KR20020043349A

KR20020043349A - 고정화 포스포리파제 ａ-2 및 이를 이용한 인지질 또는그를 포함하는 레시틴의 가수분해방법

Info

Publication number: KR20020043349A
Application number: KR1020000072824A
Authority: KR
Inventors: 김병기; 김주한
Original assignee: 김병기; 김주한
Priority date: 2000-12-04
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2002-06-10

Abstract

본 발명은 포스포리파제 A-2 를 칼슘알긴산 비드에 고정시킨 후 겔화제로 처리한 고정화 효소 및 이를 이용하여 인지질을 가수분해하는 방법에 관한 것이다. 이러한 가수분해를 통하여 라이소 인지질을 만들 수 있으며, 나아가 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 함유하는 유지성분에서 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 용이하게 제거하는 것도 가능하다. 본 발명의 방법에 의하면, 기존의 고정화하지 않은 효소를 이용하는 방법에 비하여 효소의 사용을 줄일 수 있을 뿐 아니라, 반응 종결 후에 효소를 따로 분리하지 않아도 된다는 점이 우수하고, 기존의 방법에 비하여 첨가제의 사용 없이 높은 수율로 오랜 시간 동안 효소를 재사용 할 수 있어 자원의 활용 및 경제적인 생산이라는 측면에 있어서도 큰 이점이 있다.

Description

고정화 포스포리파제 Ａ-2 및 이를 이용한 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴의 가수분해 방법{IMMOBILIZED PHOSPHOLIPASE A-2 AND METHOD OF HYDROLYSIS OF PHOSPHOLIPIDS OR LECITIN CONTAINING THEM BY USING THE SAME}

본 발명은 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴의 효과적인 가수분해를 위한 신규 고정화 포스포리파제 A-2 효소 및 그것을 이용한 인지질 또는 그를 함유하는 레시틴의 효과적인 가수분해 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 칼슘알긴산 비드에 고정시킨 후 겔화제로 처리하여 제조된 고정화 포스포리파제 A-2 및 이를 이용하여 유기용매와 물의 혼합용액상에서 첨가제의 사용없이 연속적으로 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴을 가수분해할 수 있는 방법에 관한 것이다. 이러한 가수분해를 통하여 라이소 인지질을 만들 수 있으며, 나아가 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 함유하는 유지성분에서 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 용이하게 제거하는 것도 가능하다.

