 (zjevný kvintet, 1H), 4,83 (šd, 1H), 5,05-5,30 (m, 9H), 5,35 (šs, 1H), 5,68 (šs, 1H), 6,30 (šs, 1H), 6,62 (šs, 1H), 7,33 (m, 20H), MS (HR-FAB) m/z 923, 4455 (M+H, vypočt. pro C₅iH₆₃N₄O₁₂, 923, 4442).

-23CZ 290445 B6

Příklad 21

Fenylmethylester /S-(R^x,R^x)/-N-/N²-//3-oxo-2/(l-oxoheptyl)amino/-l-methyl-3-(fenylmethoxy)-propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-Llysyl/-D-alaninu (la-3)

Sloučenina 2e-3 (27,4 mg, 0,085 mmol) se kopuluje se 3b (0,06 mmol) postupem podle příkladu 19. Čistěním surového produktu (1,5 x 16 cm kolona, 2:1 hexan/EtOAc) se získá bílý vosk, který je identifikován jako la3: NMR δ 0,86 (m, 3H), 1,20-1,35 (m, 1H), 1,39 a 1,35-1,57 (přesahující d, J=7,l, 3H a m, 4H), 1,75-1,95 (šs, 2H), 2,10-2,30 (m, 2H), 4,08 (šm, 1H), 4,37 (šs, 1H), 4,57 (zjevný kvintet, J=7,3, 1H), 4,70-5,30 (přesahující multilepty, 10H), 5,93 (šd, 1H), 6,50 (šd, 1H), 6,63 (šd, J=7, 1H), 7,05 (m, 1H), 7,34 (m, 20H), MS (HR-FAB) m/z 945, 4281 (M+Na, vypočt. pro C₅iH₆2N₄0i2Na, 945,4262).

Příklad 22

Fenylmethylester /R-(R^x,S^x)/-N-/N²-//3-oxo-2-/(l-oxoheptyl)amino/-l-methyl-3-(fenylmethoxy)-propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-Llysyl/-D-alaninu (la-4)

Sloučenina 2e-4 (27,6 mg, 0,085 mmol) se kopuluje se 3b (0,06 mmol) postupem podle příkladu 19. Čištěním surového produktu (1,5 x 16 cm kolona, gradient 2:1-1:1 hexan/EtOAc) se získá bílý vosk, který je identický s la-4: NMR δ 0,86 (m, 3H), 1,25 a 1,25-1,40 (přesahující d, J=6,5 a 3 am, 11H), 1,42 (d, J=7,0, 3H), 1,53-1,73 (m, 4H, s přesahujícím H₂o signálem), 1,73-1,95 (šs, 2H), 2,27 (zjevný t, J= 7,5, 2H), 4,12 (šs, 1H), 4,38 (šs, jemná struktura, 1H), 4,58 (šs, 1H), 4,81 (šd, 1H), 5,03-5,23 (m, 8H), 6,41 (šd, 1H), 6,71 (šd, 1H), 7,33 (m, 20H), MS (HR-FAB) m/u 945,4271 (M+Na vypočt. pro C₅iH₆₂N₄0i2Na 945,4262).

Příklad 23

Fenylmethylester (R)-N-/N²-//3-oxo-2-/(l-oxoheptyl)amino/-3-(fenylmethoxy)propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (la-5)

Sloučenina 2e-5 (99 mg, 0,32 mmol) se kopuluje se 3b (0,21 mmol) postupem podle příkladu 19. Čištěním surového produktu (2x21 cm kolona, gradient 2:1-1:1 toluen/ether) se získá bílý vosk, který je charakterizován jako la-5: NMR δ 0,88 (m, 3H), 1,20-1,38 (m, 8H), 1,39 (d, J=7,2, 3H), 1,50-1,66 (m, 4H), 1,85 (šs, 2H), 2,21 (zjevný t, J=7,6, 2H), 4,09 (šs, 1H), 4,23-4,51 (m, 3H), 4,58 (zjevný kvintet, J=7,3, 1H), 4,90 (šs, 1H), 5,05-5,25 (m, 9H), 5,55 (št, 1H), 6,55 (šd, 1H), 6,90 (šd, 1H), 7,33 (m, 20H), MS (HR-FAB) m/z 909,4270 (M+H vypočt. pro C₅oH₆₁N₄0|₂ 909, 4285).

Příklad 24

Fenylmethylester/R-(R^X,R^x)/-N-/N²-//l-methyl-3-oxo-2-//(4-pentykcyklohexyl)karbonyl/amino/-3-(fenylmethoxy)propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (1 a-6)

Sloučenina 2e-6 (33 mg, 0,085 mmol) se kopuluje se 3b (0,6 mmol) postupem podle příkladu 19. Čištěním surového produktu (1,5 x 17 cm kolona, 2:1 hexan/EtOAc) se získá bílý pevný vosk, který je charakterizován jako la-6: NMR δ 0,87 (m, 5H), 1,10 (d, J=6,6, 3H), 1,10-1,43 (m, 15H), 1,43 (d, J=7,3, 3H), 1,70-2,20 (m, 7H), 4,15 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,89

-24CZ 290445 B6 (šd, >8,3, 1H), 5,03-5,30 (m, 9H), 5,37 (šd, 1H), 6,43 (šd, 1H), 7,33 (m, 20H), 7,34 (šd, 1H),

MS (HR-FAB) m/z 1013, 4903 (M+Na, vypočt. pro C₅6H₇₀N₄O₁₂Na, 1013, 4888).

Příklad 25

Fenylmethylester /R-(R^x,R^x)/-N-/N²-//2-//(4-butoxyfenyl)acetyl/amino/-l-methyl-3-oxo-3(fenylmethoxy)propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu

Sloučenina 2e-7 (34 mg, 0,085 mmol) se kopuluje se 3b (0,06 mmol) postupem podle příkladu 19. Čištěním surového produktu (1,5 x 14 cm kolona, 2:1 hexan/EtOAc) se získá bílý vosk, který je charakterizován jako la-7: NMR δ 0,97 (m, 6H), 1,10-1,60 (m, přesahující d, >7,3, 9H), 1,65-2,03 (m, 4H), 3,45 (m, 2H), 3,92 (zjevný t, >6,5, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,62 (zjevný kvintet, >7,3, 1H), 4,86 (šd, >8,0, 1H), 5,05-5,25 (m, 9H), 5,42 (šd, >7,5, 1H), 6,33 (šd, 1H), 6,84 (d, >8,5, 2H), 7,13 (d, >8,5, 2H), 7,33 (m, 20H), 7,89 (šd, 1H), MS (HR-FAB) m/z 1023, 4368 (M+Na, vypočt. pro C56H₆₄N₄O₁₂Na, 1023, 4368).

Příklad 26

Fenylmethylester/R-(R^x,R^x)-/N-/N²-//l-ethyl-3-oxo-2-/(l-oxoheptyl)amino/-3-(fenylmethoxy)propoxy/karbonyl/-N⁶-/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-/(fenylmethoxy)karbonyl/-Ltysyl/-D-alaninu (la-8)

Sloučenina 2e-8 (99 mg, 0,32 mmol) se kopuluje se 3b (0,21 mmol) postupem podle příkladu 19.

Příklad 27

Fenylmethylester /S-(R^x,S^x)/-N-/N²-//l-ethyl-3-oxo-2-/(l-oxoheptyl)amino/-3-(fenylmethoxy)propoxy/karbonyl/-N⁶/(fenylmethoxy)karbonyl/-(R)-6-/(fenylmethoxy)karbonyl/-Ltysyl/-D-alaninu (1 a—9)

Sloučenina 2e-9 (99 mg, 0,32 mmol) se kopuluje se 3b (0,21 mmol) postupem podle příkladu 19.

