CZ24295A3 - Enzymatic cleansing agent and method of cleaning dirty fabrics - Google Patents

Description

Enzymatický čisticí prostředek a způsob čištění žnečišt&nýfch/tkanmo. ^:Vynález se obecně vztahuje k oblasti enzymatických detergentů a čisticích směsí. Přesněji řečeno se tento vynález zabývá směsmi enzymatických čisticích prostředků obsahujících enzvmv s lipolvtickou aktivitou.

Dosavadní stav techniky

V současné době jsou známy různé druhy enzymů, které se používají jako přísady do detergentních směsí. V literatuře byly například popsány detergentní směsi obsahující proteázy, celulázy, amylázy, lipázy a různé kombinace těchto enzymů, a několik takových výrobků se již objevilo na trhu. Tento vynález se zabývá detergentní směsí obsahující lipolytické enzymy nebo lipázy. Takové enzymy by mohly přispět k odstranění mastného zněčištění tkanin hydrolýzou jedné nebo více esterových vazeb v triglyceridech.

EP-A-214 761 (Novo Nordisk) popisuje lipázy odvozené z organismu druhu Pseudomonas cepacia a EP-A-258 068 (Novo Nordisk) popisuje lipázy odvozené z organismů rodu Thermomyces (dřívější název Humicold). Obě patentové přihlášky rovněž popisují využití těchto lipáz jako přísad do čisticích prostředků.

Další příklady detergentních směsí obsahujících lipázy poskytují EP-A-205 208 a EP-A-206 390 (obojí Unilever), které popisují třídu lipáz definovanou na základě jejich imunologické příbuznosti a uvádějí jejich využití v čisticích prostředcích a v praní textilu. Dává se přednost lipázám z druhů Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas gladioli a Chromobacter.

EP-A-331 376 (Amano) popisuje lipázy, jejich využití a výrobu pomocí technik rekombinantní DNA (rDNA) a uvádí sekvenci aminokyselin lipázy z Pseudomonas cepacia. Další příklady lipázových enzymů vyráběných technikami rekombinantní DNA fy»·»

-2jsou uvedeny v WO-A-89/09263 a EP-A-218 272 (obojí

Gist-Brocades).

Přes velké množství publikací o lipázových enzymech a jejich modifikacích nalezla široké uplatnění jako přísada do výrobků na praní tkanin dosud pouze lipáza získaná z Humicola lanuginosa a produkovaná v hostiteli As-pergillus oryzae. Je k dostání pod obchodním názvem Lipolase (TM) od Novo-Nordisk.

Henrik Malmos ve svém článku v Chemistrv and Industrv 1990 v t (Chemie a průmysl) na straně 183-186 poznamenává, že je obecně známo, že aktivita lipáz je během pracího procesu nízká a že Lipoláza (TM) není žádnou výjimkou. Během procesu schnutí, kdy dojde ke snížení obsahu vody, získává enzym opět svojí aktivitu a mastné skvrny jsou hydrolyzovány. Tento hydrolyzovaný materiál je odstraněn v průběhu dalšího pracího cyklu. Tím se také vysvětluje, proč je účinek lipáz po prvním pracím cyklu nízký, ale v následujících pracích cyklech je pak značný. Tato zjištění popisuje rovněž Aaslyng se sp. (1991) v Mechanistic Studies of Proteases and Lipases for the Detergent Industry, J.Chem.Tech. Biotechnol. .50, 321-330.

Autoři této přihlášky považují za nevýhodu skutečnost, že u současných detergentních výrobků obsahujících lipolytické enzymy nelze očekávat žádnou významnou výhodu plynoucí z těchto lipolytických enzymů tam, kde se tyto výrobky používají na praní tkanin, které nebyly předtím s takovým detergentem v kontaktu.

V Evropě a Spojených státech amerických je navíc mezi uživateli automatických praček vzrůstající tendence používat k sušení vypraných tkanin bubnové sušičky. V těchto sušičkách se mokré prádlo rychle vysušuje kontaktem s horkým vzduchem. Sušicí proces, který by normálně za okolní teploty trval 6 až 48 hodin, se použitím bubnové sušičky zkrátí na méně než jednu hodinu. Jak již bylo dříve uvedeno, lipázové enzymy získávají zpět svojí aktivitu v průběhu sušicího procesu, kdy se snižuje obsah vody v tkanině. Při použití bubnové sušičky se doba obsahu vody optimálního pro lipázu výrazně zkrátí. Tím zákazník ztrácí výhodu danou přítomností obvyklých lipázových enzymů v čisticím

9%S£fiSaaQ&S<a!SZS&EU£a!£HBC£SS2ESsa£faA£WSaBiaaaiaattUBUBSfiUCKEBSL£SlSS&BSStSSSSU

-3 prostředku tam, kde se takový prostředek používá k pracímu procesu, který zahrnuje i krok sušení v bubnové sušičce.

Cílem tohoto vynálezu je tudíž poskytnout enzymatický čisticí prostředek, který vykazuje značnou lipolytickou aktivitu během hlavního cyklu v průběhu praní v automatické pračce a který bude proto vykazovat lipolytickou aktivitu při praní tkanin, které se dosud s tímto detergentním přípravkem nedostaly do styku. Záměrem tohoto vynálezu je rovněž poskytnou enzymatický čisticí prostředek, který je vzláště vhodný pro použití v kombinaci s bubnovou sušičkou.

Dalším záměrem tohoto vynálezu je poskytnout postup pro výrobu takového enzymu, který vykazuje značnou lipolytickou aktivitu během hlavního cyklu pracího procesu v automatické pračce.

S údivem jsme zjistili, že existují lipolytické enzymy, které mohou být použity pro přípravu čisticích prostředků a které vykazují značnou lipolytickou aktivitu během hlavního pracího procesu. Navíc jsme zjistili, že mezi jejich schopnostmi vykazovat takovouto lipolytickou aktivitu během hlavního pracího cyklu a jejich inaktivací diisopropyl-fluorfosfátem (DFP) je zjevná souvislost. Tak mohou být snadno vybrány vhodné lipolytické enzymy podle jejich citlivosti k DFP. Zejména kutinázy se ukázaly jako vhodné enzymy eukaryotíckého původu vykazující takovýto lipolytický účinek během hlavního cyklu v pracím procesu.

WO-A-88/09367 ‘(Genencor) navrhuje kombinaci smáčedla a čistého mikrobiálního enzymu kutinázy pro formulaci účinné čisticí směsi. Jsou známy čisticí prostředky obsahující (prokaryotickou) kutinázu získanou z Pseudomonas putida ATCC 53552. Avšak v poslední evropské patentové přihlášce EP-A-476 915 (Clorox) se ukázalo, že ten samý enzym, o kterém se pak píše jako o lipáze, není v odstraňování mastných skvrn z tkanin při použití obvyklých metod o nic účinnější než ostatní lipázy. Jinými slovy, tento enzym zřejmě nevykazuje prací účinek.

WO-A-90/09446 (Plant Genetics System) popisuje klonování a výrobu eukaryotické kutinázy z Fusarium solani pisi v E. coli a •'-w

-4zmiňuje se o tom, že tato kutináza by se mohla použít pro výrobu čisticích prostředku jako jsou prací prostředky a další přípravky specializované na rozpouštění mastnot, jako jsou kosmetické směsi a šampony. Není zde navržen nebo popsán žádný určitý enzymatický čisticí prostředek, takže tento odborník nenašel žádný podnět k formulaci detergentní směsi pro praní tkanin.

Podstata vynálezu

Podstata enzymatického čisticího prostředku a způsobu čištění znečištěných tkanin spočívá podle prvního aspektu tohoto vynálezu v tom, že poskytuje enzymatickou detergentní směs obsahující:

(a) 0.1 - 50% hmotnosti aktivního systému, který obsahuje (al) 0-95% hmotnosti jedno nebo více aniontových smáčedel a (a2) 5 - 100% hmotnosti jedno nebo více neiontových smáčedel a (b) 10 - 20,000 LU enzymu, který je schopen vykazovat značnou lipolytickou aktivitu během hlavního cyklu pracího procesu.

Podle druhého aspektu tohoto vynálezu popisuje tento vynález postup pro určování a výběr enzymu, který vykazuje značnou lipolytickou aktivitu během hlavního cyklu pracího procesu v automatické pračce na základě jeho inaktivace diisopropyl-fluorofosfátem (DFP).

Podle dalších aspektů tohoto vynálezu popisuje tento vynález postup pro výrobu takového enzymu.

(a) Systém smáčedla

Tento vynález podle jednoho ze svých aspektů popisuje enzymatický čisticí prostředek obsahující z 0.1 - 50% hmotnosti aktivní systém, který zase obsahuje z 0 - 95% hmotnosti jedno nebo více aniontových smáčedel a z 5 - 100% hmotnosti jedno nebo více neiontových smáčedel. Systém smáčedel může dále obsahovat amfoterní nebo zwitterionové detergentní sloučeniny, ale za normálních okolností není jejich přítomnost vzhledem k jejich relativně vysoké ceně žádoucí.

-5Neiontová a aniontová smáčedla mohou být obecně vybrána ze smáčedel popsaných v Surface Active Agents Vol. 1, Schwartz & Perry, Interscience 1949, Vol. 2, Schwartz, Perry & Berch, Interscience 1958, v současné edici McCutcheon's Emulsifiers and Detergents vydané společností Manufacturing Confectioners Company nebo v Tenside-Taschenbuch, H. Stache, 2. vvd., Carl Hauser Verlag, 1981.

Vhodné neiontové detergentní sloučeniny, které se mohou použít, zahrnují zejména produkty reakce sloučenin majících hydrofobní skupinu a reaktivní vodíkový atom. Jsou to například alifatické alkoholy, kyseliny, amidy nebo alkylfenoly s alkylenoxidv, zejména ethylenoxidem - buď samotným nebo s propylenoxidem. Specifické neiontové detergentní sloučeniny jsou kondenzáty Cg-C^, alkylfenolethylenoxidu, obecně 5 až 25 EO, tj. 5 až 25 jednotek ethylenoxidu na molekulu, a dále kondenzační produkty alifatických primárních nebo sekundárních lineárních nebo rozvětvených alkoholu C_S-C_1S s ethylenoxidem, obecně 5 až 40 EO.

Vhodné aniontové detergentní sloučeninv, které mohou bvt použity, jsou většinou ve vodě. rozpustné soli alkalických kovů alkvlsulfátů a alkylsulfonátů majících alkylové radikály obsahující asi od 8 do 22 uhlíkových atomů, kde se termín alkyl používá pro zahrnutí alkylové části vyšších acylradikálů. Příkladem vhodné syntetické aniontové detergentní sloučeniny jsou alkylsulfát sodný a draselný, zvláště ty, které byly získány sulfatací vyšších C_S-C_1S alkoholů, vyrobeny například z rostlinného nebo kokosového oleje, sodné nebo draselné C₉-C,_o alkylbenzensulfonáty, zvláště lineární sekundární C₁₀-C₁₅ alkylbenzensulfonáty sodné, a alkylglycerolethersulfáty sodné, zvláště ty ethery vyšších alkoholů, které byly odvozeny od rostlinného nebo kokosového oleje, a syntetické alkoholy odvozené z ropy. Dává se přednost C_u-C₁₅ alkykbenzensulfonátům sodným a C₁₂-C_lg alkylsulfátům sodným.