라이소 인지질 또는 그를 포함하는 개질 레시틴은 pH의 변화나 염의 첨가에 상관없이 높은 에멀젼 안정성을 부가하는 물질로서, 가장 흔한 용도는 식품용의 분산제이며, 또한 첨가제로서 식품의 변색을 막고 미생물 포자의 오염을 억제하며 쓴맛을 내는 물질을 코팅함으로서 식품의 맛을 조절하는 역할을 한다. 라이소 인지질은 물에 녹지 않는 약제를 녹이거나, 유지성분에 수용성 제재를 녹이는 등 독특한 기능을 발휘한다. 라이소 인지질 또는 그를 포함하는 개질 레시틴을 제조하는 방법으로서 가장 흔하게 사용되는 것은 포스포리파제-A2 효소를 사용하는 방법[참조문헌: Nakai, E.; Suzuki, K.; Sato, S.; Kato, M. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 63,044,893 (1988): Nanbu, H.; Aoi, N.; Kadota, N.; Toda, Y.; Yamazaki, N. Jpn Kokai Tokkyo Koho 63,279,753 (1988): Nakai, E.; Suzuki, K.; Sato, S.; Kato, M.; Kameda, H. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 01 16,595 (1989): Hibino, H.; Fukuda, N.; Nakachi, O. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 1,233,290 (1989): Kudo, S.; Nishi, E. PCT Int. Appl. WO 90 11,823 (1990): Okada, T.; Tsutsumi, K.; Yamane, T. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 5,049,488 (1993): Kudo, S.; Sakai, M.; Matsumura, Y. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 09 03,078 (1997): Chang, P. S.Kor. J. Food Sci. Technol. 29, 26-3 (1997): Yesair, D. W. PCT Int. Appl. WO 97 28,270 (1997): Garti, N.; Lichtenberg, D.; Silberstein, T.Colloids Surf. 128, 17-25 (1997)]이나, 포스포리파제-A1 [참조문헌 : Uchida, N.; Hatsutori, A. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 07,222,592 (1995): Kim, J.-K.; Kim, M.-K.; Chung, G.-H.; Choi, C.-S.; Rhee, J.-S.J. Microbiol. Biotechnol. 7, 258-261 (1997)] 또는 리파제 [참조문헌 : Maeda, K.; Kawamoto, N.; Ishida, T. Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 02,107,195 (1990): Mazur, A. W.; Hiler II, G. D.; Lee, S. S. C.; Armstrong, M. P.; Wendel, J. D.Chem. Phys. Lipids 60, 189-199 (1991): Sarney, D. B.;Fregapane, G.; Vulfson, E. N.J. Am. Oil Chem. Soc. 71, 93-96 (1994): Han, J. J.; Rhee, J. S.Biotechnol. Lett. 17, 531-536 (1995): Chillemi, R.; Russo, D.; Sciuto, S.J. Org. Chem. 63, 3224-3229 (1998): Virto, C.; Svensson, I.; Adlercreutz, P.Enzyme Microb. Technol. 24, 651-658 (1999)] 등의 효소를 사용하는 방법을 이용하기도 하고, 화학적인 합성법 [참고문헌: Tokuyama, S.; Tomoi, M. Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 05,310,760 (1993)]을 이용하기도 한다.

종래의 기술 중 가장 그 사용빈도가 빈번한 것은 포스포리파제-A2 (이하 PLA2라 한다) 를 사용하는 방법이다. PLA2를 사용하는 경우에는 가수분해의 수율을 높이기 위하여 여러가지 첨가물을 사용하기도 하는데, 이 때 사용하는 첨가제의 종류는 지방산 유도체[참고문헌: Nakai, E.; Suzuki, K.; Sato, S.; Kato, M. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 63,044,893 (1988): Nakai, E.; Suzuki, K.; Sato, S.; Kato, M.; Kameda, H. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 01 16,595 (1989): Yesair, D. W. PCT Int. Appl. WO 97 28,270 (1997): Garti, N.; Lichtenberg, D.; Silberstein, T.Colloids Surf. 128, 17-25 (1997)]나 계면활성제[참고문헌: Chang, P. S.Kor. J. Food Sci. Technol. 29, 26-3 (1997)] 등이 있다.

PLA2를 이용하는 기존의 방법에서 가장 문제가 되는 것은 인지질이나 그의 가수분해 산물이 모두 계면활성능력을 가지고 있어 반응액이 에멀젼을 형성하게 되므로 반응의 종결후에 효소를 제거하기가 매우 어렵다는 것이다. 이를 극복하기 위하여 반응의 종결후 열을 가하여 사용한 PLA2를 열적으로 활성을 잃게 하는 경우가 있으나, 이는 생산물로 부터 효소물질을 완전히 제거하는 방법은 아니므로그 열적 안정성을 더욱 떨어뜨리기 위하여 pH를 10 이상 높게 조절하고 열을 가하기도 한다. 효소를 제거하기 위한 다른 방법으로 반응의 종결후에 효소의 구조를 자르는 단백질 가수분해효소로 처리를 한 후에 다시 이 단백질 가수분해 효소를 가열하여 활성을 잃게 하는 등의 간접적인 방법을 사용하기도 한다.

