CZ286747B6

CZ286747B6 - Enzyme immobilization process

Info

Publication number: CZ286747B6
Application number: CZ19974187A
Authority: CZ
Inventors: Martin Roger Grote; Johan Paul T Geurtsen; Putte Karel P A M Van
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-14
Publication date: 2000-06-14
Also published as: CA2225475A1; JP3403202B2; AU720776B2; AU6303696A; TR199701705T1; BR9609381A; PL324288A1; SK176397A3; EP0835304A1; CZ418797A3; WO1997001632A1; US6162623A; MX9800035A; ZA965375B; JPH11500319A

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu imobilizace enzymů pro použití pro katalýzu zpracování triglyceridových tuků a pevných částic s obsahem tímto způsobem imobilizováných enzymů.

Dosavadní stav techniky

Enzymy se používají v průmyslovém měřítku jako katalyzátory pro zpracování různých surovin. Často jsou tyto způsoby z ekonomického hlediska výhodné pouze tehdy, jestliže mohou být enzymy mnohokrát opakovaně použity. Pro recirkulaci enzymů je zapotřebí oddělit enzymy ze zpracovávané kapaliny. To je možné vtom případě, když jsou enzym navázány na nosič, který může být filtrován nebo centrifugován.

Důležitá skupina průmyslových enzymů má amfifilní povahu. Do této skupiny enzymů, která je charakterizována přítomností hydrofilní části i hydrofobní části v molekule patří lipázy a fosfolipázy. Tyto enzymy, jestliže jsou dispergovány v emulzi, budou migrovat a hromadit se na rozhraní vodné a olejové fáze. Hydrofobní část enzymu směřuje do hydrofobní fáze a hydrofilní část směřuje do vodné fáze.

Vynález bude popisován s lipázou jako příkladem amfifilního enzymu. Dalším průmyslově důležitým amfífilním enzymem je fosfolipáza, u které je známo mnoho typů a která se používá pro hydrolýzu fosfolipidů na lyzofosfolipidy. Průmyslovým použitím je enzymatické odgumování (degumming) triglyceridových olejů, které se popisuje například v EP 513 709.

Lipázy se používají pro svou schopnost modifikovat strukturu a složení triglyceridových olejů a tuků. Katalyzují různé druhy triglyceridových přeměn, jako je hydrolýza, esterifikace a přeesteriflkace. Jde o rovnovážné reakce, které v jednom směru vedou khydrolýze triglyceridů na volné mastné kyseliny a glycerol, mono- nebo díglyceridy, a v opačném směru vedou k reesterifikaci glycerolu, monoglyceridů a diglyceridů na triglyceridy. Pro proces reesterifikace je nutné odstraňovat z reakčního prostředí vodu, aby došlo k posunu rovnováhy ve směru syntézy triglyceridů.

Použití lipázy ve v podstatě bezvodém prostředí je spojeno s hlavním probléme, kterým je solubilizace lipázy v oleji. K tomu účelu se používá s výhodou lipáza, která je aktivní v bezvodém prostředí a která je imobilizována.

V současnosti je hlavním způsobem výroby lipázy mikrobiologická fermentace vhodných mikroorganismů, které za vhodných podmínek enzym produkují. K vyčištěnému roztoku lipázy se přidá nosič a enzym se ponechá přichytit na povrch nosiče. Takový způsob imobilizace se uvádí na příkladu interesterifikačního postupu například v GB 2 159 527. Připojení enzymy na nosič umožňuje snadné oddělení nevratně imobilizovaného enzymu z výrobního média pro následující použití.

Obvykle jsou použité nosiče porézní a ve formě částic, ale vždy jsou ve vodě nerozpustní a poskytují velkou plochu povrchu na jednotku objemu. Příprava imobilizovaných enzymů se popisuje například v EP 0 140 542, EP 0 382 767, WO 95/22606, EP 0 444 092 a WO 89/01032.

Protože současné způsoby imobilizace vyžadují použití čistého enzymu, musí být surová fermentační média podrobena důkladnému a nákladnému čisticímu procesu, který představuje hlavní nevýhodu pro současnou produkci systémů imobilizovaných enzymů.