Je možno rovněž použít ta smáčedla, která jsou popsána v EP-A-328 177 (Unilever) a která vykazují rezistenci k vysolování, alkylpolyglykosidová smáčedla popsaná v EP-A-070 074 (Unilever) a alkylmonoglykosidy.

-6Přednostně se používají systémy smáčedel, které jsou směsí aniontových a neaniontových detergentu, zvláště ty skupiny a příklady aniontových a neiontových smáčedel popsaných v EP-A 346 995 (Unilever). Zvláštní přednost má smáčedlový systém, který je směsí solí alkalických kovů sulfátů primárních alkoholů C₁₆-C₁₃ a C₁₂-C₁₃ primárních álkohol-3-7-EO-ethoxylatů.

Takový neiontový detergent je přítomen především v množstvích větších než 10%, tj. 25-90% hmotnosti smáčedlového systému. Aniontová smáčedla mohou být přítomna například v množstvích asi od 5% do přibližně 40% hmotnosti smáčedlového svstému.

(b) Enzym

Enzymatický čisticí prostředek tohoto vynálezu dále obsahuje enzym, který je schopen vykazovat značnou lipolytickou aktivitu během hlavního cyklu pracího procesu v množství 10 - 20,000 LU na gram, zvláště při 50 - 2,000 LU na gram detergentní směsi. V této specifikaci jsou LU, neboli lipázové jednotky, definovány tak, jak jsou určeny v EP-A-258 068 (Novo Nordisk).

Výraznou lipolytickou aktivitou během hlavního cyklu pracího procesu nebo pracím účinkem se zde míní, že čisticí prostředek obsahující enzym je schopen odstranit značné množství mastné nečistoty ze znečištěných tkanin v jednoduchém pracím cyklu v evropském typu automatických praček při použití běžných pracích podmínek pokud jde o koncentraci, tvrdost vody, teplotu. Měli bychom zde připomenout, že za těchto podmínek nedochází u obvyklého komerčně dodávaného enzymu Lipolázy (TM) z Novo Nordisk k žádnému výraznému pracímu účinku na mastnou nečistotu.

Prací účinek enzymu na mastnou nečistotu může být vyhodnocen s použitím následující zkoušky. Nové polyesterové/bavlněné zkušební látky s 33%ním obsahem bavlny jsou předeprány s použitím čisticího prostředku neobsahujícího enzym, tedy takového jak je uvedeno níže, a potom důkladně vymáchány. Takto vyčištěné látky jsou pak znečištěny olivovým olejem nebo jinými vhodnými mastnými hydrolyzovatelnými

-Ί skvrnami. Každá testovací látka (vážící přibližně 1 g) je inkubována v 30 ml prací tekutiny v 100 ml polystyrénové lahvi. Prací tekutina obsahuje čisticí prostředek uvedený níže v dávce 1 g na litr. Láhve jsou 30 minut protřepávány v pračce Miele TMT naplněné vodou při použití běžného 30°C hlavního pracího programu. Enzym s lipolvtickou aktivitou je předem přidán do prací tekutiny v množství 3 LU/ml. Kontrola neobsahuje žádný enzym. Prací prášek má následující složení (ve váhových procentech):

ethoxvlované alkoholové neiontové smáčedlo 9,5 síran sodný 38,6 uhličitan sodný 40,4 silikát sodný (Na,O:Si,O = 2.4) 7,3 voda 4,2

Jako neiontové smáčedlo jsme použili C₁₂-C₁₅ ethoxvlovaný alkohol 10.5-13 EO, ale bylo zjištěno, že neiontové ethoxvlované alkoholy se mohou ve velké míře lišit.

Po vyprání byly látky důkladně vymáchány studenou vodou a vysušeny v bubnové sušičce studeným vzduchem. Pak se vyhodnotilo množství zbylé mastnoty. To se může provádět několika způsoby. Běžnou metodou je extrakce testovací látky petroletherem v Soxhletově extrakčním přístroji, oddestilování rozpouštědla a stanovení počtu procent zbylého mastného materiálu jako frakce počátečního množství tuku na látce zvážením.

Druhá citlivější metoda používá ke znečištění testovaných tkanin brómovaný olivový olej (Richards, S., Morris, M.A. a Arklav, T.H. (1968), Textile Research Journal 38, 105-107). Každá testovaná tkanina je pak inkubována v 30 ml prací tekutiny v 100 ml polystyrénové láhvi. Sada lahví je pak protřepávána v pračce naplněné vodou a zapnuté na 30°C hlavní prací program. Po hlavním praní jsou testované tkaniny během 5 sekund pečlivě vymáchány ve studené vodě. Okamžitě po máchání jsou testované tkaniny sušeny studeným vzduchem v bubnové sušičce. Po vysušení se může množství zbytkového tuku určit měřením obsahu bromu pomocí rentgenové fluorescenční spektrometrie. Odstranění tuku může být určeno jako procenta z množství tuku původně použitého

-8na znečištění testované tkaniny následujícím způsobem:

% odstranění znečištění - brom^ ^brom^ * 100% brom_bw kde: brom_bw označuje procento bromu na látce před praním a brom_aw procento bromu po praní.

Další metoda vyhodnocování enzymatické aktivity je pomocí měření činitele odrazu při 460 nm standardními technikami.

Podle tohoto vynálezu obsahuje tento čisticí prostředek enzym, který má schopnost odstranit podle výše uvedeného testu nejméně o 5% více, spíše o minimálně 10% více mastného znečištění než ty samé čisticí prostředky bez tohoto enzymu.

Dalším způsobem určení enzymové aktivity je vztažením této aktivity na aktivitu komerčně dodávané Lipolázy (TM), tj. lipázy, kterou lze získat od Novo/Nordisk. Podle tohoto vynálezu je poměr enzymatického odstranění mastného znečištění tímto enzymem k enzymatickému odstranění mastného znečištění Lipolázou (TM) podle výše uvedeného testu nejméně 3, spíše přinejmenším 5. Enzymatickým odstraněním znečištění se rozumí odstranění znečištění, které může být připisováno přítomnosti tohoto enzymu, tj. odečtením pozadí odstranění znečištění, které je pozorováno v nepřítomnosti tohoto enzymu.

Teď, když tato přihláška ukázala, že je možné formulovat čisticí prostředek mající výrazný prací účinek, bude již pro odborníka snadné rozhodnout, jak vybrat vhodný enzym pro použití v tomto vynálezu. My jsme však našli velice pohodlnou metodu, jak vybírat vhodné lipolytické enzymy pro směs, která je předmětem tohoto vynálezu. Tato metoda je založena na našem zjištění, že prací účinek lipolytických enzymů úzce koreluje s jejich inaktivací diisopropyl-fluorofosfátem (DFP). Je obecně známo, že tato sloučenina ochotně reaguje s aktivním místem serinového zbytku v lipolytických enzymech, které tak ztrácí svojí enzymatickou aktivitu. Zjistili jsme, že lipolytické enzymy, které jsou snadno inaktivovány pomocí DFP, tj. které mají přístupné aktivní místo serinového

-9zbytku, mají obecně dobrý prací účinek. Na druhé straně, lipolytické enzymy, které se DFP inaktivují pomaleji, tj. které mají nepřístupné aktivní místo serinového zbytku, mají obecně žádný nebo jen velice malý prací účinek. Zjistilo se, že lipolytické enzymy, které vykazují zbytkovou aktivitu méně než 50%, spíše méně než 40%, po 10 minutách inkubace s DFP pří pH 10 a pokojové teplotě mají dobrv prací účinek. Ještě lepší prací účinky byly zjištěny u lipolvtickvch enzymů majících zbytkovou aktivitu menší než 25% a nejlepší účinek byl nalezen u enzymu majících zbytkovou aktivitu nižší než 15%. Podrobnosti ke zkoušce DFP- inaktivace jsou uvedeny v příkladech.

Enzymy vhodné pro směs tohoto vynálezu lze najít v enzymech třídy esteráz a lipáz, (EC 3.1.1. *, kde hvězdička označuje jakékoli číslo).

Velice preferovaným typem enzymu, vykazujícího prací účinek podle tohoto vynálezu, je eukaryotícká kutináza. Kutinázy tvoří podtřídu enzymů (EC 3.1.1.50) - voskové esterhydrolázy. Tyto enzymy mají schopnost rozkládat kutin, síť esterifikovaných dlouhých řetězců mastných kyselin a mastných alkoholů, které se tvoří u rostlin jako ochranný obal na listech a stoncích. Tyto enzymy mají navíc lipolvtickou aktivitu, tj. mají schopnost hydrolyzovat triglyceridy. Proto mohou být považovány za zvláštní skupinu lipáz.

Charakteristickou vlastností lipáz je, že vykazují mezifázovou aktivaci. To znamená, že aktivita enzymu je daleko vyšší na substrátu, který vytvořil fázové rozhraní nebo micely, než na substrátu plně rozpuštěném. Mezifázová aktivace se odrazí v náhlém vzrůstu lipolytické aktivity, jakmile koncentrace substrátu vzroste nad kritickou koncentraci micel substrátu (CMC) a vytvoří se mezifázové rozhraní. Tento jev může být experimentálně pozorován jako diskontinuita v grafu enzymové aktivity proti koncentraci substrátu. Kutinázy však na rozdíl od lipáz nevykazují žádnou výraznou mezifázovou aktivitu.

V důsledku této charakteristické vlastnosti, tj. nepřítomnosti mezifázové aktivace, definujeme pro účely této patentové přihlášky kutinázy jako lipolytické enzymy, které nevykazují přesvědčivě

-10žádnou mezifázovou aktivitu. Kutinázy se od klasických lipáz liší tím, že nemají šroubovicové víčko zakrývající katalytické vazebné místo.

Pro své schopnosti rozkládat tuky byly kutinázy obecně navrhovány jako složka enzymatických čisticích prostředků.

Například WO-A-88/09367 (Genencor) navrhuje kombinaci smáčedla a značně čisté mikrobiální kutinázy pro formulaci účinné čisticí směsi. Jsou již popsány čisticí prostředky obsahující (prokaryotickou) kutinázu získanou z gramnegativní bakterie Pseudomonas putida ATCC 53552. Nicméně jak již bylo dříve uvedeno, v poslední evropské patentové přihlášce EP-A-476 915 (Clorox) je ukázáno, že enzym, který se dále uvádí jako lipáza, není v odstraňování mastných nečistot při použití běžných metod o nic účinnější než ostatní lipázy.

