CZ20033078A3 - Polypeptid s aktivitou P450 monooxygenázy, nukleová kyselina kódující tento polypeptid a způsob přípravy emamektinu - Google Patents

Description

Polypeptid s aktivitou P450 monooxygenázy, nukleová kyselina kódující tento polypeptid a způsob přípravy emamektinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti agrochemikálií, a to zejména insekticidů. Konkrétně se tento vynález týká přípravy derivátů avermektinu, zejména za účelem syntézy emamektinu.

Dosavadní stav techniky

Emamektin je silný insekticid působící proti mnoha škůdcům, jako jsou např. třásněnky, vrtalky a housenky můr, jako je např. žluťásek, blýskavka červivcová, kovolesklec cizokrajný, černopáska bavlníková, housenky můrovitých jako např. osenice, zápředníček polní, černopáska Heliothis virescens, černopáska americká a motýlek makadlovka. Emamektin (4''-deoxy-4''-epi-N-metylamino-avermektin Bla/Blb) je popsán v patentu USA č. 4 874 749 a v práci Cvetovich, T.R. et al, J. Organic. Chem. 59: 7704-7708, 1994 (jako MK-244).

Patent USA č. 5 288 710 popisuje soli emamektinu, které jsou agrochemicky zvláště cenné. Tyto soli emamektinu jsou cennými pesticidy, zejména při boji s hmyzem a zástupci řádu Acarína. Někteří škůdci, v boji proti nimž se emamektin osvědčil, jsou uvedeni v evropské patentové přihlášce

EP-A 736 252.

• ·

- 2 Jednou z nevýhod využití emamektinu je obtížnost jeho syntézy z avermektinu. Je to dáno prvním krokem tohoto procesu, který je nejdražším a časově nejnáročnějším krokem v přípravě emamektinu a v němž je třeba 4'^z-karbinolovou skupinu avermektinu oxidovat na keton. Oxidace 4''-karbinolové skupiny je problematická díky přítomnosti dvou dalších hydroxylových skupin na molekule, které musí být před oxidací chemicky chráněny a po oxidaci musí být tato ochrana zrušena. Tento krok tedy značně zvyšuje celkové náklady a čas přípravy emamektinu z avermektinu.

Vzhledem k účinnosti a potenciálu emamektinu jako insekticidu vznikla potřeba vyvinout finančně a časově úsporný způsob a/nebo reagencii pro regioselektivní oxidaci 4''-karbinolové skupiny avermektinu na 4''-keto-avermektin, který je nutným mezičlánkem přípravy emamektinu z avermektinu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje novou rodinu P450 monooxygenáz, jejíž všechny členy jsou schopny regioselektivně oxidovat 4''-karbinolovou skupinu nechráněného avermektinu, z čehož vyplývá levný a účinný způsob přípravy 4^z'-ketoavermektinu, nutného mezičlánku přípravy emamektinu. Tento vynález umožňuje odstranění drahých a časově náročných kroků (1) chemické ochrany dvou dalších hydroxylových skupin na molekule avermektinu před oxidací 4^zz-karbinolové skupiny, jež musí být chemicky chráněny před oxidací; a (2) odstranění chemické ochrany těchto dvou dalších hydroxylových skupin po oxidaci. Tento vynález tak poskytuje reagencie a postupy • ·

umožňující výrazné snížení celkových nákladů na přípravu emamektinu z avermektinu.

• Předkládaný vynález tedy v jednom aspektu poskytuje purifikovanou molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivnš oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

• V jednom specifickém provedení se předkládaný vynález týká purifikované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin, přičemž tento polypeptid vykazuje velkou podobnost, výhodně shodu v aminokyselinové sekvenci od nejméně 50 % do 99 % se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, přičemž každá jednotlivá hodnota tohoto rozmezí mezi 50% a 99% je také součástí tohoto vynálezu.

• V dalším specifickém provedení se předkládaný vynález týká purifikované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, jež kóduje polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin, přičemž tento polypeptid je imunologicky reaktivní na protilátky připravené proti polypeptidu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2.

• Předkládaný vynález dále poskytuje purifikovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci

a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1;

b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

• ·

- 4 s (a) či její komplementární

c) schopnou hybridizovat sekvencí;

d) schopnou hybridizovat s molekulou nukleové kyseliny obsahující 50 až 200 či více po sobě následujících nukleotidů nukleotidové sekvence uvedené jako SEKV. ID. Č. 1 či její komplementární sekvencí;

e) komplementární k (a), (b) či (c);

f) která je zpětně (reverzně) sekvence (a), (b) či (c), nebo komplementární sekvencí

g) která je funkční součástí (a), (b), (c) , (d), (e) či (f) kóduj ící polypeptid, který enzymatickou aktivitu regioselektivně oxiduje avermektin.

stále ještě vykazuje P450 monooxygenázy a avermektin na 4''-ketoV jednom specifickém provedení se předkládaný vynález týká purifikované molekuly nukleotidovou sekvenci, vykazuje enzymatickou nukleové kyseliny obsahující která kóduje aktivitu P450 regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin, přičemž tento polypeptid vykazuje podstatnou podobnost a výhodně má 60% až 99% aminokyselinovou sekvenční shodu s polypeptidy o sekvenci SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, polypeptid, jenž monooxygenázy a

SEKV. ID. Č.	6,	SEKV,	. ID	. Č.	8, SEKV.	ID. Č. 10, SEKV.	ID.
Č. 12, SEKV.	ID.	Č.	14,	SEKV	. ID. Č.	16, SEKV. ID. Č.	18,
SEKV. ID. Č.	20,	SEKV	. ID	. Č.	22, SEKV.	ID. Č. 24, SEKV.	ID.
Č. 26, SEKV.	ID.	Č.	28,	SEKV	. ID. Č.	30, SEKV. ID. Č.	32,

SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95, přičemž každá jednotlivá hodnota v tomto rozmezí mezi 60 % a 99 % je také součástí tohoto vynálezu.

V dalším specifickém provedení se předkládaný vynález týká purifikované molekuly nukleotidovou sekvenci, vykazuje enzymatickou nukleové kyseliny obsahující která kódující polypeptid, jenž monooxygenázy a -keto-avermektin, aktivitu P450 regioselektivně oxiduje avermektin na 4 přičemž tento polypeptid je imunologicky reaktivní na protilátky připravené proti polypeptidům o sekvenci SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8,

SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID.

Č. 16, SEKV. ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID.

Č. 30, SEKV. ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95.

• Předkládaný vynález dále poskytuje purifikovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci

a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94;

b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

c)	schopnou sekvencí;	hybridizovat	s (a) či	její	komplementární
d)	schopnou	hybridizovat	s molekulou	nukleové kyseliny
	obsahuj ící	50 až 200	či více po	sobě	následuj ících
	nukleotidů	o nukleotidové sekvenci uvedené	jako SEKV. ID.

Č. 1, SEKV.	ID.	Č. 3, SEKV	. ID.	Č. 5,	SEKV. ID.	Č.	7,
SEKV. ID. Č.	9,	SEKV. ID. Č	• Ha	SEKV.	ID. Č. 13,	SEKV.
ID. Č. 15, SEKV.	ID. Č. 17,	SEKV.	ID. Č.	19, SEKV.	ID.	Č.

21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27,

Φ· ·· · · ·· ···« ···· ·· ·» · · · • »· · · · φ · ···· · · · · · · • · · · · · · · · φφφφ φφ ··· ··· ·· ··

- 6 SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94 nebo sekvenci k ní komplementární;

e) komplementární k (a), (b) či (c);

f) která je zpětně komplementární sekvencí sekvence (a), (b) či (c), nebo

g) která je funkční součástí (a), (b), (c), (d) , (e) či (f) kódující polypeptid, který stále ještě vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a re.gioselektivně oxiduje avermektin na 4''-ketoavermektin.

• V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 66% až 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1, přičemž každá jednotlivá hodnota tohoto rozmezí mezi 66 % a 99 % je také součástí tohoto vynálezu.

V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 70% až 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1,

SEKV. ID. Č. 3,	SEKV	. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7,	SEKV. ID. Č.
9,	SEKV. ID. Č.	11,	SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID.	Č. 15, SEKV.
ID.	Č. 17, SEKV	. ID	. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21,	SEKV. ID. Č.
23,	SEKV. ID. Č.	25,	SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID.	Č. 29, SEKV.
ID.	Č. 31, SEKV.	ID.	Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94,	přičemž každá

% a 99 % je také jednotlivá hodnota tohoto rozmezí mezi 70 součástí tohoto vynálezu.

• V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 80% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č.

• 4 ···· *··* »··· ·» · • «· · · · · · ···· · · · · · · ··· · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ··

- Ί -

17, SEKV. ID. Č.	19,	SEKV. ID	. Č. 21, SEKV.	ID.	Č. 23, SEKV.
ID. Č. 25, SEKV.	ID	. Č. 27,	SEKV. ID. Č.	29,	SEKV. ID. Č.
31, SEKV. ID. Č.	33	či SEKV.	ID. Č. 94.

• V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 90% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID.

Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV.

ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č.

17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č.

31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94.

• V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 95% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID.

Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV.

ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č.

17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č.

31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94.

• V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č.

11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV.

ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č.

25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV.

ID. Č. 33 a SEKV. ID. Č. 94.

• V určitých provedeních je molekula nukleové kyseliny izolována z kmene Streptomyces. V některých provedeních je tento kmen Streptomyces vybrán ze skupiny tvořené • · · · · ·

- 8 Streptomyces

Streptomyces

Streptomyces

Streptomyces tubercidicus, Streptomyces lydicus, platensis, Streptomyces chattanoogensis, kasugaensis, Streptomyces rimosus a albofaciens.

• V některých provedeních z tohoto hlediska nukleová kyselina dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující značku vázanou na P450 monooxygenázu kovalentní vazbou. V určitých provedeních je značka vybrána se skupiny značek His, GST, HA, HSV, Myc a VSV-G.

• V jiném aspektu poskytuje předkládaný vynález purifikovaný polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxidující avermektin na 4''-keto-avermektin.

• V některých provedeních polypeptid obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která je kódována molekulou nukleové kyseliny

a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1 či její komplementární sekvencí;

b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

c) schopnou hybridizovat s (a) či její komplementární sekvencí;

d) schopnou hybridizovat s molekulou nukleové kyseliny obsahující 50 až 200 či více po sobě následujících nukleotidů nukleotidové sekvence uvedené jako SEKV. ID. Č. 1 či její komplementární sekvencí;

e) komplementární k (a), (b) či (c) ;

f) která je zpětně komplementární sekvencí sekvence (a), (b) či (c), nebo

g) která je funkční součástí (a) , (b) , (c) , (d) , (e) či (f) kódující polypeptid, který stále ještě vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-ketoavermektin.

V některých provedeních polypeptid obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 50% až 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, přičemž každá jednotlivá hodnota tohoto rozmezí 50% až 99% je také součástí tohoto vynálezu.

• V některých provedeních polypeptid obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která je kódována molekulou nukleové kyseliny

a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID.

Č. 5, SEKV. ID.	Č. 7, SEKV. ID.	Č. 9, SEKV	. ID.	Č. 11,
SEKV. ID. Č. 13,	SEKV. ID. Č. 15	, SEKV. ID.	Č. 17,	SEKV.
ID. Č. 19, SEKV.	ID. Č. 21, SEKV.	ID. Č. 23,	SEKV.	ID. Č.
25, SEKV. ID. Č.	27, SEKV. ID.	Č. 29, SEKV	. ID.	Č. 31,
SEKV. ID. Č.	33 či SEKV.	ID. Č. 94	nebo	její

komplementární sekvencí;

b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

c) schopnou	hybridizovat	s	(a)	či	její komplementární
sekvencí;
d) schopnou	hybridizovat	s	molekulou	nukleové kyseliny
obsahuj ící	50 až 200	či	více	po	sobě následujících
nukleotidů	nukleotidové	sekvence	uvedené jako SEKV. ID.

Č. 1, SEKV. ID.	Č. 3, SEKV. ID.	Č. 5,	SEKV. ID.	Č.	7,
SEKV. ID. Č. 9,	SEKV. ID. Č. 11,	SEKV.	ID. Č. 13,	SEKV.
ID. Č. 15, SEKV.	ID. Č. 17, SEKV.	ID. Č.	19, SEKV.	ID.	, Č.
21, SEKV. ID. Č.	. 23, SEKV. ID. Č	. 25,	SEKV. ID.	Č.	27,

• · · · · • · · · · · • · · · · · ··· ··· ·· · ·

SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94 či její komplementární sekvence, nebo s její komplementární sekvencí;

e) komplementární k (a), (b) či (c);

f)	která je zpětně komplementární sekvencí či (c), nebo	sekvence (a),	(b)
g)	která je	funkční součástí (a),	(b), (c)	, (d) ,	(e) či	(f)
	kóduj ící	polypeptid, který	stále	ještě	vykazuj e

enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivnš oxiduje avermektin na 4''-ketoavermektin.

• V některých provedeních P450 monooxygenáza obsahuje či je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 60% až 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10,

SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID.

Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID.

Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95, přičemž každá jednotlivá hodnota tohoto rozmezí 60% až 99% je také součástí tohoto vynálezu.

• V některých provedeních P450 monooxygenáza obsahuje či je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 70% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č.

4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV.

ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č.

18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č.

32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95.

• V některých provedeních P450 monooxygenáza obsahuje či je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 80% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č.

4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV.

ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č.

18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č.

32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95.

• V některých provedeních P450 monooxygenáza obsahuje či je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 90% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č.

4,	SEKV. ID. Č.	6,	SEKV. ID. Č. 8,	SEKV.	ID.	Č. 10, SEKV.
ID.	Č. 12, SEKV.	ID	. Č. 14, SEKV.	ID. Č.	16,	SEKV. ID. Č.
18,	SEKV. ID. Č.	20,	SEKV. ID. Č. 22	SEKV.	ID.	Č. 24, SEKV.
ID.	Č. 26, SEKV.	ID	. Č. 28, SEKV.	ID. Č.	30,	SEKV. ID. Č.
32,	SEKV. ID. Č.	34	či SEKV. ID. Č.	95.

• V některých provedeních P450 monooxygenáza obsahuje či je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 95% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č.

4,	SEKV. ID. Č.	6,	SEKV. ID. Č. 8,	SEKV.	ID.	Č. 10, SEKV.
ID.	Č. 12, SEKV.	ID	. Č. 14, SEKV.	ID. Č.	16,	SEKV. ID. Č.
18,	SEKV. ID. Č.	20,	SEKV. ID. Č. 22	, SEKV.	ID.	Č. 24, SEKV.
ID.	Č. 26, SEKV.	ID	. Č. 28, SEKV.	ID. Č.	30,	SEKV. ID. Č.
32,	SEKV. ID. Č.	34	či SEKV. ID. Č.	95.

• V některých provedeních z tohoto hlediska P450 monooxygenáza z předkládaného vynálezu obsahuje či je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22,

SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 a SEKV. ID. Č. 95.

• V určitých provedeních polypeptid podle předkládaného vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy dále obsahuje značku. V některých provedeních je značka vybrána se skupiny značek His, GST, HA, HSV, Myc a VSV-G.

• V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje vazebnou látku, jež specificky váže polypeptid podle tohoto vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, který regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

V některých provedeních je touto vazebnou látkou protilátka.

V určitých provedeních je protilátkou polyklonální. protilátka či monoklonální protilátka.

• Z dalšího hlediska poskytuje předkládaný vynález rodinu polypeptidů P450 monooxygenázy, přičemž každý člen této rodiny regioselektivně oxiduje avermektin na 4' '-ketoavermektin .

• V určitých provedeních každý člen této rodiny obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 50% až 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, přičemž každý člen tohoto rozmezí 50 % až 99 % je také součástí tohoto vynálezu.

• V určitých provedeních každý člen této rodiny obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 60% až 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV.

ID. Č. 4,	SEKV.	ID. Č.	6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV.	ID. Č.	10,
SEKV. ID.	Č. 12,	SEKV.	ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16	, SEKV.	ID.
Č. 18, SEKV. ID.	. Č. 20	, SEKV. ID. Č. 22, SEKV.	ID. Č.	24,
SEKV. ID.	Č. 26,	SEKV.	ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30	, SEKV.	ID.

Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95, přičemž každý

člen tohoto rozmezí 60 % až 99 % je také součástí tohoto vynálezu.

• V určitých provedeních každý člen této rodiny obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 70% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č.

4,	SEKV. ID. Č.	6,	SEKV. ID. Č. 8,	SEKV.	ID.	Č. 10, SEKV.
ID.	Č. 12, SEKV.	ID	. Č. 14, SEKV.	ID. Č.	16,	SEKV. ID. Č.
18,	SEKV. ID. Č.	20,	SEKV. ID. Č. 22	:, SEKV.	ID.	Č. 24, SEKV.
ID.	Č. 26, SEKV.	ID	. Č. 28, SEKV.	ID. Č.	30,	SEKV. ID. Č.
32,	SEKV. ID. Č.	34	či SEKV. ID. Č.	95.

V určitých provedeních každý člen této rodiny obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 80% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č.

ID

C. 12, SEKV.

16, SEKV. ID. C.

SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV.

ID. Č. 26, SEKV. ID 32, SEKV. ID. Č. provedeních každý v podstatě tvořen

Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č.

nejméně 90% shodu se sekvencí SEKV.

či SEKV. ID. C člen této rodiny obsahuje nebo aminokyselinovou sekvencí, která

95.

V určitých je ma

4, SEKV. ID. Č,

SEKV. ID. C.

ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. SEKV. ID. Č. 10, SEKV.

ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č.

18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č.

32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95.

• V určitých provedeních každý člen této rodiny obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 95% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č.

t

- 14 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95.

V některých provedeních každý člen této rodiny z tohoto hlediska obsahuje nebo je tvořen aminokyselinovou sekvencí

vybranou ze	skupiny sekvencí SEKV. ID.	Č. 2	, SEKV. ID. Č.	4,
SEKV. ID. Č.	6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV.	ID.	Č. 10, SEKV.	ID.
Č. 12, SEKV.	, ID. Č. 14, SEKV. ID. Č.	16,	SEKV. ID. Č.	18,
SEKV. ID. Č.	20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV.	ID.	Č. 24, SEKV.	ID.
Č. 26, SEKV.	, ID. Č. 28, SEKV. ID. Č.	30,	SEKV. ID. Č.	32,
SEKV. ID. Č.	34 a SEKV. ID. Č. 95.

V dalším aspektu poskytuje geneticky upravenou tak, že kyseliny kódující polypeptid, aktivitu P450 monooxygenázy avermektin na 4''-keto-avermektin.

předkládaný vynález buňku obsahuje molekulu nukleové který vykazuje enzymatickou a regioselektivně oxiduje • V některých provedeních je molekula nukleové kyseliny vnesena do buňky k expresi. V určitých provedeních je v buňce dále molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu, která kóduje polypeptid podle tohoto vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu proteinu ferredoxin.

• V některých provedeních je v buňce dále molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle předkládaného vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu proteinu reduktázy ferredoxinu.

• V určitých provedeních je buňka z geneticky upraveného kmene Streptomyces. V jistých provedeních je buňka z geneticky upraveného kmene Streptomyces lividans. V určitých provedeních má geneticky upravený kmen Streptomyces lividans

označení NRRL (Designation No.) B-30478. V některých provedeních je buňka z geneticky upraveného kmene Pseudomonas. V některých provedeních je buňka z geneticky upraveného kmene Pseudomonas putida. V určitých provedeních má geneticky upravený kmen Pseudomonas putida označení NRRL (Designation No.) B-30479. V některých provedeních je buňka z geneticky upraveného kmene Escherichia coli.

• V jiném aspektu poskytuje předkládaný vynález purifikovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle tohoto vynálezu, jenž vykazuje enzymatickou aktivitu ferredoxinu, přičemž molekula nukleové kyseliny je izolována z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

• Ve specifickém provedení se předkládaný vynález týká purifikované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, přičemž tento polypeptid vykazuje podstatnou podobnost a výhodně má nejméně 80% až 99% shodu v aminokyselinové sekvenci s polypeptidem o sekvenci SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38 a přičemž každý člen tohoto rozmezí 80 % až 99 % je také součástí tohoto vynálezu.

• V dalším specifickém provedení se předkládaný vynález týká purifikované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, přičemž tento polypeptid je imunologicky reaktivní na protilátky připravené proti polypeptidu o sekvenci SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38.

• Předkládaný vynález dále poskytuje purifikovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci

a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37;

b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

c) schopnou hybridizovat s (a) či její komplementární sekvencí;

d) schopnou hybridizovat s molekulou nukleové kyseliny obsahující 50 až 200 či více po sobě následujících nukleotidů nukleotidové sekvence uvedené jako SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37 nebo její komplementární sekvencí;

e) komplementární k (a), (b) či (c);

f) která je zpětně komplementární či (c), nebo sekvencí sekvence (a), (b) která je funkční součástí kódující polypeptid, enzymatickou aktivitu oxiduje avermektin na 4''

g) (a) , (b) , (c) , (d) , (e) či (f) který stále ještě vykazuje ferredoxinu a regioselektivně -keto-avermektin.

• V určitých provedeních molekula nukleové kyseliny kódující ferredoxin podle předkládaného vynálezu obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 81% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37. V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 85%, nebo nejméně 90%, či nejméně 95% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37. V určitých provedeních molekula nukleové kyseliny kódující ferredoxin podle tohoto vynálezu obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny o sekvenci SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37.

• 0 • · 0 0 0 0 « · · · · ·

- 17 • · · 0· • V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález purifikovaný protein ferredoxin, přičemž protein ferredoxin je izolován z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin. V určitých provedeních ferredoxin podle tohoto vynálezu obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 80% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38. V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 85%, nebo nejméně 90%, nebo nejméně 95%, nebo nejméně 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38.

• Ve zvláštních provedeních ferredoxin z předkládaného vynálezu obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38.

• V jiném aspektu poskytuje předkládaný vynález purifikovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle tohoto vynálezu, jenž vykazuje enzymatickou aktivitu reduktázy ferredoxinu, přičemž molekula nukleové kyseliny je izolována z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

• V určitých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle předkládaného vynálezu, jenž vykazuje enzymatickou aktivitu reduktázy ferredoxinu, obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny o sekvenci SEKV. ID. Č. 98, SEKV. ID. Č. 100, SEKV. ID. Č. 102 či SEKV. ID. Č. 104.