- 1 CZ 286747 B6

Navíc v rozsahu, ve kterém jsou aktivní části imobilizováného enzymu nasměrovány k nosnému materiálu spíše než směrem k substrátu, bude aktivita enzymu odpovídajícím způsobem snížena. V obvyklých porézních nosných materiálech dále limitují aktivitu lipázy vlivy spojené s přenosem hmoty.

Předkládaný vynález má za cíl poskytnout způsob imobilizace enzymů, při kterém je možno použít nečištěného enzymového preparátu. Navíc si předkládaný vynález klade cíl poskytnout vysoce účinný preparát imobilizovaného enzymu, který je možno regenerovat a reaktivovat.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje způsob imobilizace enzymu, který se vyznačuje kroky:

a. selekce amfifilního enzymu ze skupin lipáz a fosfolipáz pro imobilizaci,

b. příprava emulze obsahující spojitou hydrofobní fázi a dispergovanou vodnou fázi, přičemž ve vodné fázi je rozpuštěn enzym a materiál vhodný jako nosič enzymu při provádění dalšího kroku,

c. odstraňování vody z dispergované fáze, dokud se tato fáze nepřemění na pevné enzymem pokryté částice.

Vynález dále poskytuje amfifilní enzym, který je imobilizován připojením na nosič ve formě částic, který je rozpustný ve vodné fázi.

Výchozí emulze se připravuje s výhodou s 5 až 10 % hmotnostními vodné fáze. Vodná fáze by měla obsahovat amfifilní enzym určený k imobilizaci a dále rozpuštěný materiál, který může působit jako nosič po převedení na pevnou látku. Vodnou fází je s výhodou fermentační kapalina, která stále obsahuje fermentační zbytky. Fermentační kapalina je s výhodou kapalina, ve které byl enzym vytvořen. Alternativně může být jako vodná fáze použit roztok více nebo méně čištěného enzymu, hlavní výhodou předkládaného vynálezu je to, že předběžná izolace a purifikace enzymu z fermentační kapaliny není nutná.

Nosný materiál je ve vodě rozpustný a volí se s výhodou ze skupiny cukrů, škrobu jako je pšeničný škrob, dextranu, ve vodě rozpustných derivátů celulózy a fermentačních zbytků. Jestliže již není přítomen ve vodné fázi, nosný materiál se přidává k vodné fázi před nebo potom, kdy byla dispergována do hydrofobní spojité fáze. Tento přídavek je nezbytný, pokud vodná fáze neobsahuje dostatečné množství nosného materiálu. Tento přídavek může být dodatečný materiál k jiným nosným materiálům, například již přítomným zbytkům fermentace.

Nosný materiál je přítomen s výhodu v množství 0,5 až 5 % hmotnostních, výhodněji 1 až 2 % hmotnostní, vztaženo na olej. Termín rozpustný znamená, že nosná látka se při použití v uvedených množstvích úplně rozpouští ve vodné fázi.

Pod fermentačními zbytky se rozumí všechny látky, které jsou ještě přítomny v supematantu: fermentační médium pro výrobu enzymu se například odstředí, čímž se odstraní ve vodě nerozpustné materiály včetně biomasy. Tento supematant se popřípadě koncentruje například jeho průtokem mikrofiltračním membránovým modulem s dutými vlákny (známý jako umělá ledvina). Fermentační zbytky zahrnují polysacharidy, proteinový materiál, soli a cukry. Tyto látky jsou rozpustné ve vodné fermentační kapalině, ale oddělují se jako pevný materiál ve formě částic při odstranění vody.

-2 CZ 286747 B6

Vodná fáze obsahující enzym se disperguje obvyklými způsoby emulgace jako jemné kapičky v hydrofobní fázi. Amfifilní enzym migruje do mezifázového rozhraní a hromadí se v něm.

