CZ20032496A3

CZ20032496A3 - Způsob stereoselektivní redukce substituovaného acetofenonu

Info

Publication number: CZ20032496A3
Application number: CZ20032496A
Authority: CZ
Inventors: Ramesh Patel; Animesh Goswami; Linda N. Chu; Venkata B. Nanduri; Steven L. Goldberg; Robert M. Johnston; Mary Jo Donovan; K. David Mirfakhrae
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2003-12-17
Also published as: EP1370677A1; HUP0400261A3; BR0208265A; KR20030085012A; CA2441267A1; US6800477B2; JP2004532017A; MXPA03008437A; CN1498273A; US20030068811A1; HUP0400261A2; IL157386A0; WO2002077258A1; PL364577A1

Description

Způsob stereoselektivní redukce substituovaného acetofenonu

Podstata vynálezu

Vynález se týká nového způsobu stereoselektivní přípravy (S)-1-arylethanolu redukcí odpovídajících sloučenin obsahujících ketoskupiny za použití mikroorganismů. Vynález se týká také nových způsobů přípravy chirálních alkoholů mikrobiální redukcí odpovídajících ketonů.

Dosavadní stav techniky

Bing-nan-Zhou a kol. (J. ftmer. Chem. Soc. 105, str. 5926 aš 5928, 1983) popisuje způsob chemoffiikrobiální syntézy L-carnitinu, který má velký význam v lidském metabolismu a v transportu mastných kyselin s dlouhým řetězcem. Tento vynález se týká obzvláště redukce ethyl-4-chloracetoacetátu na ethyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutanoát za použití pekařských kvasnic, tedy Saccharomyces cerev í s i ae.

Kazutoshi Ushio a kol. (Tetrahedron Letters 27, číslo 23, str. 2647 až 2660, 1986) popisuje způsob redukce (J-ketoesterů kvasnicemi kultivovanými methanolem. Uvádí se, že předmětná reakce způsobuje dramatický posun nadbytku enantiomeru výsledného produktu ve směru D-isomeru. Tento jev se pozoruje, když se reakce provádí s využitím kvasnic kultivovaných v raethanolu v důsledku enzymů chrakteristickým pro kvasnice kultivované v takovém protředí.

Markus Christen a kol. (J. Chem. Soc. Chem. Comeun., str. 264 až 266, 1988) popisuje způsob přípravy čtyř stereoisomerů methy-6-(p-chlorfeny1thio)-3,4-dihydroxyhexanoátu, při kterém je klíčové zavedení chirality provedeno vhodnou redukcí za použití kvasnic. Konstatuje se tam, že ačkoli redukce p-ketoesterů kvasnicemi byla rozsáhle studována, zůstává obtížným • · · · • · předpovědět, zda se dosáhne buď absoluttní konfigurace produktu (produktu), nebo se obzvláště dosáhne nadbytku enantiomerů.

Antonio Tri neone a kol. (Biotechnology and Bioengineering, 35, str, 559 až 564, 1990) popisuje způsob asymetrické redukce ketonů klidovými buňkami Sulfolobus solfataricus. Uvádí, že redukční schopnost klidových buněk tohoto organismu závisí silně na fázi růstu buněk.

Ramesh Patel a kol. (Enzyme Microb. Technol. 13, str. 906 až 912, 1991) popisuje způsob stereospecifické mikrobiální redukce 4, 5-di hydro-4-(4-methoxyf enyl)-6-(trifluormethy1 -1H-1)benzazepin-2-onu. Zejména se uvádí, že klíčový meziprodukt, (3R-cis)- 1,3,4,5- tetrahydro-3-hydroxy-4-( 4- methoxyfeny1)-6-(trif1uormethyl)-2H-1-benzazepin-2-on, byl připraven stereoselektivní mikrobiální redukcí mateřského ketonu. Uvádí se, že je možné volbou specifických podmínek získat samotný isomer ze čtyř známých možnost í.