• V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález purifikovaný polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu proteinu ·· ···»

- 18 reduktáza ferredoxinu, přičemž polypeptid je izolován z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin. V určitých provedeních polypeptid podle tohoto vynálezu obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí SEKV. ID. Č. 99, SEKV. ID. Č. 101, SEKV. ID. Č. 103 či SEKV. ID. Č. 105.

• V jiném aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob přípravy sloučeniny vzorce (I)

kde

Ri-Rg představují, nezávisle na sobě, atom vodíku nebo substituent;

m j e 0, 1 nebo 2;

n je 0, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousední uhlíkové atomy jsou spojené dvojnou vazbou,

A A AAAA

AAA

- 19 jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce , či jednoduchou vazbou s metylenovým můstkem

H, vzorce zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě či ve formě soli, přičemž tento postup zahrnuje

1) přivedení sloučeniny vzorce (II)

kde

R1-R7, m, η, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (I) uvedeném výše, do kontaktu s polypeptidem podle předkládaného vynálezu, který je schopen regioselektivně • fc ···· • fc fcfc fcfc

- 20 aby vznikla sloučenina » 9 <

> · · 4 • fc *· oxidovat alkohol v pozici 4' ', vzorce (III)

kde Ri, R₂, R₃z R4, Rsz Rez R7z m, n, stejný význam jako ve vzorci (I); a

A, B, C, D, E a F mají

2) reakci sloučeniny vzorce (III) s aminem vzorce kde R₈ a R_g mají stejný význam jako ve vzorci (I) a znám, za přítomnosti redukujícího činidla;

HN(Rg)Rg, který je a, v každém případě, pokud je to žádoucí, převedení sloučeniny vzorce (I), kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomeru E/Z či jeho tautomeru, v každém případě ve volné formě nebo ve formě soli, na odlišnou sloučeninu vzorce (I) nebo izomer E/Z či jeho tautomer, v každém případě ve volné formě nebo ve formě soli, rozdělení směsi izomerů E/Z, kterou lze získat tímto postupem, a izolaci požadovaného izomeru a/nebo převedení volné sloučeniny vzorce (I), kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomeru E/Z či jeho tautomeru na sůl nebo převedení soli sloučeniny vzorce (I),

- 21 • 4 • 4·

4*4

44 4 4 kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomeru E/Z či jeho tautomeru na volnou sloučeninu vzorce (I) nebo na izomer E/Z či jeho tautomer, nebo na jinou sůl.

• V některých provedeních je sloučenina vzorce (II) dále přivedena do kontaktu s polypeptidem podle předkládaného vynálezu vykazujícím enzymatickou aktivitu ferredoxinu.

V určitých provedeních je sloučenina vzorce (II) dále přivedena do kontaktu s polypeptidem podle tohoto vynálezu vykazujícím enzymatickou aktivitu reduktázy ferredoxinu.

V některých provedeních je sloučenina vzorce (II) dále přivedena do kontaktu s redukčním činidlem (např. NADH či NADPH).

• V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález způsob přípravy sloučeniny vzorce (III)

(III), kde R_x, R₂, R₃, stejný význam, zahrnuj e

R^z Rsz h-6z R7, řn, n jako ve vzorci (I),

A, B, C, D, přičemž tento

E a F mají postup ·· · · · · ···· ··

- 22 1) přivedení sloučeniny vzorce (II)

kde

R1-R7, m, η, Ά, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (I) uvedeném výše, do kontaktu s polypeptidem podle tohoto vynálezu, který je schopen regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4'' a udržet tento kontakt po dobu postačující k oxidační reakci, a dále izolaci a purifikaci sloučeniny vzorce (II).

• V ještě dalším provedení poskytuje předkládaný vynález postup podle předkládaného vynálezu pro přípravu sloučeniny vzorce (I), kde n je 1;

m je 1;

A je dvojná vazba;

B je jednoduchá nebo dvojná vazba, C je dvojná vazba, » « • ·

D je jednoduchá vazba,

E je dvojná vazba,

F je dvojná vazba; nebo jednoduchá vazba s epoxidovým můstkem; nebo jednoduchá vazba s metylenovým můstkem;

Ri, R₂ a R₃ jsou H;

R₄ je metylová skupina;

R₅ je alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, Cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku či Alkenylová skupina obsahující 2 až 10 atomů uhlíku;

R₆ je atom vodíku;

R7 je skupina OH;

Rg a Rg jsou navzájem nezávisle atom vodíku; alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku či acylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku; nebo současně tvoří skupinu -(CH₂)_q-; a q je 4, 5 nebo 6.

• V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález způsob přípravy sloučeniny vzorce (I) podle tohoto vynálezu, kde n je 1;

m je 1;

A, B, C, E a F jsou dvojné vazby;

D je jednoduchá vazba;

Ri, R₂, a R3 jsou atom vodíku;

R₄ je metylová skupina;

R₅ je s-butylová či izopropylová skupina;

R₆ je atom vodíku;

·« ··· ·

- 24 I ·« • · 4 • ··

R₇ je skupina OH;

R₈ je metylová skupina;

R_g je atom vodíku.

• V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález způsob přípravy benzoátové soli 4' ' -deoxy-4' '-N-metylaminoavermektinu Bi_a/B_lb.

V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob přípravy emamektinu. Postup zahrnuje přidání polypeptidu podle tohoto vynálezu vykazujícího enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, který regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin, k reakční směsi obsahující avermektin a inkubaci reakční směsi za podmínek umožňujících polypeptidu regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-ketoavermektin. V některých provedeních reakční směs dále obsahuje polypeptid podle tohoto vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu. V určitých provedeních reakční směs dále obsahuje polypeptid podle tohoto vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu reduktázy ferredoxinu.

V některých provedeních reakční směs dále obsahuje redukční činidlo (např. NADH či NADPH).

• V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález kompozici pro přípravu sloučeniny vzorce (I) obsahující polypeptid podle tohoto vynálezu, který vykazuje aktivitu P450 monooxygenázy a který je schopen regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4'' tak, aby vznikla sloučenina vzorce (II). V některých provedeních tato kompozice dále zahrnuje polypeptid podle tohoto vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu (např. ferredoxin z buněk či kmene, ze kterých byla P450 monooxygenáza izolována či odvozena) .

·· ·»··

• · · · 99 ·· • ·· · · • · · · · · 9

9 9 9 9

9999 99 999 999

- 25 • V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález kompozici pro přípravu emamektinu obsahující P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin. V některých provedeních kompozice dále obsahuje ferredoxin (např. ferredoxin z buněk či kmene, ze kterých byla P450 monooxygenáza izolována či odvozena).

• V určitých provedeních kompozice dále obsahuje polypeptid podle předkládaného vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu reduktázy ferredoxinu (např. ferredoxin z buněk či kmene, ze kterých byla P450 monooxygenáza izolována či odvozena). V některých provedeních kompozice dále zahrnuje redukční činidlo (např. NADH či NADPH).

Popis obrázků

Obr. 1 představuje schématické znázornění mapy plasmidu rozpoznávaná uvedenými s jejich umístěním na geny (např.

uvedeny pTBBKA. Jsou označena místa restrikčními endonukleázami spolu plasmidové sekvenci. Jsou také kanamycinová rezistence KanR) a další funkční oblasti (např. promotor Tip) obsažené v plasmidu.

Obr. 2 představuje schématické znázornění mapy plasmidu pTUAlA. Jsou označena místa rozpoznávaná uvedenými s jejich umístěním na geny (např.

endonukleázami spolu sekvenci. Jsou také ampicilínová rezistence AmpR) a další funkční oblasti (např. promotor Tip) obsažené v plasmidu.

restrikčními plasmidové uvedeny • · · · · ·

- 26 Obr. 3 představuje schématické znázornění mapy plasmidu pRK-emal/fd.233. Tento plasmid byl odvozen ligací fragmentu BglII obsahujícího geny emal a fd233 organizované v jedinou transkripční jednotku do restrikčního místa pro BglII v plasmidu s širokým spektrem hostitelů pRK290. Geny emal/fd233 jsou exprimovány z promotoru tac (Ptač) a jsou následovány terminátorem tac (Ttac). Uvedená rozpoznávací místa pro restrikční endonukleázy jsou BglII B; EcoRI E; PacI Pc; Pmel Pm; a Sáli S.

Předkládaný vynález poskytuje rodinu polypeptidů vykazujících enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a schopných regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4'' na sloučenině vzorce (II), např. avermektinu, za účelem přípravy sloučeniny vzorce (III), avšak zejména 4''-keto-avermektinu.

Konkrétněji může být rodina polypeptidů podle tohoto vynálezu využita při přípravě sloučeniny vzorce (I)

kde

R_x-R₉ představují, nezávisle na sobě, atom vodíku nebo substituent;

m je 0, 1 nebo 2;

n je 0, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousedící uhlíkové atomy jsou spojeny dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce

Η O H nebo jednoduchou vazbou s metylenovým můstkem vzorce

zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě či ve formě soli, přičemž tento postup zahrnuje

1) přivedení sloučeniny vzorce (II)

kde

R1-R7, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (I) uvedeném výše, do kontaktu s polypeptidem vzorce (II) podle předkládaného vynálezu vykazujícím enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy oxidovat alkohol v pozici 4'' (III) a schopným regioselektivně za vzniku sloučeniny vzorce

R7 • · · ·

kde Ri, R₂, R₃, R4, R5, Rč, R7, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (I); a

2) reakci sloučeniny vzorce (III) s aminem vzorce HN(R₈)R₉, kde Rg a Rg mají stejný význam jako ve vzorci (I), a který je znám, za přítomnosti redukujícího činidla;

a, v každém případě, pokud je to žádoucí, převedení sloučeniny vzorce (I), kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomerů E/Z či jeho tautomeru, v každém případě ve volné formě nebo ve formě soli, na odlišnou sloučeninu vzorce (I) nebo izomer E/Z či jeho tautomer, v každém případě ve volné formě nebo ve formě soli, rozdělení směsi izomerů E/Z, kterou lze získat tímto postupem, a izolaci požadovaného izomerů a/nebo převedení volné sloučeniny vzorce (I), kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomerů E/Z či jeho tautomeru na sůl nebo převedení soli sloučeniny vzorce (I), kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomerů E/Z či jeho tautomeru na volnou sloučeninu vzorce (I) nebo na izomer E/Z či jeho tautomer, nebo na jinou sůl.

jsou popsaný postupy známé

Postupy v literatuře syntézy sloučenin vzorce (I Bylo však zjištěno, že z literatury způsobují značné problémy při této přípravě zejména díky nízkým výtěžkům a pracným procedurám, kterých je třeba využít. Proto nejsou známé postupy z tohoto hlediska vyhovující a vzniká potřeba mít k dispozici lepší postupy pro přípravu těchto sloučenin.

Sloučeniny (I), (II) a (III) mohou existovat ve formě tautomerů. Proto výše i níže v textu tam, kde je třeba, označují sloučeniny (I), (II) a (III) také odpovídající tautomery, i když to v textu není pro každý případ výslovně zmíněno.

»· · · · · »·«· · · kyselina kyseliny, karboxylové askorbová, (jablečná) ,

Sloučeniny (I) , (II) a (III) jsou schopné tvořit soli adicí kyselin. Tyto soli jsou tvořeny např. se silnými anorganickými kyselinami, jako jsou minerální kyseliny, např. kyselina chloristá, kyselina sírová, kyselina dusičná, dusitá a kyseliny fosforu nebo halogenvodíkové se silnými organickými karboxylovými kyselinami, substituovanými i nesubstituovanými, jako např. kyseliny substituované halogeny, Ci-C₄_alkankarboxylové kyseliny jako kyselina etanová (octová), nasycené či nenasycené dikarboxylové kyseliny jako kyselina etandiová (šťavelová), propandiová (malonová), butandiová (jantarová), cis-butendiová (maleinová), trans-butendiová (fumarová), benzen-1,2-di(ftalová), hydroxykarboxylové kyseliny jako hydroxypropanová (mléčná) , hydroxybutandiová 2,3-dihydroxybutandiová (vinná),

2-hydroxy-l,2,3-propantrikarboxylová (citrónová) či benzenkarboxylová (benzoová), nebo s organickými sulfonovými kyselinami, substituovanými či nesubstituovanými, jako např. kyseliny substituované halogeny, Ci-C₄-alkan- či arylsulfonové kyseliny jako metan- či p-toluensulfonová kyselina. Navíc sloučeniny vzorce (I), (II) a (III), které mají alespoň jednu kyselou skupinu, jsou schopny tvořit soli s bázemi. Vhodné soli s bázemi jsou např. soli kovů jako alkalických kovů či kovů alkalických zemin, např. soli sodíku, draslíku či hořčíku nebo soli s amoniakem či organickým aminem jako 4-iminooxan (morfolin), piperidin, pyrrolidin, a mono-, di- či tri- nižší alkylaminy jako etyl-, dietyl-, ťrietyl- či dimetylpropylamin, nebo mono-, di- či trihydroxy- nižší alkylamin jako mono-, diči trietanolamin. Navíc mohou být tvořeny odpovídající vnitřní soli. V předkládaném vynálezu se dává přednost agrochemicky výhodným solím. S ohledem na úzký vztah mezi sloučeninami vzorce (I), (II) a (III) ve volné formě a ve formě solí je ··

- 31 třeba chápat jakýkoli odkaz výše a níže v textu na tyto volné sloučeniny vzorce (I), (II) a (III) nebo na jejich odpovídající soli jako na obojí, tj . volné sloučeniny i soli, tam, kde je to žádoucí či očekávané. Totéž se týká tautomerů sloučenin vzorce (I), (II) a (III) a jejich solí. Obecně se ale v každém případě dává přednost volné formě.

V rámci předkládaného vynálezu je výhodný způsob přípravy sloučenin vzorce (I), kde n je 1;

m je 1;

A je dvojná vazba;

B je jednoduchá vazba či dvojná vazba,

C je dvojná vazba,

D je jednoduchá vazba,

E je dvojná vazba,

F je dvojná vazba; nebo jednoduchá vazba s epoxidovým můstkem; nebo jednoduchá vazba s metylenovým můstkem;

Ri, R₂ a R₃ jsou atom vodíku;

R₄ je metylová skupina;

R₅ je alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, cykloalkylová skupina obsahující 3 až 8 atomů uhlíku či alkenylová skupina obsahující 2 až 10 atomů uhlíku;

R₆ je atom vodíku;

R₇ je skupina OH;

Rg a Rg jsou nezávisle na sobě atom vodíku; alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku či acylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku; nebo spolu tvoří skupinu -(CH₂)_q-; a

Φ Φ φφφφ • φ φ φ φ φ φφ q je 4, 5 nebo β.

V rámci předkládaného vynálezu je zvláště výhodný způsob přípravy sloučenin vzorce (I) , kde n je 1;

m je 1;

A, B, C, E a F jsou dvojné vazby;

D je jednoduchá vazba;

R_x, R₂, a R3 jsou atom vodíku;

R₄ je metylová skupina;

R₅ je s-butylová či izopropylová skupina;

R₆ je atom vodíku;

R₇ je skupina OH;

Rg je metylová skupina

Rg je atom vodíku.

Zvláště výhodná je příprava emamektinu, konkrétněji benzoátové soli emamektinu. Emamektin je směs 4-deoxy-4-Nmetylamino-avermektinu B_la/B_lb a je popsán v patentu US-P-4 874 749 a jako MK-244 v časopise Journal of Organic Chemistry, sv. 59 (1994), 7704-7708. Soli emamektinu, které jsou zvláště agrochemicky výhodné, jsou popsány v patentu US-P-5 288 710. Každý člen této rodiny peptidů vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, jak je popsáno výše, je schopen regioselektivně v pozici 4' oxidovat nechráněný avermektin, čímž se otvírá nová a úspornější cesta k přípravě emamektinu.

» ··· ·

- 33 «0 00

Každý člen této rodiny katalyzuje reakci následuj ící

redukční aminací avermektin

4-keto-avermektin emamektin

Bia (R=CH₃) a Blb (R=H)

Bia (R=CH₃) a Blb (R=H) r=ch₃, h

Předkládaný vynález tedy poskytuje purifikovanou molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a je schopen regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4'' sloučeniny vzorce (II) jakou je avermektin, za účelem přípravy sloučeniny vzorce (III), ale zvláště 4''-keto-avermektinu.

Konkrétně poskytuje předkládaný vynález purifikovanou molekulu nukleové kyseliny kódující P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin. Molekula nukleové kyseliny označuje jednovláknové či dvouvláknové polynukleotidy jako deoxyribonukleovou kyselinu (DNA), ribonukleovou kyselinu (RNA) nebo analoga DNA či RNA.

Předkládaný vynález také poskytuje purifikovaný polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a schopný regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4' ' sloučeniny vzorce (II) jakou je avermektin za účelem přípravy sloučeniny vzorce (III), ale zvláště 4^z'-keto-avermektinu.

Konkrétně poskytuje předkládaný vynález také purifikovanou P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

·♦ 4 4 4 4

- 34 Tak, jak se zde používá, označuje purifikovaný molekulu nukleové kyseliny či polypeptid (např. enzym nebo protilátku) oddělené od složek, které je přirozeně provázejí. Příkladem takové požadované nukleotidové sekvence či úseku purifikovaného ze svého zdroje by byla nukleotidová sekvence či úsek vyštšpený nebo vyjmutý z tohoto zdroje chemickým způsobem, např. pomocí restrikčních endonukleáz, takže s ním bude možno dále pro potřeby tohoto vynálezu manipulovat, např. amplifikací, pomocí postupů genového inženýrství. Taková nukleotidová sekvence či úsek se obecně označuje jako rekombinantní. Z jednoho specifického hlediska může být molekula nukleové kyseliny oddělena od nukleotidových sekvencí jako jsou promotorové či enhancerové sekvence obklopující molekulu nukleové kyseliny, tak jak se přirozeně vyskytují v chromozomu.

V případě proteinu či polypeptidu je purifikovaný protein či polypeptid oddělen od složek jako jiné proteiny nebo fragmenty buněčné membrány, které jej v buňce doprovázejí. Odborníci v molekulární biologii budou vědět, že voda, pufry a doprovázet purifikovanou purifikovaný proteinový nukleové kyseliny nebo další malé molekuly mohou také molekulu nukleové kyseliny či preparát. Purifikované molekula purifikovaný polypeptid (např. enzym) v předkládaném vynálezu znamená, že jsou svou hmotností nejméně z 95%, nebo nejméně z 98%, nebo nejméně z 99%, nebo ze 100% zbaveny složek, které je přirozeně provázejí.

Podle předkládaného vynálezu purifikovanou molekulu nukleové kyseliny lze připravit např. vyštěpením molekuly nukleové kyseliny z chromozomu. Pak ji lze ligovat do expresního plasmidu. Jiné způsoby přípravy purifikované molekuly kódující P450 monooxygenázu jsou dostupné a zahrnují · · · · I

- 35 bez omezení umělou syntézu molekuly nukleové kyseliny syntetizátorem nukleových kyselin.

Podobně lze připravit P450 monooxygenázu z předkládaného vynálezu např. rekombinantní expresí molekuly nukleové kyseliny kódující P450 monooxygenázu v buňce, ve které se P450 monooxygenáza přirozeně nevyskytuje. Jiné způsoby přípravy purifikované P450 monooxygenázy z předkládaného vynálezu zahrnují bez omezení umělou syntézu P450 monooxygenázy syntetizátorem polypeptidů a izolaci P450 monooxygenázy z buňky, ve které se přirozeně nevyskytuje, např. pomocí protilátky, jež specificky váže P450 monooxygenázu.

Je známo, že biotransformace sekundárních alkoholů na ketony bakteriemi Streptomyces jsou katalyzovány dehydrogenázami nebo oxidázami. Před nynějším objevem cytochrom P450 monooxygenázy z kmene Streptomyces tubercidicus R-922 odpovědné za regioselektivní oxidaci avermektinu na 4''-keto-avermektin nebyla zveřejněna žádná experimentální data o jiné cytochrom P450 monooxygenáze ze Streptomyces, která by oxidovala sekundární alkohol na keton.

Podle některých provedení předkládaného vynálezu molekula nukleové kyseliny a/nebo polypeptid kódovaný molekulou nukleové kyseliny jsou izolovány z kmene Streptomyces. Molekula nukleové kyseliny (či polypeptid jí kódovaný) může být izolována z kteréhokoli z kmenů Streptomyces tubercidicus, Streptomyces lydicus, Streptomyces platensis, chattanoogensis, Streptomyces kasugaensis, rimosus a Streptomyces albofaciens.

Streptomyces

Streptomyces

Jak bylo zmíněno výše a bude detailněji popsáno níže, je zde poskytnuta celá rodina polypeptidů vykazujících enzymatickou aktivitu P450 monooxygenáz, které jsou schopny regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin.

- 36 ···· »·

Všechny členy této rodiny jsou si příbuzné nejméně 60% shodou na aminokyselinové úrovni. Využitelná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid z předkládaného vynálezu, jenž vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 70% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3,

SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV.

ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID.

Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94. V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid z předkládaného vynálezu, jenž vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 80% shodu; nebo nejméně 85% shodu; nebo nejméně 90% shodu; nebo nejméně 90% shodu; nebo nejméně 95% shodu; nebo

nejméně 98% shodu se	sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID.	Č. 3,
SEKV. ID. Č. 5, SEKV	. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV.	ID. Č.
11, SEKV. ID. Č. 13,	SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17,	SEKV.
ID. Č. 19, SEKV. ID.	Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID.	Č. 25,

SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94.

Předkládaný vynález podobně poskytuje purifikovaný polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxidující avermektin na 4'-keto-avermektin, jenž v některých provedeních obsahuje nebo je v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 60% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV.

· • · ···

- 37 ····

ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID.

V některých provedeních vynálezu vykazující

Č. 95. z tohoto monooxygenázy obsahuje nebo aminokyselinovou sekvencí, která nejméně 80% shodu; nebo nejméně shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, purifikovaný polypeptid enzymatickou aktivitu P450 je v podstatě tvořen má nejméně 7 0% shodu; nebo 90% shodu; nebo nejméně 95% SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č.

6, SEKV. ID.	Č. 8	, SEKV.	ID. Č.
Č. 14, SEKV.	ID.	Č. 16	, SEKV
SEKV. ID. Č.	22,	SEKV.	ID. Č.
Č. 28, SEKV.	ID.	Č. 30,	SEKV.
SEKV. ID. Č.	95.