Příklad 28 /R-(R^x,R^x)/-N-/(R)-6-karboxy-N²-//2-karboxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethoxy/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 a—11)

Roztok la—1 (140 mg, 0,15 mmol) v EtOAc/EtOH (5 ml: 15 ml) se hydrogenuje nad Pd(OH)₂ (Pearlmanův katalyzátor, 20 % na C) za použití Parrovy aparatury při počátečním tlaku 490 kPa. Po 5,5 hodinách, filtraci a odpaření se získá bezbarvé sklo. Toto se trituruje s etherem a stěny baňky se poškrábou a získá se bílý krystalický prášek. Etherový roztok se odstraní stříkačkou a pevná látka se promyje dvěma podíly etheru, suší se a charakterizuje jako la—11: NMR (CD₃OD) δ 0,89 (m, 3H), 1,22 (d, >6,5, 3h), 1,24-1,39 (m, 6H), 1,42 (d, >7,3, 3H), 1,45-1,99 (m, 8H), 2,26 (t, >7,5, 2H), 3,62 (m, 1H), 4,06 (m, 1H), 4,41 (m, 1H), 4,89 (šs pro OH, NH, jeden skrytý CH signál), 5,14 (m, 1H), MS (HR-FAB) m/z 519,2671 (M+H vypočt. pro C₂₂H₃₉N₄O₁₀, 519,2666).

-25CZ 290445 B6

Příklad 29 /S-(R^x,S^x)/-N-/(R)-6-karboxy-N²-//2-karboxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethoxy/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 a-12)

Hyydrogenolázou sloučeniny la-2 (37,0 mg, 0,04 mmol), postupem podle příkladu 28 se získá la—12: NMR (CD₃OD) δ 0,90 (m, 3H), 1,26 (d, J=6,3, 3H), 1,2-1,38 (m, 6H), 1,40 (d, J=7,2, 3H), 1,44-1,73 (m, 5H), 1,73-2,05 (m, 3H), 2,33 (zjevný t, J= 7,3, 2H), 3,92 (m, 1H), 4,16 (šs, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,64 (m, 1H), 5,31 (m, 1H); Ms (HR-FAB) m/z 519,2671 (M+H vypočt. pro C22H59N4O10, 519,2666).

Příklad 30 /S-(R^x,R^x)/-N-/(R)-6-karboxy-N²-//2-karboxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethoxy/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 a-13)

Hyydrogenolýzou sloučeniny 1 a—3 (22,0 mg, 0,024 mmol) postupem podle metody z příkladu 28 poskytne la—13: NMR (CD₃OD) δ 0,91 (m, 3H), 1,19-1,45 /přesahující d (J=6,5, při 1,25 d), m ad (J=7,3, při 1,39 d), 12 H/, 1,47-1,72 (m, 5H), 1,72-2,10 (m, 3H), 2,29 (zjevný t, J=7,5, 2H), 3,68 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 5,17 (m, 1H); MS (HR-FAB) m/z 519,2651 (M+H vypočt. pro C₂2H₃9N4O₁₀, 519,2666).

Příklad 31 /R-(R^x,S^x)/-N-/(R)-6-karboxy-N²-//2-karboxy-l -methy 1-2-/ (1 -oxoheptyl)am ino/ethoxy/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 a-14)

Hydrogenolýzou sloučeniny la-4 (36,6 mg, 0,04 mmol) podle metody z příkladu 28 se získá 1 a-14: NMR (CD₃OD) δ 0,90 (m, 3H), 1,22-1,36 /přesahující d (J=6,2, při 1,24 d) a m, 12H/, 1,36-2,02 (m, 8H), 2,32 (m, 2H), 3,60-3,80 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,61 (m, 1H), 5,30 (šs, 1H), MS (HR-FAB) m/z 519,2667 (M+H vypočt. pro C₂2H₃₉N₄O₁₀, 519,2666).

Příklad 32 (R)-N-/(R)-6-karboxy-N²-//2-karboxy-2-/(l-oxoheptyl)-amino/ethoxy/karbonyl/-L-lysyl/D-alanin (1 a—15)

Hydrogenolýza sloučeniny la-5 (247 mg, 0,27 mmol) postupem podle metody z příkladu 28 poskytne la-15: NMR (CD₃OD) δ 0,90 (m, 3H), 1,16-1,46 /přesahující d (J=7,0, při 1,40 d) am, 9H/, 1,46-2,05 (m, 8H), 2,25 (m, 2H), 3,69 (šs, 1H), 4,11 (šs, 1H), 4,36 (m, 3H), 4,63 (šs, 1H), MS (HR-FAB) m/z 505,2505 (M+H vypočt. pro C2iH₃₇N₄Oi₀ 505,2509).

Příklad 33 /R-(R^xR^x)/-N-/(R)-6-Karboxy-N²-//2-karboxy-l-methyl-2-//(4-pentylcyklohexyl)karbonyl/amino/ethoxy/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 a-16)

Hydrogenolýzou sloučeniny la-6 (17 mg, 0,017 mmol) se postupem podle metody z příkladu 28 získá la—16: NMR (CD₃OD) δ 0,90 (m, 5H), 1,10-1,75 /m, 19H, s přesahem 1,23 (d, J=6,6) a 1,45 (d, J=7,4)/, 1,75-2,05 (m, 8H), 2,27 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 4,07 (m, 1H), 4,44 (m, 1H),

-26CZ 290445 B6

4,90 (m, 1H, pod OH signálem), 5,14 (m, 1H); MS (HR-FAB) m/z 609,3099 (M+Na vypočt. pro

C₂₇H₄₆N₄O₁₀Na 609,3112).

Příklad 34 /R-(R^X,R^X)/-N-/ (R)-6-Karboxy-N²-//(4-butoxyfeny l)acety l/-am i no/-2-karboxy-1 -methy 1ethoxy/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 a-17)

Hydrogenolýza sloučeniny la-7 (33 mg, 0,034 mmol) postupem podle metody z příkladu 28, poskytne la-17: NMR (CD₃OD) δ 0,99 (m, 3H), 1,10-2,05 (m, 16 H), 3,55 (m, 2H), 3,65 (m, 1), 3,96 (m, 2H), 4,07 (m, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,90 (m, 1H, pod OH signálem), 5,18 (m, 1H), 6,85 (m, J=8,6, 2H), 7,22 (m, J=8,6, 2H), MS (HR-FAB) m/z 597,2757 (M+H, vypočt. pro C₂₇H_4IN₄0h 597,2772).

Příklad 35 /R-(R^x,R^x)-/N-/(R)-6-karboxy-N²-//l-/karboxy/(l-oxoheptyl)amino/methyl/propoxy/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 a—18)

Hydrogenolýza sloučenina la-8 (247 mg, 0,27 mmol) metodou podle příkladu 28 poskytne la—18.

Příklad 36 /S-(R^x,S^x)/N-/(R)-6-karboxy-N²-//l-/karboxy/(l-oxoheptyl)amino/methyl/propoxy/karbonyl/L-lysyl/-D-alanin (la—19)

Hydrogenolýza sloučeniny la-9 (247 mg, 0,27 mmol) postupem podle příkladu 28 se získá la—19.