Ramesh Patel a kol. (Enzyme Microb. Technol. 15, str. 1014 až 1021, 1993) popisuje způsob stereoselektivní redukce diketosloučeniny, aethylester 3,5-dioxo-6-(benzyloxy)hexanoové kyseliny, za získání jediného enantiomerů výsledné dihydroxysloučeniny.

Ramesh Patel a kol. (Enzyme Microb. Technol. 14, str. 731 až 738, 1992) popisuje způsob tepelného zpracování Geotríchum candidum ke zlepšení optické čistoty hydroxyproduktu získaného tak redukcí /3-keto esterů.

Kometani a kol. (Journal of Fermentation and Bioengineering 80, číslo 2, str. 208 až 210, 1995) popisuje způsob kvasnicemi zprostředkované bioredukce za použití ethanolu jako zdroje energie. Studuje se závislost mezi rychlostí spotřeby ethanolu a rychlostí prochirální redukce ketonu v pekařských • · · · kvasnicích a dospívá se k závěru, že ethanol by mohl být použitelný k produkcí chirálních alkoholů ve velkém měřítku z prochirá1ních ketonů.

Raaesh Patel a kol. (americký patentový spis číslo US 5 391495, zveřejněno 21. února 1995) popisuje způsob stereoselektivní redukce určitých keto-obsahujících sulfamidových sloučenin k vytvořeni odpovídajících sloučenin obsahujících mikroorganismu nebo enzymu Vyjmenovanými enzymy jsou ox i hydroxylovou skupinu použitím schopného katalyzovat redukci.

doreduktáza nebo dehydrogenáza a mikroorganismy jsou voleny s výhodou ze souboru zahrnujícího Hansenula, Rhodococcus a Norcard i a.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nového způsobu stereose1ektivní přípravy (S) - 1 - ary1ethanolu redukcí odpovídající ketoskupinu obsahujících sloučenin za použití mikroorganismů. Vynález se také týká nového způsobu přípravy chirálních alkoholů mikrobiální redukcí odpovídajících ketonů za účelem syntézy například 4-[2-((1R)-1-(1(4-chlorf enyl)su1f onyl]-2,5-difluoran i 1 i no}ethyl-5-f1uorfeny1]butanové kyseliny, která je novým gama-sekretázovým inhibitorem pro ošetřování Alzheimerovy nemocí.

kde znamená

X a Y na sobě nezávisle atom vodíku, chloru, bromu, jodu nebo

skupinu R¹, kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou nebo (CHz)nCOR², kde znamená n celé číslo 1 až 10,

R·² skupinu hydroxy lovou nebo OR³ nebo NHz, kde znamená R³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, spočívá podle vynálezu v tom, že se stereose1ekti vně redukuje sloučenina obecného vzorce II,

kde znamená

X a Y na sobě nezávisle atom vodíku, chloru, bromu, jodu nebo skupinu R¹, kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou nebo (CHzlnCOR², kde znamená n celé číslo 1 až 10,

R² skupinu hydroxylovou nebo OR³ nebo NH2, kde znamená R³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, reakcí s enzymem oxidoreduktáza schopným katalyzovat enzymatickou redukci ketonu obecného vzorce II.

Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I • · · · • ·

kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou nebo (CIfelnCOR², kde znamená n ce1 é číslo 1 až 1O,

R² skupinu hydroxylovou nebo OR³ nebo NH2, kde znamená R·³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, spočívá podle vynálezu také v tom, že se stereose1ekti vně redukuje sloučenina obecného vzorce II,

kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou nebo (CH2)nC0R², kde znamená n celé číslo 1 až 10,

R² skupinu hydroxylovou nebo OR³ nebo NH2, kde znamená R³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkýlovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, reakcí s mikroorganismem, který poskytuje oxidoreduktázový enzymem schopný katalyzovat enzymatickou redukci ketonů obecného vzorce II.

Způsob podle vynálezu blíže objasňuje následující podrobný popis a obr. 1, na kterém je sekvence Pichia methanolica ketoreduktázy.