포스포리파제-A1 (이하 PLA1이라한다) 를 사용하는 경우는 그 과정이 PLA2를 사용하는 경우와 유사하나, 일반적인 인지질의 두개의 지방산 사슬중 가수분해 하는 위치가 달라 가장 많이 사용하는 sn-2-lyso 형의 인지질을 얻기 위해서는 다시 암모니아 가스로 처리하여 지방산이 자리옮김을 하게 하는 등의 추가적인 기술이 필요하다[참고문헌: Sarney, D. B.; Fregapane, G.; Vulfson, E. N.J. Am. Oil Chem. Soc. 71, 93-96 (1994)]. 이 경우도 효소를 효과적으로 제거하기 위하여, 일부러 pH의 조절 없이도 쉽게 열적으로 활성을 없앨 수 있는 안정성이 낮은 PLA1을 사용하는 경우가 보고되어 있다[참고문헌: Uchida, N.; Hatsutori, A. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 07,222,592 (1995)].

고정화 효소라 함은 고형담체에 효소를 물리적 화학적으로 가두어 그 효소가 반응용액으로 유출되지 않은 상태로 작용하는 효소로서, 효소를 재사용하여 일반적으로 원자재비에서 큰 비용을 차지하는 효소단가를 낮출수 있다는 장점 등을 가지고 있으나, 가장 큰 장점은 반응종결후에 효소를 분리 정제하는 단계를 생략함으로써 비용을 절감한다는데 있다. 인지질 또는 그를 포함하는 혼합물의 가수분해에 있어서 고정화 효소를 사용한 경우는 몇 가지 유래가 있으나, 그 사용예가 고콜레스테롤증의 치료에 국한되어 있고[참고문헌: Labeque, R.; Mullon, C. J. P.;Efeerira, J. P. M.; Lees, R. S.; Langer, R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3476-3480 (1993): Shefer, S. D.; Breslau, J.; Langer, R.Biotechnol. Prog. 1, 133-139 (1995): Shefer, S. D.; Rosenberger, V.; Vahanian, G., Wong, W. T., Langer, R.Biotechnol. Bioeng. 48, 36-41 (1995): Chen, J. -P.; Chen, J. -Y.J. Mol. Cat. B: Enzymatic 5, 483-490 (1998)], 이온교환수지에 고정화한 리파제를 사용한 예와 같이 sn-1-lyso 형의 인지질을 제조하는 등 적용예가 매우 적을 뿐 아니라, 고정화 방법도 본 발명의 경우와 다르다. 이는 효소의 활성이 개개의 효소마다 그 독특한 반응조건에 매우 의존적이어서, 특정한 고정화방법을 유사한 효소에 쉽사리 일반화할 수 없기 때문이다.

본 발명자들은 이러한 종래의 기술적 문제를 극복하기 위한 연구를 수행한 결과, PLA2를 칼슘알긴산 비드에 고정시킨 후 겔화제로 처리함으로써 고정화 PLA2 를 제조하였고, 이를 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴의 가수분해에 사용하여 라이소 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴을 제조할 수 있었다.

즉, 본 발명의 목적은 상기 종래 기술의 문제를 해결하면서 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴을 효과적으로 가수분해할 수 있는 고정화 PLA2 효소를 제조하고, 그를 이용하여 라이소 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴을 제공하거나 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 함유하는 유지성분에서 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 용이하게 제거는데에 있다.

본 발명은, 첫째로, PLA2를 고정시킨 고정화 효소, 둘째로, 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴으로부터 앞의 고정화 PLA2를 이용한 가수분해 방법이다.

〈고정화 PLA2 의 제조〉

① PLA2를 알긴산나트륨 용액과 섞어서, 이것을 차갑게 식힌 염화칼슘용액에 점적하여 고정화 효소를 얻는다.

② 상기 고정화 효소에 핵산을 가하고 겔화제를 가한다.

③ 이어서 4 ℃의 온도에서 15 시간 방치하고 다시 채로 거르고, 75%(부피비)의 글리세롤을 포함한 수용액에 담그고 상온에서 4 시간 방치한 후, 고정화 효소를 채로 걸러서 1주일 동안 상온에서 방치하여 굳힘으로서 고정화 PLA2 를 얻는다.