Příklad 37

Methylester N-(l-oxo-heptyl)-L-serinu (2j)

Hydrochlorid methylesteru L-serinu se převede na 2j postupem podle příkladu 1: NMR δ 0,89 (t, J=6,9, 3H), 1,30 (m, 6H), 1,65 (m, 2H), 2,28 (zjevný t, J= 7,5, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,96 (m, 2H), 4,69 (m, 1H), 6,80 (šs, 1H); MS (HR-E1) m/z 231,1465 (M vypočt. pro C_hH₂₁NO₄ 231,1459); /a/_D ²⁶+ 22±l (CHC1₃):

Příklad 38

Methylester (S)-2,2-dimethyl-3-(l-oxoheptyl)-4-oxazolidinkarboxylové kyseliny (8a)

Sloučenina 2j (320 mg, 1,38 mmol) a p-TSA (40 mg) se rozpustí v suchém acetonu (2 ml) a 2,2-dimethoxypropanu (2 ml). Výsledný roztok se zahřívá přes noc pod refluxem. Přidá se pevný K₂CO₃ a těkavé látky se odstraní ve vakuu, získá se zbytek. Rychlá chromatografíe (2x21 cm kolona, 6:1 hexan/EtOAc) zbytku poskytne 8a jako olej: NMR δ 0,88 (m, 3H), 1,29 (m, 6H), 1,57 (s, 3H), 1,62 (m, 2H), 1,70 (s, 3H), 2,15 (m, 2H), 3,81 (s, 3H), 4,20 (m, 2H), 4,46 (m, lH);/a/_D ²⁶-47±l (CHCI3):

-27CZ 290445 B6

Příklad 39 (R) -2,2-Dimethyl-3-(l-oxoheptyl)-4-oxazolidinmethanol

Roztok 8a (296 mg, 1,09 mmol) v suchém etheru (1 ml) se zpracuje s lithiumborohydridem (2M roztok v THF, 0,55 ml, 1,09 mekv.) pod argonem. Směs se míchá 3 h pod refluxem a 18 h při teplotě místnosti. Výsledná směs se zředí etherem a rozruší methanolem. Těkavé látky se odstraní a zbytek se vyjme do EtOAc/H₂O. Zpracování poskytne surový alkohol, který se čistí chromatografii (2:1 hexan/EtOAc): NMR δ 0,88 (m, 3H), 1,30 (m, 6H), 1,54 (s, 3H), 1,62 (s, 3H), 2,35 (m, 2H), 3,30-4,40 (komplex m, 6H); MS (HR.E1) m/z 243,1837 (M vypočt. pro C₁₃H₂₅NO₃ 243,1840), /a/_D ²⁶-5±l (CHC1₃).

Příklad 40 (S) -2,2-Dimethyl-3-(l-oxoheptyl)-4-oxazolidin-karboxaldehyd (9a)

Roztok oxalylchloridu (105 μΐ, 1,23 mmol) vCH₂C1₂ (2,75 ml) se ochladí na -60 °C. Roztok DMSO (192 μΐ) v CH₂C1₂ (0,55 ml) se přidá během 5 min a výsledná mléčná směs se míchá 15 min při -60 °C. Ke směsi se přidá alkohol během 5 minut (alkohol z příkladu 39 - 133 mg, 0,55 mmol) v CH₂C1₂ (0,55 ml)). Lázeň se nechá ohřát na -20 °C (20 min) a čirý roztok se míchá 20 min při -20 °C. Přidá se triethylamin (0,77 ml) a vody (3,4 ml) a směs se míchá 5 min při teplotě okolí. Zpracování sCH₂Cl₂ poskytne surový olej, který se čistí chromatografii (1,5 x 20 cm, 3:1 spolu) se získá 9a: NMR δ 0,85 (m, 3H), 1,30 (m, 6H), 1,60 (s, 3H), 1,60-1,70 (m, 2H), 1,70 (s, 3H), 2,00-2,40 (m, 2H), 4,00-4,30 (m, 3H), 9,65 (d, J=1,1H).

Příklad 41 (4S)-a-Ethyl-2,2-dimethyl-3-(l-oxoheptyl)-4-oxazolidinmethanol (10a)

Roztok 9a (108 mg, 0,44 mmol) v etheru (1 ml) se přikape ke studenému (5 °C) roztoku EtMgBr (3M v etheru, 0,36 ml). Studená lázeň se odstraní, přidá se krystalický jod ke směsi a v míchání se pokračuje 1,5 h při teplotě místnosti. Výsledná směs se zředí EtOAc a promyje se nasyceným vodným NH₄C1 roztokem. Vodná fáze se reextrahuje a spojený organický roztok se suší a odpařením se získá surový výtěžek 10a: NMR δ 0,88 (m, 3H), 1,05 (m, 3H), 1,30 (m, 6H), 1,45 (m, 2H), 1,57 (s, 3H), 1,50-1,75 (m, 5H), 2,10-2,60 (m, 2H), 3,50-4,50 (m, 4H); MS (El) m/z 271 (M).

Příklad 42

R-(R^X,S^X) a S-(R^x,R^x)-N-/2-hydroxy-l-(hydroxymethyl)-butylheptanamid

Surový 10a (107 mg, 0,39 mmol) se rozpustí ve studeném TFA (0,38 ml), obsahujícím vodu (= 1%) a roztok se míchá 45 min při 0 °C. Těkavé látky se odstraní a zbytek se vyjme do EtOAc a promyje se nasyceným NaHCO₃ a solankou. Po sušení a odstranění rozpouštědla se izoluje 1 la (2:1 směs diastereoizomerů) chromatografii (1,5x18 cm, 2% MeOH v CH₂C1₂): NMR 0,85-1,05 (m, 6H), 1,30 (m, 6H), 2,23 (m, 2H), 3,65-4,05 (m, 4H), 6,20 a 6,40 (dva široké d, 2:1 poměr, 1H); MS (HR-EI) m/z 232,1887 (M vypočt. pro C₁₂H₂₅NO₃ 231,1940).

-28CZ 29044S B6

Příklad 43 /S-(R^x,R^x)-/N-71-///(l,l-dimethylethyl)difenylsilyl/oxy/methyl/-2-hydroxybutyl/heptanamid (10c)

Směs 11a (1,0 mmol), terc.butyldifenylsilylchloridu (1,2 mmol), TEA (1,2 mmol) a DMAP (0,04 mmol) v CH₂C1₂ (1,5 ml) se míchá 20 h při teplotě místnosti podle S.K.. Chaudhary-ho a O. Hemandeze (Tetrahedron Lett., 1979, 99). Výsledná směs se rozdělí mezi CH₂C1₂ a vodu. Vrstvy se oddělí a organická fáze se promyje nasyceným roztokem NH₄C1 a suší. Odstraněním rozpouštědla se získá směs, která se čistí chromatografii. Méně polární produkt je identifkován jako 10c.

Příklad 44 /R—(R^x, S^x)/—N—/1 —///(1, l-dimethylethyl)difenylsilyl/oxy/methyl/-2-hydroxybutyl/heptanamid (10d)

Polárnější izomer izolovaný v příkladu 43 je charakterizován jako lOd.

Příklad 45 /S-(R^x,R^x)/-N-/l-///(l,l-dimethylethyl)difenylsilyl/oxy/methyl/-2-(fenylmethoxy)butylheptanamid (12c)

Roztok 10c (1 mmol) v DMF (0,60 ml) a BnBr (0,96 ml, 8 mmol) se zpracuje sn-Bu₄N⁺I (37 mg, 0,1 mmol). Disperze NaH (60% v oleji, 1,3 mekv.) se přidá po částech k roztoku během 1 h. Směs se míchá přes noc při teplotě místnosti. Etherové zpracování poskytne surový olej, který se čistí chromatografii. Hlavní produkt je charakterizován jako 12c.

Příklad 46 /R-(R^x,S^x)/-N-/l-///(l,l-dimethylethyl)difenylsilyl/-oxy/methyl/-2-(fenylmethoxy)butylheptanamid (12d)

Sloučenina 12d se připraví z 1 Od za použití postupu z příkladu 45.

Příklad 47 /S-(R^x,R^x)/-N-(/l-(Hydroxymethyl)-2-(fenylmethoxy)-butyl/heptanamid (13c)

Sloučenina 12c (1 mmol) se rozpustí v THF (1,1 ml) a zpracuje se s roztokem n-Bu₄N⁺F~ (INvTHF, 3,0 ml (podle E.J. Coreye a A. Venkateswarlu, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 6190). Po 40 min při teplotě místnosti se reakce přeruší ledem a směs se rozdělí mezi ether a vodu. Vodná vrstva se reextrahuje etherem a spojené organické vrstvy se promyjí solankou, suší se a rozpouštědlo se odstraní čímž se získá 13c, která se čistí chromatografii.