Je možno použít jakékoliv lipázy vhodné pro hydrolýzu triglyceridu nebo reesterifikaci, ale s výhodou se lipáza získává fermentací z Rhizomucor miehei, Humicola lanuginosa nebo Rhizopus niveus. Množství přidané enzymatické aktivity se přizpůsobí konkrétnímu postupu. Obvykle je vhodnou aktivitou lipázy 165 LU na gram oleje.

Hydrofobní fází emulze může být jakákoliv potravinářská kapalina, ve které může být vodná fáze dispergována. Může jít například o hexan, nebo s výhodou o jedlý triglyceridový olej. Jestliže se použije triglyceridového oleje, volí se s výhodou olej, který v podstatě neobsahuje fosfolipidy, neboť jinak mohou fosfolipidy nepříznivě interferovat s vytvářením enzymem pokrytých částic. Triglyceridový olej s výhodou neobsahuje více než 100 ppm hydratovatelných fosfolipidů.

Pro odstranění vody z emulze jsou dostupné standardní způsoby včetně přídavku molekulárních sít a prohánění dusíku emulzí, ale sušení se nejlépe provádí postupným odpařováním vody, s výhodou použitím vakua 0,1 až lOkPa, s výhodou 0,3 až 2,5 kPa nebo kombinací těchto způsobů.

Odstraňováním vody z dispergované vodné fáze se kapičky smršťují a stávají se suššími. Nejprve se rozpuštěný nosný materiál, například fermentační zbytky, oddělí jako pevný materiál ve formě částic a potom se enzym nahromaděný na rozhraní uloží na povrh a připojí se na materiál pevné částice. Tímto způsobem prováděné sušení dispergované fáze poskytuje in šitu imobilizovaný enzymový preparát, který se dále odlišuje od imobilizovaných enzymů podle stavu techniky tím, že enzym není na nosič navázán nevratně. Enzym může být použit buď jakmile byl imobilizován za předpokladu, že je přítomen substrát, nebo může být přidán do hydrofobní fáze, nebo může být oddělen a skladován pro pozdější použití.

Protože hydrofobní část enzymu s aktivním místem zůstává v průběhu odstraňování vody orientována ve směru opačném k povrchu nosiče, v hotovém imobilizovaném enzymu je pro katalýzu k dispozici maximální množství aktivních enzymových míst.

V závislosti na množství enzymu ve vodné fázi budou pevné částice pokryty enzymem úplně nebo částečně. S výhodou hydrofobní fáze buď obsahuje nebo se skládá ze zpracovávané látky a v případě fosfolipidů se volí ze skupiny zahrnující triglyceridy, diglyceridy, monoglyceridy, glycerol, fosfolipidy a mastné kyseliny.

Jakmile se vytvořila emulze vody voleji obsahující lipázu, molekuly glyceridů se začínají hydrolyzovat, pokud jsou přítomny, na mastné kyseliny a diglyceridy, monoglyceridy a glycerol. Hydrolýza, s výhodou v míchaném reaktoru, pokračuje dokud nedosáhne zvolené úrovně. Jakmile je v dalším reakčním kroku, voda ze směsi odstraněna, hydrolýza se převrátí na reesterifikaci. Je možno snadno dosáhnout nízkého obsahu volných mastných kyselin dokonce až 4 % hmotnostní.

Předkládaný vynález se dále týká imobilizovaných amfifílních enzymů, připojených k nosiči ve formě částic, ve kterých je materiál částic rozpustný ve vodné fázi.

Enzymy imobilizované podle předkládaného vynálezu jsou ve srovnání se systémem podle stavu techniky velmi aktivní. Ktéto vysoké aktivitě mohl přispět způsob imobilizace. Pokud je imobilizovaným enzymem lipáza, může být bez aktivace použit při zvýšených teplotách za předpokladu, že enzym působí v nevodném prostředí. V závislosti na typu lipázy je možnou použít teplot 60 °C nebo dokonce 70 °C. S těmito odolnými enzymovými systémy je možno zpracovávat tuhé tuky, které mají teploty tání vyšší než 30 °C až 40 °C v oblasti, ve které většina vodných preparátů s lipázami má svou maximální teplotu zpracování.