Kutinázový gen z Fusarium solani pisi byl klonován a sekvencován (Ettinger se sp., (1987) Biochemistry 26, 7883-7892). WO-A-90/09446 (Plant Genetics Systems) popisuje klonování a výrobu tohoto genu v E. coli. Tato kutináza může účinně katalýzo vat hydrolýzu a syntézu esterů ve vodném a bezvodém prostředí, a to jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti mezifáze mezi kutinázou a substrátem. Na základě její všeobecné stability se předpokládá, že tato kutináza by se mohla použít pro výrobu čisticích prostředků jako pracích prostředků a dalších specializovaných tuky rozpouštějících přípravků jako jsou kosmetické směsi a šampony.

Způsoby výroby tohoto enzymu ekonomicky proveditelnou cestou nejsou uvedeny, stejně tak nejsou uvedeny specifické enzymatické detergentní směsi obsahující tuto kutinázu.

Kutinázy lze získat z velkého množství takových zdrojů jako jsou rostliny (např. pyl), bakterie a houby. Kutináza, která se má používat pro tento vynález, byla vybrána ze skupiny eukaryotických kutináz. Tyto eukaryotické kutinázy mohou být získány z různých zdrojů jako např. rostlin (např. pylu) nebo hub. E

Zdá se, že skupina (eukaryotických) kutináz z hub obsahuje dvě rodiny s odlišnou specificitou - listovou specificitou a stonkovou specificitou. Kutinázy s listovou specificitou mají většinou

-11 optimální pH kyselé nebo neutrální, zatímco kutinázv se stonkovou specificitou mají optimální pH alkalické. Kutinázv s alkalickým optimálním pH jsou vhodnější pro použití v alkalicky sestavených čisticích prostředcích jako jsou prací prášky a tekutiny pro trvanlivé tkaniny. Kutinázv mající optimální pH kyselé nebo neutrální jsou vhodnější pro výrobky nižšího zatížení a pro máchací kondicionéry, ale také pro průmyslové čisticí prostředky.

Následující tabulka I ukazuje čtyři různé kutinázv se stonkovou specificitou a jejich optimální pH.

Příkladv-kutináz se stonkovou speicificitou optimální.ρΗ Fusarium solani pisí 9

Fusarium roseum culmorum 10

Rhizoctonia solani 8,5

Altemaria brassicicola (PNBáza I) 9

V tomto vynálezu jsou používány zvláště ty kutinázv, které se mohou odvodit od divokého typu Fusarium solani pisi (Ettinger se sp., 1987). Při použití vhodného čisticího prostředku vykazuje tato kutináza značné prací účinky.

Pro tento vynález jsou rovněž vhodné zvláště kutinázv s vysokým stupněm homologie v sekvenci aminokyselin s kutinázou získanou z Fusarium solani pisi. Jsou to například kutinázv z Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiod.es a Magnaporthe grisea.

Pro tento vynález není vhodná lipáza z Humicola lanuginosa popsaná v EP-A-305 216 (Novo Nordisk), která je komerčně dodávaná jako Lipoláza (TM). Tento enzym se však může upravit technikami rDNA tak, aby rovněž vykazoval výraznou lipolytickou aktivitu během hlavního cyklu pracího procesu. Takové modifikace ovlivní strukturu tohoto lipázového enzymu a vyžadují tedy určité experimentování zaměřené na nalezení rovnováhy mezi ««»u*aw.au

-12nevyhnutelnou distorzí konformace tohoto enzymu a výhodami v podobě enzymové aktivity. Obecně se dává přednost takovým modifikacím, které příliš neovlivňují náboj v okolí aktivního místa.

Lipolytický enzym tohoto vynálezu může být výhodně přidáván do čisticího prostředku v jakékoli vhodné podobě, tj. ve formě granulované směsi, suspenze enzymu, nebo s nosičovými látkami (např. jako v EP-A-258 068 a výrobky Savináza (TM) a Lipoláza (TM) z Novo Nordisk). Vhodným způsobem přidávání tohoto enzymu do tekutého čisticího prostředku je ve formě kašovité suspenze obsahující 0.5 - 50% hmotnosti enzym v ethoxylovaném alkoholovém neiontovém smáčedle tak, jak je popsáno v EP-A-450 702 (Unilever).

Enzym, který se má podle tohoto vynálezu v čisticím ’ prostředku používat, se může vyrábět klonováním genu pro tento enzym do vhodného produkujícího organismu jako jsou Bacilli nebo Pseudomonaceae, kvasinky jako Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula nebo Pichia, nebo houby jako Aspergillus.

Přirozené organismy produkující kutinázu většinou patří mezi rostlinné patogeny. Tyto mikroorganismy nejsou příliš vhodné pro použití jako hostitelské buňky pro kutinázové geny. Proto byly geny kódující kutinázy vloženy do rDNA vektorů, které je možno přenést do hostitelských mikroorganismů vhodnějších pro technologii rDNA. 2a tímto účelem se mohou používat rDNA vektory velice podobné rDNA vektorům popsaným v WO-A-90/09446.

Pro zvýšení výtěžku fermentačního procesu může být gen pro kutinázu přenesen do mikroorganismů, které mohou rychle růst na levném mediu a mají schopnost syntézy a sekrece velkého množství tohoto enzymu. Takto vhodně upravenou rDNA (hostitelské mikroorganismy) představují podle tohoto vynálezu bakterie, mezi jinými Bacilli, Corynebacteria, Staphylococci a Streptomyces, nebo nižší eukaryota jako Sacčharomyces cerevisiae a příbuzné druhy, Kluyveromyces marxianus a příbuzné druhy, Hansenula polymorpha a příbuzné druhy, a druhy rodu Aspergillus. Vhodnější hostitelské mikroorganismy patří do nižších eukaryot, protože tyto mikroorganismy velice dobře vytvářejí a uvolňují enzymy ve

-13 fermentačním procesu a nemají schopnost glykolvzovat kutínázové molekuly. Glvkosvlace může přispívat ke stabilitě kutinázv v detergentních systémech.

Tento vynález rovněž popisuje genetický materiál odvozený zavedením eukarvotických kutinázových genů, např. genu z Fusarium solemi pisi do klonovacích rDNA vektorů, využitím těchto nových transformovaných hostitelských buněk a expresí těchto genů pro kutinázu v takových nových hostitelských buňkách.

Tento vynález dále popisuje polynukleotidy vytvořené nebo modifikované technikou rDNA kódující takovou kutinázu, rDNA upravené mikroorganismy obsahující takové polynukleotidy a/nebo rDNA vektory. Vynález rovněž popisuje odpovídající polynukleotidy mající sekvenci baží kódující zralou kutinázu. Takový polynukleotid má za posledním translatovaným kodonem terminační kodon a může mít sekvence nukleotidů kódujících prepro- nebo prosekvence této kutinázy umístěné přímo proti směru exprese nukleotidových sekvencí kódujících zralou kutinázu.

V takovém polynukleotidu může být sekvence nukleotidů kódujících kutinázu a odvozených od původního organismu upravena tak, že alespoň jeden kodon, ale lépe co nejvíce kodonů, je připraven tak, aby podléhal tiché mutaci a dal vznik kodonu, který by kódoval stejný aminokyselinový zbytek a byl upřednostňován novým hostitelským organismem, čímž by se v buňce takového hostitele použila pro vložený gen stabilnější m-RNA.

Proti směru exprese nukleotidové sekvence kódující prokutinázu nebo zralou kutinázu může být umístěna nukleotidová sekvence, která kóduje signální nebo sekreční sekvenci vhodnou pro vybraného hostitele. Tak se princip tohoto vynálezu vztahuje k vektoru rDNA, do kterého byla vložena sekvence nukleotidů kódující kutinázu nebo její prekurzor.

Daná nukleotidová sekvence může být odvozena například z:

(a) přirozeně se vyskytující nukleotidové sekvence (e.g. kódující původní sekvenci aminokyselin proprekutinázy nebo prokutinázy produkované Fusarium solanipisi), (b) z chemicky syntetizovaných nukleotidových sekvencí

-14obsahujících kodony, které jsou upřednostňovány novým hostitelskvm. organismem, a nukleotidové sekvence vedoucí ke stabilní mediátorové RNA v novém hostiteli, (c) sekvencí nukleotidu získaných genovým inženýrstvím a odvozených od sekvence nukleotidů uvedené v předchozích odstavcích (a) a (b) kódujících kutinázu z Fusarium solemi -píší s odlišnou sekvencí aminokyselin, ale s vysokou stabilitiou a/nebo aktivitou v detergentním systému.

Celkově můžeme říci, že by rDNA vektory schopné řídit expresi nukleotidové sekvence kódující kutinázový gen v některém z vhodných hostitelů, tak jak zde bylo popsáno, měly obsahovat tyto složky:

(a) Dvouvláknovou (ds) DNA kódující zralou kutinázu nebo prekutinázu či odpovídající prekutinázy, ve kterých byla alespoň část presekvence přemístěna proti směru exprese od místa sekrečního signálu (upřednostňovaného vybranou hostitelskou buňkou). V případech, kdy část genu, která má být překládána, nezačíná kodonem ATG, měl by se ATG kodon umístit před tuto část. Překládaná část genu by měla vždy končit vhodným terminačním kodonem.

(b) Regulon exprese (vhodný pro vybraný hostitelský organismus) umístěný po směru exprese na pozitivním řetezci dvouvláknové DNA kódující kutinázu (složka (a)).

(c) Terminační sekvenci (vhodnou pro vybraný hostitelský orgnismus) umístěnou po směru exprese na pozitivním řetězci dvouvláknové DNA kódující kutinázu (složka (a)).

(dl) Nukleotidovou sekvenci, která zprostředkovává integraci dvouvláknové DNA do genomu hostitelské buňky.

(d2) Počátek replikace vhodný pro vybraného hostitele.

(el) Volitelně i (auxotrofní) selekční signální znak. Auxotrofní signální znak se může skládat z kódující oblasti pro tento auxotrofní signální znak a z defektního promotoru.

(e2) Volitelně i dvouvláknovou DNA sekvenci kódující protein účastnící se zrání a/nebo sekrece jedné z prekurzorových forem kutinázy ve vybrané hostitelské buňce.

-15Takový rDNA vektor může rovněž obsahovat ve výše definovaném polynukleotidu sekvence zprostředkovávající funkční expresi kutinázy umístěné buď po směru, nebo proti směru exprese . Auxotrofní signální znak se může skládat z kódující oblasti pro tento auxotrofní signální znak a z defektního promotoru.