10,	SEKV. ID. Č.	12, SEKV.	ID.
ID	. Č. 18, SEKV	. ID. Č.	20,
24,	SEKV. ID. Č.	26, SEKV.	ID.
ID.	Č. 32, SEKV.	ID. Č. 34	či

V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid z předkládaného vynálezu, jenž vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny o sekvenci SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9,

SEKV. ID. Č.	11,	SEKV. ID	. Č.	13,	SEKV.	ID.	Č.	15, SEKV.	ID.
Č. 17, SEKV.	ID.	Č. 19,	SEKV.	. ID	. Č.	21,	SEKV	. ID. Č.	23,
SEKV. ID. Č.	25,	SEKV. ID	. Č.	27,	SEKV.	ID.	Č.	29, SEKV.	ID.

ID. Č. 94.

Podobně či SEKV. z tohoto vynálezu vykazující monooxygenázy obsahuje nebo je

2, Č.

C. 31, SEKV. ID. C. 33 purifikovaný polypeptid enzymatickou aktivitu P450 v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č

3, SEKV. ID.

10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV.

ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24,

SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID.

Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95.

AA AAAA

- 38 A A

AA

K popisu sekvenčních vztahů mezi dvěma či více nukleovými kyselinami či polynukleotidy se užívají následující termíny: (a) „referenční sekvence, (b) „srovnávací okno, (c) „sekvenční shoda, (d) „procento sekvenční shody a (e) „podstatná shoda.

(a) Jak se zde užívá, je „referenční sekvence definovanou sekvencí užívanou jako základ pro srovnávání sekvencí. Referenční sekvence může představovat část nebo celek specifické sekvence; např. úsek z úplné cDNA či ze sekvence

genu nebo kompletní	cDNA	či sekvenci genu.
(b) Jak se	zde	užívá, „srovnávací	okno označuje
specifikovaný úsek	PO	sobě následujících	polynukleotidů v

polynukleotidové sekvenci, přičemž polynukleotidová sekvence ve srovnávacím okně může obsahovat adice či delece (např. mezery) ve srovnání s referenční sekvencí (která neobsahuje adice či delece) při optimálním srovnání obou sekvencí. Srovnávací okno obvykle představuje nejméně 20 po sobě délkově následujících nukleotidů, ale může být dlouhá i 30, 40, 50, 100 či více nukleotidů. Odborníci budou vědět, že aby se zabránilo vysoké shodě s referenční sekvencí způsobené zahrnutím mezer do polynukleotidové sekvence, obvykle se zavádí penalizace mezer a ta se pak odečítá od celkového počtu nalezených shod.

Postupy srovnávání sekvencí jsou odborníkům dobře známy. Určení procenta shody dvou sekvencí lze tedy provést pomocí matematického algoritmu. Výhodnými, ale ne jedinými, příklady takových matematických algoritmů jsou algoritmus podle Myerse a Millera, 1988; algoritmus pro lokální homologie podle Smithe et al., 1981; algoritmus srovnávání homologií podle Needlemana a Wunsche, 1970; postup vyhledávání shod podle Pearsona a

- 39 ·© *· • · ·« · · 99 999

9 9 9 9 9 ·· 9 9

99 · · © · « © * © 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 ··♦ ·· ··

Lipmana, 1988; algoritmus podle Karlina a Altschula, 1990, modifikovaný podle Karlina a Altschula, 1993.

Pro srovnávání sekvencí k určení jejich sekvenční shody lze využít počítačové provedení těchto matematických algoritmů. Tato provedení zahrnují, kromě jiných: CLUSTAL v programu PC/Gene (dodávaný firmou Intelligenetics, Mountain View, California); program ALIGN (verze 2.0) a GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA v sadě programů Wisconsin Genetics Software Package, verze 8 (dodávaný firmou Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA).

Srovnávání s využitím těchto programů lze provádět pomocí standardních parametrů. Program CLUSTAL je dobře popsán v Higgins et al. 1988; Higgins et al. 1989; Corpet et al. 1988; Huang et al. 1992; a Pearson et al. 1994. Program ALIGN je založen na algoritmu Myerse a Millera, viz výše. Programy BLAST podle Altschul et al., 1990, jsou založeny na algoritmu podle Karlina a Altschula, viz výše.

Software pro provádění analýz BLAST je veřejně dostupný v

Biotechnology Information

V tomto algoritmu se nejprve

National Center for (http://www.nebi.nim.nih.gov/) . identifikují segmenty s vysokým skóre (high scoring sequence pairs, HSPs) určením krátkých slov o délce W v testované sekvenci, jež při srovnání se slovem o stejné délce v sekvenci z databáze mají stejné nebo vyšší skóre než kladné prahové skóre T. T označuje práh pro skóre sousedícího slova (Altschul et al. 1990). Tyto počáteční zásahy (hits) sousedících slov slouží jako jádra pro zahájení vyhledávání delších HSPs, které je obsahují. Zásahy slov se pak prodlužují v obou směrech podél každé sekvence tak dlouho, dokud lze zvyšovat kumulativní srovnávací skóre. Kumulativní skóre lze pro nukleotidové sekvence spočítat pomocí parametrů M (nej lepší ·♦ ····

- 40 ·· ·· ♦ * 9 9

99

9 9

9999 99

9 9

9 9

9 9 9

9 9 9 skóre pro pár odpovídajících si zbytků; vždy >0) a N (nejhorší skóre pro neodpovídající si zbytky; vždy < 0) . Pro aminokyselinové sekvence se k výpočtu kumulativních skóre užívá matice pro skóre. Prodlužování zásahů slov v každém směru se zastaví, jakmile kumulativní srovnávací skóre klesne o hodnotu X se svého maxima, kumulativní skóre dosáhne nuly nebo je nižší díky nahromadění jednoho nebo více srovnání zbytků s negativním skóre, nebo je dosaženo konců kterékoli z obou sekvencí.

Kromě výpočtu procenta sekvenční shody provádí algoritmus BLAST také statistickou analýzu shody mezi dvěma sekvencemi (viz např. Karlin & Altschul (1993)). Jednou z hodnot pro označení míry shody, kterou poskytuje algoritmus BLAST, je nejmenší sumární pravděpodobnost (P(N)), která naznačuje pravděpodobnost, se kterou se náhodně vyskytne shoda mezi dvěma nukleotidovými či aminokyselinovými sekvencemi. Např. testovaná sekvence nukleové kyseliny se považuje za podobnou referenční sekvenci, pokud nejmenší sumární pravděpodobnost při srovnání testované sekvence nukleové kyseliny s referenční sekvencí nukleové kyseliny je menší než 0,1; výhodněji menší než cca 0,01 a nejvýhodněji menší než cca 0,001.

K získání srovnání s mezerami pro srovnávací potřeby lze využít Gapped BLAST (v BLAST 2.0) jak je popsáno v Altschul et al. 1997. Je také možno využít PSI-BLAST (v BLAST 2.0) k opakovanému vyhledávání, které zjišťuje vzdálenou příbuznost molekul. Viz výše Altschul et al. Při použití BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST lze využít předdefinované parametry příslušných programů (např. BLASTN pro nukleotidové sekvence, BLASTX pro proteiny). Program BLASTN (pro nukleotidové sekvence) užívá jako standard délku slova (W) 11, očekávání (expectation, E) 10, limit (cutoff) 100, M=5, N=-4 a srovnání

4· 4444

4 4 ·

44

4 4 4

4 ·

4444 44 β

444 4

- 41 4 4 4

4 4

4 4

4 4 4 «4 44 obou vláken. Pro aminokyselinové sekvence používá program BLASTP jako standard délku slova (W) 3, očekávání (E) 10 a matici pro skóre BLOSUM2 (viz Henikoff & Henikoff, 1989). Viz http://www.nebi.nim.nih.gov. Srovnání lze také provést ručně prohlédnutím.

Pro účely předkládaného vynálezu je srovnání nukleotidové sekvence za účelem určení procenta sekvenční shody výhodně provedeno pomocí programu BlastN (verze 1.4.7 či pozdější) s jeho předdefinovanými parametry nebo jakýmkoli jiným ekvivalentním programem. Za „ekvivalentní program se považuje jakýkoli program pro srovnávání sekvencí, který pro kterékoli dvě požadované sekvence provede srovnání se stejnou mírou shody nukleotidů či aminokyselinových zbytků a se stejným procentem sekvenční shody jako odpovídající srovnání získané výhodným programem.

(c) Jak se zde užívá, „sekvenční shoda či „shoda v kontextu dvou sekvencí nukleové kyseliny či polypeptidu označuje zbytky v těchto dvou sekvencích, které jsou stejné při srovnávání hledajícím maximální shodu ve specifickém srovnávacím okně. Tam, kde se užívá procento sekvenční shody v souvislosti s proteiny, pokládá se za fakt, že poloha zbytků, která není totožná, se často liší díky konzervativním aminokyselinovým substitucím, kdy aminokyselinové zbytky jsou nahrazeny jinými aminokyselinovými zbytky s podobnými chemickými vlastnostmi (např. nábojem či hydrofobností), a nedojde tedy ke změně funkčních vlastností molekuly. Pokud se sekvence liší konzervativními substitucemi, procento sekvenční shody lze upravit směrem nahoru, aby se opravila konzervativní podstata substituce. 0 sekvencích lišících se takovou konzervativní substitucí se říká, že mají „sekvenční podobnost nebo „podobnost. Prostředky pro provedení této ·· · · · · «··· »· ·· · · ·

99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 999 99 99

- 42 úpravy jsou odborníkům dobře známy. Normálně se provádí tak, že konzervativní substituce se skóruje jako parciální a ne jako úplná neshoda, čímž se zvyšuje procento sekvenční shody.

Takto např. v případě, kdy je shodné aminokyselině přiděleno skóre 1 a nekonzervativní substituci skóre nula, konzervativní substituce dostane skóre mezi nulou a 1. Výpočty skóre pro konzervativní substituce se provádějí např. pomocí programu PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California).

(d) Jak se zde užívá, „procento sekvenční shody znamená hodnotu určenou srovnáním dvou optimálně srovnávaných sekvencí pomocí srovnávacího okna, přičemž úsek polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okně může zahrnovat adice či delece (tj . mezery) ve srovnání s referenční sekvencí (která neobsahuje adice či delece) pro optimální srovnání těchto dvou sekvencí. Toto procento se vypočítá určením počtu poloh, ve kterých se v obou sekveních vyskytuje tatáž báze nukleové kyseliny či aminokyselinový zbytek, čímž se dostane počet odpovídajících si pozicí, které se dělí celkovým počtem pozicí ve srovnávacím okně, a výsledek se dělí 100, což je procento sekvenční shody.

(e)(i) Termín „podstatná shoda polynukleotidové sekvence znamená, že polynukleotid obsahuje sekvenci, která má nejméně 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% či 79%, výhodně nejméně 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% či 89%, výhodněji nejméně 90%, 91%, 92%, 93% či 94% a nejvýhodněji nejméně 95%, 96%, 97%, 98% či 99% sekvenční shodu ve srovnání s referenční sekvencí zjištěnou jedním z uvedených programů pro srovnávání pomocí standardních parametrů. Odborník bude vědět, že tyto hodnoty mohou být vhodně upraveny, aby byla určena odpovídající shoda proteinů kódovaných oběma nukleotidovými sekvencemi, přičemž bude brán aminokyselinovou

Podstatná shoda normálně znamená

- 43 zřetel na degeneraci genetického kódu, podobnost, polohu čtecího rámce apod. aminokyselinových sekvencí pro tyto účely sekvenční shodu nejméně na 70%, výhodněji nejméně na 80%, 90% a nejvýhodněji nejméně na 95%.

Dalším potvrzením, že nukleotidové sekvence mají podstatnou shodu, je schopnost obou molekul spolu hybridizovat za stringentních podmínek (viz níže). Stringentní podmínky se obvykle volí o 5°C nižší než tepelný bod tání (T_m) specifické sekvence za definované iontové síly a pH. Stringentní podmínky však překračují teploty o rozmezí mezi 1°C až 20°C, v závislosti na požadovaném stupni stringence, jak je dále blíže vymezen v tomto textu. Nukleové kyseliny, které spolu nehybridizují za stringentních podmínek, jsou přesto podstatně shodné, pokud jsou podstatně shodné polypeptidy, které kódují. K tomu může dojít např, když kopie nukleové kyseliny je vytvořena pomocí maximální degenerace kodonů umožněné genetickým kódem. Jedním z příznaků, že dvě sekvence nukleové kyseliny jsou podstatně shodné, je, když polypeptid kódovaný první nukleovou kyselinou vykazuje imunologickou kříženou reaktivitu na polypeptid kódovaný druhou nukleovou kyselinou.

(e) (ii) Termín „podstatná shoda v kontextu polypeptidu znamená, že polypeptid obsahuje sekvenci, která má nejméně 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% či 79%, výhodně 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% či 89%, výhodněji nejméně 90%, 91%, 92%, 93% či 94% nebo nejvýhodněji

95%, 96%, 97%, 98% či 99% sekvenční shodu s referenční sekvencí v určitém srovnávacím okně. Optimální srovnání se výhodně provádí pomocí algoritmu pro homologní srovnávání podle Needlemana a Wunsche (1970) . Jedním z příznaků, že dvě polypeptidové sekvence jsou podstatně shodné, je když jeden ···· ··

- 44 polypeptid protilátky polypeptid např. pokud vykazuje imunologickou zkříženou reaktivitu na připravené proti druhému polypeptidu. Jeden je tedy podstatně shodný s druhým polypeptidem se oba peptidy liší jen konzervativní substitucí.

Při srovnávání sekvencí jedna sekvence obvykle slouží jako referenční sekvence, ke které je přirovnávána testovaná sekvence. Pokud se pro srovnání sekvencí použije algoritmu, testovací a referenční sekvence se zadají do počítače, je-li třeba, určí se pozice části sekvence a zvolí se parametry pro program sekvenčního algoritmu. Algoritmus sekvenčního srovnávání pak vypočítá procento sekvenční shody pro testovanou sekvenci (sekvence) na základě zvolených parametrů programu.

Jak bylo uvedeno výše, dalším příznakem, že dvě sekvence nukleové kyseliny jsou podstatně shodné je, že tyto dvě molekuly spolu hybridizují za stringentních podmínek. Výraz „specificky hybridizující označuje vazbu, tvorbu duplexu či hybridizaci molekuly pouze s určitou nukleotidovou sekvencí za stringentních podmínek, kdy tato sekvence je přítomna v komplexní směsi (např. celkové buněčné) DNA či RNA.

„Specificky váže (vážou) označuje komplementární hybridizaci mezi sondou nukleové kyseliny a cílovou nukleovou kyselinou a zahrnuje drobné neshody, které lze odstranit snížením stringence hybridizačních médií, aby bylo dosaženo požadované detekce cílové sekvence nukleové kyseliny.

„Stringentní hybridizační podmínky a „stringentní podmínky hydbridizačního promývání v kontextu experimentů s hybridizaci nukleových kyselin, jako jsou hybridizace podle Southerna a Northerna, jsou závislé na sekvenci a liší se podle daných parametrů okolí. T_m je teplota (za definované iontové síly a pH), při které 50% cílové sekvence hybridizuje

4444 • « · · 4 4 44 4 4 4

44 4 · 4 4«

4 4 4 « 4 4 4 4 ·

444 4 4 4«··

4444 44 444 444 44 4«

- 45 s dokonale odpovídající sondou. Specificita je normálně funkcí pohybridizačního promývání, přičemž kritickými faktory jsou iontová síla a teplota konečného promývacího roztoku. Pro hybridy DNA-DNA lze T_m aproximovat z rovnice podle Meinkotha a Wahla, 1984; T_m 81.5°C + 16.6 (log Μ) +0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; kde M je molarita monovalentních kationtů, %GC je procento guanosinových a cytosinových nukleotidů v DNA, % form je procento formamidu v hybridizačním roztoku a L je délka hybridu v párech baží. T_m se snižuje o cca 1°C na každé 1% neshody; T_m, hybridizační a/nebo promývací podmínky lze upravit tak, aby došlo k hybridizaci se sekvencemi o požadované shodě. Např. pokud jsou hledány sekvence s >90% shodou, T_m lze snížit o 10°C. Stringentní podmínky bývají obvykle zvoleny tak, aby byly o 5°C nižší než teplotní bod tání I pro specifickou sekvenci a její komplementární sekvenci za definované iontové síly a pH. Přísně stringentní podmínky však mohou využít hybridizaci a/nebo promývání při teplotě o 1, 2, 3 či 4°C nižší než teplotní bod tání I; mírně stringentní podmínky mohou využít hybridizaci a/nebo promývání při teplotě o 6, 7, 8, 9 či 10°C nižší než teplotní bod tání I; podmínky nízké stringence mohou využít hybridizaci a/nebo promývání při teplotě o 11, 12, 13, 14, 15 či 20°C nižší než než teplotní bod tání I. Odborníkům bude jasné, že pomocí uvedené rovnice, hybridizačních a promývacích směsí a požadované T jsou varianty stringencí, hybridizaci a/nebo promývacích roztoků ve své podstatě popsány. Pokud z požadovaného stupně neshod vyplývá T nižší než 45°C (vodný roztok) nebo 32°C (roztok formamidu), dává se přednost zvýšení koncentrace SSC tak, aby bylo možno využít vyšší teploty. Vyčerpávají návod k hybridizacím nukleových kyselin je uveden v Tijssen, 1993. Vysoce stringentní podmínky pro hybridizaci a promývání se ·»« ·· ··

- 46 obvykle volí při teplotě o cca 5°C nižší než teplotní bod tání T_m pro specifickou sekvenci za definované iontové síly a pH.

Příkladem vysoce stringentních promývacích podmínek je 0,15 M NaCl při 72°C po dobu cca 15 minut. Příkladem stringentních promývacích podmínek je promývání 0,2X SSC při 65°C po dobu 15 minut (popis pufru SSC viz Sambrook, viz níže) . Před promýváním za vysoké stringence se často provádí promývání za nízké stringence, aby se odstranil signál pozadí sondy. Příkladem středně stringentního promývání duplexu o např. více než 100 nukleotidech je IX SSC při 45°C po dobu 15 minut. Příkladem promývání za nízké stringence pro duplex o např. více než 100 nukleotidech je 4-6X SSC při 40°C po dobu 15 minut. Pro krátké sondy (např. o cca 10 až 50 nukleotidech) znamenají stringentní podmínky obvykle koncentrace solí nižší než cca 1,5 M, výhodněji cca 0,01 až 1,0 M koncentraci iontu Na (nebo jiné soli) při pH 7,0 až 8,3 a teplota je obvykle nejméně cca 30°C a nejméně 60°C pro dlouhé sondy (např. o >50 nukleotidech). Stringentních podmínek lze také dosáhnout přidáním destabilizačních činidel jako např. formamidu. Poměr signálu k šumu 2X (či vyšší) než poměr pozorovaný u nepříbuzné sondy v určitém hybridizačním testu obvykle naznačuje detekci specifické hybridizace. Nukleové kyseliny, které spolu za stringentních podmínek nehybridizuji, jsou přesto podstatně shodné, pokud jsou podstatně shodné proteiny, které kódují. To se stává např. když je vytvořena kopie nukleové kyseliny pomocí maximální degenerace kodonů umožněné genetickým kódem.

Velmi stringentní podmínky se volí tak, aby byly shodné s T_m určité sondy. Příkladem stringentních podmínek pro hybridizaci komplementárních nukleových kyselin, které mají více než 100 komplementárních zbytků na filtru při Southernově či Northernově přenosu, je 50% formamid, např. hybridizace v 50% ·· ·· « « * · • ·· • · · • · · ···· ·Α • ·· ··»· ·· 9 9 · • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

999 99 99

- 47 formamidu, 1 Μ NaCl, 1% SDS při 37°C, a promyt! v O,1X SSC při 60 až 65°C. Příkladné podmínky nízké stringence zahrnuji hybridizaci v roztoku pufru o 30 až 35% formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS (dodecylsulfát sodný) při 37°C, a promyt! v IX až 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrát trojsodný) při 50 až 55°C. Podmínky příkladné mírné stringence zahrnují hybridizaci v 40 až 45% formamidu, 1,0 M NaCl, 1% SDS při 37°C, a promytí v 0,5X až IX SSC při 55 až 60°C.

Následují příklady souboru podmínek hybridizace/promývání, jichž lze využít při klonování ortologních nukleotidových sekvencí, které jsou podstatně shodné s referenčními nukleotidovými sekvencemi z předkládaného vynálezu: referenční nukleotidová sekvence výhodně hybridizuje s referenční nukleotidovou sekvencí v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v 2X SSC, 0,1% SDS při 50°C, vhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v IX SSC, 0, 1% SDS při 50°C, ještě vhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v 0,5X SSC, 0,1% SDS při 50°C, výhodně v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v 0,lX SSC, 0,1% SDS při 50°C, výhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v 0,lX SSC, 0,1% SDS při 65°C.

Jedním, ale ne jediným, zdrojem purifikovaného polypeptidu z předkládaného vynálezu vykazujícího enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxidujícího avermektin na 4' '-keto-avermektin je bezbuněčný extrakt popsaný v příkladech uvedených níže. Jiným způsobem purifikace polypeptidu vykazujícího aktivitu P450 monooxygenázy podle tohoto vynálezu je připojení značky na protein a tím usnadnění jeho ·· ···· ·· ·· • · · · • ·· • · · · • · · ···« ··

- 48 ·· · · · • · · · • · · · · • · · · · • ··· ·· ·· purifikace. Tento vynález tedy poskytuje purifikovaný polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxidující avermektin na 4''-keto-avermektin, přičemž polypeptid je kovalentně vázán na značku. Tento vynález dále poskytuje nukleovou kyselinu kódující značený polypeptid.

Jak se zde užívá, termín „značka označuje polypeptid či jinou molekulu kovalentně vázanou na polypeptid z předkládaného vynálezu, přičemž vazebná látka (např. polypeptid nebo molekula) je specificky vázán na značku. Podle tohoto vynálezu „specificky vázán znamená, že vazebná látka (např. protilátka nebo Ni²⁺ pryskyřice) rozpoznává a váže určitý polypeptid či chemikálii, ale v podstatě nerozpoznává či neváže jinou molekulu ve vzorku. V některých provedeních vazebná látka, která je specificky vázána na ligand, je spojena s ligandem s afinitou nejméně 10⁶ M^_1, nebo nejméně 10⁷ M^_1, nebo nejméně ΙΟ⁸ NT¹, nebo nejméně 10⁹ M^_1, buď ve vodě za fyziologických podmínek nebo za podmínek podobných fyziologickým s ohledem na iontovou sílu, např. 140 mM NaCl, 5 mM MgCl2. Např. značka His je specificky vázána na nikl (např. na komerčně dostupnou kolonu nesoucí nabité ionty Ni²⁺ jako je pryskyřice His»Bind® Resin od firmy Novagen lne, Madison, WI). Podobně značka Myc je specificky vázána na protilátku, která specificky váže Myc.