Stereoselektivní redukce sloučeniny obecného vzorce II na sloučeniny obecného vzorce I se provádí způsobem podle vynálezu redukcí oxidoreduktázovým enzymem nebo s výhodou mikroorganismem, který posktuje oxidoreduktázový enzym, schopný katalyzovat enzymatickou redukci ketonů obecného vzorce II. Buňky mikroorganismu mohou být v podobě intaktních mokrých buněk nebo usušených buněk například buněk 1yofi 1 izovaných, usušených rozprašovacím způsobem nebo za tepla, nebo v podobě zpracovaného buněčného materiálu například roztrháním buněk nebo v podobě buněčných extraktů. Jakkoliv je znám velký počet mikroorganismů dodávajících určitou formu oxidorekuktázy, zjistilo se podle vynálezu, že pouze vybrané druhy Rhodococcus, Brevibacteriua, Sacchairoayces, Candida, GeoLiri chua, RhodoLorula, Pichia, Hansenula, Nocardia, llucor' Sphingoaonas a pekařských kvasnic katalyzájí redukci sloučenin obecného vzorce II za získání žádaných sloučenin obecného vzorce I ve vysoce kvantitativním a enantioraernim výtěžku. Těmito druhy jsou Rhodococcus eryLropoiis ATCC 4277, Rhodococcus erytropol is DSM 6971 a Rhodococcus erytropolis ATCC 21227, Rhodococcus erytropolis ATCC 27854, Candida sonorensis ATCC 56511, Candida boidinii ATCC 26175 a ATCC 56507, Candida guiI1ieraondi i ATCC 9058, Candida utilis ATCC 9950, Candida parapsilosis ATCC 52820, Geotfi chua candidua ATCC 34614 a ATCC 34014, Rhodotoru• · · · · · ⁴• · · · *«· · · · • 4 · · la glutinis ATCC 26207 a ATCC 201718, Hansenula Fabianii ATCC 58045, Hansenula polymorpha ATCC 58401, ATCC 34438 a ATCC 26012, Hansenula saturnus ATCC 16762, Nocardia salttoni color ATCC 19149, Pichia anomala ATCC 66094, Pichia capsulata ATCC 29204, Pichia methanoli ca ATCC 56510, ATCC 56508 a ATCC 58403, Pichia pinus ATCC 28780, Pichia silvicola ATCC 16764, Pichia stipitis ATCC 59785, Sphingomonas paucimobi1is ATCC 202027, Saccharomyces cerevisiae ATCC 12341 a ATCC 44953, Nocardiodes albus ATCC 55425, Hucor rouxi i ATCC 24905, Hucor hiemalis ATCC 16636 a Brebacieri um sp. ATCC 19653. Výraz ATCC je objednacím číslem v depozitáři příslušných mikroorganismů ve sbírce American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Výraz DSM je objednacím číslem v depozitáři příslušných mikroorganismu ve sbírce German Collection of Mícrooganisms and Cell Cultures, Branschweig, Německo. Zahrnuty jsou také geneticky konstruovaná mikroorganismy. Hostitelskou buňkou může být jakákoliv buňka, například Escherichia coli, modifikovaná za účelem obsahu genu nebo genů pro expresi jednoho nebo několika enzymů schopných shora uvedené katalýzy.

Některé zde používané výrazy jsou následně objasněny.

Výrazem alkyl se vždy míní po případě substituovaná nasycená uhlovodíková skupina s přímým nebo s rozvětveným řetězcem s 1 až 10 atomy uhlíku, s výhodou s 1 až 4 atomy uhlíku.

Výrazem alkenyl se vždy míní po případě substituovaná nenasycená uhlovodíková skupina s přímým nebo s rozvětveným řetězcem s 1 až 10 atomy uhlíku, s výhodou s 1 až 4 atomy uhlíku.