Tento vynález rovněž popisuje postup výroby lipolvtického enzymu schopného vykazovat prací účinky. Postup obsahuje kroky fermentační kultivace uměle upraveného mikroorganismu s vloženým genem vytvořeným technikami rekombinantní DNA a kódujícím lipolytický enzym s pracími účinky, přípravu tohoto enzymu vyprodukovaného mikroorganismem jeho separací buď z kultivačního bujónu, nebo separací buněk hostitelských mikroorganismů z kultivačního bujónu, jejich rozrušením a koncentrací, nebo částečnou purifikací daného enzymu buď z bujónu nebo separovaných buněk pomocí koncentračních nebo purrfikačních fyzikálních nebo chemických metod. Kultivace může být v tomto případě buď jednorázová, vsádková nebo kontinuální. Výběr typu kultivace závisí na druhu vybraného hostitelského organismu a samotné metodě dalšího zpracování.

Podmínky jsou voleny tak, aby byl enzym vylučován mikroorganismy do kultivačního bujónu, ze kterého je pak po odstranění buněk získáván filtrací nebo centrifugách Pak je možno enzym koncentrovat a čistit do požadované míry.

Samotný kultivační proces může být nezávisle na specifické povaze zvolených mikroorganismů založen na známých kultivačních technikách a na obecně používaném zařízení pro další zpracování.

V dalším aspektu poskytuje tento vynález uměle upravené mikroorganismy obsahující gen pro enzym mající již zmíněnou lipolytickou aktivitu a schopnost produkce tohoto enzymu kódovaného daným genem.

Tento vynález dále popisuje vektory rekombinantní DNA nesoucí neukleotidové sekvence pro lipolytické enzymy mající prací účinky popsané v této přihlášce.

-16(c) Ostatní složky.

Enzymatický čisticí prostředektohoto vynálezu může dále obsahovat 5 - 60, raději od 20% do 50% hmotnosti čisticí složku. Touto čisticí složkou může být jakýkoli druh materiálu schopného snižovat hladinu volných vápenatých iontů v prací tekutině, který tak bude tvořit směs poskytující další výhody jako tvorbu alkalického pH, tvorbu suspenze nečistot odstraněných z tkanin a přítomnost suspenze změkčovadel jílovitých látek.

Příklady čisticích složek zahrnují srážecí složky jako jsou uhličitany alkalických kovů, kyselé uhličitany, orthofosfáty, změkčovadla vody jako tripolyfosfáty alkalických kovů nebo nitrilotriacetáty, či iontoměniče jako amorfní alumosilikáty alkalických kovů nebo zeolity.

Zjistilo se, že pro lipolytickou aktivitu čisticího prostředku tohoto vynálezu je vhodné, obsahuje-li takové složky, kterými se koncentrace volného vápníku sníží na méně než 1 mM.

Enzymatický čisticí prostředek tohoto vynálezu může v dalším provedení obsahovat rovněž kombinaci enzymů a dalších složek, které se obyčejně v detergentních směsích používají, včetně přísad do takových směsí. Tyto složky mohou být kteréhokoli dosud známého druhu, například ty, které jsou popsány v GB-A-1 372 034 (Unilever), US-A-3 950 277, US-A-4 011 169, EP-A-179 533 (Procter & Gamble), EP-A-205 208 a EP-A-206 390 (Unilever), JP-A-63-078000 (1988) a v Research Disclosure 29056 z června 1988, spolu s každou z několika zde uvedených specifikací. Formulace čisticího prostředku podle tohoto vynálezu může být rovněž doložena odkazy na příklady Dl až D14 v EP-A-407 225 (Unilever).

Zvláštní výhody mohou poskytovat takové čisticí prostředky, ve kterých je obsažen proteolytický enzym nebo preteáza. EP-A-271 154 (Unilever) popisuje několik vhodných proteáz majících pl nižší než 10. Proteázy pro použití dohromady s lipázami mohou za určitých okolností zahrnovat subtilisiny například typu BPN nebo mnoho druhů subtilisinů popsaných v literatuře, z nichž některé již byly navrženy pro použití v čisticích prostředcích, jako například mutantní proteáza popsaná například v EP-A-130 756 nebo v

-17EP-A-251 446 (obojí Genentech), US-A-4 760 025 (Genencor), EP-A-214 435 (Henkel), WO-A-S7/05050 (Genex), Thomas se sp. (1986) v Nátuře 5, 316, a 5, 375-376 a v J.Mol.Biol. (1987) 193, 803-813, Russel se sp. (1987) v Nátuře 328, 496-500, a jiné.

Tento vynález bude nyní dále dokumentován následujícími příklady. Přiložené nákresy zobrazují:

Obrázek IA

Nukleotidová sekvence kazety 1 kutinázového genu Fusarium solani pisi a počátečních oligonukleotidů. Tranzice oligonukleotidů jsou vyznačeny v sekvenci kazety. Malá písmena označují nukleotidy umístěné mimo otevřeny čtecí rámec.

Obrázek 1B

Nukleotidová sekvence kazety 2 syntetického genu kutinázy Fusarium solani pisi a počátečních oligonukleotidů. Tranzice oligonukleotidů jsou vyznačeny v sekvenci kazety.

Obrázek ÍC

Nukleotidová sekvence kazety 3 syntetického genu kutinázy Fusarium solani pisi a počátečních oligonukleotidů. Tranzice oligonukleotidů jsou vyznačeny v sekvenci kazety. Malá písmena označují nukleotidy umístěné mimo otevřený čtecí rámec.

Obrázek ID

Nukleotidová sekvence syntetického kutinázového genu kódujícího preprokutinázu Fusarium solani pisi. Jsou zde vyznačeny presekvence, prosekvence a zralé sekvence pro kutinázu. Dále jsou zde vyznačena místa používaná pro klonování a tranzice oligonukleotidů. Malá písmena označují nukleotidy umístěné mimo otevřený čtecí rámec.

Obrázek 2

Nukleotidová sekvence syntetického fragmentu DNA pro spojení sekvence kódující prokutinázu Fusarium solani pisi se sekvencí

-18kódující derivát phoA presekvence E. coli. Vazebné místo pro ribozóm (RBS) a rozpoznávací místa restrikčních enzymů jsou zde rovněž vyznačena. Jednopísmenným kódem jsou vyznačeny sekvence aminokyselin kódované signální sekvencí phoA a části kutinázového genu.

Obrázek 3

Nukleotidové sekvence kazety 8, SacI-BclI fragment, bod který kóduje místo fúze kódující sekvence pro invertázové presekvence a zralou kutinázu Fusarium solani pisi.

Obrázek 4

Plazmid pUR2741 získaný delecí 0.2 kb Sall-Nrul z pUR2740, který je pendlujícím vektorem E. coli-S. ceremsiae obsahujícím část pBR322, počátek replikace kvasinkové buňky odvozený od 2gm plazmidu, kvasinkový gen leu2D a spojení oblasti kódující signální sekvence kvasinkové invertázy s oblastí kódující zralou kutinázu Fusarium solani pisi pod kontrolou kvasinkového promotoru gal7.

Obrázek 6

Plazmid pUR2740 je pendlující vektor E. coli - S. ceremsiae obsahující část pBR322, počátek replikace kvasinkových buněk odvozený od 2pm plazmidu, kvasinkový gen leu2D a fúzi oblasti kódující signální sekvenci kvasinkové invertázy s rostlinným a-galaktosidázovým genem pod kontrolou kvasinkového promotoru gaI7.

Obrázek 7

Nukleotidové sekvence kazet 5, 6 a 7 obsahujících různé typy spojení kódujících oblastí exlA presekvencí a zralé kutinázy Fusarium solani pisi.

Obrázek 8

Plazmid pAW14B získaný inzercí 5,3 kb Sáli fragmentu genomové DNA Aspergillus níger var. awamori do Sáli místa v pUC19.

-19Obrázek 9

Plazmid pUR7280 získaný záměnou fragmentu BspHI-AflII obsahujícího exlA otevřený čtecí rámec v pAW14B za fragment BspHI-AflII obsahující sekvenci kódující preprokutínázu Fusarium solárii pisi. Tak plazmid pUR7280 obsahuje gen pro preprokutínázu Fusarium solani pisi pod kontrolou promotoru_a terminátoru A. niger var. azoamori.

Obrázek 10

Plazmid pUR7281 získaný zavedením obou selekčních signálních znaků amdS z A. nidulans a pyrG z A. niger var. awamori do pUR7280.

Obrázek 11

Vztahy mezi zbytkovou aktivitou po inaktivaci DFP a procenty odstranění znečištění u různých lipolytických enzymů. Byly použity následující zkratky:

Lipoláza (TM, Novo Nordisk) lip

Fusarium solani pisi kutináza (příklad 2) CT

Candida cylindracea lipáza (Sigma) Candida

Chromobacter viscosum lipáza (Sigma) Chrom

Prasečí pankreatická lipáza (Sigma) Pancr

Genencor lipáza (varianta Pseudomonas putida

ATCC 53552) Gen

AKG lipáza 30B (Amano) AKG

SDL 195 lipáza (Showa Denko) SDL

Ps. pseudoalcaligines CBS 473.85 lipáza Ps.ALK

Obrázek 12

Srovnání lipolytické aktivity kutinázy z Fusarium solani pisi a Lipolázy (TM).

Obrázek 13

Samotný prací účinek kutinázy Fusarium solani pisi a Lipolázy (TM) při různém druhu znečištění.

-20,»tw ν..·«·._Α\7ΑίΜ>ς·«»νΐΗ.·«*>»«Α·^·νιΜί»<4ίυί '·'’.

Obrázek 14A

Účinky kutinázv z Fusarium solani pisi a Lipolázy (TM) pří hladině enzymu 1 LU/ml měřené po několika pracích cyklech.

Obrázek 14B totéž při hladině enzymu 3 LU/ml.

Obrázek 14C totéž při hladině enzymu 5 LU/ml.

Obrázek 14D totéž při hladině enzymu 10 LU/ml.

Obrázek 15

Několikacyklový prací test s Lipolázou (TM), lipázou Pseudomonas gladioli a kutinázou Fusarium solani pisi v PAS/neiontové sestavě.

Obrázek 16

Několikacyklový prací test s Lipolázou (TM), lipázou Pseudomonas gladioli a kutinázou Fusarium solani pisi v jiné PAS/neiontové sestavě.

Obrázek 17 totéž jako obr. 16, ale s opětovným znečištěním po každém cyklu.

Literatura

Sambrook, J., Fritsch, E.F. a Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning : a laboratory manual (2. vyd). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. ISNB 0-87969-309-6.

Furste, J.P., Pansegrau, W._z Frank, R., Blócker, H., Scholz, P. Bagdasarian, M. a Lanka, E. (1986). Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. GeneJS: 119-131.

Michaelis se sp. (1983). J. Bacteriol 154: 366Tartof a Hobbs (1988). Gene_6Z: 169-182.

Soliday, C.L., Flurkey, W.H., Okita, T.W. a Kolattukudy, P.E. (1984).

Cloning and structure determination of cDNA for cutinase, an enzyme involved in fungal penetration of plants. Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 81: 3939-3943.

-21 Nogi, Y. a Fukasawa, T. (1983). Nucleotide sequence of the transcríptonal initiation region of the yeast GAL7 gene. Nucleic Acid Res. 11: 8555-8568.