-3CZ 286747 B6

Imobilizované enzymy podle vynálezu mohou být použity při zpracování vsádkovým způsobem stejně jako při kontinuálním způsobu. Velikost enzymem pokrytých částic by měla být dostatečná pro umožnění separace centrifugací aje alespoň 0,1 pm, svýhodou alespoň 1 pm a výhodněji 5 až 15 pm.

Imobilizované enzymy podle vynálezu mohou být použity při enzymatických postupech, k nimž patří hydrolýza buď triglyceridů lipázou nebo fosfolipidů fosfolipázou, lipázou katalyzovaná reesterifikace hydrolyzovaných triglyceridů (odkyselení) nebo kombinace postupů jak je interesterifíkace.

Interesterifikační postupy mohou zahrnovat mono-, di- nebo triglyceridy, ve kterých se skupiny mastných kyselin za katalytického působení lipázy na glycerolové kostře vyměňují.

Enzymatické odkyselení triglyceridového oleje zahrnuje katalytické působení lipázy, kdy se esterifikují mastné kyseliny a mono- nebo diglyceridy přítomné v oleji.

Imobilizované enzymy podle vynálezu mohou být použity při odstraňování fosfolipidů z triglyceridového oleje (odgumování), který zahrnuje kroky:

a. míšení triglyceridového oleje obsahujícího fosfolipidy s prostředkem obsahujícím patřičnou fosfolipázu,

b. hydrolýzu fosfolipidů na lyzofosfolipidy,

c. oddělení hydrolyzovaných fosfolipidů z oleje, a který se vyznačuje tím, že fosfolipázovým prostředkem je imobilizovaný enzym podle předkládaného vynálezu. Z několika fosfolipáz, které jsou známé a dostupné se vybírá ta, která je pro požadovaný typ hydrolýzy nej vhodnější.

Pro výrobu imobilizované fosfolipázy by měla být použita hydrofobní fáze neobsahující fosfolipidy. Po oddělení hotové imobilizované fosfolipázy může být tato přidána do oleje s obsahem fosfolipidů bez poškození enzymového prostředku.

Enzym imobilizovaný in šitu se z výrobní šarže snadno odděluje filtrací, výhodněji však centrifugací a po oddělení může být mnohokrát opakovaně použit.

Pro opětné použití imobilizované lipázy není nutné do další šarže přidávat žádnou vodu. Pro počáteční krok hydrolýzy je dostatečné množství vody, které je rozpuštěno v triglyceridovém oleje určeném k interesterifikaci.

Každému opětovnému použití enzymu může předcházet reaktivace: namísto oddělování použitého imobilizovaného enzymu z hydrofobní fáze se do hydrofobní fáze přidá a disperguje s výhodou 5 až 10% hmotnostních vody, čímž se enzym spolu sjeho nosným materiálem rozpustí v kapičkách vody. Enzym opět migruje do mezifázového povrchu a hromadí se na styku vody s olejem. Když se voda odstraní jak bylo popsáno dříve, kapičky se sušením smrští a nosný materiál se opět oddělí jako pevná látka. Jak se voda postupně odděluje z vysychajících kapiček, separovaný nosný materiál se nakonec pokryje enzymem. Nová imobilizace má za následek obnovení nebo alespoň částečné obnovení enzymové aktivity. Reaktivace s novou imobilizací může být prováděna znovu a znovu a dosáhne se jí prodlouženého použití enzymu a nosného materiálu. Obraz 3 ukazuje opětovné použití imobilizovaného enzymu lipázy v následných šaržích. Postupný pokles aktivity enzymu se částečně zmírní novou imobilizací s použitím