-29CZ 290445 B6

Příklad 48 /R-(R^x,S^x)/-N-/l-(Hydroxymethyl)-2-(fenylmethoxy)-butyl/heptanamid (13d)

Sloučenina 13d se připraví ze 12d postupem podle postupu popsaného v příkladu 47.

Příklad 49

N-( 1 -Oxohepty 1)-3-(fenylmethoxy)-threo-D-norvalin (14c)

Alkohol 13c (1 mmol) v DMF (4 ml) se zpracuje s pyridiniumdichromátem (3,5 mekv.) metodou podle Corey-e a Schmodt-a, Tetrahedron Lett., 1979, 399). Po 18 h se směs nalije na led. Zpracováním s etherem se získá 14c, který se čistí chromatografií.

Příklad 50

N-(l-Oxoheptyl)-3-(fenylmethoxy)-erythro-D-norvalin (14d)

Sloučenina 14d se připraví ze 13d postupem podle příkladu 49.

Příklad 51

3-Hydroxy-N-( 1-oxohepty l)-threo-D-norvalin (2c-8)

Roztok 14c v EtOAc/EtOH se hydrogenuje postupem podle příkladu 28. Surový produkt je identifikován jako 2c-8 a použit v příkladu 15.

Příklad 52

3-Hydroxy-N-( l-oxoheptyl)-erythro-D-norvalin (2c-9)

Sloučenina 2c-9 se připraví ze 14d postupem podle příkladu 51. Surový produkt se použije v příkladu 16.

Příklad 53

N²-(l-Oxyheptyl)-D-asparagin (22a)

D-Asparagin 21a (4,5 g, 29,9 mmol) se převede na 22a postupem podle příkladu 1. Směs vody a THF se použije jako rozpouštědlo a 2N vodný NaOH se nahradí směsí triethylaminu a 0,5N NaHCO₃. Surová pevná látka se čistí rekrystalizací z methylalkoholu-etheru. NMR (CD₃OD) δ 0,90 (t, 3H), 1,61 (m, 2H), 2,23 (t, 2H), 2,75 (m, 2H), 4,71 (dd, 1H); MS (LR-CI) m/z 245 (M+H) vypočt. pro C11H21N2O4 245.

-30CZ 290445 B6

Příklad 54

3-Amino-N-( l-oxoheptyl)-D-alanin (2g— 1)

Sloučenina 22a (2,21 g, 9,0 mmol) se přidá k roztoku bis-(trifluoracetoxy)jodbenzenu (5,83 g, 13,57 mmol) v 51 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a 41 ml vody. Směs se míchá 15 minut a zpracuje s pyridinem (1,46 ml, 18,09 mmol). Výsledný roztok se míchá 18 h při teplotě místnosti. Těkavé látky se odstraní a zbytek se zředí 90 ml vody. Směs se promyje 3 x 50 ml etheru. Vodná vrstva se oddělí a odpaří. Triturací výsledné kapaliny s etherem se získá bílá pevná látka, která je charakterizována jako 2g-l: NMR(CD₃OH) δ 0,61 (t, 3H), 1,35 (m, 2H), 2,05 (t, 2H), 3,-3,2 (m, 2H), 4,40 (m, 1H): MS (HR-FAB) m/z 217,1555 (M+H, vypočt. pro Ci₀H₂iN₂O₃ 217,1552).

Příklad 55

Monohydrochlorid/fenylmethylesteru 3-amino-N-( 1 -oxoheptyl)-D-alaninu (2h— 1)

Acetylchlorid (3,05 ml, 42,87 ml) se přidá po kapkách během 10 min k ledově studenému roztoku benzylalkoholu (10 ml, 96,63 mmol). Výsledný roztok se míchá dalších 30 min. Ledová lázeň se potom odstraní a přidá se sloučenina 2g—1 (1,32 g, 6,12 mmol). Roztok se míchá přes noc při teplotě místnosti a těkavé látky se odstraní Kugelrohr destilací. Zbytek se trituruje s etherem a potom se rekrystaluje z ethylalkoholu a získá se bílá pevná látka, která se identifikuje jako 2h-l: NMR (CDC1₃) δ 0,75 (t, 3H), 1,45 (m, 2H), 2,20 (t, 2H), 3,40 (m, 2H), 4,80 (šs, 1H), 5,10 (s, 2H), 7,62 (šs, 1H); MS (HR-FAB) m/z 307,2017 (M+H vypočt. pro C,₇H₂₇N₂O₃ 307,2022).

Příklad 56 /S-(R^x,R^x)/-N-/2-Hydroxy-l-(hydroxymethyl)propyl/heptanamid (11c)

K roztoku (2e-2) (1,0 g, 3,11 mmol) v etheru za zahřátí se přikape roztok lithiumborohydridu (1,60 ml, 3,2 mmol) v tetrahydrofuranu. Reakční směs se refluxuje 3 hodiny, zředí se etherem a pomalu se zpracuje s methanolem až do ukončení bublání. Těkavé látky se odstraní a získá se zbytek, který se rozdělí mezi vodu a ethylacetát. Organická vrstva se oddělí, promyje se solankou, suší a filtruje. Filtrát se odpaří a získá se olej, který je čistí chromatografií za eluce 3:1 ethylacetát-hexany a získá se 560 mg požadovaného produktu jako oleje. NMR δ 1,20 (d, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,26 (t, 2H), 4,19 (q, 1H), 6,23 (šd, 1H), MS (Cl) m/z 218 (M+H vypočt. pro C_HH₂₄NO₃218).

Příklad 57 /S-(R^x,R^x)/-N-/l-///(l,l-Dimethylethyl)dimethylsilyl/oxy/methyl/-2-hydroxypropyl/heptanamid (10c)

Směs 11 c (1,945 g) terc.butyldimethylsilylchloridu (1,4165 g) triethylaminu (951 mg, 1,31 ml) a 4-dimethylaminopyridinu (42,76 mg) ve 13 ml methylenchloridu se míchá pod argonem při teplotě místnosti 18 h. Reakční směs se zředí methylenchloridem a přidá se voda. Organická vrstva se oddělí, promyje se vodou, suší a odpařením se získá 3,25 g zbytkového oleje, který se čistí chromatografií za eluce 1:5 ethylacetát/hexan a získá se 2,30 g požadovaného produktu jako oleje. NMR δ 0,08 (d, 6H), 0,89 (t, 3H), 0,90 (s, 9H), 1,16 (d, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,24 (t, 2H), 3,47 (s, 1H), 3,84 (m, 1H), 3,85 (s, 2H), 4,28 (q, 1H), 6,13 (šd, 1H), MS (FAB) m/z = 332 (m+H vypočt. pro C₁₇H_3gNO₃Si 332).

-31 CZ 290445 B6

Příklad 58 (S)-N-/l-///(l,l-Dimethylethyl)dimethylsilyl/oxy/methyl/-2-oxopropyl/heptanamid (27c)

Směs (10c) (2,30 g, 6,94 mmol) a pyridiniumdichromátu (10,62 g, 28,2 mmol) ve 20 ml Ν,Ν-dimethylformamidu se míchá pod argonem 18 h. Reakční směs se zředí 100 ml vody a extrahuje se ethylacetátem (3 x 40 ml). Organická vrstva se oddělí, promyje se vodou a solankou, suší a odpařením se získá 1,87 g zbytkové hnědé kapaliny. Kapalina se čistí chromatografií za použití 1:6 ethylacetátu/hexanu a získá se 997 mg požadovaného produktu jako oleje. NMR δ 0,83 (S, 9H), 1,61 (m, 2H), 2,22 (t, 2H), 2,23 (s, 3H), 3,82 (dd, 1H), 4,09 (dd, 1H), 4,57 (m, 1H), 6,42 (šs, 1H), MS (FAB) m/z 330 (M+H vypočt. pro Ci₇H₃₆NO₃Si 330).