〈고정화 PLA2 를 이용한 인지질의 가수분해 방법〉

상기 수득한 고정화 PLA2를 이용하여 양이온을 첨가하거나 첨가하지 아니하고 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴을 가수분해한다.

일반적으로 고정화 효소의 경우 고정화 과정을 거치면서 그 역가가 많이 손실되나, 본 발명에 의한 고정화 PLA2는 기본 역가가 많이 손실되지 않는다. 또한, 비고정화 효소는 수용액 상태로 존재하므로 완충액-유기용매 혼합액에 사용할 때에 수용액 상태의 효소를 첨가하면 상기 혼합액의 수분함유량이 증가한다. 따라서, 적정 완충액농도로 판단되는 5% 부근에서 사용하기 위해서 5%의 함수율을 보이는 일반적인 공업용에탄올을 사용하려면 매우 소량의 효소를 사용할 수 밖에 없다. 그러나, 본 발명의 고정화 PLA2는 고체상으로 준비하였으므로 완충액의농도를 원하는 대로 조절할 수 있으며 효소를 고농도로 첨가할 수 있다는 것이 본 발명의 특징으로서 가장 주목할 점이라 할 것이다. 나아가, 효소의 작용시 일반적으로 요구되는 양이온에 있어서, 본 발명에 의하면 특이하게도 이러한 양이온이 없어도 고정화에 의하여 PLA2가 높은 활성을 유지하면서 작용한다는 점을 빼놓을 수 없다. 물론 양이온을 함께 사용할 경우에는 고정화되지 않은 상태에 비하여 더 높은 효소의 활성을 보이고, 양이온의 과도한 첨가시 나타나는 효소의 비활성화 현상도 본 발명의 고정화 PLA2에서 훨씬 적게 나타난다. 본 발명의 고정화 효소의 작용시에 사용할 수 있는 양이온은 칼슘, 마그네슘, 철 등 2가 금속 양이온으로서 그의 염 형태, 예컨대 칼슘의 경우는 염화칼슘과 같은 염의 형태로서 첨가한다.

본 발명의 또 다른 특징으로서는, 고정화 PLA2를 이용하여 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴을 가수분해하는 과정에서 유기용매를 함께 사용하고 그 비율을 조절함으로써, 또는 양이온을 첨가할 경우 양이온의 양을 조절함으로써, 또는 온도를 조절함으로써 반응의 속도 및 가수분해도를 조절할 수 있다는 점을 들 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 사용 유기용매의 양은 완충액-유기용매 혼합액을 기준으로 10 내지 95 % (부피비), 바람직하게는 50 내지 90 % (부피비) 로 할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 유기용매는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 2-부탄올, t-부탄올, 프로판올, 이소프로판올 등 알콜계 용매 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

본 발명의 사용온도는 5 내지 80 ℃ 이며, 바람직하게는 30 내지 50 ℃ 이다. 반응 온도가 5 ℃ 미만이거나 80 ℃ 를 초과시 효소의 활성이 급격히 감소된다. 반응 혼합액의 pH 는 5 내지 11 이며, 바람직하게는 8 내지 10 이다. 반응 pH 가 5 미만이거나 11 을 초과시에도 효소의 활성이 급격히 감소된다.

본 발명에서 사용되는 겔화제는 테트라알콕시실란류 (알콕시기가 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시 등으로부터 하나이상 선택되는 것으로서 실란의 에테르결합으로 이루어진 화합물), 아미노알콕시트리알콕시실란류 및 카르복시알킬트리알콕시실란류 (알킬기는 탄소수가 1 내지 50 이하인 직쇄형 포화탄화수소류이고 알콕시기는 상기 테트라알콕시실란과 동일함) 로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택할 수 있다. 그러한 겔화제의 예를 들면, 테트라메톡시오르소실리케이트 (Tetramethoxyorthosilicate, TMOS), 테트라에톡시오르소실리케이트 (tetraethoxyorthosilicate, TEOS), 테트라부톡시오르소실리케이트 (tetrabutoxyorthosilicate, TBOS) 등의 테트라-알콕시실란 (tetra-alkoxysilane) 또는 실리케이트나트륨(sodium silicate) 또는 이들의 혼합물들이다.