-4CZ 286747 B6 stejného enzymu a stejného nosného materiálu (vystínované oblasti). Enzym poškozený nebo vyčerpaný v průběhu postupu může být popřípadě nahrazen přídavkem určitého množství čerstvého enzymového preparátu. Možnost opětovného použití materiálu navíc k lacinému zdroji enzymu v nepurifikované formě, nepřítomnost nákladného nosného materiálu a vysoká účinnost imobilizovaného enzymu ve velké míře zlevňuje nákladnou katalýzu. Současně také chybí problémy týkající se ukládání odpadního vyčerpaného enzymového materiálu. Tyto výhodné rysy jsou jedinečné a nepopisují se u žádných enzymů imobilizovaných podle dosavadního stavu techniky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje průběh reakce interesterifikace směsi triglyceridů se střední délkou řetězce a slunečnicového oleje s vysokým obsahem kyseliny olejové v přítomnosti imobilizované lipázy. Je ukázán obsah volných mastných kyselin a stupeň přeměny u postupu používající lipázy (Lypozyme™) tradičně imobilizovanou na materiálu Duolite™ (čáry proložené silně tečkovanými body) a u postupu používajícího lipázu (Lypozyme™ 10 OOOL), která je imobilizována in šitu podle předkládaného vynálezu (čáry proložené slabě tečkovanými body).

Obr. 2 je diagram ukazující obsah volné mastné kyseliny při odkyselování tří směsí kyseliny olejové a glycerolu v přítomnosti imobilizované lipázy, porovnávající

1. lipázu Lypozyme™ 1000L (165 LU/g oleje) imobilizovanou in šitu podle vynálezu (označeno tečkovanou čárou),

2. lipázu Lypozyme™ (1750 LUP/g oleje) tradičně imobilizovanou na materiálu Duolite™ (onačeno čárou proloženou čtverci) a

3. lipázu Lypozyme™ (35000 LU/g oleje), tradičně imobilizovanou na materiálu Duolite™ (označeno čárou proloženou kosočtverci.

Obr. 3 ukazuje lipázu získanou zHumicola lanuginosa a použitou v následných řadách šarží interesterifikace, s vynesenou aktivitou (gram přeměněného oleje na gram enzymu za hodinu) jako funkcí času (dny). Pro 24 hodinové šarže tmavě stínovaných oblastí je použita lipáza poprvé imobilizována podle vynálezu. Reakcí při tomto postupu je interesterifikace slunečnicového oleje s vysokým obsahem kyseliny olejové/triglycerid se střední délkou řetězce, prováděná při teplotě 35 °C. Pro 8 hod, 15 hod a víkendové šarže ostatních (světle šedé) oblastí se imobilizovaná lipáza používá pro interesterifíkaci POs/PKs při 60 °C v „suché“ formě po separaci odstředěním z předcházející šarže interesterifikace.

Vynález bude osvětlen pomocí následujících příkladů:

Příklady provedení vynálezu

Roztok Lipozyme™ 10000L je surové fermentační médium zbavené mikroorganismů, obsahující lipázu (firmy NOVO) Rhizomucor miehei, kde aktivita lipázy je 10 kLU/ml.

Čištěná forma lipázy uvádí na trh firma NOVO pod názvem Lipozyme IM™ nebo lipozyme Immobilized on Duolite™. Aktivita je 70 kLU/gram prášku.

Duolite™ je slabě aniontová iontoměničová pryskyřice vhodná pro imobilizaci enzymů.

Jedna lipázová jednotka (LU) je definována jako množství enzymu, které uvolní 1 mikromol kyseliny máselné za minutu z emulgovaného tributyrinového substrátu (při pH 7,0 a 30 °C).

-5 CZ 286747 B6

Aby bylo možno monitorovat postup tohoto postupu v následujících příkladech, byly v určitých časových odstupech odebírány vzorky. Vzorky odebrané z reakčního média pomocí jehly byly ohřátý na teplotu vyšší než 85 °C ve 2 ml skleněných zkumavkách, aby byly enzymy deaktivovány.