Taussig, R. a Carlsson, M. (1983). Nucleotid sequence of the yeast SUC2 gene for invertase. Nucleic Acids Res. 11: 1943-1954.

Erhart, E a Hollenberg, C.P. (1981) Curing of Saccharomvces cerevisiae 2-μιη DNA by transformation. Curr. Genet._3: 83-89. Verbakel, J.A.M.V. (1991) Heterologous gene expression in the yeast Saccharomvces cerevisiae. Ph.D. thesis. Rijks Universiteit Utrecht, The Netherlands.

Maar, J., Róza, M., Verbakel, J., Stam, J., Santos da Silva, M.J., Bosse, M., Egmond, M.R., Hagemans, M.L.D., v. Gorcom, R.F.M., Hessing, J.G.M., v.d. Hondel, C.A.M.J.J. a v. Rotterdam, C. (1992). Xylanases and their application in bakery. In: Visser, J., Beldman, G., Kusters-van Someren, M.A. a Voragen, A.G.J. (Eds), Xylans and Xylanases. Progress in Biotechnology Volume 7, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. ISBN 0-444-89477-2.

de Graaff, L.H., van den Broek, H.C., van Ooijen, A.J.J. a Visser, J. (1992). Structure and regulation of an Aspergillus xylanase gene. In: Visser, J., Beldman, G., Kusters-van Someren, M.A. a Voragen, A.G.J. (Eds), Xylans and Xylanases. Progress in Biotechnology Volume 7, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. ISBN 0-444-89477-2.

Hankin, L. and Kolattukudy, P.E. (1968). J. Gen. Microbiol. 51: 457-463.

Ettinger, W.F., Thukral, S.K. a Kolattukudy, P.E. (1987). Structure of cutinase gene, cDNA, and the derived amino acid sequence from phytopathogenic fungi. Biochemistry 26: 7883-7892.

Huse, W.D. and Hansen, C. (1988). Strategies 1:1-3.

De Graaff, L.H., H.W.J. van den Broek a J. Visser (1988). Isolation and expression of the Aspergillus nidulans pyruvate kinase gene. Curr. Genet. 13:315-321.

-22Příkladv provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce syntetického genu kódujícího preprokutinázu Fusarium solaní pisi.

Syntetický gen kódující preprokutinázu Fusarium solaní pisi byl konstruován v podstatě metodou popsanou v EP-A-407 225 (Unilever). Na základě publikovaných nukleotidových sekvencí genů Fusarium solaní pisi (Soliday se sp. (1984) a WO-A-90/09446, Plant Genetic Systems), byl navržen kompletně syntetický fragment DNA obsahující oblast, která kóduje polypeptid preprokutinázy z Fusarium solani pisi. V porovnání s nukleotidovou sekvencí původního genu Fusarium solani pisi obsahuje tento syntetický kutinázový gen několik nukleotidových změn, kterými byla do vhodných míst zavedena rozpoznávácí místa restrikčních enzymů, aniž by se tak ovlivnila kódovaná sekvence aminokyselin. Sekvence nukleotidů celého umělého kutinázového genu je zobrazena na obr. ID.

Konstrukce syntetického kutinázového genu byla provedena shromážděním tří oddělených kazet začínajících syntetickými DNA oligonukleotidy. Každá kazeta syntetické DNA je na začátku vybavena EcoRI místem a na konci místem HindlII. Oligonukleotidy byly syntetizovány pomocí syntetizéru Applied Biosystems 380A DNA synthesizer a purifikovány polyakrylamidovou gelovou elektroforézou. Pro syntézu každé kazety byl použit níže popsaný postup. Byla smíchána ekvimolární množství (50 pmol) oligonukleotidů tvořících danou kazetu, oligonukleotidy byly forsforylovány na 5'- koncích, ochlazeny a ligovány podle standardních metod. Výsledná směs dvouvláknové DNA byla naštěpena EcoRI a HindlII, frakcionována podle velikosti fragmentů elektroforézou v agarosovém gelu a z gelu opět získána elektroelucí. Výsledná kazeta syntetické DNA byla ligována s fragmentem EcoRI-HindlII z pUC9 o velikosti 2,7 kb a transformována do Escherichia coli. K ověření sekvence syntetické kazety byla provedena kompletní sekvenace inzertů EcoRI-HindlII z několika klonů v obou

-23 směrech s použitím vhodných primerú. S použitím tohoto postupu byly zkonstruovány pUR7207 (obsahující kazetu 1, obr. IA), pUR7208 (obsahující kazetu 2, obr. 1B) a pUR7209 (obsahující kazetu 3, obr. IC). Nakonec bvl sestaven svntetickv kutinázovv gen kombinací 2,9 kb fragmentu EcoRI-Apal z pUR.7207 s 0,2 kb Apal-Nhel fragmentem z pUR7208 a 0,3 kb Nhel-HindlII fragmentem pUR7209 za vzniku pUR7210. Tento plazmid obsahuje otevřený čtecí rámec kódující kompletní preprokutinázu z Fusarium solani pisi (obr. ID).

Příklad 2

Exprese (pro)kutinázy Fusarium solani pisi v Escherichia coli.

Byl zkonstruován expresívní vektor se syntetickým kutinázovým genem pro E. coli. Tento vektor je funkčně podobný vektoru popsanému v WO-A-90/09446 (Plant Genetic Systems). Konstrukt byl sestaven tak, aby syntetickému genu kódujícímu prokutinázu Fusarium solani pisi předcházely náležité signály pro expresi v E. coli, tj. (i) inducibilní promotor, (ii) vazebné místo pro ribozóm a (iii) signální sekvence, která poskytuje iniciační kodon pro translaci a zároveň informace potřebné pro export prokutinázy přes cytoplasmatickou membránu.

Pro fúzi derivátu signální sekvence phoA E. coli (Michealis se sp., 1983) s prosekvencí syntetického kutinázového genu byl navržen syntetický spojovník (viz obr. 2). Pro optimalizaci štěpení signálního peptidu a sekreci prokutinázy byla sekvence nukleotidu tohoto spojovníku volena tak, že tři aminokyselinové zbytky s C-koncem (Thr-Lys-Ala) signální sekvence phoA byly změněny na Ala-Asn-Ala a N-koncové aminokyselinové zbytky kutinázovč prosekvence (Leu 1, viz obr. ID) byly změněny na Ala. Taková konstrukce zajišťuje sekreci kutinázy do periplasmatického prostoru (viz WO-A-90/09466, Plant Genetic Systems).

K dosažení tohoto konstruktu byl z pUR7210 odstraněn

EcoRI-Spel fragment o 69 kb obsahující kutinázovou presekvenci a část prosekvence, a byl nahrazen syntetickou spojovací sekvencí

DNA (fragment EcoRI-Spel) poskytující derivát phoA presekvence

-24E. coli a pozměněný N-koncový aminokyselinový zbytek kutinázové prosekvence (obr. 2). Vzniklý plazmid byl označen pUR7250 a byl použit pro izolaci fragmentu BamHI-HindlII o velikosti 0,7 kb obsahujícího vazebné místo pro ribozóm a oblast kódující prokutinázu sloučenou s kódující sekvencí signální sekvence phoA. Tento fragment byl ligován s 8,9 kb fragmentem BamHI-HindlII z pMMB67EH (Fůrste se sp., 1986) za vzniku pUR7220. V tomto plazmidu je syntetický gen kódující prokutinázu fúzován s pozměněnou verzí signální sekvence phoA a umístěn pod kontrolu inducibilního tac-promotoru.

Kmen E. coli WK6 nesoucí pUR7220 byl pěstován ve dvoulitrových třepacích lahvích obsahujících 0,5 1 IXTB media (Tartof a Hobbs, 1988) skládajícího se z:

0,017 M KH₂PO₄

0,017 M K₂HPO₄ g/1 Bacto-tryptone g/1 Bacto-yeast extract

0,4% glycerolu (objemová %)

Kultury se nechaly růst přes noc při 25°C - 30°C za přítomnosti 100 mg/1 ampicilinu při vydatném třepání (150 ot/min) až do dosažení zákalu 10-12 při 610 nm. Pak byl přidán IPTG (isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid) do konečné koncentrace 10 μΜ a inkubace pokračovala dalších 12-16 hodin. Jakmile nebyl ve vzorcích odebraných z kultury pozorovatelný žádný další významný nárůst lipolytické aktivity, byly buňky sklizeny centrifugací a při teplotě 0°C resuspendovány v pufru s 20% sacharosou v objemu odpovídajícímu původnímu objemu kultury. Pak byly buňky shromážděny centrifugací a resuspendovány v původním objemu v ledové vodě, která způsobila lýzu buněk osmotickým šokem. Buněčný odpad byl odstraněn centrifugací a bezbuněčný extract byl okyselen na pH 4,0 kyselinou octovou, ponechán přes noc v teplotě 4°C a výsledný precipitát byl odstraněn. V tomto stadiu byla metodami ultrafiltrace a vymražováním bezbuněčného extraktu získána kutináza o čistotě vyšší než 75% bez přítomnosti endogenní lipázy. V alternativním případě by kutináza mohla být vyčištěna do

-25homogenity (tj. čistoty vyšší než 95%) navrstvením okyseleného bezbuněčného extraktu na SP-sephadex, elucí enzymu pufrem o pH 8.0, průchodem koncentrovaného alkalického roztoku přes vhodný objem DEAE-celulosy (Whatman DE-52) a přímou aplikací průtoku DEAE-celulosy do sloupce Q-sepharosy HP (Pharmacia). Elucí v solném gradientu byl . získán přípravek homogenní kutinázy s typickým celkovým výtěžkem lepším než 75%.

Příklad 3

Exprese kutinázy Fusarium solani pisi v Saccharomyces cerevisiae.

Pro expresi syntetického genu kutinázy Fusarium solani pisi v Saccharomyces cerevisiae byl zkonstruován expresívní vektor, ve kterém syntetickému genu kódujícímu zralou kutinázu předchází presekvence invertázy S. cerevisiae (Taussig a Carlsson, 1983) a silný inducibilní promotor gal7 (Nogi a Fukasawa, 1983). K přípravě syntetického kutinázového genu pro takovouto fúzi byl syntetizován adaptorový fragment, ve kterém byla fúzována kódující sekvence pro invertázovou presekvenci se sekvencí kódující N-konec zralé kutinázy. Tento fragment byl shromážděn jako kazeta EcoRI-HindlII v pUC9 v podstatě stejným způsobem, jaký byl popsán v příkladě 1 (kazeta 8, viz obr. 3), čímž vznikl pUR7217. E. coli JM110 (kmeny postrádající dam metylázovou aktivitu) byly transformovány plazmidy pUR7210 a pUR7217 a 2,8 kb fragment BclI-HindlII z pUR7217 byl ligován s 0,6 kb fragmentem BclI-HindlII pUR7210 za vzniku pUR7218, ve kterém byla nukleotidová sekvence kódující polypeptid zralé kutinázy fúzována s oblastí kódující presekvenci invertázy S. cerevisiae.