Jak je popsáno níže, značka His je připojena na purifikovaný polypeptid z předkládaného vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy vytvořením molekuly nukleové kyseliny kódující polypeptid s His značkou a exprimující polypeptid v E. coli. Jakmile jsou tyto polypeptidy exprimovány v E. coli, snadno se purifikují standardními postupy (např. pomocí jedné z komerčně dostupných

souprav His‘Binci® Kits od firmy Novagen nebo pomocí TALON™ Resin (a návodu výrobce) komerčně dostupné od firmy Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA).

Ke kterémukoli či všem polypeptidům z předkládaného vynálezu lze připojit značku pro usnadnění purifikace. Tyto značky zahrnují kromě jiného značky HA (aminokyselinová sekvence: YPYDVPDYA (SEKV. ID. Č. 39)), Myc (aminokyselinová sekvence: EQKLISEEDL (SEKV. ID. Č. 40)), HSV (aminokyselinová sekvence: QPELAPEDPED (SEKV. ID. Č. 41)) a VSV-G (aminokyselinová sekvence: YTDIEMNRLGK (SEKV. ID. Č. 42)). Kovalentní spojení (např. polypeptidovou vazbou) těchto značek s polypeptidem tototo vynálezu umožňuje purifikaci značeného pólypeptidů pomocí protilátek anti-HA, anti-Myc, anti-HSV, resp. anti-VSV-G, z nichž všechny jsou komerčně dostupné (např. od firem MBL International Corp., Watertown, MA; Novagen lne.; Research Diagnostics lne., Flanders, NJ).

Značené polypeptidy z předkládaného vynálezu vykazující aktivitu P450 monooxygenázy mohou také být značeny kovalentní vazbou k chemikálii, jako např. k biotinu, který je specificky vázán na streptavidin, a tak mohou být purifikovány na streptavidinové koloně. Podobně značené P450 monooxygenázy z tohoto vynálezu mohou být kovalentně vázány (např. polypeptidovou vazbou) na konstantní oblast protilátky. Taková značená P450 monooxygenáza může být purifikována např. na protein A sefaróze.

Značená P450 monooxygenáza z předkládaného vynálezu může být také značena GST (glutathion-S-transferázou) či konstantní oblastí imunoglobulinu. Např. molekula nukleové kyseliny z tohoto vynálezu (např. obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 1) může být klonována do jednoho z plasmidů pGEX komerčně dostupných od firmy Amersham Pharmacia Biotech, lne.

• 0 0 ·

- 50 Mnoho plasmidů části fúzního (Piscataway NJ) a plasmid může být exprimován v E. coli. Výsledná P450 monooxygenáza kódovaná molekulou nukleové kyseliny je kovalentně vázána na GST (glutathion-Stransferázu). Tyto GST fúzní proteiny lze purifikovat na koloně glutathion-sefarózy (komerčně dostupné např. od firmy Amersham Pharmacia Biotech), a tak purifikovat pGEX umožňuje jednoduché odstranění GST proteinu. Např. plasmid pGEX-2T obsahuje rozpoznávací místo pro thrombin mezi vloženou požadovanou molekulou nukleové kyseliny a sekvencí nukleové kyseliny kódující GST. Podobně plasmid pGES-3T obsahuje místo pro faktor Xa. Vystavením fúzního proteinu odpovídajícímu enzymu a oddělením GST části of P450 monooxygenázy z tohoto vynálezu pomocí glutathionagarózy (na kterou se GST specificky váže) monooxygenázu purifikovat.

lze P450

Dalším způsobem, jak získat purifikovaný polypeptid z předkládaného vynálezu vykazující aktivitu P450 monooxygenázy, je využití vazebné látky, která specificky váže tento polypeptid. Tento vynález tedy poskytuje vazebnou látku, která specificky váže P450 monooxygenázu z tohoto vynálezu. Touto vazebnou látkou z předkládaného vynálezu může být chemická sloučenina (např. protein), kovový ion či malá molekula.

V určitých provedeních je vazebnou látkou protilátka. Termín „protilátka zahrnuje kromě jiného polyklonální protilátku (např. Fab, Fv či fragmenty Fab'), jednořetězcovou protilátku, chimérickou protilátku, protilátku s dvojí specificitou, protilátku jakéhokoli izotypu (např. IgG, IgA a IgE) a protilátku z kteréhokoli druhu (např. králík, myš a člověk).

- 51 V jednom neomezujícím příkladě je vazebnou látkou polyklonální protilátka. V jiném neomezujícím příkladě je vazebnou látkou z předkládaného vynálezu monoklonální protilátka. Postupy přípravy monoklonálních i polyklonálních protilátek jsou dobře známy (viz např. Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons, lne. 1993; Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, lne. 2000).

Zde popsané polypeptidy vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, které regioselektivně oxidují avermektin na 4''-keto-avermektin, patří do rodiny nových P450 monooxygenáz. Předkládaný vynález tedy také poskytuje rodinu polypeptidů P450 monooxygenáz, přičemž každý člen této rodiny regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin. V některých provedeních každý člen rodiny obsahuje nebo je tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 50% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 či SEKV. ID. Č. 95. V určitých provedeních je každý člen rodiny kódován molekulou nukleové kyseliny, jež obsahuje nebo je tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 66% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13,

SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID.

Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94.

- 52 • φφφ ·a «· ΦΦ

Předkládaný vynález, který poskytuje celou rodinu P450 monooxygenáz, jejíž každý člen je schopen regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin, umožnil vytvořit vylepšenou P450 monooxygenázu, která se nemusí vyskytovat přirozeně, ale která regioselektivně oxiduje avermektin na 4' '-keto-avermektin účinně a se sníženým množstvím nežádoucího vedlejšího produktu. Např. jeden z členů rodiny P450 monooxygenáz z tohoto vynálezu, enzym P450_Emai, katalyzuje další oxidaci, která není žádoucí, protože tvorba 3-O-demetyl-4keto-avermektinu byla zaznamenána

Streptomyces tubercidicus R-922 a při reakci kmene Streptomyces lividans obsahujícím gen emal. Tvorba 3-0-demetyl-4-keto-avermektinu je způsobena oxidací 3''-O-metylové skupiny, při níž vzniká hydrolyticky labilní 3''-O-hydroxymetylová skupina, která je hydrolyzována na formaldehyd a 3' '-hydroxylovou skupinu.

Tím, že je k dispozici rodina polypeptidu vykazujících enzymatickou aktivitu

P450 monooxygenázy, které regioselektivně oxidují avermektin na 4''-keto-avermektin (viz např. Tabulka 3 níže), lze u jednotlivých členů této rodiny provádět změnu v uspořádání genů za účelem přípravy nových hybridních genů kódujících optimalizované P450 monooxygenázy z předkládaného vynálezu. V jednom neomezujícím příkladu lze část genu emal kódující vazebné místo 0₂ na proteinu P450_Emai vyměnit za část genu ema2 kódující vazebné místo 0₂ proteinu P450_Ema2. Takový chimérický protein emal/2 spadá pod definici P450 monooxygenázy z tohoto vynálezu.

Řízenou mutagenezi či řízené evoluční postupy lze také využít k tvorbě derivátů genů emal, které kódují enzymy se zlepšenými vlastnostmi, včetně vyšší celkové aktivity a/nebo snížené tvorby vedlejších produktů. Jedním postupem odvození takové mutanty je mutace samotného kmene Streptomyces podobným způsobem jako je mutace kmene R-922 Streptomyces tubercidicus UV zářením popsaná níže.

Další deriváty lze připravit konzervativními či nekonzervativními změnami aminokyselinové sekvence P450 monooxygenázy. Konzervativní a nekonzervativní aminokyselinové substituce jsou dobře známy (viz např. Stryer, Biochemistry, 3^rd Ed., W.H. Freeman and Co., NY 1988). Podobně zkrácené formy P450 monooxygenázy z předkládaného vynálezu lze připravit zkracováním proteinu na jeho N-konci (např. viz gen emalA popsaný níže), na jeho C-konci, či zkracováním (tj. odstraněním zbytku aminokyseliny) uprostřed proteinu.

Taková mutanta, derivát či zkrácená P450 monooxygenáza je P450 monooxygenázou z předkládaného vynálezu, pokud je schopna regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin.

Z jiného hlediska poskytuje předkládaný vynález buňku geneticky upravenou tak, aby obsahovala molekulu nukleové kódující polypeptid, P450 monooxygenázy který vykazuje enzymatickou a regioselektivně oxiduje kyseliny aktivitu avermektin na 4''-keto-avermektin. „Geneticky upravená znamená, že nukleová kyselina je pro buňku, do které je vnesena, cizorodá. Vnesení molekuly cizorodé nukleové kyseliny do geneticky upravené buňky lze provést jakýmkoli způsobem, včetně kromě jiného transfekce, transdukce a transformace.

V některých provedením je molekula nukleové kyseliny vnesena k expresi do geneticky upravené buňky. „Vnesena k expresi znamená, že molekula cizorodé nukleové kyseliny kódující polypeptid je spojena s regulační sekvencí tak, aby po vnesení do buňky umožnila expresi molekuly nukleové kyseliny. „Regulační sekvencí je míněna sekvence nukleové kyseliny, jako např. iniciační signály, polyadenylační (polyA) signály, promotory a enhancery, které řídí expresi sekvencí kódujících • · · · • · ·* protein, se kterými jsou funkčně spojeny. „Expresí molekuly nukleové kyseliny kódující proteinový či polypeptidový fragment je míněna exprese této molekuly nukleové kyseliny jako proteinu a/nebo mRNA.

Geneticky upravenou buňkou z předkládaného vynálezu může být prokaryotická buňka (např. E. coli) či eukaryotická buňka (např. Saccharomyces cerevisiae nebo savčí buňka (např. HeLa)). Podle některých provedení vynálezu je geneticky upravenou buňkou buňka, jejíž divoký typ (tj. geneticky neupravený) přirozeně neobsahuje vloženou molekulu nukleové kyseliny a přirozeně neexprimuje protein kódovaný vloženou molekulou nukleové kyseliny. Buňkou tedy může být geneticky upravený kmen Streptomyces, např. kmen Streptomyces lividans či Streptomyces avermitilis. Buňka může být také z geneticky upraveného kmene Pseudomonas, např. z Pseudomonas putida či Pseudomonas fluorescens. Jinou možností je buňka z geneticky upraveného kmene Escherichia coli.

Je třeba poznamenat, že v některých typech buněk geneticky upravených tak, aby obsahovaly molekulu nukleové kyseliny kódující P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4' '-keto-avermektin, samotná skutečná geneticky upravená buňka nemusí být schopna převést avermektin na 4''-keto-avermektin. Lze spíše z této buňky purifikovat P450 monooxygenázu heterologně exprimovanou takovou geneticky upravenou buňkou, přičemž purifikovaná P450 monooxygenáza z tohoto vynálezu může být využita k regioselektivní oxidaci avermektinu na 4' '-keto-avermektin. Geneticky upravené buňka z tohoto vynálezu tedy sama o sobě nemusí být schopna regioselektivně převést avermektin na 4''-keto-avermektin; geneticky upravená buňka z tohoto vynálezu spíše jen může obsahovat molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid *

« · · · o · • · · « * • · · · · **

- 55 vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, který regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin, a nezáleží na tom, zda je polypeptid uvnitř buňky aktivní.

Navíc buňka (např. E. coli) geneticky upravená tak, aby obsahovala molekulu nukleové kyseliny kódující polypeptid z předkládaného vynálezu, který vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, nemusí být schopna regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin, i když P450 monooxygenáza purifikovaná z geneticky upravené buňky je schopna regioselektivně oxidovat avermektin na 4'-ketoavermektin. Pokud by však tato buňka byla geneticky upravena tak, aby obsahovala polypeptid z tohoto vynálezu vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, ferredoxinu z tohoto vynálezu a/nebo reduktázy ferredoxinu z tohoto vynálezu, pak P450 monooxygenáza i ferredoxin a reduktáza ferredoxinu, všechny purifikované z této buňky a za přítomnosti redukčního činidla (např. NADH či NADPH), by byly schopny regioselektivně oxidovat avermektin na 4' ^z-keto-avermektin. Kromě toho geneticky upravená buňka obsahující P450 monooxygenázu z předkládaného vynálezu, ferredoxin z tohoto vynálezu a reduktázu ferredoxinu z tohoto vynálezu by sama o sobě mohla být schopna provést tuto oxidaci.

Navíc v neomezujícím příkladu, kde buňka (např. E. coli) je geneticky upravena k expresi proteinů P450 monooxygenázy, ferredoxinu a reduktázy ferredoxinu, všechny tři tyto proteiny, pokud by byly purifikovány z geneticky upravené E. coli, společně a za přítomnosti redukčního činidla (např. NADH či NADPH) by byly aktivní a schopné regioselektivně oxidovat avermektin na 4' '-keto-avermektin, a jsou tedy využitelné pro způsob přípravy emamektinu.

• · · ·

- 56 0 » » 4 ··

V souladu s předkládaným vynálezem materiál uložen ve sbírce Agricultural Patent Culture byl následující Research Service, North University

Collection (NRRL), 1815

Street, Peoria, Illinois 61604, na základě Budapešťské úmluvy o mezinárodním uznávání ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení: (1) Streptomyces lividans ZX7 (emal/fd233TUA1A) NRRL Designation No. NRRL B-4067 obsahující Designation No.B-30479.

Při určování nové enzymatickou aktivitu

B-30478; a (2) Pseudomonas putida plasmid pRK29Q-emal/fd233, NRRL polypeptidů vykazujících monooxygenázy, které rodiny P450 regioselektivně oxidují avermektin na 4^z '-keto-avermektin, byly také ve stejných kmenech bakterií, ve kterých byly nalezeny P450 monooxygenázy, určeny nové ferredoxiny a nové reduktázy ferredoxinu. Z dalšího hlediska tedy poskytuje předkládaný vynález purifikovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu ferredoxinu, přičemž molekula nukleové kyseliny je izolována z kmene Streptomyces obsahujícího polypeptid, který regioselektivně oxiduje avermektin na 4'^z-keto-avermektin. Podobně tento vynález poskytuje purifikovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu reduktázy ferredoxinu, přičemž molekula nukleové kyseliny je izolována z kmene Streptomyces obsahujícího polypeptid, který regioselektivně oxiduje avermektin na 4^zz-keto-avermektin. Tento vynález také poskytuje purifikovaný protein vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, a také purifikovaný protein vykazující enzymatickou aktivitu reduktázy ferredoxinu, přičemž protein ferredoxin i protein reduktáza ferredoxinu je izolován z kmene • · 9 0 » O O 4 • ··

Streptomyces obsahujícího polypeptid, který regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

Užitečná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid, jenž vykazuje enzymatickou aktivitu ferredoxinu, obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 81% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37. V jiném případě molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 85%, nebo nejméně 90%, nebo nejméně 95%, nebo nejméně 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37. Molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, může obsahovat či být v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny SEKV. ID. Č. 35 či SEKV. ID. Č. 37.

Protein z předkládaného ferredoxinu může obsahovat vynálezu vykazující aktivitu nebo být v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 80% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38. V některých provedeních molekula nukleové kyseliny obsahuje nebo je v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí, která má nejméně 90%, nebo nejméně 95%, nebo nejméně 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38. Ferredoxin z tohoto vynálezu může obsahovat nebo být v podstatě tvořen aminokyselinovou sekvencí o sekvenci SEKV. ID. Č. 36 či SEKV. ID. Č. 38.

Užitečná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein z předkládaného vynálezu, jenž vykazuje aktivitu reduktázy ferredoxinu, může obsahovat nebo být v podstatě tvořena sekvencí nukleové kyseliny, která má nejméně 85%, nebo nejméně 90%, nebo nejméně «· ····

- 58 95%, nebo nejméně 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 98, SEKV. ID. Č. 100, SEKV. ID. Č. 102 či SEKV. ID. Č. 104. V určitém provedení tohoto vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující reduktázu ferredoxinu z tohoto vynálezu může obsahovat nebo být v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí o sekvenci SEKV. ID. Č. 98, SEKV. ID. Č. 100, SEKV. ID. Č. 102 či SEKV. ID. Č. 104.

vynálezu může aminokyselinovou

ID. Č. 101, SEKV. provedení tohoto vynálezu může

Reduktáza ferredoxinu z předkládaného obsahovat nebo být v podstatě tvořena sekvencí, která má nejméně 85%, nebo nejméně 90%, nebo nejméně 95%, nebo nejméně 99% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 99, SEKV.

ID. Č. 103 či SEKV. ID. Č. 105. V určitém vynálezu reduktáza ferredoxinu z tohoto bsahovat nebo být v podstatě tvořena aminokyselinovou sekvencí o sekvenci SEKV. ID. Č. 99, SEKV. ID. Č. 101, SEKV. ID. Č. 103 či SEKV. ID. Č. 105.

Postupy purifikace proteinů ferredoxinu a reduktázy ferredoxinu a molekul nukleových kyselin kódujících takové proteiny ferredoxinu a reduktázy ferredoxiny jsou odborníkům známy a jsou totožné s výše popsanými postupy pro purifikaci P450 monooxygenáz z tohoto vynálezu a molekul nukleových kyselin kódujících P450 monooxygenázy z tohoto vynálezu.

V jednom neomezujícím příkladu přípravy purifikované P450 monooxygenázy s purifikovaným ferredoxinem může být kmen S. lividans (či kmen P. putida nebo jakákoli jiná buňka, ve které se P450 monooxygenáza z tohoto vynálezu přirozeně nevyskytuje) geneticky upraven tak, aby obsahoval první molekulu nukleové kyseliny kódující P450 monooxygenázu z tohoto vynálezu a druhou molekulu kódující protein ferredoxin, přičemž jak první, tak i druhá molekula nukleové kyseliny je vnesena k expresi do geneticky upravené buňky. První i druhá molekula

- 59 nukleové kyseliny mohou být na různých plasmidech nebo mohou být na témže plasmidu. Tatáž upravená buňka či kmen tedy bude produkovat jak P450 monooxygenázu z tohoto vynálezu, tak i protein ferredoxin z tohoto vynálezu.

V dalším neomezujícím příkladu získání purifikované P450 monooxygenázy z předkládaného vynálezu s purif ikovaným. ferredoxinem a purifikovanou reduktázou ferredoxinu z tohoto vynálezu může být kmen S. lividans (či kmen P. putida nebo jakákoli jiná buňka, ve které se P450 monooxygenáza z tohoto vynálezu přirozeně nevyskytuje) geneticky upraven tak, aby obsahoval první molekulu nukleové kyseliny kódující P450 monooxygenázu z tohoto vynálezu, druhou molekulu kódující protein ferredoxin a třetí molekulu kódující reduktázu ferredoxinu, přičemž jak první, tak i druhá a třetí molekula nukleové kyseliny jsou vneseny k expresi do geneticky upravené buňky. První, druhá i třetí molekula nukleové kyseliny mohou být na různých plasmidech nebo mohou být na témže plasmidu. Tatáž upravená buňka či kmen tedy bude produkovat jak P450 monooxygenázu z tohoto vynálezu, tak i protein ferredoxin a reduktázu ferredoxinu z tohoto vynálezu.

Jak bylo popsáno výše pro P450 monooxygenázy z předkládaného vynálezu, protein ferredoxin a/nebo protein reduktáza ferredoxinu může dále obsahovat značku. Navíc tento vynález uvažuje o vazebných látkách (např. protilátkách), které specificky vážou protein ferredoxin a o vazebných látkách, které specificky vážou proteiny ferredoxin reduktázy z tohoto vynálezu. Postupy přípravy značeného proteinu ferredoxin, značeného proteinu reduktáza ferredoxinu a vazebných molekul (např. protilátek), které specificky vážou ferredoxin či reduktázu ferredoxinu, jsou totožné s výše popsanými postupy přípravy značených P450 monooxygenáz • · ··· · « · « · · ·

- 60 » · <

» » · « ·· ·» z tohoto vynálezu a přípravy vazebných látek, jež specificky vážou P450 monooxygenázy z tohoto vynálezu.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob přípravy emamektinu. V tomto postupu se P450 monooxygenáza, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4' '-keto-avermektin, přidá do reakční směsi obsahující avermektin. Reakční směs se pak inkubuje za podmínek umožňujících, aby P450 monooxygenáza regioselektivně oxidovala avermektin na 4''-keto-avermektin. Reakční směs může dále obsahovat ferredoxin, např. ferredoxin z tohoto vynálezu. V určitých provedeních reakční směs dále obsahuje reduktázu ferredoxinu, např. ferredoxin z tohoto vynálezu. Reakční směs může dále obsahovat redukční činidlo, např. NADH či NADPH.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy 4''keto-avermektinu. Tento postup zahrnuje přidání P450 monooxygenázy, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin, do reakční směsi obsahující avermektin a inkubaci reakční směsi za podmínek umožňujících, aby P450 monooxygenáza regioselektivně oxidovala avermektin na 4''keto-avermektin. V některých provedeních reakční směs dále obsahuje ferredoxin, např. ferredoxin z tohoto vynálezu. Reakční směs může dále obsahovat reduktázu ferredoxinu, např. ferredoxin z tohoto vynálezu. V určitých provedeních obsahuje reakční směs redukční činidlo, např. NADH či NADPH.

Předkládaný vynález také poskytuje kompozici e pro přípravu mamektinu obsahující P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4-keto-avermektin. V některých provedeních popis dále zahrnuje ferredoxin, např. ferredoxin z tohoto vynálezu. V určitých provedeních je ferredoxin izolován ze stejného druhu buněk či kmene, ze kterého byla izolována či odvozena P450 monooxygenáza. Popis • · ·· · ·

- 61 např. reduktázu provedeních je může dále zahrnovat reduktázu ferredoxinu, ferredoxinu z tohoto vynálezu. V určitých reduktáza ferredoxinu izolována ze stejného druhu buněk či kmene, ze monooxygenáza kterého byla izolována či odvozena P450 V některých provedeních zahrnuje popis redukční činidlo, např. NADH či NADPH.

Předkládaný vynález poskytuje také kompozici pro přípravu 4''-keto-avermektinu obsahující P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4' '-keto-avermektin.

V některých provedeních popis dále zahrnuje ferredoxin, např. ferredoxin z tohoto vynálezu. V určitých provedeních je ferredoxin izolován ze stejného druhu buněk či kmene, ze kterého byla izolována či odvozena

V některých provedeních popis dále ferredoxinu, např. reduktázu ferredoxinu z tohoto vynálezu.