본 발명의 포스포리파제 A-2 가 작용할 수 있는 기질은 일반적인 인지질을 포함하고 보다 구체적으로는 예컨대 대두레시틴, 난황레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜 글리세롤 등 인산글리세롤기의 구조를 가진 인지질류 및 이들의 혼합물 등을 포함한다.

본 발명에 따른 가수분해 방법을 사용할 경우 다음과 같은 장점이 있다.

첫째, 반응의 종결 후에 PLA2를 제거하기 위하여 열처리나 효소처리 등을 할 필요가 없다. 기존의 방법은 열을 가하여 PLA2의 활성을 잃게 하거나 단백질 가수분해 효소로 PLA2를 절단하여 활성을 없애고 다시 열을 가하는 방법을 사용하였으나, 본 발명의 방법에 따르면 간단히 생산물을 포함한 용액과 고체인 고정화 효소를 분리하면 된다.

둘째, 효소를 효과적으로 재사용 할 수 있다. 본 발명의 예에 따르면 본 발명에서 제조한 고정화 PLA2는 조건에 따라 250시간 까지 활성의 변화 없이 사용할수 있었으므로 장시간 동안 여러번의 제조공정에 사용할 수 있다.

셋째, 생산물의 정제를 효과적으로 할 수 있다. 첨가제를 사용하는 방법 등에 비하여 본 방법에서는 고정화 효소를 제거하고 나면, 유기용매와 수용액의 혼합물에 약간의 양이온과 가수분해 산물만이 혼합되어 있으므로, 계면활성제를 추가로 사용하는 방법에 비하여, 그 정제방법이 매우 용이하다.

네째, 고정화 효소의 작용시에 금속 양이온의 첨가가 없이도 활성을 나타내게 할 수 있다.

이하 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 보다 자세하게 설명하지만 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용된 %는 특별히 언급하지 않으면 중량%를 의미한다.

실시예 1

〈고정화 PLA2의 제조〉

노보사(Novo-Nordisk, 덴마크)의 PLA2 (상표명 레시타제 Lecitase; 돼지췌장유래의 포스포리파제2) 25 mL를 동량의 4% 알긴산나트륨 용액과 섞어서, 이것을 차갑게 식힌 200mM의 염화칼슘용액에 점적하면서 구형의 고정화 효소를 얻었다. 고정화 효소를 체로 걸러서 비이커에 담고 여기에 핵산을 고정화 효소를 덮을 정도로 부어준 다음 TMOS를 고정화 효소와 동량의 부피만큼 더했다. 이것을 4 ℃의 온도에서 15 시간 방치하고 다시 체로 거른후, 75%(부피비)의 글리세롤을 포함한 수용액에 담그고 상온에서 4 시간 방치했다. 마지막으로 구형의 고정화 효소를 체로 걸러서 1주일 동안 상온에서 방치하여 굳힘으로서 고정화 PLA2를 얻었다.

실시예 2

〈고정화 PLA2에 의한 인지질의 가수분해〉

난황레시틴(포스파티딜콜린 함량 97%이상, 두산기술연구원 제공)을 10mM 의 염화칼슘을 포함한 완충액-에탄올 혼합액에 5%농도로 녹이고, 이 레시틴 용액 1 mL에 5%(50mg)의 고정화 PLA2를 가하여 밀폐한 유리용기 안에서 50 ℃ 의 진탕배양기를 이용하여 가수분해를 실시한 결과 하기 결과를 얻었다.