Příklad 59 /R—(R^X,S^X)/—N—/1 —///(1, l-Dimethylethyl)dimethylsilyl/oxy/methyl/-2-/(fenylmethyl)amino/propyl/heptanamid (28c)

Směs 27 c (960 mg, 2,91 mmol) v 5 ml methylalkoholu, obsahujícího molekulová síta se míchá při teplotě místnosti 30 min. Za míchání se přidá kyanoborohydrid sodný (365 mg) a reakční směs se míchá pod argonem 18 h. Reakční směs se filtruje a odpaří na zbytek, který se rozdělí mezi ethylacetát a vodný hydrogenuhličitan sodný. Organická vrstva se oddělí, promyje se solankou a suší a odpařením se získá 1,224 g zbytkové žluté kapaliny. Zbytek se čistí chromatograficky za použití 2:5 ethylacetátu/hexanu a získá se 561,2 mg požadovaného produktu 28c jako oleje. NMR 0,84 (s, 9H), 1,09 (d, 3H), 1,61 (m, 2H), 2,20 (t, 2H), 3,08 (m, 1H), 6,22 (šd, 1H), 7,32 (m, 5H); MS (HR-FAB) 421,3245 (M+H vypočt. pro C₂₄H₄₄N₂O₂Si 421,3250).

Příklad 60 /R-(R^x,R^x)/-N-///(l,l-dimethylethyl)dimethylsilyl/oxy/methyl/-2-/(fenylmethyl)amino/propyl/heptanamid (28d)

Další elucí chromatografické kolony z příkladu 59 se získá 239,4 g požadovaného produktu 28d jako oleje. NMR δ 0,84 (s, 9H), 1,18 (d, 3H), 1,61 (m, 2H), 2,18 (t, 2H), 2,80 (m, 1H), 6,47 (šd, 1H), 7,31 (m, 5H); MS (HR-FAB) m/z 421,3253 (M+H vypočt. pro C₂4H₄₄N₂O₂Si 421,3250).

Příklad 61 /R-(R^x,S^x)/-N-/2-Amino-l-///( 1, l-dimethylethyl)dimethylsilyl/oxy/methyl/propyl/heptanamid (25c)

Směs 28c (208,6 g, 0,50 mmol) a 104 mg Pd(OH)₂ v 15 ml methylalkoholu se třepe vParrově aparatuře pod tlakem vodíku 18 h. Reakční směs se filtruje přes diatomickou hlinku a zahuštěním filtrátu se získá 169 mg požadovaného produktu 25c jako oleje. NMR δ 0,84 (s, 9H), 1,05 (d, 3H), 1,60 (m, 2H), 2,10 (t, 2H), 3,31 (m, 1H), 6,47 (šd, 1H).

Příklad 62 /R-(R^x,R^x)/-N-/2-Amino-l-///( 1, l-dimethylethyl)dimethylsilyl/oxy/methyl/propyl/heptanamid (25c)

-32 CZ 290445 B6

Sloučenina 25d se připraví z 28d postupem použitým pro přípravu 25c.

Příklad 63

Fenylmethylester kyseliny /S-(R^x,S^x)/-/3-//(l,l-dimethylethyl)dimethylsilyl/-oxy/-l-methyl-2/(l-oxoheptyl)aminopropylkarbamové (26-c)

K roztoku 25c (164 mg, 0,496 mmol) v 1 ml methylenchloridu při 0 °C pod argonem se přidá triethylamin (201 mg, 276,5 μΐ, 1,98 mmol) a potom se přikape benzylchloroformiát (169 mg, 142 μΐ, 0,992 mmol). Reakční směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a pak se míchá 18 h. Reakční směs se zředí methylenchloridem a přidá se voda. Organická vrstva se oddělí, promyje se solankou, suší a zahuštěním se získá 230 mg zbytkového světležlutého oleje. Zbytek se čistí chromatografií za použití 1:5 ethylacetátu/hexanu za vzniku 92 mg požadovaného produktu 26c. NMR δ 0,90 (s, 9H), 1,21 (d, 3H), 1,56 (m, 2H), 2,09 (t, 2H), 3,69 (2dd, 2H), 3,84 (m, 1H), 3,93 (m, 1H), 5,07 (q, 2H), 5,17 (d, 1H), 6,15 (šd, 1H), 7,34 (m, 5H), MS (FAB): m/z 465 (M+H vypočt. pro C25H45N2O4SÍ 465).

Příklad 64

Fenylmethylester kyseliny /R-(R^x,R^x)/-/3-//(l,l-dimethylethyl)dimethylsilyl/-oxy/-l-methyl2-/( 1 -oxoheptyl)am inopropyl/karbamové (26d)

Sloučenina 25d se chrání postupem použitým pro přípravu 26c a získá se 26d.

Příklad 65

Fenylmethylester kyseliny /S-(R^x,S^x)/-/3-hydroxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/propyl/karbamové (29c)

Sloučenina 26c se desilyluje postupem podle příkladu 47 a získá se 29c.

Příklad 66

Fenylmethylester kyseliny /R-(R^x,R^x)/-/3-hydroxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/propyl/karbamové (29d)

Sloučenina 26d se desilyluje postupem podle příkladu 65 a získá se 29d.

Příklad 67

Kyselina /S-(R^x,S^x)/-2-/(l-oxoheptyl)amino/-3-//(fenylmethoxy)karbonyl/amino/butanová (30c)

Oxidací sloučeniny 29c postupem podle příkladu 49 se získá 30c.

-33 CZ 290445 B6

Příklad 68

Kyselina /R-(R\R^x)/-2-/(l-<)xoheptyl)amino/-3-//(fenylmethoxy)karbonyl/amino/butanová (30d)

Sloučenina 29d se převede na 30d postupem podle příkladu 67.

Příklad 69

Kyselina /R-(R’\S^x)/-3-amino-2-/(l-oxoheptyl)amino/butanová (2g-2)

Hydrogenolýzou 30c podle příkladu 28 se získá sloučenina 2g-2.

Příklad 70

Kyselina /R-(R^x,R^x)/-3-amino-2-/(l-oxoheptyl)amino/butanová (2g-3)

Sloučenina 30d se převede na 2g-3 postupem podle příkladu 69.

Příklad 71

Methylester kyseliny /R-(R.^x,S^x)/-3-amino-2-/(l-oxoheptyl)amino/butanové (2h-2)

Esterofolací 2g-2 postupem podle příkladu 55 za použití MeOH jako alkoholu se získá 2h-2 jako jeho hydrochloridová sůl.

Příklad 72

Methylester kyseliny /R-(R^x,R^x)-3-amino-2-/(l-oxoheptyl)amino/butanové (2h—3)

Sloučenina 2g-3 se esterifikuje jako v příkladu 71 a získá se její hydrochloridová sůl.

Příklad 73

Kyselina (S)-5-oxo-37(fenylmethoxy)karbonyl/-4-oxazolidinpropanová (43c)

Směs 100 g (355 mmol) N-benzyloxykarbonyl-L-Glu (42c) a 213 g paraformaldehydu se zahřívá pod refluxem v toluenu (1 1). Po 4 hodinách se výsledný roztok ochladí na teplotu místnosti a extrahuje se nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 x 150 ml). Vodné vrstvy se spojí, potom se rozdělí mezi 400 ml ethylacetátu a okyselí se pevným hydrogensíranem sodným. Vrstvy se oddělí a organická vrstva se suší nad síranem hořečnatým, potom se zahustí a získá se 89,72 g surové kyseliny jako viskozního žlutého oleje: NMR δ 7,38 (m, 5H), 5,6 (šs, 1H), 5,21 (d, J=4,7 Hz, 1H), 5,19 (s, 2H), 4,41 (t, J=6 Hz, 1H), 2,6-2,1 (m, 4H).