Obsah volné mastné kyseliny byl stanoven rozpuštěním přibližně 0,5 g homogenizovaného oleje v 50 ml neutrálního rozpouštědla, obsahujícího stejné objemy ethanolu (96 %) a diethyletheru (p.a) a titrací vzniklé směsi roztokem hydroxidu sodného o koncentraci 0,1 mol/1 s použitím fenolftaleinu jako indikátoru. Obsah volné mastné kyseliny (FFA) se vypočte z rovnice:

V x M x 282 %FFA =----------x 100%

Wx 1000 kde: V = titrovaný objem (ml)

W = hmotnost vzorku oleje (g)

M = molarita roztoku NaOH

282 = průměrná molekulová hmotnost mastných kyselin.

Stupeň konverze se vypočte z následujících rovnic:

k =-In(l-x)*M/Wxt kde k = aktivita katalyzátoru (g oleje/katalyzátoru za h)

M = hmotnost oleje (g)

W = hmotnost katalyzátoru (g enzymového preparátu) t = doba cyklů (h) x = stupeň přeměny definovaný jako

ZCNO-lCNi x =----------ECNe-ZCNi

ECN představuje součet hodnot rozsahu počtu atomů uhlíku zvolených pro specifický postup, kde index (o, i, e) označují výstup z reaktoru v jakémkoli okamžiku v čase (o), vstup (i) a rovnováhu (e) distribucí. Hodnoty počtu atomů uhlíku se získávají pomocí plynové chromatografie (GLC) vzorku. Pro interesterifikaci HOSF/MCT se volí hodnoty pro výpočet stupně přeměny CN 34 - 46 a pro systémy POs/PK. se hodnoty CN volí 44 - 46.

Příklad 1

Porovnání lipázy imobilizované in šitu a tradičně imobilizované lipázy pro použití při interesterifikaci

Vsádkový reaktor opatřený míchadlem a vodním pláštěm byl naplněn pro interesterifikaci směsí 131,5 g triglyceridů se střední délkou řetězce (MCT) a 229,0 g slunečnicového oleje s vysokým obsahem kyseliny olejové (HOSF). 95% mastných kyselin MCT tvořily C8 - C10 mastné kyseliny a 5 % jiných kyselin.

Směs MCT/HOSF byla zahřáta na 35 °C. Za míchání byl olej smísen s 5 % hmotnostními vody, čímž vznikla emulze vody v oleji. K emulzi bylo přidáno takové množství roztoku

-6CZ 286747 B6

Lipozyme™10000L, že emulze obsahovala 165 LU aktivity na gram oleje. Důkladným mícháním bylo dosaženo jemné disperze s velkým mezifázovým povrchem olej - voda.

Hydrolýza molekul triglyceridu začala po přídavku vodné fáze a pokračovala při teplotě 35 °C, dokud nebylo dosaženo obsah 30 % volných mastných kyselin.

Snížením tlaku na 0,6 kPa se odpařila voda, čímž bylo dosaženo uložení a imobilizování lipázy na suchých fermentačních zbytcích.

Reesterifikace začala, když byla ze systému odstraněna voda a teplota byla zvýšena na 50 °C. Obsah 1 (čáry proložené světlými body) ukazuje, že po 50 hodinách reesterifikace klesl obsah FFA z přibližně 30 % hmotnostních na přibližně 4 % hmotnostní. Stupeň konverze triglyceridů dosáhl téměř 80 %.

Stejným způsobem byla připravena srovnávací dávka, která byla zpracována s použitím lipázy Lipozyme IM™ tradičně imobilizované na materiálu Duolite™. Hydrolýza začala, když bylo přidáno dostatečné množství lipázy pro dosažení její aktivity voleji 165 LU na gram oleje. Pouze po 50 hod dosáhl obsah FFA koncentrace 24 %. Bylo použito vakuum, ze systému byla odstraněna voda a začala reesterifikace.

Obr. 1 (čáry proložené tmavými body) ukazuje účinnost porovnávací šarže.

Lipáza imobilizovaná in šitu podle vynálezu ukazuje velkou rychlost hydrolýzy a po odstranění vody rychlé snížení obsahu FFA s vysokým stupněm přeměny. Naopak způsob s použitím tradičně imobilizované lipázy ukazuje velmi nízkou rychlost hydrolýzy a nízkou rychlost reesterifikace FFA, což obojí má za následek odpovídajícím způsobem nižší rychlost přeměny.