반응번호	1	2	3	4	6	7	8	9
완충액^*-%부피비	1	5	10	15	30	40	50	55
반응시간	전환율(%, 반응혼합물의 전체 인지질의 중량에 대해생성된 라이소 인지질의 중량비)
7시간	0.0	3.1	27.9	69.4	94.9	85.9	75.2	70.9
18시간	0.0	15.2	67.7	100.0	100.0	100.0	98.3	97.3
25시간	2.2	21.4	77.9	----	----	----	100.0	98.7
30시간	3.8	23.3	87.1	----	----	----	----	100.0
40시간	6.1	34.7	95.4	----	----	----	----	----
70시간	13.1	55.9	100.0	----	----	----	----	----
100시간	15.0	68.1	----	----	----	----	----	----

* 완충액은 10mM, pH 8의 Tris-HCl 완충액을 사용했다[이하 완충액은 동일함]. 완충액은 에탄올과 혼합하여 사용했다.

상기 표 1 에서 보듯이, 45 내지 95 % (부피비)의 유기용매 범위에서 가수분해 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

실시예 3

〈고정화 PLA2 의 온도 및 사용횟수에 따른 활성분석〉

난황레시틴(포스파티딜콜린 함량 97%이상, 두산기술연구원 제공)을 5%농도로 10 mM 의 염화칼슘을 포함한 3:7 부피비의 완충액-에탄올 혼합액에 녹이고, 이 레시틴 용액 1 mL에 10%(100mg)의 고정화 PLA2를 가하여 밀폐한 유리용기 안에서 진탕배양기를 이용하여 30 ℃와 50 ℃ 에서 가수분해를 실시하고 한번의 가수분해가 종결되면 반응액의 액체만을 제거하고 효소는 다시 동일한 조건에서 재사용하여 반복하여 가수분해를 실시한 결과 하기 결과를 얻었다.

	반응온도
	30 ℃	50 ℃
	전환율(%, 반응혼합물의 전체 인지질의 중량에 대해생성된 라이소 인지질의 중량비)
사용횟수	6시간	19시간	6시간	19시간
1회	90.8	100	97.2	100
2회	86.2	100	91.9	100
3회	85.1	100	86.8	100
4회	83.2	100	84.8	100
5회	84.1	100	83.5	100
6회	82.4	100	80.3	100
7회	80.5	100	80.4	97.3
8회	80.2	100	79.3	95.1
9회	80.2	100	80.0	96.1
10회	81.1	100	77.0	95.3

상기 표 2 에서 보듯이, 30 ℃ 및 50 ℃ 에서 우수한 가수분해 활성이 나타나고, 고정화 PLA2 를 10 회나 반복사용하여도 그 활성이 유지됨을 알 수 있다.

비교예 1

〈비고정화 PLA2 에 의한 인지질의 분해효과〉

난황레시틴(포스파티딜콜린 함량 97%이상, 두산기술연구원)을 10mM 의 염화칼슘을 포함한 3:7 부피비의 완충액-에탄올 혼합액에 5%농도로 녹이고, 이 레시틴 용액 1 mL에 0.5%(부피비)의 고정화하지 않은 PLA2 (상표명 레시타제)를 가하여 밀폐한 유리용기 안에서 50 ℃ 의 진탕배양기를 이용하여 가수분해를 실시한 결과 하기 결과를 얻었다.