-34CZ 290445 B6

Příklad 74 (S)-5-Oxo-3-/(fenylmethoxy)karbonyl/-4-oxazolidinpropanal (44c)

Roztok 27 g (92,7 mmol) surové kyseliny (43c) ve 200 ml THF se ochladí na 0 °C a pomocí kapací nálevky se přikape 13 ml (10,7 g, 141 mmol) komplexu boran-methylsulfid. Reakce se postupně nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se 12h. Výsledná směs se zahustí ve vakuu a získá se bílý sklovitý materiál, který se vyjme do 500 ml methylenchloridu a zpracuje se s pyridiniumchoroformiátem (61 g, 281 mmol) při 0 °C za přítomnosti 3-molekulového síta. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se 3 h. Směs se zfíltruje přes diatomickou hlinku s etherem (200 ml) potom se zahustí. Zbytek se vyjme do etheru a zfíltruje se opět přes diatomickou hlinku s etherem a potom se zahustí a získá se 13,22 surového aldehydu jako světlezeleného oleje: NMR δ 9,80 (šs, 1H), 7,40 (m, 5H), 5,55 (šs, 1H), 5,20 (m, 3H), 4,38 (t, J=6,0 Hz, 1H), 2,6-2,1 (m, 4H).

Příklad 75

Fenylmethylester kyseliny 4-/4-//( 1,1-dimethylethoxy)karbonyl/amino/-5-methoxy-5-oxo-3pentenyl/-5-oxo-3-oxazolidinkarboxylové (46c)

K roztoku 15,1 g fosfonátu 45 ve 300 ml methylenchloridu se při -78 °C přidá po kapkách 102 ml 0,5M hexamethyldisilylamidu draselného v THF. Reakční směs se míchá 10 min a k enolátovému roztoku se přidá 18 g surového aldehydu ve 30 ml methylenchloridu. Směs se míchá 3h zatímco se ohřívá na teplotu místnosti. Reakční směs se rozloží 100 ml vody a extrahuje se 2 x 300 ml etheru. Organické extrakty se spojí a promyjí se 200 ml vody a 50 ml solanky. Po sušení nad síranem hořečnatým se redukuje objem. Zbytek se chromatografuje za použití proměnlivého gradientu hexan/ethylacetát. E-izomer (2,4 g) eluuje jako první a je následován 15,4 g požadovaného Z izomerů 46c. NMR δ 1,45 (s, 9H), 2,00-2,40 (Μ, 4H), 3,74 (s, 3h), 4,6 (št, 1H), 5,20 (Μ, 4H), 5,54 (šs, 1H), 6,43 (št, 1H), 7,37 (m, 5H). IR(neředěný) cm’¹: 3350 (s), 1800 (s), 174 (s), MS(CI): m/z 466 (M+NH4), 410 (M-C4H8)⁺, 349 (M-C4H₈CO₂+H⁺, /a/²⁶ _D +68±1.

Příklad 76

Methylester (Z)-N-/5,6-didehydro-N⁶-/( 1,1-dimethylethoxy)karbonyl/-6-(methoxykarbonyl)N²-/(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (47c)

Směs 3,3 g methylesteru D-alaninu a 7,1 g 46c se zahřívá na 140 °C 10 min, potom se přidá dalších 1,6 g methylesteru D-alaninu. V zahřívání se pokračuje při 140 °C po dalších 10 min. Po ochlazení na teplotu místnosti se surový produkt chromatografuje na silikagelu za použití proměnlivého gradientu hexan/ethylacetát. Čištěný produkt (6,7 g) se získá. Materiál se krystaluje z hexanů-etheru a získá se 5,8 g požadovaného produktu 47c jako pevné látky. NMR δ 1,43 (s,d,12H), 1,80-2,10 (m, 2H), 2,23-2,36 (m, 2H), 3,72 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 4,15-4,27 (m, 1H), 4,50-4,60 (m, 1H), 5,11 (šs, 2H), 5,76 (šs, 1H), 6,38 (šs, 1H), 6,47 (št, 1H), 6,81 (šs, 1H), 7,34 (m, 5H);

¹³C-NMR: 17,82 (-CHCH₃, 24,33 (-CH₂-CH₂), 28,02 (C(CH₃)₃), 30,99 (-CH₂CH=C), 47,94 (-CHCH₃), 52,17 (-OCH₃), 52,29 (-OCH₃), 54,28 (OCCHNH), 66,93 (-CH₂Ar), 80,43 (-OC(CH₃)₃), 126,57 (~HNC=C), 127,86 (uhlík fenylového kruhu), 127,94 (uhlík fenylového kruhu), 128,12 (uhlík fenylového kruhu), 128,28 (uhlík fenylového kruhu), 135,98 (uhlík fenylového kruhu, 153,45 (OCONH), 156,21 (OCONH-), 165,13 (-CONH-), 165,13 (-CONH-), 171,04 (~OC0₂), 172,99 (-CO₂-). IR (KBr cm'¹) 3300 (s), 1720 (s), 1690(s), 1650(s), 1510(s),

-35CZ 290445 B6

MS (Cl) m/z 522 (MH)⁺, 466 (MH-C4H8)⁺, 422 (MH-C4H₈CO₂)⁺.

MS (FAB) m/z 544 (M+Na)⁺, 522 (MH)⁺, 466 (MH-C₄H₈)⁺, elementární analýza:

vypočteno 57,57 % C, 6,76 % H, 8,06 % N nalezeno 56,98 % C, 6,67 % H, 7,88 % N:

/a/²⁶ _D-7±l, t.t. 120 až 121 °C.

Příklad 77

Methylester N-/N⁶-/( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl/-(R)-6-(methoxykarbonyl)-N²-/(fenylmethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (40c)

Roztok 8,5 g 47c ve 25 ml kyseliny octové a 250 ml THF se hydrogenuje při 336 kPa vodíku nad 0,5 g (bicyklo(2.2.1)hepta-2,5-dien/2S,3S)bis(difenylfosfino)butan)rhodium(I)perchlorátu po 18 h. Reakční směs se odfiltruje a odpaří se na zbytek. Zbytek se chromatografuje za použití proměnného gradientu hexan-ethylacetát a získá se 7,9 g redukovaného produktu jako zbytku. Vícenásobnou krystalizací se získá 2,6 g diastereomemě čistého 40c. NMR (CDC1₃) δ 1,40 (d, J=6,Hz, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,60-1,97 (m, 6H), 3,73 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 4,12-4,37 (m, 2H), 4,52-4,61 (m, IH), 5,12 (šs, 3H), 5,44-5,55 (šs, IH), 6,73 (šs, IH), 7,36 (šs, 5H);

¹³C-NMR: δ 18.02 (CH-CH₃), 21,12 (CH₂-CH₂-CH₂), 28,23 (-OC(CH₃)₃), 31,87 (-CH₂-CH₂-), 32,29 (-CH₂CH₂-), 47,99 (-CHCH₃), 52,23 (-OCH₃), 52,38 (-OCH₃), 52,75 (OCCHN), 54,41 (OCCHN), 67,01 (-OCH₂Ar), 79,97 (-OC(CH₃)₃), 127,99 (uhlík fenylového kruhu), 128,09 (uhlík fenylového kruhu), 128,44 (ArCH), 136,13 (ArCC), 155,48(OCONH), 156,23(OCONH), 171,10 (-CONH-), 173,03 (-CO-2X),

IR(KBr), (cm·¹): 3340(s), 1760(s), 1680(s), 1660(s), 1660(s), 1520(s); MS(FAB) m/z 546 (M+Na)‘, 524 (MH)⁺, 424 (MH-C₄H₈CO₂)⁺, elementární analýza vypočteno 57,35 % C, 7,12 % H, 8,03 % N nalezeno 57,23 % C, 7,27 % H, 8,03 % N optická otáčívost/a/²⁵ _D-9±l, t.t. 120 až 121 °C.