V určitých provedeních je reduktáza ferredoxinu izolována ze stejného druhu buněk či kmene, ze kterého byla izolována či odvozena P450 monooxygenáza. Popis může dále zahrnovat redukční činidlo, např. NADH či NADPH.

P450 monooxygenáza. zahrnuje reduktázu

Následující příklady mají dále ilustrovat některá výhodná provedení předkládaného vynálezu a ve své podstatě nejsou pro tento vynález omezující.

«9 ·· · · «9 9999 • •99 99 99 99 ·

99 «9 9 9 9

9 9 9 9 9999 9

9 9 9 9 «999

9999 99 999 999 99 99

- 62 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Optimalizované podmínky růstu kmene Streptomyces tubercidicus R-922

V jednom neomezujícím příkladě byly optimalizovány fermentační podmínky potřebné pro získání stálého zdroje kmene Streptomyces tubercidicus R-922 s vysokou schopností regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin.

Nejprve byly připraveny následující roztoky. Pro získání agaru ISP-2 byly 4 g kvasničného extraktu (komerčně dostupného od firmy Oxoid Ltd, Basingstoke, UK), 4 g D ( + )-glukózy, 10 g bakterálního sladového extraktu (Difco No. 0186-17-7 (Difco produkty komerčně dostupné např. od firmy Voigt Global Distribution, Kansas City, MO) ) a 20 g agaru (Difco No. 014001) rozpuštěny v jednom litru demineralizované vody a pH bylo upraveno na 7,0. Roztok byl sterilizován při 121 °C po 20 min, ochlazen a uložen při 55°C na dobu potřebnou pro okamžitou přípravu agarových ploten.

Pro získání média PHG bylo 10 g peptonu (Sigma 0521; komerčně dostupného od firmy Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO) , 10 g kvasničného extraktu (komerčně dostupného od Difco), g D(+)-glukózy, 2 g NaCl, 0,15 g MgSO₄ x 7 H₂O, 1,3 g NaH₂PO₄ x H₂O a 4,4 g K₂HPO₄ rozpuštěno v 1 litru demineralizované vody a pH bylo upraveno na 7,0.

Kmen Streptomyces tubercidicus R-922 byl pomnožen na petriho misce v agaru ISP-2 při 28°C. Tato kultura byla použita pro inokulaci 500 ml třepacích lahví se zátkou, z nichž každá obsahovala 100 ml média PHG. Předběžné kultury byly ponechány růst v krouživé třepačce při 120 rpm po 72 hod a poté použity k inokulaci 10-ti litrového fermentátoru vybaveného mechanickým míchadlem a obsahujícího 8 litrů média PHG. Tato hlavní kultura byla ponechána růst při 28°C za míchání při 500 rpm s provdzušňováním 1,75 vvm (14 1/min) při tlaku 0,7 barů. Na konci exponenciálního růstu, po cca 20 hodinách, byly buňky sklizeny centrifugací. Výtěžek vlhkých buněk byl 70-80 g/1 kultury.

Příklad 2

Test biokatalýzy celých buněk

Podle předkládaného vynalezu byl následující test biokatalýzy celých buněk využit k určení, zda aktivita buněk Streptomyces schopných regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin je kataiyzována P450 monooxygenázou.

Kmen Streptomyces tubercidicus R-922 byl pomnožen v médiu PHG a kmen Streptomyces tubercidicus 1-1529 byl pomnožen v médiu

M-17 nebo PHG. Médium PHG 0.521), 10 g/1 kvasničného g/1 D-glukózy, 2 g/1 NaCl,

NaH₂PO₄ x 1 H₂O a 4,4 g/1 obsahuje 10 g/1 glycerolu, soytonu (Difco 0437-17), 3

0127-17-9), 2 g/1 (NH₄)₂SO₄ a

obsahuj e	10 g/1	peptonu	(Sigma,
extraktu	(Difco,	0127-17	-9), 10
0,15 g/1	MgSO4 x	7 H2O,	1,3 g/1
K2HPO4 při pH 7	,0. Médium M-17
20 g/1	dextrinové běli,	10 g/1
g/1 kvasničného	extraktu	(Difco

g/1 CaCCb při pH 7,0.

9999

- 64 K množení buněk byla inokulována ISP2 agarová plotna (ne starší 1-2 týdnů) a inkubována po 3-7 dní, až bylo dosaženo dobrého nárůstu. Poté byla část přerostlého agaru přenesena (pomocí inokulační kličky) do 250 ml erlenmeyerovy baňky se zátkou obsahující 50 ml média PHG. Tato předběžná kultura se inkubovala při 28 °C a 120 rpm po 2-3 dny. Pak bylo 5 ml předběžné kultury přeneseno do 500 ml erlenmeyerovy baňky se zátkou obsahující 100 ml média PHG. Hlavní kultura se inkubovala při 28 °C a 120 rpm 2 po dny. Poté byla kultura centrifugována po 10 min při 8000 rpm v rotoru Beckman JA-14. Buňky pak byly jednou promyty 50 mM pufrem fosfátu draselného, pH 7,0.

K provedení testu biokatalýzy celých buněk bylo 500 mg vlhkých buněk umístěno do 25 ml erlenmeyerovy baňky, do níž bylo přidáno 10 ml 50 mM pufru fosfátu draselného, pH 7,0. Buňky byly promíchávány magnetickým míchadlem k rozdělení buněk. Poté se přidalo 15 μΐ roztoku avermektinu Bia v izopropanolu (30 mg/ml) a směs byla třepána na krouživé třepačce při 160 rpm a 28°C. Kmen R-922 se ponechal reagovat 2 hodiny a kmen 1-1529 30 hodin.

Pro přípravu kultur k testu biokatalýzy celých buněk bylo 10 ml metyl-t-butyl-éteru přidáno do erlenmeyerovy baňky obsahující klidové buňky a celá buněčná směs se přenesla do 30 ml centrifugační kyvety, důkladně se protřepala a poté centrifugovala při 16000 rpm po 10 min. Éterová fáze se napipetovala do 50 ml kulaté baňky a odpařila se vakuem pomocí rotačního odpařovače (<0,l mbarů). Reziduum se rozpustilo v 1,2 ml acetonitrilu a přeneslo do zkumavky pro HPLC. Přeměnu avermektinu Bia na 4''-hydroxy-avermektin Bia (zvaný také 4'oxo-avermektin Bia) a tvorbu vedlejšího produktu

• 4 • · 4	44	4 4« 4	4 4 · 4	44	4444 • 4
• •	4 4	4 •	4 4
4	4	4	•	♦	4	4	4 4
44 4 4	4	4	44·	444	4 ·		44

biokatalytické reakce bylo možno pozorovat při analýze HPLC podle protokolu HPLC I.

Při protokolu HPLC I byly použity tyto parametry:

Hardware

Pumpa:

Autosampler:

Modul rozhraní: Detektor kanálu 1 Pec kolony:

Kolona:

Adsorbent:

L-6250 Merck-Hitachi

AS-2000A Merck-Hitachi

D-6000 Merck-Hitachi

L-7450A UV-Diode Array Merck-Hitachi žádná

70mm x 4mm

Kromasil 100Á-3,5p-C18

Mód gradientu: nízký

Tlakový limit: 5-300bar

Teplota kolony mírná («20°C)

Rozpouštědlo A: acetonitril

Rozpouštědlo B: voda

Průtok: 1,5 ml/min

Detekce:	2 43 nm
Tabulka pro pumpu:	0,0 min	75%	A	25%	B
lineární gradient	7,0 min	100%	A	0%	B
	9,0 min	100%	A	0%	B
skok	9,1 min	75%	A	25%	B
	12,0 min	75%	A	25%	B
Čas zastavení:	12 min

Doba odběru: každých 200 msec

Tabulka retenčních časů: čas		Reference
2, 12	min	4-hydroxy-avermektin Bia
3,27	min	avermektin Bia
3,77	min	3//-0-demetyl-4//-ketoavermektin Bia

4,83 min 4-keto-avermektin Bia • · • · • ·

- 66 Příklad 3

Biotransformace bezbuněčným extraktem z kmene Streptomyces R922

K přípravě aktivního bezbuněčného extraktu z kmene Streptomyces tubercidicus R-922 schopného regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin byly zhotoveny, uloženy při 4°C a při použití umístěny na ledu tyto roztoky.

Roztok	složení
Pufr PP	50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,0)
Disrupční pufr	50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,0), 5 mM benzamidin, 2 mM dithiothreitol a 0,5 mM Pefabloc (od Roche Diagnostics)
Substrát	10 mg avermektinu bylo rozpuštěno v 1 ml izopropanolu

Šest gramů vlhkých buněk kmene Streptomyces R-922 bylo promyto pufrem PP a poté resuspendováno v 35 ml disrupčního pufru a rozbito postupem drcení mražené směsi (French press) při 4°C. Výsledná suspenze byla centrifugována po 1 hod při 35000 x g. Supernatant bezbuněčného extraktu byl odebrán. Jeden μΐ substrátu byl přidán k 499 μΐ čirého bezbuněčného lyzátu a inkubován při 30°C po 1 hod. Poté se do reakční směsi přidal 1 ml metyl-t-butyl éteru a vše se důkladně promíchalo. Směs pak byla centrifugována po 2 min. při 14000 rpm a fáze metyl-t-butyl éteru byla převedena do 10 ml baňky a odpařena

vakuem pomocí rotačního odpařovače. Reziduum bylo rozpuštěno ve 200 μΐ acetonitrilu a převedeno do zkumavky pro HPLC.

Pro HPLC byl použit protokol HPLC I.

Když se 1 μΐ substrátu přidal k 499 μΐ čirého bezbuněčného extraktu a inkuboval se při 30°C, nebyla při analýze HPLC za použití protokolu HPLC I pozorována žádná přeměna avermektinu na 4''-keto-avermektin.

Byla však zkoumána možnost přidání špenátového ferredoxinu a špenátové reduktázy ferredoxinu s NADPH do bezbuněčného extraktu pro obnovení biokatalytické aktivity (viz obecně D.E. Cane and E.I. Graziani, J. Amer. Chem. Soc. 120:2682, 1998). Byly tedy připraveny následující roztoky:

Roztok	složení
Substrát	10 mg avermektinu bylo rozpuštěno v v 1 ml izopropanolu
Ferredoxin	5 mg ferredoxinu (špenátového), roztok 1-3 mg/ml v pufru Tris/HCl (od Fluky) nebo 5 mg ferredoxinu (z Clostridium pasteurianum), roztok 1-3 mg/ml v pufru Tris/HCl (od Fluky) nebo 5 mg ferredoxinu (z Porphyra umbilicalis), roztok 1-3 mg/ml v pufru Tris/HCl (od Fluky)
Reduktáza	1 mg mrazem sublimované reduktázy
ferredoxinu	ferredoxinu (špenátové), roztok 3,9 U/mg v 1 ml H20 (od Sigmy)
NADPH	100 mM NADPH v H20 (od Roche Diagnostics)

«· ·· • · · · • · • ··

Roztok substrátu byl uložen při 4°C, ostatní roztoky byly uloženy při -20°C a při použití umístěny na ledu.

K 475 μΐ čirého bezbuněčného extraktu tedy byly přidány tyto roztoky: 10 μΐ ferredoxinu, 10 μΐ reduktázy ferredoxinu a 1 μΐ substrátu. Po přidání substrátu k buňkám byla směs ihned a důkladně promíchána a provzdušněna. Poté bylo přidáno 5 μΐ NADPH a směs se inkubovala při 30 °C po 30 min. Pak byl k reakční směsi přidán 1 ml metyl-t-butyl éteru a vše se důkladně promíchalo. Směs byla poté centrifugována 2 min při 14000 rpm a fáze metyl-t-butyl éteru byla převedena do 10 ml baňky a odpařena vakuem pomocí rotačního odpařovače. Reziduum bylo rozpuštěno v 200 μΐ acetonitrilu, převedeno do zkumavky pro HPLC a byla provedena analýza HPLC podle protokolu HPLC I.

Při analýze HPLC bylo možno pozorovat tvorbu 4^z'-ketoavermektinu. Přidání špenátového ferredoxinu a špenátové reduktázy ferredoxinu s NADPH k bezbuněčnému extraktu tedy vede k obnovení biokatalytické aktivity.

Po injekci 30 μΐ vzorku se v 4,83 minutě objevilo maximum, což bylo důkazem přítomnosti 4''-keto-avermektinu Bia. Tomuto maximu bylo možno pomocí hmotnostní spektrometrie HPLC přiřadit hmotnost 870 D, což odpovídá molekulové hmotnosti 4''-keto-avermektinu Bia.

Je třeba zaznamenat, že při analýze vzniku produktů pomocí HPLC a hmotnostní spektrometrie HPLC byl zjištěn kromě

4-keto-avermektinu odpovídající ketohydrát 4''-hydroxyavermektin, který dával maximum v 2,12 min. Tento nález ukazuje, že P450 monooxygenáza převádí avermektin hydroxylací na 4''-hydroxy-avermektin, ze kterého se dehydratací tvoří 4' '-keto-avermektin. Je zajímavé, že když špenátový ferredoxin byl nahrazen ferredoxinem z bakterie Clostridium pasteurianum ·· 0000 » 0 0 4 • »· • · ·

0 0

0 0 0 • 0 0 0 • 00 ··

- 69 či z červené řasy Porphyra umbilicalis_r biokatalytická konverze avermektinu na 4''-keto-avermektin stále přetrvávala, což znamená, že enzym není při získávání redukčních ekvivalentů závislý na specifickém ferredoxinu.

Příklad 4

Izolace mutovaného kmene Streptomyces R-922 se zesílenou aktivitou

K získání kmenů Streptomyces R-922, které mají zesílenou schopnost regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-ketoavermektin, byly vytvořeny UV mutanty. Za tímto účelem byly sebrány spory kmene Streptomyces R-922 a uloženy v 15% glycerolu při -20°C. Tento zásobní roztok obsahoval 2xl0⁹ spor.

Zásobní roztok spor byl poté zředěn a přenesen na petriho misky obsahující 10 ml sterilní vody, roztok byl vystaven UV záření ze zdroje Stratalinker UV crosslinker 2400 (komerčně dostupného od firmy Stratagene, La Jolla, CA). Stratalinker UV crosslinker používá zdroj 254-nm záření a množství energie využité k ozáření vzorku lze nařídit v „energetickém módu.

Pomocí experimentů bylo zjištěno, že k usmrcení 99,9 % spór je třeba vystavit je 8000 mikrojoulům UV ozáření (254 nm). Tato hladina vystavení UV byla použita při mutagenezi.

Spory, které přežily UV mutagenezi, byly plátovány, kultivovány a převedeny do minimálního média. Bylo zjištěno, že přibližně 0,3-0,4% živých spór je auxotropních, což znamená, že úroveň mutageneze v populaci byla dobrá.

ΊΟ

• · •	·· * · ©·	• •	• ·· •	··	···· • •
• •	€ •
•	• i		•	•	•	• ·
····	··	···	♦ ··	··		··

Mutagenizované klony byly testovány na aktivitu v testu biokatalýzy celých buněk popsaném v příkladu 2. Jak ukázal chromatogram HPLC, jedna mutanta („UV mutanta R-922) vykazovala dvoj- až trojnásobně zvýšenou schopnost regioselektivně oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin ve srovnání s kmenem R-922 divokého typu. Ačkoli gen kódující P450 monooxygenázu odpovědný za aktivitu regioselektivní oxidace, emal, není v mutantě R-922 mutován, tato mutanta přesto poskytuje výborný zdroj bezbuněčného extraktu obsahujícího protein emal.

Příklad 5

Izolace P450 monooxygenázy z kmene Streptomyces R-922

K získání obohaceného enzymu P450 bylo 35 ml aktivního bezbuněčného extraktu fitrováno přes 45 μιη filtr a rozděleno do frakcí výměnnou aniontovou chromatografií. Podmínky výměnné aniontové chromatografie byly následující:

Přístroj na FPLC: Kolona na FPLC:

eluenty teplota průtok detekce

Tabulka pro pumpu lineární gradient

Akta prime (od Pharmacia Biotech)

HiTrap™Q (5 ml) nanesená na Resource® Q (6 ml) (from Pharmacia Biotech) pufr A: 25 mM Tris/HCl (pH 7,5) pufr B: 25 mM Tris/HCl (pH 7,5) obsahující 1 M KC1 láhve s eluenty a frakce na ledové lázni 3 ml/min UV 280 nm

0,0 min 100% A 0% B

2,0 min 90% A

10% B

		5,0 i	min	90% A	10%	B
lineární	gradient	30, 0	min	50% A	50%	B
lineární	gradient	40,0	min	0% A	100%	B
		50,0	min	0% A	100%	B

Enzymatická aktivita se vymyla 35%-40% pufrem B. Aktivní frakce se spojily a koncentrovaly centrifugační filtrací přes filtry Biomax™ s vylučovacím limitem 5 kD (komerčně dostupným od firmy Millipore Corp., Bedford, MA) při 5000 rpm a poté byly znovu rozpuštěny v disrupčním pufru obsahujícím 20% glycerol na objem 5 ml s obsahem 3-10 mg/ml proteinu. Tento roztok obohaceného enzymu obsahoval nejméně 25% původní enzymatické aktivity.

Enzym byl dále purifikován vylučovací chromatografií („size exclusion chromatography). Podmínky této chromatografie byly následující:

Přístroj pro FPLC Kolona pro FPLC:

vzorek:

příprava vzorku: eluční pufr: teplota: průtok: detekce:

Akta prime (from Pharmacia Biotech)

HiLoad 26/60 Superdex® 200 prep grade (od Pharmacia Biotech)

3-5 ml obohaceného roztoku enzymu z kroku výměnné aniontové chromatografie filtrace přes 45 μιη filtr pufr PP (pH 7,0) + 0,1 M KC1 4°C ml/min

UV 280 nm

Enzymatická aktivita se vymyla mezi 205-235 ml elučního pufru. Aktivní frakce se spojily, koncentrovaly centrifugační filtrací přes filtry Biomax™ s vylučovacím limitem 5 kD (od

firmy Millipore) při 5000 rpm a poté byly znovu rozpuštěny v disrupčním pufru obsahujícím 20% glycerol na objem 0,5-1 ml s obsahem 2-5 mg/ml proteinu. Tento obohacený roztok enzymu obsahoval 10% původní enzymatické aktivity. Tento preparát enzymu po kontrole čistoty pomocí SDS page (viz obecně Laemmli, U.K., Nátuře 227:680-685, 1970 a Current Protocols in Molecular Biology, viz výše) a obarvení Coomassie blue vykazoval podle referenčních proteinů o známé molekulové hmotnosti jeden hlavní proteinový proužek o molekulové hmotnosti 45-50 kD.

Příklad 6

Pokus o izolaci genů pro P450 monoxygenázu z kmenů Streptomyces R-922 a 1-1529

Na základě výše popsaných výsledků, které naznačovaly, že enzymem z kmene R-922 odpovědným za regiospecifickou oxidaci avermektinu na 4''-keto-avermektin je P450 monooxygenáza, byl započat přímý pokus klonovat P450 monooxygenázu z tohoto kmene založený na PCR (viz obecně Hyun et al., J. Microbiol. Biotechnol. 8(3):295-299, 1998). Tento pokus je založen na faktu, že všechny enzymy P450 monooxygenázy jsou vysoce konzervativní na nukleotidové úrovni. Byly navrženy PCR primery k navázání na tyto konzervativní domény a amplifikaci fragmentů DNA z genů P450 pomocí genomové DNA z R-922 či 1-1529 jako templátu. Použité PCR primery jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1

• · · · ·	• · »	• · ·
• ·	•	•	•	©	•	•
9 ·	• ·	•	•	• ©	•
• ·	•	•	•	•	•	•
• · · · ·	•	• · *	• · ·	• ·		• ·

Primery vazebné domény pr	o O2	(5' až 3')*	Degenerace	SEKV. ID. Č.
I	A	G	H	E	T	T				43
ATC	GCS	GGS	CAC	GAG	ACS	AC			8	44
V	A	G	H	E	T	T				45
GTS	GCS	GGS	CAC	GAG	ACS	AC			16	46
L	A	G	H	E	T	T				47
CTS	GCS	GGS	CAC	GAG	ACS	AC			16	48
L	L	L	I	A	G	H	E	T		49
TS	CTS	CTS	ATC	GCS	GGS	CAC GAG	AC5	32	50
Primery	vazebné domény	pro hem (3' až 5' ) *
H	Q	C	L	G	Q	N	L	A		51
GTG	GTC	ACG	GAS	CCS	TGC	TTG	GAS	CGS	8	52
F	G	H	G	V	H	Q	C			53
AAG	CCS	GTG	CCS	CAS	GTG	GTC	ACG		8	54
F	G	F	G	V	H	Q	C			55
AAG	GCS	AAG	CCS	CAS	GTG	GTC	ACG		8	56
F	G	H	G	I	H	Q	C			57
AAG	CCS	GTG	CCS	TAG	GTG	GTC	ACG		4	58
F	G	H	G	V	H	F	C			59
AAG	CCS	GTG	CCS	CAS	GTG	AAG	ACG		8	60

* Aminokyselinová sekvence je uvedena v horní řádce a odpovídající nukleotidové sekvence je uvedena pod ní v druhé řádce; S=G či C.

^s Tento primer popsal Hyun et al., viz výše.

Amplifikací PCR pomocí kteréhokoli z primerů specifického pro nukleotidové sekvence kódující vazebnou doménu pro 0₂ s kterýmkoli primerem specifickým pro nukleotidové sekvence kódující vazebnou doménu pro hem a genomovou DNA z kmenů «· • · ··· · ·· ··

- 74 Streptomyces R-922 či 1-1529 byl získán fragment DNA o cca 350 bp. To představuje přesnou velikost, která by byla očekávána po této amplifikací PCR díky cca 350 bp oddělení úseků genů kódujících vazebná místa pro O₂ a hem v genech P450.

PCR fragmenty o délce 350 bp byly klonovány do klonovacího plasmidu pCR2.1-TOPO TA (komerčně dostupného od firmy Invitrogen, Carlsbad, CA) a transformovány do kmene E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Přibližně 150 jednotlivých klonů z kmenů R-922 a 1-1529 bylo sekvenováno k určení, kolik unikátních fragmentů genu P450 představují. Analýzou sekvencí bylo zjištěno, že zahrnují 8 unikátních fragmentů genu P450 z kmene R-922 a 7 unikátních fragmentů z 1-1529.