반응번호	1	2	3	4	5	6	7	8	9
완충액-%부피비	1.7	3.2	5.7	8.1	10.6	15.6	20.6	30.5	40.4
반응시간	전환율(%, 반응혼합물의 전체 인지질의 중량에 대해생성된 라이소 인지질의 중량비)
24시간	28.4	57.6	71.2	71.1	64.0	46.1	39.1	40.4	47.4
40시간	36.6	68.2	79.5	80.5	73.5	57.3	48.4	50.5	58.4
100시간	52.0	81.6	93.9	89.9	88.5	75.7	71.8	70.5	76.8

상기 표3에서 보듯이, 비고정화PLA2의 경우 고정화 PLA2에 비해 가수분해능이 열등하다. 액상인 비고정화PLA2 와 고체인 고정화PLA2의 최적완충액농도가 다르므로, 완충액농도에 따른 비교는 힘들지만, 예를들어 비교하면, 약 10% 완충액에서 상기 표1의 고정화 PLA2(25시간)에서는 전환율이 77%이지만, 상기표3의 비고정화 PLA2(24시간)에서는 64%에 지나지 않는다. 또한 비고정화PLA2는 100시간까지 반응을 시켜도 그 전환율이 어느조건에서나 100%에 이르지 못하지만,상기표1의 고정화 효소에서는 조건에 따라 20시간내에도 100%전환율에 이른다. 이것은 실시예4에서 예시하듯이 비고정화PLA2가 고정화 PLA2에 비해 열적안정성이 낮아, 그 활성을 잃어 전환율100%에 이르기 전에 활성의 대부분을 상실하기 때문이다.

실시예 4

〈열적 안정성 비교실험〉

고정화한 효소 및 고정화 하지 않은 효소의 열적안정성을 비교하기 위하여,먼저 효소를 여러 온도에서 완충액안에서 3시간 동안 방치한 후에 이들의 남아있는 활성을 방치전의 활성과 비교하여 잔류효소역가를 %로 측정한 결과 하기 결과를 얻었으며, 고정화로 효소의 열적안정성이 증가하였음을 알 수 있다.

온도 (℃)	잔류효소역가(%)
	비고정화 PLA2	고정화 PLA2
	칼슘 비함유완충액	10mM 칼슘 함유 완충액	칼슘 비함유완충액	10mM 칼슘 함유완충액
30	97.3	97.2	100	100
50	50.4	91.3	95.9	100
60	0	61.5	55.1	84.5
70	--------	0	17.5	58.6
80	--------	--------	0	22.5

상기 표 4 에서 보듯이, 칼슘이 없는 경우 60 ℃ 에서 비고정화 PLA2 는 잔류효소의 역가가 0 이 되지만 고정화 PLA2 는 55.1 % 의 높은 역가를 유지하며, 칼슘이 있는 경우 70 ℃ 에서 비고정화 PLA2 는 잔류효소의 역가가 0 이 되지만 고정화 PLA2 는 58.6 % 의 높은 역가를 유지하고 있음을 알 수 있다.

실시예 5

〈칼슘이 없는 경우 효소의 활성 비교실험〉

고정화한 PLA2 및 고정화 하지 않은 PLA2의 양이온 (칼슘) 부재시 활성을 비교하기 위하여 다음과 같은 비교실험을 행하였다.

난황레시틴(포스파티딜콜린 함량 97%이상, 두산기술연구원 제공)을 완충액-에탄올 혼합액에 5%농도로 녹이고, 이 레시틴 용액 1 mL에 0.5%(부피비, 0.005mL)의 비고정화 PLA2를 가하여 밀폐한 유리용기 안에서 50 ℃ 의 진탕배양기를 이용하여 5 시간동안 가수분해를 실시하고, 또한 5% (50mg)의 고정화 PLA2 를 동일한 조건에서 가하여 밀폐한 유리용기 안에서 50 ℃ 의 진탕배양기를 이용하여 1.5 시간동안 가수분해를 실시하여 하기 결과를 얻었다.