Příklad 78

Methylester N-/N⁶-/( 1, l-dimethylethoxy)karbonyl/-R-6-(methoxykarbonyl)-L-lysyl/-Dalaninu (3c)

Roztok 40c (248 mg, 0,47 mmol) v methanolu (8 ml) se hydrogenuje nad Pd(OH)₂ postupem podle příkladu 28. Po 3 hodinách, filtraci a odpaření se získá bezbarvé sklo. NMR (CDC1₃) δ 3,50 (m, IH), 3,80 (s, 6H), 4,30 (m, IH), 4,55 (m, IH), 5,15 (d, IH), 7,85 (šs, IH).

-36CZ 290445 B6

Příklad 79

N-/N⁶-/1,1 -Dimethylethoxy)karbonyl/-6-(methoxykarbonyl)-N²-///3-oxo-2-/( 1 -oxoheptyl)amino/-3-(fenylmethoxy)propyl/amino/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (lb-1)

Roztok 30 (94,5 mg, 0,24 mmol) v sušeném THF (3A síro 0,8 ml) se přikape pod argonem ke směsi l,T-karbonyldiimidazolu (39,34 mg, 0,24 mmol, sušený nad P₂O₅) v 1,8 ml sušeného THF. Směs se míchá 2 h a přidá se 2h—1 (83,3 mg, 0,24 mmol) a TEA (34 μΐ, 0,24 mm). Výsledná směs se míchá 18 h při teplotě okolí. Směs se zředí vodou a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se oddělí, promyje se solankou, suší, filtruje a odpařením se získá zbytek. Zbytek se čistí chromatografií za eluce 1-2% methanolu v chloroformu a získá se 109,3 mg 1 b—1 jako špinavě bílé pevné látky. NMR δ 0,88 (t, 3H), 2,22 (t, 2H), 3,59 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 4,26 (m, 1H), 4,52 (t, 1H), 4,63 (m, 1H), 5,32 (d, 2H), 5,63 (d, 1H), 7,07 (d, 1H), 7,20 (d, 1H); MS (HR-FAB) m/z 722,3980 (M+H, vypočt. pro C₃₅H₅₆N₅O_h 722,3976).

Příklad 80

Methylester N-/6-(methoxykarbonyl)-N²-///3-oxo-2-/l-oxo-heptyl)amino/-3-( fenylmethoxy)propyl/amino/karbonyl/-L-lysyl/-D-alaninu (1 b—2)

K 16 mg lb—1 pod argonem při 0 °C se přidá 100 μΐ TFA s následujícím mícháním po 1 h. Těkavé látky se odpaří a získá se 11,1 mg lb-2. NMR (CD₃OD) δ 0,80 (t, 3H), 1,30 (d, 3H), 2,15 (t, 2H), 3,32 (m, 1H), 3,56 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,95 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,30 (q, 1H), 4,38 (m, 1H), 5,07 (d, 2H), 7,28 (m, 5H); MS (HR-FAB) m/z 622,3435 (M+H, vypočt. pro (Jo^NjOg 622,3452).

Příklad 81

Methylester N-/N²-///2-karboxy-2-/( 1 -oxoheptyl)amino/ethyl/amino/karbonyl/-N⁶-/( 1,1-dimethylethoxy)karbonyl/-6-(methoxykarbonyl)-L-lysyl-D-alaninu (1 b—3)

K 70 mg lb—1 v 7 ml methylalkoholu se přidá 31 mg Pd(OH)₂ na uhlí a reakční směs se hydrogenuje po 4 h podle příkladu 28. Reakční směs se zfiltruje přes sloupeček diatomické hlinky. Filtrát se zahustí a získá se 53,8 mg le-3 jako skla. NMR (CD₃OD) δ 0,80 (t, 3H), 2,15 (t, 2H), 3,32 (m, 1H), 3,56 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,95 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,30 (q, 1H), 4,38 (m, 1H); MS(HR-FAB) m/z 632,3493 (M+H vypočt. pro CmHsoNsOu 632,3506).

Příklad 82

Methylester N-/N²-///2-karboxy-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethyl/amino/karbonyl/-6-(methoxykarbonyl)-L-lysyl/-D-alaninu (1 b—4)

Ke 40,2 mg 1 b—3 pod argonem při 0 °C se přidá 300 μΐ TFA a potom se postupuje podle příkladu 80. Těkavé látky se odstraní odpařením a koncentrát se suší přes noc. Získá se 47 mg lb-4. NMR (CD₃OD) δ 0,80 (t, 3H), 1,30 (d, 3H), 2,15 (t, 2H), 3,28 (m, 1H), 3,56 (m, 1H), 3,62 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,95 (m, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,31 (q, 1H), 4,43 (m, 1H); MS(HR-FAB) m/z 532,2972 (M+H, vypočt. pro C₂₃H₄₂N₅O₉ 532,2983).

-37CZ 290445 B6

Příklad 83 (R)-N-/(R)-6-karboxy-N²-///2-karboxy-2-/(l-oxoheptyl)/amino/ethyl/aminokarbonyl-N⁶-/(1,1 -dimethylethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 b-5)

K. roztoku 135,9 mg lb—1 ve 2,7 ml methylalkoholu se přidá 104 mg uhličitanu draselného a 0,9 ml vody a míchá se při teplotě místnosti 20 hodin. Reakční směs se odpaří a zbytek se rozpustí v 1 ml vody a okyselí se IN HC1 na pH 2. Reakční směs se 5 hodin míchá a extrahuje se 2x ethylacetátem. Spojené organické extrakty se promyjí solankou, suší a odpařením se získá 106 mg zbytku. Zbytek se trituruje se 3 x 5 ml etheru a ether se dekantuje. Pevný zbytek se suší a získá se 91,7 mg produktu lb—5 jako bílé pevné látky. NMR(CD₃OD) δ 0,80 (t, 3H), 2,15 (t, 2H), 3,32 (m, 1H), 3,56 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 4,15 (m, 1H), 4,30 (q, 1H), 4,38 (m, 1H); MS(HR-FAB) m/z 604,3200 (M+H vypočt. pro C₂₆H46N₅O_h 604, 3195).

Příklad 84 (R)-N-/(R)-6-karboxy-N ²-///2-karboxy-2-/( 1 -oxohepty l)-amino/ethy 1/am ino/karbony 1/-Llysyl/-D-alanin (1 b-11)

K 85,9 mg 1 b—5 pod argonem se přidá 500 μΙ TFA a zpracuje se jako v příkladu 80. Těkavé látky se odpaří a zbytek se trituruje s etherem 3x a ether se slije. Sušením zbytku se získá 77,9 mg lb—11 jako bíle pevné látky. NMR (CD₃OD) δ 0,80 (t, 3H), 2,16 (t, 2H), 3,22 (šs, 5H), 3,58 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,30 (d, 1H), 4,40 (m, 1H), MS (HR-FAB) m/z 526,2482 (M+H vypočt. pro C₂₁H₃₈N₅O₉ 526,2489).

Příklad 85 /S—(R^X,S^X)/-N-/N⁶-/(1, l-Dimethylethoxy)karbonyI-N²-///3-methoxy-l-methyl-3-oxo-2-/( 1oxoheptyl)amino/propyl/amino/karbonyl/-(R)-6-(methoxykarbonyl)-L-lysyl/-D-alanin (1 b—6)

Amin 2h-2 se kopuluje s aminem 3c postupem popsaným v příkladu 79. Močovina se čistí chromatografií a je identifikována jako 1 b—6.