Expresívní vektor pUR2741 (viz obr. 4) byl odvozen od pUR2740 (Verbakel, 1991, viz obr. 6) izolací 8,9 kb Nrul-Sall fragmentu z pUR2740, doplněním přesahujícího konce Sáli polymerázou Klenow a uzavřením tohoto fragmentu do kruhu. Fragment SacI-HindlII z pUR2741 o velikosti 7,3 kb byl ligován s fragmentem SacI-HindlII z pUR7218 o velikosti 0,7 kb za vzniku pUR7219 (viz obr. 5). Terminátor S. cerevisiae polili může být rovněž umístěn za kutinázový gen do místa HindlII, které se ukázalo být

-26podstatné pro účinnou expresi kutinázového genu. Pendlující plazmid pUR7219 E.coli-S. cerevisiae obsahuje počátek pro replikaci v kmenech S. cerevisiae, které nesou 2μ plazmid (kmeny cir+), Leu2 gen S. cerevisiae s defektní verzí promotoru umožňující selekci transformantů s velkým počtem kopií v leu2‘ kmenech S. cerevisiae, a syntetický gen kódující zralou část kutinázv Fusarium solani pisi funkčně připojený k presekvenci invertázy S. cerevisiae pod kontrolou silného inducibilního promotoru S. cerevisiae gal7.

Kmen S. ceverisiae SU50 (a, cir°, leu2, his4, canl), který je totožný s kmenem YT6-2-1L (Erhert a Hollenberg, 1981), byl kotransformován s ekvimolámí směsí 2μ plazmidu S. cerevisiae a pUR7219 s použitím standardního protokolu pro elektroporací kvasinkových buněk. Na leucinové prototrofii byly selektovány transformanty a z velkého počtu transformantů byla izolována celková DNA. Ukázalo se, že všechny transformanty obsahují jak 2μ plazmid, tak pUR7219, což dokladuje, že verze genu leu2 na pUR7219 obsahující defektní promotor může v důsledku přítomnosti kvasinkového plazmidu 2μ funkčně komplementovat kmeny deficientní v leu2 pouze v případě, že je přítomen ve vysokém počtu kopií. Jeden z transformantů byl z pUR7219 léčen kultivací na kompletním mediu po více než 40 generací následovaných replikovým přenosem na selektivní a kompletní pevné medium za vzniku kmene S. cervisiae SU51 (a, cir*, leu2, his4, canl).

Kmen S. cerevisiae SU51 nesoucí pUR7219 byl pěstován v jednolitrových třepacích lahvích obsahujících 0,2 1 MM media sestávajícího z:

- kvasničného základu bez aminokyselin (YNB - yeast nitrogen base) 6.7 g/1

- histidinu 20 mg/1

- glukosy 20 g/1

Kultury byly pěstovány přes noc při 30°C za vydatného třepání (150 ot/min) do zákalu 2-4 při vlnové délce 610. Buňky byly sebrány centrifugací a resuspendovány v 11 YPGAL media obsahujícího:

- kvasinkový extrakt 10 g/1

-27 - bacto peptone 20 g/1

- galaktosu 50 g/1 ve dvoulitrových třepacích lahvích a inkubace pokračovala dalších 12-16 hodin. Z kultury byly v pravidelných intervalech odebírány vzorkv, ze ktervch bvla biomasa odstraněna centrifusrací. V supernatantu byla analyzována aktivita kutinázy titrační zkouškou používající jako substrát olivový olej. Ke každému vzorku filtrátu o objemu 100 - 200 μΐ byla přidána rozmíchaná směs 5,0 ml lipázového substrátu (Sigma, obsahující jako substrát pro lipázu olivový olej) a 25,0 ml pufru (5 mM Tris-Cl pH 9,0 , 40 mM NaCl, 20 mM CaCIJ. Zkouška byla prováděna v teplotě 30°C a uvolněné mastné kyseliny byly měřeny automatickou titraci 0,05 M NaOH do pH 9,0 s použitím titrátoru Mettler DL25. Sledovala se křivka množství titrantu v čase. Velikost lipázové aktivity ve vzorku byla počítána z maximálního spádu této křivky. Jedna jednotka enzymové aktivity je definována jako množství enzymu, které ve výše uvedených podmínkách uvolní z olivového oleje 1 μιηοΐ mastných kyselin za minutu. Tato definice je odborníkům dostatečně známa.

Jakmile se produkce aktivity kutinázy již nijak nezvyšovala, byly buňky odstraněny centrifugací a bezbuněčný exrakt okyselen na pH 4,8 kyselinou octovou. Kutináza pak byla získána podle popisu v příkladě 1.

Příklad 4

Exprese kutinázy Fusarium solani pisi v Aspergilli.

Byl zkonstruován vektor pro expresi syntetického kutinázového genu Fusarium solani pisi v Aspergillus niger var. azvamori. V tomto vektoru byl syntetický gen kódující preprokutinázu umístěn pod kontrolu silného inducibilního promotoru exl A A. niger var. awamori (Maat et al., 1992, de Graaff et al., 1992).

Expresívní plazmid (pUR7280) pro preprokutinázu byl zkonstruován z plazmidu pAW14B, který byl uložen do kmene E.

coli JM109 s Cetraalbureau voor Schimmelcultures, Baam, The

Netherlands, pod číslem N° CBS 237.90 dne 31. května a který

-28obsahuje Sall fragment o přibližně 5,3 kb. Na tomto fragmentu je umístěn gen o délce 0,7 kb pro endoxylanázu II společně s 5'-lemující sekvencí o délce 2,5 kb a 3'-lemující sekvencí o 2,0 kb (obr. 8). Kódující oblast exlA v pAW14B byla nahrazena kódující oblastí pro preprokutinázu. Místo BspHI (5'-TCATGA-3') obsahující první kodon (ATG) genu exlA a místo AflII (5'-CTTAAG-3') obsahující terminační kodon (TAA) genu exlA napomohlo vytvoření pUR7280.

Konstrukce byla provedena následujícím způsobem: pAW14B (7,9 kb) byl částečně naštěpen BspHI a takto linearizovaný plazmid (7,9 kb) byl izolován z agarosového gelu. K odstranění plazmidů linearizovaných v místech BspHI byl takto izolovaný fragment naštěpen BsmI, který štěpí několik nukleotidů od místa BspHI ve směru exprese. Fragmenty byly separovány na agarosovém gelu a byl izolován fragment 7,9 kb BspHI-Bsml. Ten byl potom částečně štěpen AflII a výsledný fragment o 7,2 kb BspHI-AflII byl vyizolován.

Fragment BspHI-AflII z pUR7210 o velikosti 0,7 kb obsahující celý otevřený čtecí rámec kódující preprokutinázu Fusarium solani pisi byl ligo ván s fragmentem BspHI-AflII z pAW14B o velikosti 7,2kb za vzniku pUR7280. Sestrojený vektor (pUR7280) může být následně přenesen do plísní (např. Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, atd.) obvyklými technikami pro kotransformaci a gen pro preprokutinázu může pak být exprimován indukcí promotoru pro endoxylanázull. Sestrojený rDNA vektor může být rovněž vybaven obvyklými selekčními signálními znaky (např. amdS nebo pyrG, hydromycin atd.) a pak použit pro transformaci plísní k výrobě požadovaného proteinu. Selekční znaky amdS a pyrG byly například zavedeny do expresívního vektoru za vzniku pUR7281 (obr. 10). Za tímto účelem bylo vytvořeno místo Notl přeměnou místa EcoRI (přítomného 1,2 kb od ATG kodonu preprokutinázového genu proti směru exprese) na místo Notl s použitím syntetických oligonukleotidů (5'-AATTGCGGCCGC-3') za vzniku pUR7282. Vhodné fragmenty DNA obsahující celý gen amdS z A. nidulans a pyrG gen A. niger var. awamori společně s jejich vlastními promotory a terminátory byly vybaveny lemujícími Notl

-29místv a zavedeny do Notl místa v pUR7282 za vzniku pUR7281 (obr. 10). Jako alternativa byl pro expresi syntetického genu pro kutinázu Fusarium solani pisi v Aspergillus niger var. awamori sestaven vektor se syntetickým genem kódujícím zralou kutinázu, kterému však nepředchází jeho vlastní preprosekvence, ale presekvence exlA z A. niger var. aivamori.

K přípravě syntetického kutinázového genu pro tuto fúzi bylo syntetizováno několik adaptorových fragmentů, ve kterých byla kódující sekvence pro presekvenci exlA různými způsoby spojena se sekvencí kódující N-konec zralé kutinázy. V kazetě 5 je toto spojení vytvořeno fúzí exlA presekvence s prosekvencí kutinázy. V kazetě 6 je exlA presekvence fúzována s N-koncovým zbytkem zralé kutinázy. Kazeta 7 je totožná s kazetou 6 s tím rozdílem, že N-koncový zbytek polypeptidového řetězce kódované zralé kutinázy byl změněn z původního glycinového zbytku na serinovv zbytek, aby tak lépe vyhovoval požadavkům pro štěpení signálního peptidů. Kazety 5, 6 a 7 byly nashromážděny ze syntetických oligonukleotidů převážně podle popisu v příkladě 1 (viz obr. 7). Kazeta byla použita k náhradě 0,1 kb fragmentu EcoRI-BclI z pUR7210, čímž vznikl plazmid pUR7288 nebo pUR7289. Pro každý z plazmidů pUR7287, pUR7288 a pUR7289 byl ligován BspI-AflII fragment o 0,7 kb s fragmentem BspI-AflII z pAW14B dlouhým 7,2 kb za vzniku pUR7290, pUR7291 nebo pUR7292.

Sestrojené vektory byly poté přeneseny do plísní (Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori) běžnými technikami pro kotransformaci a pre(pró)kutinázový gen byl exprimován indukcí promotoru endoxylanázy II. Vytvořené rDNA vektory mohou být vybaveny také běžnými selekčními signálními znaky (tj. amdS nebo pyrG, hydromycin) a výsledným rDNA vektorem může být za účelem produkce požadovaného proteinu transformována plíseň, jak bylo ilustrováno v tomto příkladě na pUR7280 (viz výše).