BLAST analýza (srovnání aminokyselinových sekvencí odpovídajících fragmentům PCR specifickým pro gen P450 odvozeným z kmene Streptomyces tubercidicus R-922 resp. z kmene Streptomyces 1-1529 a P450 monooxygenázy ze S. thermotolerans účastnící se syntézy karbomycinu(Stol-ORFA) (GenBank Accession No. D30759)) programem Pretty z University of Wisconsin Package verze 10.1 (Altschul et al. , Nud. Acids Res. 25:3389-3402) ukázala, že všechny unikátní fragmenty genu P450 z obou kmenů R-922 a 1-1529 byly odvozeny z genů P450 a kódují oblast mezi vazebnými doménami pro O₂ a hem.

Dále byly ke klonování celých genů, ze kterých byly odvozeny fragmenty PCR, použity fragmenty DNA klonované PCR jako hybridizační sondy pro knihovny genů obsahující genomovou Za tímto účelem byla genomová DNA

DNA z kmenů R-922 a 1-1529 z kmenů R-922 a 1-1529 částečně rozštěpena Sau3A fosfatázou (CIP) lígována do kosmidu pPEH215, upravené verze SuperCos defosforylována telecí intestinální

I, a

(komerčně dostupného od firmy Stratagene, La Jolla, CA).

Produkty ligace byly sbaleny pomocí sbalovacího extraktu * · · · ·

- 75 Gigapack III XL a transfekovány do hostitelských buněk E. coli XLI Blue MR. Dvanáct kosmidů silně hybridizujících s genovými fragmenty P450 získanými PCR bylo určeno pomocí knihovny R-922 a z nich byly překlonovány a sekvenovány tři unikátní geny P450. Hybridizace proběhly za vysoce stringentních podmínek podle protokolu Churche a Gilberta (Church and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:1991-1995, 1984). V krátkosti, tyto vysoce stringentní podmínky zahrnují hybridizační pufr obsahující 500 mM Na-fosfát, 1 mM EDTA, 7% SDS, 1% BSA; promývací pufr 1 obsahující 40 mM Na-fosfát, 1 mM EDTA, 5% SDS, 0,5% BSA; a promývací pufr 2 obsahující 40 mM Na-fosfát, 1 mM EDTA, 1% SDS (pozn.: jiné vysoce stringentní podmínky jsou popsány např. v Current Protocols in Molecular Biology, viz výše.). Z knihovny 1-1529 bylo identifikováno devatenáct silně hybridizujících kosmidů a z nich byly čtyři unikátní geny P450 překlonovány a sekvenovány.

Při dalším pokusu izolovat různé geny P450 monooxygenázy z kmenů R-922 a 1-1529 byl k identifikaci kosmidových klonů obsahujících homologní geny P450 z kmenů R-922 a 1-1529 použit jako hybridizační sonda známý gen P450 z jiné bakterie. Gen epoF P450 z kmene Sorangium cellulosum So ce90, účastnící se syntézy epothilonů (Molnar et al., Chem Biol. 7(2):97-109, 2000) byl za tímto účelem využit jako sonda. Pomocí sondy genu epoF P450 byl identifikován jeden kosmid z kmene R-922 (klon LC) a tři z kmene 1-1529 (klony LA, LB a EA) . Ve všech případech byl fragment homologního genu překlonován a sekvenován a bylo zjištěno, že kóduje enzymy P450 monooxygenázy.

Srovnání 17 polypeptidových sekvencí určených v příkladu 7 (viz níže) však nevedlo k jejich přiřazení k žádným z klonovaných genů. Dvě z polypeptidových sekvencí (konkrétně

- 76 LVKDDPALLPR a AVHELMR) se na mapě nalézaly v oblasti mezi vazebnými doménami pro 0₂ a hem, a bývaly by tudíž měly identifikovat kterýkoli z částečných genových fragmentů odvozených postupem PCR. Standardní postupy založené na známém postupu PCR podle Hyun et al., viz výše, a s využitím známých P450 genů jako hybridizačních sond tedy nevedly k identifikaci genu kódujícího specifickou P450 monooxygenázu odpovědnou za regioselektivní oxidaci avermektinu. Bylo tedy rozhodnuto, že k izolaci genu kódujícího P450 monooxygenázu a předkládaného vynálezu je třeba provést další experimenty.

Příklad 7

Částečné sekvenování P450 monooxygenázy z kmene Streptomyces R-922

Částečné aminokyselinové sekvenování P450 monooxygenázy z kmene Streptomyces R-922 bylo provedeno na Friedrich Miescher Institute, Basilej, Švýcarsko. Protein z dominantního proužku na SDS page byl rozštěpen trypsinem a vytvořené peptidy byly odděleny a sekvenovány hmotnostní spektrometrií a Edmanovým odbouráváním (viz obecně Zerbe-Burkhardt et al., J. Biol. Chem. 273:6508, 1998). Byly nalezeny sekvence těchto 17 peptidů:

• · • » « · · · I

Sekvence	Sekvence	I.D.	No.
HPGEPNVMD PALIT DP FTGYGALR	(SEKV.	ID	. Č.	61)
FVNNPASPSLNYAPEDNPLTR	(SEKV.	ID	. Č.	62)
LLTHYPDISLGIAPEHLER	(SEKV.	ID	. Č.	63)
VYLLGSILNYDAPDHTR	(SEKV.	ID	. Č.	64)
TWGADLISMDPDR	(SEKV.	ID	. Č.	65)
EALTDDLLSELIR	(SEKV.	ID	. Č.	66)
FMDDSPVWLVTR	(SEKV.	ID	. Č.	67)
LMEMLGLPEHLR	(SEKV.	ID	. Č.	68)
VEQIADALLAR	(SEKV.	ID.	. Č.	69)
LVKDDPALLPR	(SEKV.	ID,	. Č.	70)
DDPALLPR	(SEKV.	ID,	. Č.	71)
TPLPGNWR	(SEKV.	ID,	. Č.	72)
LNSLPVR	(SEKV.	ID,	. Č.	73)
ITDLRPR	(SEKV.	ID,	. Č.	74)
EQGPVVR	(SEKV.	ID.	. Č.	75)
AVHELMR	(SEKV.	ID.	. Č.	76)
AFTAR	(SEKV.	ID.	. Č.	77)
FEEVR	(SEKV.	ID.	. Č.	78)
Ze srovnání těchto	peptidů	s	výběrem

monooxygenázy aktinomycet vyplynulo, že všechny jsou fragmenty jediné P450 monooxygenázy.

sekvencí P450 tyto peptidy • · · ·

I · · · · ·

Příklad 8

Klonování genu P4 50 monooxygenázy z kmene R-922 kódujícího enzym odpovědný za oxidaci avermektinu na 4''-keto-avermektin

Reverzní translací aminokyselinových sekvencí několika peptidů odvozených z enzymu P450 kmene R-922 (viz příklad 7 a Tabulka 2 níže) byly navrženy primery PCR. Každý z pěti přímých (forward) primerů (2aF, 2bF, 3F, 1F a 7F) byl párován s jedním reverzním primerem (5R) v reakcích PCR s genomovou DNA R-922 jako templátem. V každé reakci byl připraven fragment DNA očekávané velikosti.

Tabulka 2

Při- měř	Sekvence primeru a aminokyselinová sekvence pro kterou byly navrženy*	Dege- nerace	Očekávaná velikost (bp)**	SEKV. ID. Č.
2aF	P	G	E	D	N	V	M		64	600	79
	5'-CCS	GGS	GAR	CCS	AAY	GTS	ATG	-3'			80
2bF	A	L	I	T	D	P	F		32	580	81
	5'-GCS	CTS	ATY	ACS	GAC	CCS	TTC	-3'			82
3F	F	M	D	D	S	P	V	W	32	549	83
	5'-TTC	ATG	GAC	GAC	WSS	CCS	GTS	TGG-3'			84
1F	L	N	Y	D	A	P	D	H	32	350	85
	5'-CTS	AAY	TAY	GAC	GCS	CCS	GAC	CAC-3'			86
7F	V	E	Q	I	A	D	A	L	32	300	87
	5'-GTS	GAR	CAG	ATY	GCS	GAC	GCS	CTS-3'			88
5R	D	L	I	S	M	D	P	D	64	—	89
	3'-CTG	GAS	TAR	WSS	TAC	CTG	GGS	CTG-5'			90

Nejednoznačné kódy : Y=C či T; R=A či G; S=C či G; W=A či T

Očekávaná velikost produktu PCR, když je primer párován s primerem 5R

Fragmenty PCR o velikosti 580 a 600 bp vytvořené pomoci primerů (2bF and 5R) resp. (2aF and 5R) byly klonovány do klonovacího plasmidu pCR-Blunt II-TOPO (komerčně dostupného od firmy Invitrogen, Carlsbad, CA) a transformovány v kmenu E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vložené fragmenty DNA pak byly sekvenovány. Analýza sekvencí ukázala, že fragmenty velikosti 580 a 600 bp byly totožné ve společných 580 bp. Byla také velmi dobrá shoda mezi předpokládanou aminokyselinovou sekvencí (SEKV. ID. Č. 2) odvozenou z nukleotidové sekvence fragmentů o 580 a 600 bp a aminokyselinovou sekvencí peptidů izolovaných z purifikovaného enzymu P450_Eraai, jež se v této oblasti shodovaly s izolovaným genem. Tento výsledek silně naznačoval, že fragmenty genu izolované z těchto klonů jsou odvozeny z genu, který kóduje enzym P450_Efflai odpovídající za oxidaci avermektinu na 4''-keto-avermektin.

Fragment PCR o 600 bp vytvořený pomocí primerů 2aF (SEKV. ID. Č. 80) a 5R (SEKV. ID. Č. 90) byl využit jako hybridizační sonda pro kosmidovou knihovnu genomové DNA izolované z kmene R-922 (kosmidová knihovna popsaná v příkladu 6) . Byly identifikovány dva kosmidy nazvané pPEH249 a pPEH250, které silně hybridizovaly se sondou. Část obou z kosmidů kódující enzym P450 byla sekvenována a bylo zjištěno, že sekvence obou kosmidů se shodují. Byla identifikována úplná kódující sekvence genu emal (SEKV. ID. Č. 1) . Aminokyselinová sekvence všech polypeptidových fragmentů z P4 50_Emai se velmi dobře shodovala s předpokládanou aminokyselinovou sekvencí genu emal. Srovnání předpokládané aminokyselinové sekvence proteinu kódovaného genem emal provedené pomocí BLASTP (Altschul et al., viz výše) ukázalo, že nejpřesnější shoda v databázích je s P450 monooxygenázou z S. thermotolerans, která se účastní biosyntézy karbomycinu (Arisawa et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59(4):582-588, 1995) a jejíž shoda s emal je pouze • · ··· · • · · · * · · · ·· ·

- 80 49% (shody = 202/409 (49%), pozitivní = 271/409 (65%), mezery = 2/409 (0%)). V analýze BLAST byla použita tato nastavení:

BLASTP 2.0.10

Lambda K

0.322 0.140

0.428

Lambda s mezerami K H

0.270 0.0470 0.230

Matice: BLOSUM62

Penalizece mezer: Existence: 11, Extenze: 1

Počet zásahů v DB: 375001765

Počet sekvencí: .1271323

Počet extenzí: 16451653

Počet úspěšných extenzí: 46738

Počet sekvencí lepších než 10.0: 2211

Počet HSP lepších než 10.0 bez vkládání mezer: 628

Počet HSP s úspěšně vloženými mezerami v předběž. testu: 1583 Počet HSP které se pokusily o vložení mezer v předběž. testu: 43251 Počet HSP s mezerami (ne předběž.): 2577

Délka vyhledávání: 430 délka databáze: 409,691,007 efektivní délka HSP: 55 efektivní délka vyhledávání: 375 efektivní délka databáze: 339,768,242 efektivní prostor vyhledávání: 127413090750 použitý efektivní prostor vyhledávání: 127413090750

Podobné srovnání nukleotidových sekvencí těchto dvou genů ukázalo, že mají 65% shodu na úrovni nukleotidů. Tyto výsledky ukazují, že P450_Emal je nový enzym.

φ φ · · φ φ φφφφφφ φφφφ φφ φφ φ φ « φφφ φ φ φφφ φφφφ φ φφφφ φ φφφ φ φ φφφφ φφφφ φφ φφφ φφφ φφ ··

- 81 Příklad 9

Heterologní exprese genu emal v kmenu Streptomyces lividans ZX7

Kódující sekvence genu emal byla fúzována s promotorem indukovatelným thiostreptonem (tipA) (Murakami et al., J. Bacteriol. 171:1459-1466, 1989). Promotor tipA byl odvozen z plasmidu pSITl51 (Herron and Evans, FEMS Microbiology Letters 171:215-221, 1999).

Fúze promotoru tipA a kódující sekvence emal bylo dosaženo nejprve pomocí amplifikace kódující sekvence emal s následujícími primery, aby bylo na 5'-konec vneseno klonovací místo pro PacI a na 3'-konec kompatibilní konec pro Pmel.

Přímý primer: Podtržená sekvence je rozpoznávací sekvence pro PacI; tučná sekvence je počátek kódující sekvence emal.

5'-AGATTAATTAATGTCGGAATTAATGAACTGTCCGTT-3' (SEKV.ID.Č. 91)

Reverzní primer: Podtržená sekvence je polovina rozpoznávací sekvence pro Pmel; tučná sekvence je reverzní komplementární sekvence translačního stop kodonu emal následovaná 3'-koncem kódující sekvence emal.

5'-AAACTCACCCCAACCGCACCGGCAGCGAGTTC-3 (SEKV. ID. Č. 92)

Fragment PCR rozštěpený PacI obsahující kódující sekvenci emal byl klonován do plasmidu pTBBKA (viz obr. 1), který byl podroben restrikci (tj. štěpen) PacI a plasmid byl transformován do E. coli.

Pmel, a ligovaný Čyři klony byly osekvenovány. Tři z těchto čtyř obsahovaly úplnou a správnou kódující sekvenci emal. Čtvrtý klon genu emal obsahoval zkrácenou verzi genu emal. Úplný gen emal kóduje protein začínající aminokyselinovou sekvencí MSELMNS (SEKV. ID. Č. 93). Zkrácený gen kóduje protein, ve kterém chybějí první 4 aminokyseliny a který začíná druhým methioninovým zbytkem. Tento gen byl nazván emalA. Nukleotidové a aminokyselinová sekvence emalA jsou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 33, resp. SEKV. ID. Č. 34. Geny emal a emalA v těchto plasmidech pTBBKA-emal a pTBBKA-emalA jsou ve správné poloze vůči promotoru tipA, čímž je zaručena exprese těchto genů z tohoto promotoru.

Plasmid pTBBKA obsahuje gen z inzerčního elementu Streptomyces IS117 kódující integrázu, která katalyzuje integraci plasmidu na specifické místo chromozomu druhu Streptomyces (Henderson et al., Mol. Microbiol. 3:1307-1318, 1989 a Lydiate et al., Mol. Gen. Genet. 203:79-88, 1986). Jelikož plasmid pTBBKA má pouze replikační počátek E. coli a mobilizační místo, lze ho konjugací přenést z E. coli do kmenů Streptomyces, kde se nebude replikovat. Je však schopen integrace do chromozomu díky integráze IS117 a klony Streptomyces obsahující chromozomální integrace lze selektovat rezistencí ke kanamycinu díky plasmidovému genu rezistence ke kanamycinu.

Kódující sekvence emal byla také klonována do jiných plasmidů, které se mohou buď replikovat ve Streptomyces, nebo se jako pTBBKA po vnesení do hostitele Streptomyces integrovat do chromozomu. Např. emal byl klonován do plasmidu PEAA, který

je podobný plasmidu pTBBKA, ale fragment KpnI/PacI obsahující promotor tipA je nahrazen promotorem genu ermE (Schmitt-John and Engels, Appl Microbiol Bíotechnol. 36(4):493-498, 1992). Navíc pEAA neobsahuje gen pro rezistenci ke kanamycinu. Gen emal byl klonován do PEAA jako fragment Pacl/Pmel, přičemž vznikl plasmid pEAA-emal, ve kterém je gen emal konstitutivně exprimován z promotoru ermE.

Plasmid pTUAlA je kyvadlový plasmid Streptomyces-E.coli (viz obr. 2) obsahující promotor tipA. Gen emal byl také klonován do místa Pacl/Pmel v plasmidu pTUAlA, čímž vznikl plasmid pTUA-emal.

Fragment genu emalA byl také ligován s fragmentem Pacl/Pmel a vnesen do plasmidů pTUAlA a pEAA stejným způsobem jako fragment genu emal, čímž vznikly plasmidy pTUA-emalA, resp. pEAA-emalA.

Plasmidy odvozené z pTBBKA, pTUAlA a pEAA obsahující geny emal či emalA byly vneseny do S. lividans ZX7 a ve všech případech byly získány a ověřeny transformanty (kmeny S. lividans ZX7::pTBBKA-emal či emalA, ZX7 (pTUA-emal či -emalA), resp. ZX7::pEAA-emal či -emalA).

Kmen Streptomyces lividans ZX7 divokého typu byl testován a bylo zjištěno, že není schopen oxidace avermektinu na 4''keto-avermektin. ZX7::pTBBKA-emal, kmeny S. lividans

ZX7 (pTUA-emal), ZX7

Trans formované ZX7::pTBBKA-ema2Λ, (pTUA-emalA), ZX7::pEAA-emal a ZX7::pEAA-emalA byly všechny testovány na schopnost oxidovat avermektin na 4''-ketoavermektin pomocí klidových buněk. Za tímto účelem byl proveden test biokatalýzy celých buněk popsaný výše (včetně postupu pro analýzu). Je třeba zaznamenat, že pro test biokatalýzy celých buněk byl transformovaný Streptomyces lividans, jako kmen R-922, zmnožen v médiu PHG a také stejně ·· ·· ♦ · · • ··

• · · • 9 ···· · · jako kmen R-922 ponechán 16 hodin reagovat (tj. během této doby bylo 500 mg transformovaných vlhkých buněk Streptomyces lividans v 10 ml 50 mM pufru fosfátu draselného, pH 7,0, třepáno při 160 rpm a 28 °C za přítomnosti 15 μΐ roztoku avermektinu v izopropanolu (30 mg/ml)).

Bylo zjištěno, že za přítomnosti induktoru thiostrepton (5 μg/ml) kmeny obsahující emal a emalA ZX7::pTBBKA-emal, ZX7::pTBBKA-emalA, ZX7 (pTUA-emal), ZX7 (pTUA-emalA) oxidují avermektin na 4''-keto-avermektin, což bylo zjištěno tím, že docházelo k tvorbě oxidované sloučeniny 4''-keto-avermektin (viz Tabulka 3).

Tabulka 3

Kmen	% Konverze	avermektinu
	2 hod	16 hod
Streptomyces lividans ZX7 + plasmid1
žádný	0	0
pTBBKA-emalA	0,5±0,059	1,17±0,112
pTBBKA-emal	0,21±0,0.356	0,65±0,079
pTUA-emal	20,96±1,044	42,0±2,5
pEAA-emal	3,0±0,232	24,l±0,358
pTBBKA-ema2	4,79±0,096	9,57±0,423
pTUA-ema2	0,77±0,138	2,05±0,537
pEAA-ema2	O o	1,73±3,00
pTBBKA-emal/fd233	8,89±0,720	30,99±0,880
pTUA-emal/fd233	23,29±0,854	61,2±3,548
pEAA-ema1/fd233	8,26±0,845	10,66±0,858
pTUA-ema2/fd233	1,85±0,861	6,40+1,918

• 0 ··· · » « · » · 9

Pseudomonas putida S12 + Plasmid
žádný		0
pRK-emal	ND2	18
pRK-emal/fd233	ND	32

pTBBKA= integraza IS117, promotor tipA; pTUA= replikativní plasmid, promotor tipA; pEAA= integráza IS117, promotor ermE ²neurčeno

Tyto výsledky jednoznačně dokazují, že enzym P4 50^^^1 kódovaný genem emal je v kmeni S. tubercidicus R-922 odpovědný za oxidaci avermektinu na 4''-keto-avermektin. Navíc tyto údaje dokazují, že gen eamlA, který je na N-konci o 4 aminokyseliny kratší než nativní gen emal, také kóduje aktivní enzym P450_Emai. Jak lze dokázat analýzou HPLC, oxidace avermektinu na 4''-keto-avermektin kmenem S. lividans ZX7::pTBBKA-emal po indukci exprese emal 0, 0,5, či 5,0 μg/ml thiostreptonu je závislá na množství thiostreptonu použitého k indukci exprese emal. Je třeba zaznamenat, že kmeny S. lividans ZX7::pEAA-emal a ZX7::pEAA-emalA (viz Tabulka 3) vykazovaly tuto oxidační aktivitu v nepřítomnosti thiostreptonu, protože v těchto kmenech jsou geny emal či emalA exprimovány z promotoru ermE, který nevyžaduje indukci.

»· ·*«

Příklad 10

Izolace genu homologního tubercidicus 1-1529 s emal z kmene

Streptomyces

Bylo zjištěno, že také kmen Streptomyces tubercidicus 1-1529 je aktivní v biokatalýze avermektinu při tvorbě derivátu 4''-keto-avermektin. Kosmidová knihovna

1-1529 popsaná v příkladu 6 byla testována z kmene vysoce za stringentních podmínek podle Churche a Gilberta (Church and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:1991-1995, 1984) PCR fragmentem emal o délce 600 bp připraveným pomocí primerů 2aF (SEKV. ID. Č. 80) a 5R (SEKV. ID. Č. 90), u nichž byla dříve popsána schopnost identifikovat klony obsahující homologa emal z kmene 1-1529. Byly identifikovány tři silně hybridizující kosmidy. Oblasti genu P450 ve dvou z těchto kosmidů, pPEH252 a pPEH253, byly sekvenovány a bylo zjištěno, že jsou totožné. Analýza sekvencí DNA prokázala přítomnost genu s vysokou homologií s genem emal kmene R-922. Srovnání předpokládané aminokyselinové sekvence Ema2 (tj . P450_Ema2 ), Emal (tj. P4 50_Emai) a P450 monooxygenázy ze Streptomyces thermotolerans, který se účastní biosyntézy karbomycinu (Carb-450) (GenBank Accession No. D30759) prokázalo, že všechny unikátní fragmenty genu P450 z kmenů R-922 i 1-1529 jsou odvozeny z genů P450 a kódovány oblastí mezi vazebnými doménami pro O₂ a hem.