Příklad 2

Porovnání lipázy imobilizované in šitu a tradičně imobilizované lipázy z hlediska použití při odkyselování

Obr 2 je graf ukazující obsah volných mastných kyselin při odkyselování směsi kyseliny olejové a glycerolu v přítomnosti imobilizované lipázy porovnáním lipázy imobilizované in šitu s lipázou imobilizovanou tradičním způsobem na nosiči Duolite™.

Ve vsádkovém reaktoru se smísí 165,3 g kyseliny olejové a 18,0 g glycerolu a za stálého míchání se zahřeje na 35 °C. Připraví se olej s aktivitou 165 LU na gram oleje s použitím in šitu imobilizované lipázy připravené z roztoku Lipozyme™ 10000L. Šarže obsahovala na počátku 7 g molekulárních sít a trvale byl probubláván olejem dusík pro odstranění vody. Po 83 hod reakce bylo ke směsi přidáno dalších 5 g molekulárních sít. Viz čára na obr. 2 proložená tečkami.

Stejným způsobem byly připraveny dvě srovnávací šarže s použitím stejného postupu zpracování, ale s použitím lipázy Lipozyme IM™, která byla tradičně imobilizována na nosiči Duolite™. Jedna šarže obsahovala 1750 LU/gram oleje a v obr. 2 byla označena čtverečkem, zatímco druhá šarže obsahovala 3500 LU/gram oleje a v obr. 2 byla označena kosočtverci.

S lipázou imobilizovanou in šitu bylo dosaženo počáteční rychlosti esterifikace 7,5 % redukce FFA/hod stejně jako celkového snížení obsahu FFA z 88,4 % na 3,3 % v průběhu 150 hodin Počáteční rychlosti esterifikace s použitím tradičním způsobem imobilizovaných lipáz byly 7,4% a 12,5 % redukce FFA/hod v případě nízké, popřípadě vysoké koncentrace. S vysokou koncentrací lipázy bylo dosaženo celkového snížení obsahu FFA v průběhu 70 hod na 2,3 %.

-7 CZ 286747 B6

Ačkoliv tyto tři postupy odkyselování probíhaly porovnatelnou rychlostí, šarže obsahující systém lipázy imobilizované in šitu potřeboval pouze zlomek aktivity lipázy obou ostatních šarží pro stejný výkon.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob imobilizace enzymu, vyznačující se tím, že se:

a. zvolí enzym ze skupiny lipáz a fosfolipáz pro imobilizaci,

b. připraví emulze obsahující spojitou hydrofóbní fázi a dispergovanou vodnou fázi, přičemž ve vodné fázi je rozpuštěn enzym a materiál vhodný jako nosič enzymu při provádění dalšího kroku,

c. odstraňuje voda z dispergované fáze, dokud se tato fáze nepřemění na pevné enzymem pokryté částice.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije lipáza získaná z Rhizomucor miehei, Humicola lanuginosa nebo Rhizopus niveus.
3. Způsob podle některého z nároků 1 až 2, vyznačující se tím, že se použije vodná fáze obsahující supematant z fermentace.
4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jako hydrofóbní fáze se použije jedlý triglyceridový olej.
5. Způsob podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že nosný materiál se volí ze skupiny cukrů, škrobu, dextranu, ve vodě rozpustných derivátů celulózy a zbytků z fermentace.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se použije hydrofóbní fáze obsahující látku určenou ke zpracování zvolenou ze skupiny zahrnující triglyceridy, diglyceridy, monoglyceridy, glycerol, fosfolipidy a mastné kyseliny.
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se použije enzymu stejně jako nosné látky, která má být rozpuštěna ve vodné fázi, pocházejících z částic imobilizovaného enzymu, připravených podle některého z předcházejících nároků a oddělených z reakční směsi.
8. Pevná částice, vyznačující se tím, že obsahuje imobilizovaný enzym specifikovaný v nároku 1 připojený na nosič a kde nosná látka je rozpustná ve vodné fázi.