Kmeny Aspergillus transformované některým z expresívních vektorů pUR7280, pUR7281, pUR7290, pUR7291, pUR7292 (obsahujících kódující oblast zralé kutinázy Fusarium solani pisi s nebo bez odpovídající sekvence a dále buď s kutinázovou signální

-30sekvencí nebo s exlA signální sekvencí pod kontrolou exlA promotoru a terminátoru A. niger var awamori byly pěstovány v následujících podmínkách: větší počet jednolitrových třepacích lahví se 400 ml syntetického media (pH 6,5) byl inokulován sporami (konečná koncentrace: 10E6/ml). Medium mělo následující složení (AW medium):

sacharosa	10	g/i
NaNO3	6,0	g/i
KC1	0,52	g/i
KH,PO4	1,52	g/1
MgSO4.7H2O	0,49	g/1
kvasinkový extrakt	1,0	g/1
ZnSO4.7H2O	22	mg/1
H.BO-	11	mg/1
MnC14H2O	5	mg/1
FeSO4.7H2O	5	mg/1
CaCb .6H,O	1,7	mg/1
CuSO4.5H2O	1,6	mg/1
NaH,MoO4.2H2O	1,5	mg/1
NaJEDTA	50	mg/1

Inkubace probíhala v 30°C, 200 ot/min po 24 hodin v třepacím inkubátoru Mk X. Po kultivaci byly buňky sebrány filtrací (filtr 0,45 gm), dvakrát promyty AW mediem bez sacharosy a kvasinkovým extraktem (solným roztokem), resuspendovány v 50 ml solného roztoku, do kterého byla přidána xylosa do konečné koncentrace 10g/l (indukční medium). Inkubace ve výše zmíněných podmínkách pokračovala přes noc. Biomasa byla z výsledných kultur odfiltrována přes miracloth a kutináza byla získána v podstatě podle postupu popsaného v příkladě 2.

Příklad 5

Identifikace a izolace genů příbuzných genu kutinázy Fusarium solani pisi.

Z různých druhů hub byly izolovány geny kódující kutinázu s různým stupněm homologie. Houbové kultury byly pěstovány v

-31 třepacích lahvích o objemu 500 ml obsahujících 200 ml media popsaného Hankinem a Kolattukudvm (1968) doplněného 0,25% glukosou a inkubovány 4 dny v 28°C v třepacím inkubátoru (100 ot/min). V té době byla glukosa již spotřebována a produkce kutinázy byla indukována přidáním kutinového hvdrolvzátu v podstatě tak, jak bylo popsáno Ettingerem se sp. (1987). V pravidelných intervalech bvlv z kulturv odebíránv vzorkv a bvlv standardními technikami testovány na přítomnost lipolytické aktivity (viz příklad 4). Většinou kolem dvou dnů poté, co se objevila indukce lipolytické aktivity, byly buňky sklizeny filtrací použitím standardních technik. Mycelia byly propláchnuta, zmražena v tekutém dusíku a lyofilizována standardními technikami. Přípravky celkové buněčné RNA byly izolovány použitím metody guanidin-thiokyanatanu a purifikovány centrifugací v hustotním gradientu CsCl vpodstatě podle postupu popsaného Sambrookem se sp. (1989). Frakce polyA(+) mRNA byly izolovány použitím izolační soupravy polyAtract mRNA (Promega). Tyto polyA(+) frakce mRNA byly použity v Northern hybridizaci používající jako nukleotidovou sondu fragment cDNA z Fusarium solani pisi podle standardních technik k ověření exprese příbuzných kutinázových genů. Pro syntézu cDNA byly použity přípravky mRNA obsahující materiál schopný hybridizovat s danou nukleotidovou sondou. Pro syntézu byla podle návodu dodavatele použita souprava ZAP cDNA synthesis kit (Stratagene, La Jolla). Syntézou byly získány fragmenty cDNA mající kohezní konce Xhol lemující oblast polyA a EcoRI adaptéry na druhém konci. Získané fragmenty cDNA byly použity pro konstrukci expresivních knihoven přímým klonováním ve směru orientace ve vektorech lambda ZAPII (Stratagene, La Jolla) umožňujících expresi protein fúzovaných s β-galaktosidázou (Huse se sp., 1988). Tyto knihovny byly prošetřeny antiserem vytvořeným proti kutináze Fusarium solani pisi.

Jako další varianta byly frakce syntetizované cDNA podrobeny

PCR screeningu s použitím primerů specifických pro kutinázu (viz tabulka 2). Tyto primery byly odvozeny ze srovnání aminokyselinových sekvencí několika kutinázových genů hub

-32(Ettinger se sp., 1987). Podmínky PCR byly optimalizovány pro každou sadu primerů a jako kontrola byla použita cDNA pro kutinázu z Fusarium solani pisi. Pro tyto přípravky cDNA, kterými mohly být vytvořeny specifické PCR fragmenty o podobné délce (nebo delší) než je délka PCR fragmentů vytvořených s pomocí cDNA z kutinázy Fusarium solani pisi za stejných podmínek, byl PCR fragment purifikován gelovou elektroforézou a z gelu pak izolován.

Jako alternativní přístup byla zvolena PCR vyšetřovací technika využívající primery specifické pro kutinázu. Tato technika byla aplikována přímo na genomovou DNA některých kmenů hub s použitím genomové DNA z Fusarium solani pisi jako pozitivní kontroly. Pro tyto přípravky cDNA, kterými mohly být vytvořeny specifické PCR fragmenty o podobné délce (nebo delší) než je délka PCR fragmentů vytvořených s pomocí cDNA z kutinázy Fusarium solani pisi za stejných podmínek, byl PCR fragment purifikován gelovou elektroforézou a z gelu pak izolován.

Z kmenů, které byly pozitivní bud' při použití expresívní knihovny nebo v technice PCR screeningu (buď s cDNA, nebo s genomovou DNA), a z mnoha dalších kmenů byla izolována vysokomolekulámí genomová DNA. Kmeny byly pěstovány v podstatě podle postupu popsaného Ettingerem se sp. (1987) a genomová DNA byla izolována podle Graaffa se sp. (1988). Genomová DNA byla naštěpena různými restrikčními enzymy a analyzována Southern hybridizací s použitím buď analogového cDNA inzertu (metoda expresívní knihovny) nebo PCR fragmentu (metoda PCR screeningu) nebo kutinázového genu Fusarium solani pisi jako nukleotidové sondy (ostatní kmeny). Poté byla sestavena fyzikální mapa kutinázového genu. Příslušné štěpy genomové DNA byly frakcionovány podle velikosti gelovou elektroforézou, fragmenty požadovaných délek byly z gelu izolovány a subklonovány v pUC19. Tyto genomové knihovny byly prověřeny odpovídajícím inzertem cDNA (metoda expresívní knihovny) nebo PCR fragmentem (metoda PCR screeningu). Tak byly získány klony obsahující genomovou kopii kutinázových genů. Tyto geny byly sekvencovány v obou směrech. Sekvencováním odpovídající cDNA

-33nebo srovnáním s jinými kutinázovými sekvencemi (Ettingeer se sp.) byly určeny intronv. Takovýmto srovnáním byl rovněž odvozen N-konec polypeptidu zralé kutinázy. S použitím standardních PCR technik byly odstraněny introny, genovým inženýrstvím bylo vytvořeno místo HindlII přímo po směru otevřeného čtecího rámce, a kódující sekvence pro presekvenci genu invertázv Saccharomyces cerevisiae (kterému předchází místo Sací, porovnejte kazetu 8, obr. 3) byla fúzována se sekvencí kódující N-konec zralé kutinázy. Získané fragmenty SacI-HindlII obsahující kutinázové geny funkčně připojené k sekvenci kódující presekvenci invertázv S. cerevisiae byly ligovány s fragmentem SacI-HindlII z pUR7241 o velikosti 7,3 kb (viz obr. 4) a přeneseny do kmene S. cerevisiae SU51. Kutinázy hub byly exprimovány a vytěženy z bujónu s kulturou postupem popsaným v příkladě 4.

Příklad 6

Inaktivační pokusy s diisopropyl-fluorofosfatem (DFP).

V tomto pokusu byly lipoly tické enzymy různého původu podrobeny inaktivaci různě koncentrovaným DFP po pevně stanovenou dobu. Procento zbylé aktivity bylo zjišťováno v experimentu měřeném na pH-statu. Experimentální podmínky byly následující:

Lipolytický enzym, který byl testován, byl použit v koncentraci 0,5mg proteinu na ml v 10 mM Tris pufru o pH 10,0 obsahujícím 20 mM CaC12.2H2O (Merck). K 0,5 ml roztoku tohoto enzymu (vzorek) bylo přidáno 20 μΐ DFP inhibitoru. K jiným 0,5 ml enzymu bylo přidáno 20μ1 etheru (kontrola). Roztok DFP inhibitoru byl 0,5 M DFP (diisopropyl-fluorofosfát od firmy Fluka) v etheru (Baker). Oba ' vzorky byly inkubovány 10 minut při teplotě místnosti. Po inkubaci byl roztok centrifugován 2 minuty při plné rychlosti (14 000 ot/min) v centrifuze Eppendorf. Pak byl použit supematant. Lipázová aktivita v obou vzorcích a v kontrole byla měřena na pH-statu v experimentu se stabilním pH 10,0 při použití lipázového substrátu (Sigma, katalogové č. 800-1). Zbylá aktivita byla vypočítána následujícím způsobem:

-34RA - lipázová aktivita vzorku/lipázová aktivita kontroly * 100% Procenta zbytkové aktivity jsou uvedena v následujícím přehledu:

Lipolytický enzym_zbytková aktivita (.%)

Lipoláza (TM, z Novo Nordisk) 86 kutináza Fusarium solani pisi (příklad 2) 5 lipáza Candida cylindracea (Sigma) 83 lipáza Chromobacterium viscosum (Sigma) 65 lipáza vepřového pankreatu (Sigma) 60 lipáza Genencor (varianta Pseudomanas putida ATCC 53552, Lumafast) 65

AKG lipáza 30B (Amano) 52

SDL 195 lipáza (Showa Denko) 20 lipáza Ps. pseudoalcaligines CBS 473.85 60

Příklad 7

Lipolytická aktivita enzymů testovaných v předchozím příkladě byla měřena použitím výše popsané metody hromovaného olivového oleje. Prací teplota byla 30°C a tvrdost vody 27°FH. Procenta odstranění hromovaného olivového oleje v průběhu pracího testu byla následující:

Lipolvtickv enzym	odstranění nečistot (%)
Lipoláza (TM, z Novo Nordisk)	0
kutináza Fusarium solani pisi (příklad 2)	19
lipáza Candida cylindracea (Sigma)	0
lipáza Chromobacterium viscosum (Sigma)	1,6
lipáza vepřového pankreatu (Sigma)	10
lipáza Genencor (varianta Pseudomanas putida
ATCC 53552, Lumafast)	11
AKG lipáza 30B (Amano)	10
SDL 195 lipáza (Showa Denko)	20
lipáza Ps. pseudoalcaligines CBS 473.85	15

Údaje získané v příkladě 6 (zbytková aktivita po inaktivaci

-35pomocí DFP) a údaje získané v tomto příkladě byly uvedeny do vzájemného vztahu pomocí analýzy lineární regrese. Na obr. 11 jsou tyto vztahy zobrazeny graficky. Na tomto obrázku lze pozorovat, že mezi procenty zbytkové aktivity a pracím výkonem daného lipolvtického enzymu je prokazatelná souvislost. 2 těchto údajů vyvozujeme, že procenta zbytkové aktivity po inkubaci s DFP podle příkladu 6 mohou sloužit jako jednoduchý předběžnv test pracího účinku lipolvtického enzymu z kteréhokoli zdroje.