Gen z kmene Streptomyces tubercidicus 1-1529 nazvaný ema2 kóduje enzym, který má 90% shodu na aminokyselinové úrovni a nukleotidů s enzymem P450_Emai· genu ema2 a předpokládaná aminokyselinová sekvence P450_Ema2 je uvedena jako SEKV. ID. Č. 3, resp. SEKV. ID. Č. 4.

90,6% shodu Nukleotidová na úrovni sekvence

Kódující sekvence ema2 byla klonována stejným způsobem jako geny emal a emal A do plasmidů pTBBKA, pTUAlA a pEAA tak, že kódující sekvence byla v těchto plasmidech funkčně připojena k promotoru tipA či ermE*. Výsledné plasmidy pTBBKA-ema2, pTUA-ema2 a pEAA-ema2 byly konjugací přeneseny z E. coli do S. lividans ZX7, takže vznikly kmeny ZX7::TBBKA-ema2, ZX7 (pTUA-ema2) a ZX7::pEAA-ema2 obsahující gen ema2 integrovaný do chromozomu či uložený v plasmidu.

Kmeny ZX7::TBBKA-ema2, ZX7 (pTUA-ema2) a ZX7::pEAA-ema2 byly dále testovány na schopnost oxidovat avermektin na 4''keto-avermektin. Bylo zjištěno, že také gen ema2 vykazuje biokatalytickou aktivitu, ovšem na nižší úrovni než gen emal (Tabulka 3).

Tyto výsledky ukazují, že gen ema2 z kmene S. tubercidicus 1-1529 také kóduje enzym P450 (P450_Ema2) schopný oxidovat avermektin na 4''-keto-avermektin.

Příklad 11

Charakterizace homolog emal z jiných biokatalytických kmenů

Bylo identifikováno sedmnáct kmenů druhu Streptomyces, včetně kmenů R-922 a 1-1529, které jsou schopny katalyzovat regioselektivní oxidaci 4''-karbinolu avermektinu na keton. Poté byla provedena izolace a charakterizace genů kódujících biokatalytický enzym ze všech těchto kmenů.

Za tímto účelem byla izolována genomová DNA z těchto kmenů a testována štěpením několika restrikčními endonukleázamí a

Southernovou hybridizací s genem emal. Pro každou DNA byla určena specifická restrikční endonukleáza, jež by vytvořila jediný fragment DNA definované velikosti, se kterým gen emal hybridizuje. U každého kmene byl nalezen pouze jediný fragment DNA, který silně hybridizoval, což naznačuje, že přítomnost dalších P450 genů nebyla za vysoce stringentních podmínek užitých v těchto experimentech zjištěna. Každá DNA byla štěpena odpovídají restrikční endonukleázou a podrobena elektroforéze na agarovém gelu. DNA v oblasti malých velikostí, jež zahrnovala velikost fragmentu hybridizujícího s emal, byla z gelu vyříznuta. DNA vybraná podle velikosti byla ligována do odpovídajícího klonovacího plasmidů a tento ligovaný plasmid byl využit k transformaci E. coli. Klony E. coli z každého experimentu byly testovány hybridizací kolonií s fragmentem genu emal k určení klonů obsahujících fragment DNA homologní s emal.

Byla určena nukleotidová sekvence klonované DNA v každém klonu homologním s emal a byla zjišťována přítomnost genu kódujícího enzym P450 homologního s emal. Takto byly geny homologní s emal izolovány ze 14 z 15 dalších aktivních kmenů. Jejich nukleotidové a předpokládané aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v Tabulce 4 jako sekvence SEKV. ID. Č. 5-32 a 94-95. Vzájemný vztah těchto enzymů lze ukázat ve formě fylogenetického stromu. Tento fylogenetický strom lze připravit pomocí komerčně dostupného softwarového programu GCG Wisconsin verze 1.0 (Madison, WI).

·· ·* » · · ·· ·« »···

- 89 Tabulka 4

Kmen číslo	Gen	Klasifikace	SEKV. ID. Č. (nukleotidová resp. aminokyselin.)
R-0922	emal	Streptomyces tubercidicus	1 a 2
1-1529	ema 2	Streptomyces tubercidicus	3 a 4
1053	ema 3	Streptomyces rimosus	5 a 6
R-0401	emal	Streptomyces lydicus	7 a 8
1-1525	ema5	Streptomyces sp.	9 a 10
DSM-40241	ema 6	Streptomyces chattanoogensis*	11 a 12
IHS-0435	ema 7	Streptomyces sp.	13 a 14
C-00083	ema 8	Streptomyces albofaciens	15 a 16
MAAG-7479	ema 9	Streptomyces platensis	17 a 18
A/96- 1208710	ema 10	Streptomyces kasugaensis	19 a 20
R-2374	email	Streptomyces rimosus	21 a 22
MAAG-7027	ema 12	Streptomyces tubercidicus	23 a 24
Tue-3077	ema 13	Streptomyces platensis	25 a 26
1-1548	ema 14	Streptomyces platensis	27 a 28
NRRL-2433	emal 5	Streptomyces lydicus	29 a 30
MAAG-0114	ema 16	Streptomyces lydicus	31 a 32
DSM-40261	emal 7	Streptomyces tubercidicus	94 a 95

* Analýzou 16s rDNA bylo prokázáno, že tento kmen je z rodu chattanoogensis; klasické taxonomické postupy využívané německou sbírkou kultur (DSMZ) však ukázaly, že jde o saraceticus.

- 90 ·· ·· • · · · • *· • · · · • · · ···· ··

Přiklad 12

Konstrukce emal a homolog emal značených His pro usnadnění purifikace enzymů

Pro purifikace enzymu P450_Emai a enzymů P450 kódovaných homology emal z jiných biokatalytických kmenů byl každý z genů P450 klonován do expresního plasmidu E. coli pET-28b(+) (komerčně dostupného od firmy Novagen, Madison, WI). Plasmidy pET-28 slouží k usnadnění fúze se značkou His na N-konci či C-konci a k silné expresi genů v E. coli z promotoru fága T7. V mnoha případech začíná kódující sekvence genů ema sekvencí ATGT. Tyto geny byly amplifikovány pomocí PCR tak, že primery 5'-konce obsahovaly na 5'-konci rozpoznávací místo pro Pcil (5' ATATGT 3') . Poslední čtyři báze místa pro Pcil odpovídají sekvenci ATGT na začátku kódující sekvence genu ema.

Primery na 3'-konci genů byly navrženy tak, aby byl odstraněn stop kodon na konci kódující sekvence genu ema a na 3'-konec bylo přidáno rozpoznávací místo pro Xhol. Výsledné fragmenty PCR byly štěpeny Pcil a Xhol, aby na 5'-koncích vznikly Pcil konce a na 3'-koncích Xhol konce, což usnadnilo klonování fragmentů do pET-28b(+), který byl předtím štěpen Ncol a Xhol. Jelikož Pcil a Ncol konce jsou kompatibilní, fragmenty byly do pET-28b(+) klonovány ve správné orientaci vůči promotoru T7 a ribozomálnímu vazebnému místu v plasmidu, čímž byla zajištěna exprese genů.

Na 3'-konci každého genu ema byla kódující sekvence spojena ve čtecím rámci (in frame) v místě pro Xhol se sekvencí značky His následovanou translačním stop kodonem. Výsledkem byla produkce enzymu Ema s šesti histidinovými • · • ·

zbytky přidanými k C-konci, což usnadnilo jeho purifikaci na niklových kolonách.

U genů ema, v nichž translační iniciační kodon ATG není následován nukleotidem T, byly geny ema amplifikovány pomocí PCR s využitím odlišné strategie pro 5'-konec. Primery na 5'-konci byly navrženy tak, aby obsahovaly C těsně před translačním iniciačním kodonem ATG a primery na 3'-konci byly tytéž, jak bylo popsáno výše. Amplifikované fragmenty PCR byly štěpeny Xhol, aby na 3'-konci vznikl Xhol konec, a 5'-konec byl ponechán jako tupý. Tyto fragmenty byly klonovány do pET-28b(+), který byl štěpen Ncol, ale Ncol konce byly zatupeny pomocí fazolové (mung beán) exonukleázy a štěpeny Xhol.

Tímto způsobem byly geny ema klonovány do pET-28b(+), aby na C-konci vytvořily funkční spojení s promotorem T7 a značkou His, jak bylo popsáno výše. Všechny geny ema značené His byly sekvenovány, aby bylo zajištěno, že do nich při PCR nebyly vneseny žádné chyby.

Velká množství enzymů P450_Emai a P450_Ema2 byla izolována a purifikována podle standardních protokolů. Byl napěstován kmen E. coli BL21 DE3 (komerčně dostupný od firmy Invitrogen; Carlsbad, CA) obsahující gen pro T7 RNA polymerázu regulovaný indukovatelným promotorem tac a odpovídající plasmid pET-28/ema, a buňky byly poté sklizeny a lyžovány. Lyzáty byly naneseny na kolony Ni-NTA (komerčně dostupné od firmy Qiagen lne., Valencia, CA) a proteiny byly purifikovány postupem doporučeným výrobcem.

Purifikované enzymy P450_Emal a P450_Ema2 značené His byly v testech aktivity in vitro vysoce aktivní, jak to prokázala vysoká míra konverze avermektinu na 4''-keto-avermektin.

Příklad 13

Exprese emal v Pseudomonas

Konstrukty genu emal byly dále vneseny do P. putida (P. putida divokého typu komerčně dostupný od American Type Culture Collection, Manassas, Virginia; ATCC č. 700801 a 17453). Gen emal a jeho fragmenty emal/fd233 byly klonovány jako fragmenty Pacl/Pmel do plasmidu pUK21 (Viera and Messing, Gene 100:189-194, 1991). Fragmenty byly klonovány do pozice mezi promotorem tac (Ptač) a terminátorem (T_tac) na pUK21 ve správné orientaci pro expresi z promotoru tac. Genové fragmenty P_tac-emal-T_tac a P_tac^_ emal/fd233-T_tac byly z pUK21 vyštěpeny jako fragmenty BglII a ty pak byly klonovány do přenosného plasmidu s širokým spektrem hostitelů pRK290 (Ditta et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:7347-7351, 1980), čímž vznikly plasmidy pRK-emal and pKK-emal/fd233 (obr. 3) . Tyto plasmidy byly z hostitelů E. coll konjugací vneseny do kmenů P. putida ATCC 700801 a ATCC 17453 standardními postupy (Ditta et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:7347-7351, 1980). P. putida ATCC 700801 a ATCC 17453 obsahující plasmidy pRKemal či pRK-emal/fd233 byly testovány na schopnost katalyzovat oxidaci avermektinu. Výsledky uvedené v Tabulce 3 ukazují, že uvedené kmeny jsou schopny tuto reakci katalyzovat.

• · · ·

• · • · ··· · · · • · ·

Příklad 14

Identifikace genů kódujících ferredoxiny působící s P450_Emai monooxygenázou

P450 monooxygenázy vyžadují pro každou katalyzovanou hydroxylační reakci dva elektrony (Mueller et al., Twentyfive years of P450_cam research: Mechanistic Insights into Oxygenase Catalysis. Cytochrome P450, 2nd Edition, P.R. Ortiz de Montellano (ed.), pp. 83-124; Plenům Press, NY 1995). Tyto elektrony jsou ferredoxinem po jednom předány P450 monooxygenáze. Jsou původně odvozeny z NAD(P)H a předány ferredoxinu reduktázou ferredoxinu. Specifické enzymy P450 monooxygenázy mají vyšší aktivitu, když reagují se specifickým ferredoxinem. V mnoha případech gen kódující ferredoxin, který specificky reaguje s určitou P450 monooxygenázou, je umístěn vedle genu kódujícího enzym P450.

Jak bylo popsáno výše, kromě genu emal byly izolovány a sekvenovány čtyři geny P450 z kmene R-922 a sedm genů P450 z kmene 1-1529 (viz příklad 6). V některých z nich byla získána dostatečná informace o DNA sousedící s geny P450, takže bylo možno zjišťovat přítomnost sousedících ferredoxinových genů. Tímto postupem byly v každém z obou kmenů identifikovány dva unikátní ferredoxinové geny. Ferredoxinové geny fd229 a fd230 byly nalezeny v kmenu R-922 a geny fd233 a fdEA byly identifikovány v kmenu 1-1529. Navíc byl nalezen gen reduktázy ferredoxinu vedle genu fdEA z kmene 1-1529.

K testování biologické aktivity každého z těchto ferredoxinů v kombinaci s P450_Emai byl každý jednotlivý

ferredoxinový gen amplifikován pomocí PCR, takže vznikl fragment genu obsahující tupý 5'-konec, nativní vazebné místo pro ribozom, kódující sekvenci ferredoxinového genu a na 3'-konci restrikční místo pro Pmel. Každý takový fragment ferredoxinového genu byl klonován do Pmel místa ležícího ve 3' směru od genu emal v plasmidu pTUA-emal. Tak byly vytvořeny umělé operony složené z genu emal a jednoho z ferredoxinových genů funkčně spojeného s funkčním promotorem.

V případě ferredoxinového genu fcZEA, kde byl vedle tohoto genu nalezen gen pro reduktázu ferredoxinu freEA, byl podobným postupem PCR připraven fragment DNA obsahující geny fdEA i freEA. Tento fragment genu byl také klonován do Pmel místa plasmidu pTUA-emal, jak bylo popsáno pro jiné ferredoxinové geny.

Každá kombinace genů emal-ferredoxin byla testována na biologickou aktivitu vnesením jednotlivých plasmidů nesoucích geny emal-ferredoxin do kmene S. lividans ZX7. Byla určena biokatalytická aktivita odvozená z každého plasmidu v S. lividans. Ze čtyř různých konstruktů pouze ferredoxinový gen fd233 odvozený z kmene 1-1529 vykazoval zvýšenou aktivitu ve srovnání s expresí samotného emal v témže plasmidovém a hostitelském kontextu (viz Tabulka 3). Plasmid pTUA-emal/fd233 v S. lividans vykazoval cca 1,5 až 3krát vyšší aktivitu ve srovnání s plasmidem pTUA-emal. Ostatní tři plasmidy obsahující další ferredoxinové geny poskytly v podstatě tytéž výsledky jako plasmid obsahující pouze gen emal. Podobně plasmid pTUA-emal/fdEA/freEA neposkytl výsledky odlišné od pTUA-emal. Nukleotidové a předpokládaná aminokyselinová sekvence genu fd233 jsou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 35 resp. 36.

• · · ·

- 95 Analýza BLAST nukleotidové a aminokyselinové sekvence fd233 ukázala, že nejbližší podobnost byla s ferredoxinem z S. coelicolor (GenBank Accession AL445945) a S. lividans (GenBank Accession AF072709) . Na úrovni nukleotidů má fd233 80 a 79,8% shodu s ferredoxinovými geny z S. coelicolor, resp. S. lividans. Na úrovni peptidů má fd233 79,4 a 77,8% shodu s ferredoxiny z S. coelicolor, resp. S. lividans.

Jelikož je fd233 odvozen z kmene 1-1529 a emal z kmene R-922, proteiny kódované oběma těmito geny nemohou spolu v přírodě reagovat. V postupu určeném k identifikaci ferredoxinového genu z kmene R-922 homologního s genem fd233 a schopného kódovat ferredoxin optimálně reagující s P450_Emai byl· gen fd233 využit jako hybridizační sonda pro genovou knihovnu DNA z kmene R-922. Byl identifikován silně hybridizující kosmid pPEH232 a hybridizující DNA byla klonována a sekvenována. Srovnání předpokládané aminokyselinové sekvence odvozené z fd233 a ferredoxinového genu na kosmidů pPEH232, fd232, ukázalo, že se lišily pouze jedinou aminokyselinou.

Podobným způsobem byl zkonstruován plasmid pTUA-emalfd232 a testován v S. lividans ZX7. Tento plasmid poskytl podobné výsledky jako plasmid pTUA-emal-td2J3 (viz Tabulka

3). Nukleotidové sekvence a předpokládaná aminokyselinová sekvence fd233 jsou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 37 resp. 38.

Operon emal-fd233 byl také překlonován jako fragment Pacl-Pmel do pTBBKA a pEAA, které byly předtím štěpeny týmiž restrikčními enzymy. S. lividans ZX7::pTBBKA-emal-řd23J a S. lividans ZX7::pEAA-emal-řd2JJ byly testovány v testu konverze avermektinu a bylo zjištěno, že vykazují vyšší aktivitu než kmeny nesoucí samotný gen emal ve srovnatelných plasmidech (viz Tabulka 3) .

4

- 96 Příklad 15

Heterologní exprese P450_Emai a P450_Ema2 v jiných buňkách

Expresní konstrukty pRK-emal (příklad 13) a pRK-ema2 (připravený analogicky jako pRK-emal v příkladu 13) byly konjugací uvolněny do tří fluorescenčních kmenů půdních bakterií Pseudomonas. Konjugace byla provedena standardními postupy (Ditta et al., Proč. Nati. Acad. Sci.

7351, 1980) . Šlo o kmeny: P. fluorescens fluorescens Pf-5 a P. fluorescens CHAO z transkonjugantů byl proveden standardní test klidových buněk pro konverzi avermektinu na 4''-keto-avermektin. U kmenů Pf-5 a CHAO byly hladiny konverze pod hranicí detekce. Kmen MOCG134 vykázal 3% konverzi u emal a 5% u ema2.

USA 77 :7347MOCG134, P. U každého

Dále byly konstrukty uvedené v Tabulce 5 vneseny protoplastovou transformací do Streptomyces avermitilis MOS-OOOl (Kieser, T.; Bibb, M.J.; Buttner, M.J.; Cháter, K.F.; Hopwood, D.A. (eds.): Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation, Norwich (England) , 2000), (StutzmanEngwall, K. et al. (1999) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B₂:Bi avermectins, WO 99/41389).

Tabulka 5

Konstrukt	% Konverze avermektinu, 16 h
žádný	0
pTBBKA-emal	10,90 +/- 3,48
pTUA-emal	5,326 +/- 2,19
pEAA-emal	6,74 +/- 0,08
pTBBKA-emalA/fd233	28,50 +/- 0,20
pTUA-emalň/fd233	23,97 +/- 5,95

·· ····

- 97 Byl testován Str. avermitilis MOS-OOOl divokého typu a bylo zjištěno, že není schopen oxidace avermektinu na 4''keto-avermektin.

Transformované kmeny S. avermitilis MOS-OOOl::pTBBKA-emal, MOS-OOOl (pTUA-emal), MOS-OOOl::pEAA-emaí, MOS-OOOl::pTBBKAemalA/fd233 a MOS-OOOl (pTUA-emalA/fd233) byly všechny testovány na schopnost oxidovat avermektin na 4'-ketoavermektin pomocí klidových buněk. Za tímto účelem byl proveden test biokatalýzy celých buněk (včetně postupu analýzy). Je třeba zaznamenat, že v testu biokatalýzy celých buněk byl transformovaný Streptomyces avermitilis podobně jako kmen R-922 ponechán narůst v médiu PHG a, opět stejně jako kmen R-922, ponechán reagovat 16 hodin (tj. po dobu, během níž 500 mg vlhkých buněk transformovaného Streptomyces avermitilis v 10 ml 50 mM pufru fosfátu draselného, pH 7,0, bylo třepáno při 160 rpm a 28°C za přítomnosti 15 μΐ roztoku avermektinu v izopropanolu (30 mg/ml)).

Jak uvádí Tabulka 5, bylo zjištěno, že za přítomnosti induktoru thiostrepton (5 μΐ/ml) kmeny MOS-OOOl::pTBBKA-emal, MOS-OOOl::pTBBKA-emalA/fd233, MOS-OOOl (pTUA-emal), MOS-OOOl (pTUA-emalA/fd233) obsahující emal či emalA/fd233 oxidují avermektin na 4''-keto-avermektin, což ukázala tvorba oxidované sloučeniny 4''-keto-avermektin. Je třeba zaznamenat, že kmen S. avermitilis MOS-OOOl::pEAA-emal vykázal tuto oxidační aktivitu v nepřítomnosti thiostreptonu, protože v tomto kmenu je gen emal exprimován a promotoru ermE, který nevyžaduje indukci.

Exprese genu emal P450 monooxygenázy v různých kmenech Streptomyces a Pseudomonas tedy vedla k získání rekombinantních buněk, které byly v testech klidových buněk schopny převést avermektin na 4-keto-avermektin.

•· ····

• · · · • · · ···· · ·

- 98 Exprese a aktivita P450_Emai monooxygenáz byla dále testována v E. coli. Za tímto účelem byl gen emal klonován do expresního plasmidu E. coli pET-28b(+) (komerčně dostupného od firmy Novagen, Madison, WI) , jak bylo popsáno výše. Kmen E. coli BL21 DE3 (komerčně dostupný od firmy Invitrogen; Carlsbad, CA) obsahující gen pro T7 RNA polymerázu regulovanou indukovatelným promotorem tac a plasmid pET-28/emal byl kultivován v 50 ml média LB obsahujícím 5 mg/1 kanamycinu v 250 ml baňce se zátkou po 16 hod při 37°C s třepáním při 130 rpm. 0,5 ml této kultury bylo použito k inokulaci 500 ml média LB obsahujícího 5 mg/1 kanamycinu v 2 litrové baňce se zátkou a kultura byla inkubována po 4 hod při 37 °C a poté 4 hod při 30°C, s průběžným třepáním při 130 rpm. Buňky byly sklizeny centrifugací, promyty 50 mM pufru fosfátu draselného a znovu centrifugovány.

Pro test klidových buněk bylo 90 mg vlhkých buněk naváženo do hlubokých misek v sériích po třech a přidáním 0,5 ml 50 mM pufru fosfátu draselného vytvořena suspenze. Pro bezbuněčné extrakty byly 4 gramy vlhkých buněk rozbity v disrupčním pufru postupem drcení mražené směsi (French press).

Pro testy klidových buněk bylo 5 μΐ substrátu (2,5 mg/ml v 2-propanolu) přidáno k suspenzi buněk. Miska byla zalepena fólií propouštějící vzduch a reakční směs byla inkubována v krouživé třepačce při 1000 rpm a 28°C po 22 hod. Nebyla pozorována žádná konverze avermektinu na 4'-keto-avermektin.

Pro bezbuněčné testy bylo 100 μΐ bezbuněčného extraktu, 1 μΐ roztoku substrátu (20 mg/ml) v 2-propanolu, 5 μΐ 100 mM NADPH, 10 μΐ ferredoxinu, 10 μΐ reduktázy ferredoxinu a 374 μΐ pufru fosfátu draselného, pH 7,0, přidáno podle příkladu 3 a směs byla inkubována při 30 °C s třepáním při 600 rpm po 20

0000 ·· » 0 <

» «0 4

0·

- 99 hod. 9,2% + /- 0,3% avermektinu bylo převedeno na avermektin.