완충액⁽¹⁾(% 부피비)	비고정화PLA2	고정화PLA2
완충액⁽¹⁾(% 부피비)	전환율 (%)(5시간)	단위효소질량당시간당전환율⁽²⁾	전환율 (%)(1.5시간)	단위효소질량당시간당전환율
6.0	14.2	0.57	0	0
15.4	6.4	0.26	4.2	0.06
24.8	1.5	0.06	22.5	0.30
34.2	0	0	23.8	0.32
43.6	0	0	18.4	0.25
53.0	0	0	12.7	0.17
62.4	0	0	0	0

(1) 완충액은 10mM, pH 8의 Tris-HCl 완충액을 사용했다[이하 완충액은 동일함]. 완충액은 에탄올과 혼합하여 사용했다.

(2) 전환율을 단위효소질량 (mg) 당 시간 (h) 당 전환율로 환산하였다. 비고정화 효소는 액상이므로 액상의 비중을 1로 하여 계산하였다.

상기 표5에서 보듯이, 칼슘이 없는 경우에도 비고정화 PLA2의 경우 장시간 가수분해를 시켰음에도 고정화 PLA2에 비해 가수분해 비율이 열등하다. 액상인 비고정화 PLA2는 낮은 완충액 부피비에서 최적활성을 보이며, 예컨대 6%(부피비) 완충액에서 단위효소질량당 시간당 전환율이 가장 높지만, 상기 표3에서 보듯이 동일조건에 칼슘을 포함시키더라도 그 전환율이 100시간내로 100%에 이르지 못한다. 반면에, 고체인 고정화 PLA2 는 비고정화 PLA2 에서 전환율이 0%가 되는 약 34% (부피비) 완충액에서 최적활성을 보이고, 동일조건에 칼슘을 포함시키면 표 1에서 보듯이 그전환율이 20시간내에 100%에 이른다.

이상 본원 발명의 구성에 관하여 구체적으로 개시하였는바, 근본적인 구성원리에 변환이 없는한 본원발명의 범위를 벗어나지 않는다할 것이다.

본 발명의 방법에 의해 고정화 PLA2를 이용하여 라이소 인지질이나 그를 포함하는 레시틴을 제조하는 경우, 종래의 방법에 비하여 반응의 종료후에 쉽게 PLA2를 제거할 수 있고, 첨가제의 사용이 없으므로 생산물의 정제가 용이하다.

또한, PLA2의 열적안정성이 고정화를 통하여 크게 증가하여 고정화 효소의 재사용을 통하여 라이소 인지질 또는 그를 포함하는 레시틴의 생산비용을 크게 절감할 수 있다. 마찬가지로 본 발명의 가수분해 방법으로 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 함유하는 유지성분에서 인지질 또는 그를 포함한 레시틴을 용이하게 제거하는 것도 가능하다.

Claims

칼슘알긴산 비드에 고정시킨 후 겔화제로 처리한 고정화 포스포리파제 A-2.
제 1 항에 있어서, 사용하는 겔화제가 테트라알콕시실란류 (알콕시기가 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시 등으로부터 하나이상 선택되는 것으로서 실란의 에테르결합으로 이루어진 화합물), 아미노알콕시트리알콕시실란류 및 카르복시알킬트리알콕시실란류 (알킬기는 탄소수가 1 내지 50 이하인 직쇄형 포화탄화수소류이고 알콕시기는 상기 테트라알콕시실란과 동일함) 로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 고정화 포스포리파제 A-2.
제 1 항 또는 제 2 항의 고정화 포스포리파제 A-2를 이용하여 완충액-유기용매 혼합액에 용해시킨 인지질 또는 그를 함유한 레시틴을 가수분해하는 방법.
제 3 항에 있어서, 칼슘, 마그네슘, 철 등의 2 가 양이온을 첨가하여 행하는 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 사용온도가 30 내지 50 ℃ 인 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 반응 혼합액의 pH 가 8 내지 10 인 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 50 내지 90 % (부피비) 의 유기용매를 사용하여 행하는 방법.
제 7 항에 있어서, 유기용매가 메탄올, 에탄올, 부탄올, 2-부탄올, t-부탄올, 프로판올, 이소프로판올 등 알콜계 용매 또는 이들의 혼합물인 방법.