Příklad 8

Srovnání lipolytické aktivity Fusarium solani pisi a Lipolázy (TM).

Lipolytická aktivita kutinázy z Fusarium solani pisi izolované podle příkladu 2 byla porovnána s lipolytickou aktivitou Lipolázy (TM) a lipázy Humicola lanuginosa, komerčně dodávané z Novo Nordisk A/S

Testované látky vyrobené z tkané a pletené bavlny byly znečištěny čistým olivovým olejem. Každá testovaná látka byla poté inkubována v 30 ml prací tekutiny v 100 ml polystyrénové láhvi. Láhve byly třepány v pračce Miele TMT naplněné vodou a spuštěné na 30°C hlavní prací program. Prací tekutina obsahovala 2 gramy pracího prášku na litr (při 6°FH) majícího následující složení (ve váhových %) neiontové smáčedlo C₁₂-C₁₅ alkohol 10,5-13EO 9,5 síran sodný 38,6 uhličitan sodný 40,4 silikát sodný (Na₂O:Si₂O - 2,4) 7,3 voda 4,2

Zbylá mastnota byla určena ihned po prvním cyklu po vysušení testovaných látek v bubnové sušičce při okolní teplotě. Testované látky byly extrahovány v Soxhletově přístroji petroletherem. Poté bylo množství mastnoty určeno vážením a vyjádřeno jako procento mastnoty na tkanině. Výsledky jsou uvedeny na obr. 12.

Na tomto obrázku můžeme pozorovat, že Lipoláza (TM) nevykazuje v porovnání s kontrolním vzorkem žádné zlepšení v

-36odstraňování olivového oleje. V našem pokuse se její příspěvek zdál lehce negativní, ale tomuto údaji se nepřikládá žádný význam. Na druhé straně kutináza vykazuje jasný prací účinek.

Příklad 9

Účinek jednoho praní- s kutinázou Fusarium solani pisi a Lipolázou (TM) při různém druhu znečištění.

Testované látky vyrobené z bavlny byly znečištěny podzemnicovým olejem, oleyl-oleátem a směsí těchto dvou tuků v poměru 50:50. Prací prášek a prací podmínky byly stejné jako v příkladě 8. Prací účinek po jediném praní byl vyhodnocen změřením indexu odrazu při 460 nm. Výsledky poskytuje obrázek 13.

Na tomto obrázku můžeme pozorovat, že prací účinek detergentní směsi obsahující kutinázu na několik druhů olejových znečištění je trvale lepší než účinek směsi obsahující Lipolázu (TM). Tento účinek se nejvýrazněji projevil v případě podzemnicového oleje.

Příklad 10

Účinek kutinázy Fusarium. solani pisi a Lipolázy (TM) při několika hladinách enzymů měřený po každém pracím cyklu.

Byl v podstatě zopakován příklad 9, avšak testované tkaniny byly znečištěny LS-3, což je emulze z 75 g podzemnicového oleje, 40 g emulzifikátoru, 125 g AS-8 a 125 g sušeného mléka. Po prvním praní byly testované tkaniny znovu znečištěny a opět vyprány. Tento postup byl několikrát opakován. Účinek kutinázy a Lipolázy (TM) byl měřen po každém pracím cyklu při hladině enzymů 1, 3, 5 a 10 LU na ml prací tekutiny. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 14 A-D.

Z těchto pokusů může být vyvozeno několik závěrů. Je jasné, že kutináza vykazuje značný účinek v jediném praní při všech hladinách enzymu, zatímco Lipoláza (TM) vykazuje pouze mírný prací účinek v jediném praní při nejvyšší hladině enzymu 10 LU/ml. Výhodnost kutinázy proti Lipoláze (TM) po prvním praní je stejná pro všechny čtyři prací cykly.

-37 Příklad 11

Účinek kutinázy Fusarium solani pisi, lipázy z Pseudomonas gladioli a Lipolázy (TM).

Testované látky z 67% polyesteru a 33% bavlny byly vyprány s použitím detergentního výrobku uvedeného níže v množství 5 g/1 a důkladně vymáchány. Byly nastříhány na kouskv 7,5 x 7,5 cm a obroubeny. Deset takovýchto neznečištěných látek (celková hmota okolo 6,5 g) bylo vypráno v 75 ml prací tekutiny obsahující detergentní výrobek uvedený níže v dávce 5 g na litr při 6°FH. Do prací tekutiny byly předem přidány v dávce 1 LU/ml lipáza z Pseudomonas gladioli, Lipoláza nebo kutináza z Fusarium solani pisi. Lipáza z Pseudomonas gladioli byla získána podle postupu popsaného v EP-A-205 208 a EP-A-206 390 (obojí Unilever). Prací tekutina a látky byly vpraveny do malých lahviček, které byly 30 minut třepány v pračce Lavamat AEG v 30°C. Prací prášek měl následující složení (ve váhových %):

coco-primary alkylsulfát 5,2 neiontové smáčedlo C₁₃-C_1S alkohol 7EO 5,2 neiontové smáčedlo C₁₃-C₁₅ alkohol 3EO 6,6 zeolit 4A *) 32,00 uhličitan sodný 11,52 silikát sodný 0,45 tvrzené lojové mýdlo 2,00

Počáteční pH bylo ve všech případech kolem 10. Na konci praní byly tkaniny do sucha vyždímány a máchány v 300 ml vody po dobu přibližně půl minuty. Tento postup byl opakován třikrát. Poté byly látky důkladně vyždímány a sušeny v okolních podmínkách.

Polovina usušených tkanin byla znečištěna olivovým olejem a ponechána po tři dny. Hmota olejové nečistoty, která byla zpočátku přibližně 5% hmotnosti, byla určena zvážením. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 15.

Je zjevné, že Lipoláza (TM) nepřispívá k odstranění mastných nečistot při jediném praní. Účinek Lipolázy (TM) se objevuje až při opakovaném praní. Lipáza P. gladioli má malý ale významný prací účinek po prvním praní a jasnou výhodu po dalších pracích cyklech.

-38Kutináza přispívá k odstranění mastných nečistot již v prvním pracím cyklu a tuto výhodu si podržuje i v dalších pracích cyklech.

Příklad 12

Účinek kutinázy z Fusarium solani pisi, lipázy z Pseudomonas gladioli a Lipolázy (TM). _

Byl zopakován příklad 11 s použitím následujících čisticích prostředků v koncentraci 5 g/1:

coco-primary alkylsulfát 1,7 neiontové smáčedlo C₁₃-C₁₅ alkohol 7EO 6,8 neiontové smáčedlo C₁₃-C₁₅ alkohol 3EO 8,5 zeolit 4A ') 32,00 uhličitan sodný 11,52 silikát sodný 0,45 tvrzené lojové mýdlo 2,00 ²) zeolit MAP označuje maximální aluminiový zeolit P. Je to typ zeolitu podrobně popsaný v EP-A-384 070 (Unilever).

Výsledky jsou uvedeny na obrázku 16. Obrázek ukazuje, že obě lipázy nepřispívají k odstranění olejových nečistot ani po prvním praní, ani po dalších pracích cyklech. Kutináza však vykazuje značný prací účinek po prvním pracím cyklu.

Příklad 13 z

Účinek kutinázy Fusarium solani pisi, lipázy z Pseudomonas gladioli a Lipolázy (TM).

Byl zopakován příklad 12 ale s opětovným znečištěním mezi jednotlivými pracími cykly. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 17. U Lipolázy (TM) a lipázy P. gladioli je pozorován malý účinek po druhém pracím cyklu. Kutináza snižuje množství olejové nečistoty na minimum již v prvním pracím cyklu. Následující prací cykly vedou k dalšímu snížení olejových nečistot dokonce i po opakovaném znečištění.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Enzymatický čisticí prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) 0,1 - 50 % hmotnosti smáčedlový systém obsahující (al) 0-95% hmotnosti jeden nebo více aniontových smáčedel (a2) 5 -100% hmotnosti jednoho nebo více neiontových smáčedel, a (b) 10 - 20,000 LU eukaryotické kutinázy (lipázová jednotka je definována v EP-A-258 068) na gram detergentní směsi.
2. 2. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 1, vyznačující setí m, že obsahuje enzym schopný odstranit nejméně o 5% více, spíše však nejméně o 10% více mastných nečistot na základě počátečního množství mastných nečistot než ten samý čisticí prostředek bez tohoto enzymu.
3. 3. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 1, vyznačující se t í m, že poměr enzymatického odstranění mastných nečistot enzvmem v něm obsaženém k enzvmatickému odstranění mastných ·/ J 4 nečistot Lipolázou (TM) je 3, spíše však nejméně 5.
4. 4. Enzymatický čisticí prostředek podle některého z předchozích nároků, vyznačující se tím, že enzymem vykazujícím lipolytickou aktivitu je v něm lipolytický enzym mající po 10 minutách inkubace s diisopropyl-fluorfosfátem při teplotě místnosti a pH 10 zbytkovou aktivitu menší než 50%, spíše menší než 40% a ještě lépe menší než 25%.
5. 5. Enzymatický čisticí prostředek podle některého z předchozích nároků, vyznačující se tím, že obsahuje kutinázu z hub.
6. 6. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 5 vyznačující se t í m, že obsahuje houbovou kutinázu mající stonkovou specificitu.

   -407. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 5, vyznačující se t í m, že je v něm kutináza vybraná ze skupiny složené z Fusarium solani pisi, Fusarium roseum culmorum, Rhizoctonia solani a Alternaria brasicicola (PNBáza I).
7. 8. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 5, v yznačující se t í m, že enzymem je kutináza získaná z organismu Fusarium.
8. 9. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 5, vyznačující se t í m, že enzymem je kutináza odvozená od Fusarium solani pisi.
9. 10. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 5, vyznačující se t í m, že enzym reaguje v imunologické křížové reakci s protilátkami vypěstovanými proti kutináze odvozené z Fusarium solani pisi.
10. 11. Enzymatický čisticí prostředek podle některého z předchozích nároků, vyznačující se tím, že neobsahuje aniontová smáčedla.
11. 12. Enzymatický čisticí prostředek podle některého z nároků 1 - 10, vyznačující se tím, že aniontovým smáčedlem je v něm síran primárního alkoholu.
12. 13. Enzymatický čisticí prostředek podle nároku 12, vyznačující se t í m, že aniontovým smáčedlem je v něm síran primárního alkoholu C₁₂-C₁₅.
13. 14. Způsob čištění znečištěných tkanin vyznačující se tí m, že obsahuje krok (a) praní znečištěných tkanin ve vodném roztoku tohoto čisticího prostředku podle některého z předcházejících nároků a (b) sušení těchto látek pomocí teplého vzduchu.