Exprese genu emal v E. coli tedy vedla k produkci aktivního enzymu Emal P450 monooxygenáza, který po purifikaci z buněk byl schopen převádět avermektin na 4''-ketoavermektin .

Příklad 16

Identifikace ferredoxinu, monooxygenázy a klonování genů kódujících reduktázy jež napomáhají zvýšené aktivitě P450_Emai

Dráha pro transport elektronů, která udržuje aktivitu P450 monooxygenáz, zahrnuje také reduktázy ferredoxinu. Tyto proteiny poskytují ferredoxinu elektrony a je známo, tak jak je tomu u ferredoxinů a P450 monooxygenáz, že specifické reduktázy ferredoxinu jsou lepšími donory elektronů pro určité ferredoxiny než jiné.

Byla tedy klonována řada genů reduktáz ferredoxinu z kmenů Streptomyces a byl zhodnocen jejich vliv na biokatalytickou reakci. Za tímto účelem byla řada proteinových sekvencí bakteriálních reduktáz ferredoxinu (Fre) získána z NCBI a srovnána pomocí programu Pretty ze sady GCG. Dvě konzervované oblasti oddělené cca 266 aminokyselinovými zbytky byly užity k přípravě degenerovaných oligonukleotidů pro PCR. Přímý primer (CGSCCSCCSCTSWSSAAS (SEKV. ID. Č. 96; kde S je C či G; a W je A či G) ) a reverzní primer ·· ♦··· • A • A ♦ · · · • ·· • A · ·

A · ·

A··· ··

- 100 (SASSGCSTTSBCCCARTGYTC (SEKV. ID. Č. 97; kde S je C či G; B je C, G, či T; R je A či G; a Y je C či T) ) byly použity k amplifikaci 800 bp produktů z biokatalyticky aktivních kmenů Streptomyces R-922 a 1-1529. Tyto soubory produktů byly klonovány do klonovacích vektorů TOPO TA (komerčně dostupných od firmy Invitrogen lne., Carlsbad, CA) a 20 klonů od každého z kmenů R-922 a 1-1529 bylo sekvenováno standardními postupy (viz např. Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, lne. 2000). Sekvenování ukázalo, že 4 unikátní fragmenty genu fre byly izolovány z těchto kmenů: tři z R-922 (fre3, frel2, frel4) a jeden z 1-1529 (řrel6). Genové fragmenty fre3, frel2, frel4 a frel6 byly použity jako sondy k identifikaci úplných reduktáz ferredoxinu z bank genomových klonů kmenů Streptomyces R-922 a 1-1529. Tímto postupem byla klonována a sekvenována úplná

kódující sekvence	každého	ze	4 různých genů	fre.	Jej ich
sekvence nukleových kyselin	a	aminokyselinové	sekvence jsou
následující: fre3	(SEKV. ID.	Č.	98 a 99); frel2	(SEKV.	ID. Č.
100 a 101); frel4	(SEKV. ID.	Č.	102 a 103); a frel6 (SEKV. ID.
Č. 104 a 105) .
Pro testování	biologické	aktivity všech genů	fre ve	vztahu

k aktivitě Emal byl každý gen vložen do operonu emal/fd233 popsaného výše ve 3' směru od genu fd233. Tím byly vytvořeny umělé operony složené z emal, fd233 a jednotlivých genů fre exprimovaných z téhož promotoru. Operony emal/fd233/fre byly klonovány do plasmidu Pseudomonas pRK290 a vneseny do 3 různých kmenů P. putida. V těchto kmenech byla poté analyzována biokatalytická aktivita Emal pomocí testu celých buněk a u jednoho z genů fre, genu řrel6 z kmene 1-1529, byla zjištěna cca 2krát zvýšená aktivita P450_Emai monooxygenázy. Tento efekt byl specifický pro daný kmen, jelikož byl pozorován pouze v jednom kmenu P. putida, ATCC Desposit No.

• ··

- 101 17453, a ne v dalších dvou. V kmenu P. putida ATCC 17453 vedla přítomnost genu frel6 ke 44% konverzi avermektinu na 4''keto-avermektin ve srovnání s 23% bez tohoto genu. Další geny fre neměly žádný vliv na biokatalytickou aktivitu v žádném z testovaných kmenů P. putida.

Podobným způsobem byly klonovány všechny operony emal/fd233/fre do plasmidů Streptomyces pTUA, pTBBKA a pEAA. a vneseny do kmene S. lividans ZX7. Ve všech případech nebyl pozorován žádný vliv žádného z genů fre na biokatalytickou aktivitu v S. lividans.

Ekvivalenty

Odborníci poznají či budou schopni najít pomocí postupů nevymykajících se rutinním experimentům řadu ekvivalentů specifických látek a postupů popsaných v předkládaném vynálezu. Tyto ekvivalenty se považují za spadající do rámce tohoto vynálezu.

Patentová a vědecká literatura, na kterou se zde odkazuje, představuje znalosti dostupné odborníkům. Poskytnuté patenty, aplikace a reference, včetně sekvencí z databáze GenBank, jež jsou zde citovány, jsou zde uvedeny a tím zahrnuty formou odkazu ve stejném rozsahu, jako by každý z nich jednotlivě byl zahrnut formou odkazu. Jakýkoli rozpor mezi zde uvedeným odkazem a údaji v původním dokumentu bude vyřešen ve prospěch původního dokumentu. Podobně jakýkoli konflikt mezi definicí danou současným stavem techniky a slovem či větou a definicí slova či věty uvedenými zde v popisu bude vyřešen ve prospěch popisu.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifikovaná molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a je schopen regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 1'' sloučeniny vzorce (II) kde

   Ri až R7 představují, nezávisle na sobě, atom vodíku nebo substituent;

   m j e 0, 1 nebo 2;

   n j e 0, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousedící atomy uhlíku jsou spojené dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce

   - 158 • 9 ·9«* • 9 9·

   9 9 9 9

   9 99

   9 9 9

   9 9 9

   99 9 9 9 9 nebo jednoduchou vazbou s metylenovým můstkem vzorce zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě či ve formě soli, za vzniku sloučeniny vzorce (III)

   R7 kde

   R_x až R₇, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (II) uvedeném výše.

   2. Molekula sekvenci nukleové nukleové kyseliny kyseliny, podle nároku 1, která kóduje obsahuj ící polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

   - 159 ·· 44 4 • · · · ·· • 44 « • 4 4 4 9

   4 4 4 4

   4444 «4 *··

   44 4444

   4 4 4

   4 4 4

   4 4 4 4 • 4 4 4

   3. Molekula nukleové kyseliny podle nároků 1 a 2, obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, přičemž polypeptid vykazuje podstatnou podobnost a má nejméně 50% až 99% shodu v aminokyselinové sekvenci s polypeptidem o sekvenci SEKV. ID. Č. 2.

   4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3 obsahující nukleotidovou sekvenci

   a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1;

   b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

   c) schopnou hybridizace s (a) či její komplementární sekvencí;

   d) schopnou hybridizace s molekulou nukleové kyseliny obsahující 50 až 200 či více po sobě následujících nukleotidů nukleotidové sekvence uvedené jako SEKV. ID. Č. 1 či s její komplementární sekvencí;

   e) komplementární k (a), (b) nebo (c);

   f) která je zpětně komplementární sekvencí sekvence (a), (b) či (c), nebo

   g) která je funkční součástí (a), (b), (c) , (d) , (e) či (f) kódující polypeptid, který stále ještě vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxiduje avermektin na 4^zz-ketoavermektin.

   5. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 či 2, obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která má nejméně 66% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 1.

   6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 či 2, obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid

   - 160 ·· «··· ·© ·* • · · · ···· ·· · • ·· © · · © © ···· · ···· · ··· · · ···· ···· ·· ··© ··· ·· ·· vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, přičemž polypeptid vykazuje podstatnou podobnost a má nejméně 60% až 99% shodu v aminokyselinové sekvenci s polypeptidem o sekvenci SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 nebo SEKV. ID. Č. 95.

   7.

   Molekula nukleové kyseliny podle sekvenci nukleové kyseliny, vykazující enzymatickou aktivitu nároku 1 či 2, obsahující která kóduje polypeptid P450 monooxygenázy, přičemž polypeptid je imunologicky reaktivní na protilátky připravené proti polypeptidu o sekvenci SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č.

   10, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV.

   ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID. Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV.

   ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 nebo SEKV. ID. Č. 95.

   8. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 či 2, obsahující nukleotidovou sekvenci

   a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 nebo SEKV. ID. Č. 94;

   b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

   c) schopnou hybridizovat s (a) nebo její komplementární sekvencí;

   - 161 d) schopnou hybridizovat s molekulou nukleové kyseliny obsahující 50 až 200 nebo více po sobě následujících nukleotidů o nukleotidové sekvenci uvedené jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 či SEKV. ID. Č. 94 nebo sekvenci k ní komplementární;

   e) komplementární k (a) , (b) nebo (c);

   f) která je zpětně komplementární sekvencí sekvence (a), (b) či (c), nebo

   g) která je funkční součástí (a) , kódující polypeptid, který enzymatickou aktivitu

   f) regioselektivně avermektin.

   (b) , (c) , (d), (e) či stále ještě vykazuje P450 monooxygenázy a avermektin na 4^zz-ketooxiduj e

   Molekula nukleové kyseliny podle nároku 8, obsahující sekvenci nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sekvencí SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 a SEKV. ID. Č. 94.

   10. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, přičemž molekula nukleové kyseliny je izolována z kmene Streptomyces.

   - 162 11. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, obsahující dále sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje značku vázanou na P4 50 monooxygenázu kovalentní vazbou.

   12. Polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a schopný regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4' sloučeniny vzorce (II)

   Ri až R₇ představují, nezávisle na sobě, atom vodíku nebo substituent; m je 0, 1 nebo 2; n je 0, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousedící atomy uhlíku jsou spojené dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce » · · • · « • · ·

   - 163 Η Ο Η \Χ. V nebo jednoduchou η₂ ^HzSu^H vazbou s metylenovým můstkem vzorce zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě či ve formě soli, za vzniku sloučeniny vzorce (III) kde

   Ri až R₇, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (II) uvedeném výše.

   13. Polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxidující avermektin na 4''-keto-avermektin.

   - 164 14.Polypeptid podle nároku 12 či 13 obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je kódována molekulou nukleové kyseliny

   a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1, nebo její komplement;

   b) vykazující podstatnou podobnost s (a) ;

   c) schopnou hybridizace s (a) či její komplementární sekvencí;

   d) schopnou hybridizace obsahující 50 až 200 s molekulou nukleové kyseliny či více po sobě následujících ID.

   nukleotidů nukleotidové sekvence uvedené jako SEKV Č. 1 či její komplementární sekvencí;

   e) komplementární k (a), (b) či (c) ;

   f) která je zpětně komplementární sekvencí sekvence (a), (b) či (c), nebo

   g) která je funkční součástí (a), (b), (c), (d) , (e) či (f) kódující polypeptid, který stále ještě vykazuje enzymatickou regioselektivně avermektin.

   aktivitu P450 monooxygenázy a oxiduje avermektin na 4'-keto15. Polypeptid podle nároků az

   14, obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci, která má nejméně 50% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2.

   16.Polypeptid podle nároku nebo obsahuj ící aminokyselinovou sekvenci, která je nukleové kyseliny

   a) uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č.

   kódována molekulou • · · · · ·

   - 165 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 nebo SEKV. ID. Č. 94, nebo její komplementární sekvencí;

   b) vykazující podstatnou podobnost s (a);

   c) schopnou hybridizovat s (a) nebo její komplementární sekvencí;

   d) schopnou hybridizovat s molekulou nukleové kyseliny obsahující 50 až 200 nebo více po sobě následujících nukleotidů nukleotidové sekvence uvedené jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11, SEKV. ID. Č. 13, SEKV. ID. Č. 15, SEKV. ID. Č. 17, SEKV. ID. Č. 19, SEKV. ID. Č. 21, SEKV. ID. Č. 23, SEKV. ID. Č. 25, SEKV. ID. Č. 27, SEKV. ID. Č. 29, SEKV. ID. Č. 31, SEKV. ID. Č. 33 nebo SEKV. ID. Č. 94 nebo její komplementární sekvence, nebo s její komplementární sekvencí;

   e) komplementární k (a), (b) nebo (c);

   f) která je zpětně komplementární sekvencí sekvence (a), (b) nebo (c), nebo

   g) která je funkční součástí (f) kódující polypeptid, enzymatickou aktivitu regioselektivně oxiduje avermektin.

   (a) , (b) , (c) , (d) , (e) nebo který stále ještě vykazuje

   P450 monooxygenázy a avermektin na 4''-ketoobsahující aminokyselinovou ID. Č. 2, SEKV. , SEKV. ID. Č. 10,

   17.Polypeptid podle nároku 16, sekvenci vybranou ze skupiny sekvencí SEKV ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č.

   SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID . Č. 14, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č. 18, SEKV. ID. Č. 20 V SEKV. ID. Č. 22, SEKV. ID. Č. 24, SEKV. ID. Č. 26, SEKV. ID . Č. 28, SEKV. ID. Č. 30, SEKV. ID. Č. 32, SEKV. ID. Č. 34 a SEKV. ID. Č. 95.

   - 166 • ·

   18. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 12 až 17, obsahující dále značku.

   19. Vazebná látka, která specificky váže polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 12 až 18.

   20. Vazebná látka podle nároku 20, přičemž vazebnou látkou je protilátka.

   21. Rodina polypeptidu vykazujících enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, přičemž každý člen rodiny je schopen regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4'' sloučeniny vzorce (II)

   Ri až R₇ představují, nezávisle na sobě, atom vodíku nebo substituent; m je 0, 1 nebo 2;

   167 n je O, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousedící atomy uhlíku jsou spojené dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce

   O H

   Z \z f

   nebo jednoduchou vazbou s metylenovým můstkem vzorce h₂ zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli, za vzniku sloučeniny vzorce (III) kde

   Ri až R₇, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (II) uvedeném výše.

   • 4 • · 4 · 4 I

   - 168 4444 44

   22.Rodina polypeptidů vykazujících enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy, přičemž každý člen rodiny oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

   23.Rodina podle nároku 21 nebo 22, přičemž každý člen rodiny obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má nejméně 50% shodu se sekvencí SEKV. ID. Č. 2.

   24.Purifikovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, resp. reduktázy ferredoxinu, přičemž molekula nukleové kyseliny je izolována z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která je schopna regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4 sloučeniny vzorce (II) substituent;

   169 m je O, 1 nebo 2;

   n je 0, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousedící atomy uhlíku jsou spojené dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce

   Η O H z-x r

   nebo jednoduchou vazbou s metylenovým můstkem vzorce h₂ zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli, za vzniku sloučeniny vzorce (III) kde • · ·»· ·

   - 170 R_x až R₇, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (II) uvedeném výše.

   25.Purifikovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 24, obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, resp.

   reduktázy ferredoxinu, přičemž molekula nukleové kyseliny je izolována z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4'-keto-avermektin.

   2 6.Molekula sekvenci

   SEKV. ID nukleové kyseliny podle nároku 25, obsahující nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sekvencí Č. 35 a SEKV. ID. Č. 37.

   Molekula nukleové kyseliny podle nároku 25, obsahující sekvenci nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sekvencí SEKV. ID. Č. 98, SEKV. ID. Č. 100, SEKV. ID. Č. 102 a SEKV. ID. Č. 104.

   28.Polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, resp. reduktázy ferredoxinu, přičemž polypeptid je izolován z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která je schopna regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4^ZZ na sloučeninu vzorce (II)

   - 171 -

   Ri až R₇ představují, nezávisle na sobě, atom. vodíku nebo substituent; m je 0, 1 nebo 2; n je 0, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousedící atomy uhlíku jsou spojené dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce nebo jednoduchou vazbou s metylenovým můstkem vzorce h₂ zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli, za vzniku sloučeniny vzorce (III) ····

   4444 44 • 44

   - 172 - :ιιΐ),

   Ri až R₇, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (II) uvedeném výše.

   29.Polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu ferredoxinu, resp. reduktázy ferredoxinu, přičemž protein ferredoxin je izolován z kmene Streptomyces obsahujícího P450 monooxygenázu, která regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

   30. Protein ferredoxin podle nároku 29, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sekvencí SEKV. ID. Č. 36 a SEKV. ID. Č. 38.

   31. Protein reduktáza ferredoxinu podle nároku 29, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sekvencí SEKV. ID. Č. 99, SEKV. ID. Č. 101, SEKV. ID. Č. 103 a SEKV. ID. Č. 105.

   ·« ···· • 9 9 9 • 99

   - 173 32.Buňka geneticky upravená tak, kyseliny podle kteréhokoliv polypeptid, který vykazuje monooxygenázy.

   že obsahuje molekulu nukleové z nároků 1 až 11 kódující enzymatickou aktivitu P450

   Buňka podle nároku kyseliny kódující reduktáza ferredoxinu

   32 obsahující dále molekulu protein ferredoxin, resp.

   , nebo jejich kombinaci.

   nukleové protein

   Buňka podle nároku 32 nebo 33, přičemž molekula nukleové kyseliny je do buňky vnesena k expresi.

   35.Buňka podle kteréhokoliv z nároků 32 až 34, přičemž buňka je geneticky upravenou buňkou vybranou ze skupiny tvořené buňkou kmene Streptomyces, buňkou kmene Pseudomonas a buňkou kmene Escherichia coli.

   36.Buňka podle nároku 35, přičemž buňka je uložena ve sbírce NRRL pod č. B-30478, nebo je uložena v NRRL pod č. B-30479.

   φ φ φφφφ

   - 174 φφφφ φφφφ φφ φ

   Φ ΦΦ 9 9 9 9 9

   ΦΦΦΦ 9 9 9 9 9 Φ

   ΦΦΦ · · 9 9 9 9 φφφφ Φφ ΦΦΦ 999 99 99

   37. Způsob přípravy sloučeniny vzorce (I)

   R7 kde

   Ri až R₉ představují, nezávisle na sobě, atom vodíku nebo substituent; m je 0, 1 nebo 2; n je 0, 1, 2 nebo 3; a označení vazeb A, B, C, D, E a F znamená, nezávisle na sobě, že dva sousedící atomy uhlíku jsou spojené dvojnou vazbou, jednoduchou vazbou, jednoduchou vazbou s epoxidovým můstkem vzorce nebo jednoduchou vazbou s metylenovým můstkem vzorce h₂ zahrnující podle potřeby izomer E/Z, směs izomerů E/Z a/nebo jejich tautomer, ve všech případech ve volné formě nebo ve formě soli, ·· ····

   9 9 9

   9 9 9

   9 9 9 9

   9 9 9 9

   99 99 • ·* • · • · ···· 9 9 . - 175 vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

   1) přivedení sloučeniny vzorce (II) kde

   Ri až R₇, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (I) uvedeném výše, do kontaktu s polypeptidem podle předkládaného vynálezu schopným regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4'' za vzniku sloučeniny vzorce (III) • 9 99 • · · · • 99

   99 ·

   - 176 9 9 9

   9999 99

   999 999

   99 9999

   9 9 9

   9 9 9 (III), kde

   Ri, R₂, R₃, Ro R5, Rez R7, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (I); a
2. 2) reakci sloučeniny vzorce (III) s aminem vzorce HN(Rg)Rg, kde Rg a Rg mají stejný význam jako ve vzorci (I) a který je znám, za přítomnosti redukujícího činidla;

   a, v každém případě, pokud je to žádoucí, převedení sloučeniny vzorce (I), kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomeru E/Z nebo jeho tautomeru, v každém případě ve volné formě nebo ve formě soli, na odlišnou sloučeninu vzorce (I) nebo izomer E/Z nebo jeho tautomer, v každém případě ve volné formě nebo ve formě soli, rozdělení směsi izomerů E/Z, kterou lze získat tímto postupem, a izolaci požadovaného izomeru a/nebo převedení volné sloučeniny vzorce (I), kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomeru E/Z nebo jeho tautomeru na sůl nebo převedení soli, sloučeniny vzorce (I),

   177 kterou lze získat tímto postupem nebo jiným způsobem, nebo izomeru E/Z nebo jeho tautomeru na volnou sloučeninu vzorce (I) nebo na izomer E/Z nebo jeho tautomer, nebo na jinou sůl.

   38. Způsob přípravy sloučeniny vzorce (III) kde

   Rl, R2, R3, Rá, Rs, Re, R7, m, n, A, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (III) z nároku 37, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

   1) přivedení sloučeniny vzorce (II)

   - 178 • · · · · · ·····© • · · · ·· ·· · · · • ·© · · 9 9 9

   9 9 9 9 © ···© ·

   9 9 9 9 9 9 9 9 9

   9999 99 999 999 99 99

   Ri~R₇, m, η, Ά, B, C, D, E a F mají stejný význam jako ve vzorci (I) uvedeném výše, do kontaktu s polypeptidem podle předkládaného vynálezu, který je schopen regioselektivně oxidovat alkohol v pozici 4'', a udržet tento kontakt po dobu postačující k oxidační reakci, a izolace a purifikace sloučeniny vzorce (II).

   39.Způsob podle kteréhokoliv z nároků 37 nebo 38 pro přípravu emamektinu, vyznačující se tím, že zahrnuje krok přidání polypeptidu vykazujícího enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxidujícího avermektin na 4''-keto-avermektin do reakční směsi za podmínek umožňujících, aby polypeptid regioselektivně oxidoval avermektin na 4-keto-avermektin.

   179 •9 9999

   9 9 9

   9 9 9

   9 9 9 9

   9 9 99

   40. Způsob podle kteréhokoliv vyznačující se tím, že protein ferredoxin.

   41. Způsob podle kteréhokoliv vyznačující se tím, že protein reduktázu ferredoxinu.

   z nároků 37 až 39, reakční směs dále obsahuj e z nároků 37 až 40, reakční směs dále obsahuj e

   42. Kompozice pro přípravy emamektinu vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu P450 monooxygenázy a regioselektivně oxiduje avermektin na 4''-keto-avermektin.

   43. Kompozice podle nároku 42 vyznačující se tím, že dále obsahuje protein ferredoxin.

   44. Kompozice podle nároku 42 vyznačující se tím, že dále obsahuje protein reduktázu ferredoxinu.