Příklad 86

Methylester /R-(R^x,R^x)/-N-/N⁶-/( 1,l-dimethylethoxy)karbonyl/-N²-//3-methoxy-l-methyl-3oxo-2-/(l-oxoheptyl)amino/propyl/aminokarbonyl/-(R)-6-(methoxykarbonyl)-L-lysyl-Dalaninu (1 b—7)

Amin 2h-3 se převede na močovinu 1 b—7 podle příkladu 85.

Příklad 87 /S-(R^x,S^x)/-N-/(R)-6-karboxy-N²-///2-karboxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethyl/amino/karbonyl/-N⁶-/( 1, l-dimethylethoxy)karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 b-8)

Hydrolýzou 1 b—6 podle postupu uvedené v příkladu 83 se získá lb-8.

-38CZ 290445 B6

Příklad 88 /R-(R^x,R^x)/-N-/(R)-6-karbox>-N²-///2-karboxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethyl/amino/karbonyl/-N⁶-/( 1, l-dimethylethoxy)karbonyl/-L-lysyl-D-alanin (1 b-9)

Hydrolýzou 1 b—7 podle příkladu 87 se získá 1 b—9.

Příklad 89 /S-(R^x,S^x)/-N-/(R)-karboxy-N^:!-///2-karboxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethyl/amino/karbonyl/-L-lysyl-D-alanin (1 b—12)

Deblokováním aminoskupiny v 1 b—8 s TFA se postupem podle příkladu 84 získá 1 b—12.

Příklad 90 /R-(R^x,R^x)/-N-/(R)-6-karboxy-N²-///2-karboxy-l-methyl-2-/(l-oxoheptyl)amino/ethyl/amino/karbonyl/-L-lysyl/-D-alanin (1 b-13)

Sloučenina 1 b—9 se zbaví chránící skupiny postupem podle příkladu 89 a získá se lb—13.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Urethany a močoviny obecného vzorce I kde

   Ri je vybrán ze souboru sestávajícího z popřípadě substituované (Ci-C₂o)alkylskupiny, popřípadě substituované (C₃-C₆)cykloalkylskupiny a popřípadě substituované (C7C|₅)aralkylskupiny,

   R_a a R₃ jsou nezávisle vybrány z vodíku a popřípadě substituované (Ci-C₆)alkylskupiny a

   R₂, R_b a Rj jsou nezávisle vybrány z karboxyskupiny, methyloxykarbonylskupiny, fenyloxykarbonylskupiny a benzyloxykarbonylskupiny,

   X je kyslík nebo skupina H,

   -39CZ 290445 B6

   R4 je vodík nebo chránící skupina aminoskupiny vybraná z fenylmethoxykarbonylskupiny a 1,1 -dimethy lethoxykarbonylskupiny, přičemž substituenty ve výše uvedených substituovaných alkyl-, cykloalkyl- a aralkylskupinách 5 jsou vybrány ze souboru sestávajícího z halogenu, hydroxyskupiny, (Ci-C₆)alkylskupiny, ((J-Cíjalkoxyskupiny, aminoskupiny, mono- nebo di-(Ci-C₆)alkylaminoskupiny, karboxyskupiny, formylskupiny a (Ci-C₆)alkoxykarbonylskupiny, a jejich farmaceuticky přijatelné soli a optické izomery.
2. 2. Urethany a močoviny podle nároku 1 obecného vzorce kde

   15 Ri je vybrán ze souboru sestávajícího zn-hexylové skupiny a 4-n-pentylcyklohexylové skupiny,

   R_a a R₃ jsou methylskupiny,

   20 R₂, Rb a Rc jsou karboxyskupiny,

   X je kyslík a

   R4 je vodík.
3. 3. Urethany a močoviny podle nároku 1 vybraný ze skupiny sestávající z [S-(R*,S*)]-N-[(R)-6-karboxy-N²-[[2-karboxy-l-methyl-2-[(l-oxoheptyl)amino]ethoxy]karbonyl]-L-lysyl]-D-alaninu;

   30 [S-(R*,R*)]-N-[(R)-6-karboxy-N²-[[2-karboxy-l-methyl-2-[(l-oxoheptyl)amino]ethoxy]karbony l]-L-lysyl]-D-alan inu;

   [R-(R*,S*)]-N-[(R)-6-karboxy-N²-[[2-karboxy-l-methyl-2-[(l-oxoheptyl)amino]ethoxy]35 karbonyl]-L-lysyl]-D-alaninu;

   (R)-N-[(R)-6-karboxy-N²-[[2-(karboxy-2-[l-(oxoheptyl)amino]ethoxy]karbonyl]-L-lysyl]D-alaninu;

   40 [(R)-6-karboxy-N²-[[2-karboxy-l-methyl-2-[[(4-pentylcyklohexyl)karbonyl]amino]ethoxy]karbonyl]-L-lysyl]-D-alaninu;

   -40CZ 290445 B6

   N-[N²-[[2-[[(4-butoxyfenyl)acetyl]amino]-2-karboxy-l-methylethoxy]karbonyl]-(R)-6-karboxy-L-lysylj-D-alaninu;

   methylesteru N-[6-(methoxykarbonyl)-N²-[[[3-oxo-2-[l-oxoheptyl)amino]-3-(fenylmethoxy)propyl]amino]karbonyl]-L-lysyl]-D-alaninu;

   methylesteru N-[N²-[[[2-karboxy-2-[(l-oxoheptyl)amino]-ethyl]amino]karbonyl]-6(methoxykarbonyl)-L-lysyl]-D-alaninu;

   N-[6-karboxy-N²-[[[karboxy-2-[( l-oxoheptyl)amino]ethyl]amino]karbonyl]-N⁶-[( 1, l—dimethylethoxy)karbonyl]-L-lysyl-D-alaninu;

   N-[6-karboxy-N²-[[[2-karboxy-2-[(l-oxoheptyl)amino]ethyl]amino]karbonyl]-L-lysyl]-Dalaninu; a [R-[R*,R*)]-N-(R)-6-karboxy-N²-[[2-karboxy-l-methyl-2-[(l-oxoheptyl)amino]ethoxy]karbonyl]-L-lysyl-D-aIaninu.
4. 4. Farmaceutický přípravek vhodný pro indukci produkce růstových faktorů IL-6 a CSF²⁵, které regulují produkci neutrofilů v kostní dřeni savců, vyznačující se tím, že obsahuje vhodný farmaceutický nosič a účinné množství urethanu nebo močoviny podle nároku 1.
5. 5. Způsob přípravy urethanu nebo močoviny obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje reakci sloučeniny obecného vzorce 2 kde Ri, R₂, R₃ a X mají význam definovaný v nároku 1, s aktivovaným karbonylovým ekvivalentem obecného vzorce kde Y je odštěpitelná skupina, za vzniku sloučeniny obecného vzorce 2y (2y),

   -41 CZ 290445 B6 kde R_b R₂, Rj a X mají definovaný význam v nároku 1, která se dále nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce 3 h₂n kde R_a, R_b, Rc a R4 mají význam definovaný v nároku 1, za vzniku sloučeniny obecného vzorce I 5 podle nároku 1.
6. 6. Způsob přípravy urethanu nebo močoviny podle nároku 1, obecného vzorce I vyznačující se tím, že zahrnuje reakci sloučeniny obecného vzorce 3
7. 10 kde R_a, R_b, Rc a R4 mají význam definovaný v nároku 1, s aktivovaným karbonylovým ekvivalentem obecného vzorce kde Y je odštěpitelná skupina, za vzniku sloučeniny vzorce

   -42CZ 290445 B6 kde R_a, R_b, Rc a R( maj í význam definovaný v nároku 1, která se dále nechá reagovat se sloučeninou vzorce 2 kde Ri, R₂, R₃ a X mají význam definovaný v nároku 1, za vzniku sloučeniny obecného vzorce I 5 podle nároku 1.