Výrazem “substituovaný alkyl” se vždy míní alkylová skupina substituovaná například jedním až čtyřmi substituenty ze souboru zahrnujícího atom halogenu, skupinu trifluormethylovou, trifluormethoxyskupinu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu, • · · · cykloalkyloxyskupinu, heterocyklooxyskupinu, oxoskupinu, skupinu alkanoylovou, arylovou, ary1oxyskupinu, skupinu aralkylovou, a1kanoyloxyskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, arylaminoskupinu, aralkylaminoskupinu, cykloalkylaminoskupinu, heterocykloaminoskupinu a disubstituovanou aminoskupinu.

Výrazem substituovaný alkenyl se vědy míní alkenylová skupina substituovaná například jedním až čtyřmi substituenty ze souboru zahrnujícího atom halogenu, skupinu trif1uormethylovou, trifluorraethoxyskupinu, hydroxyskupinu, a1koxyskupinu, cykloalkyloxyskupinu, heterocyklooxyskupinu, oxoskupinu, skupinu alkanoylovou, arylovou, aryloxyskupinu, skupinu aralkylovou, a1kanoyloxyskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, arylaminoskupinu, aralkylam inoskupinu, cykloalkylaminoskupinu, heterocykloaminoskupinu a disubstituovanou aminoskupinu.

Výrazem aryl” se vědy míní monocyklická nebo bicyklická aromatická uhlovodíková skupina se 6 aě 12 atomy uhlíku v cyklu například skupina fenylová, naftylová, bifenylová a difenylová, přičerně kaědá tato skupina je popřípadě substituovaná.

Výrazem substituovaný aryl se vědy míní arylová skupina substituovaná například jedním aě čtyřmi stejnými substituenty ze souboru zahrnujícího například skupinu alkylovou; substituovanou alkylovou, atom halogenu, skupinu trif1uormethy1ovou, trif1uoraethoxyskupinu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu, cykloalkyloxyskupinu, heterocyklooxyskupinu, skupinu alkanoylovou, a1kanoyloxyskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, aralkylaminoskupinu, cykloalkylaminoskupinu, heterocykloaminoskupinu, a1kanoylaminoskupinu, skupinu thiolovou, alkylthioskupinu, cykloalky1thioskupinu, heterocyklothioskupinu, ureidoskupinu, nitroskupinu, kyanoskupinu, skupinu karboxylovou, karboxya1ky1ovou, karbaay1ovou, alkoxykarbonylovou, alkylthionoskupinu, arylthionoskupinu, skupinu alkyl sul f ony 1 ovou, sulfonamidoskupinu a aryloxyskupinu. Tyto • · · · • · · « substituenty mohou být dále substituovány jednou nebo několika skupinami ze souboru zahrnujícího atom halogenu, skupinu hydroxylovou, alkylovou, alkoxyskupinu, skupinu arylovou, substituovanou skupinu alkylovou, substituovanou skupinu arylovou a ara1 kýlovou.

Způsob enzymatické redukce podle vynálezu se může provádět za použití mikroorganismů po fermentaci, to znamená jakožto dvoustupňová Fermentace a redukce nebo současně, to znamená jako jednostupňová in šitu prováděná fermentace a redukce. Při tomto provedení se nechávají růst mikroorganismy ve vhodném prostředí, zvláště v prostředí obsahujícím zdroje dusíku a uhlíku, až do dosažení dostatečného růstu a pak se do prostředí přidá vybraná sloučenina obecného vzorce II. Enzymatická redukce se provádí až do skutečné dokonalé konverze sloučeniny obecného vzorce II.

Při dvoustupňovém způsobu se mikroorganismus z počátku nechává růst ve vhodném prostředí, shora charakterizovaném, až do předem stanovené úrovně enzymatické aktivity, v této schvíli se buňky sklidí o sobě známými způsoby oddělování a připraví se z nich mikrobiální buněčná suspenze obsahující například vhodné pufry. Jakožtov vhodné pufry se uvádějí příkladně fosfátové pufry, zvláště pufr na bázi fosforečnanu sodného nebo draselného, tris-HCl a acetát sodný. Pro přípravu suspenze mikrobiálních buněk se také může použít voda. Do získané suspenze se vnáší sloučenina obecného vzorce II a enzymatická reúplného ukončení. V každém případě prostředí zahrnuje, jak shora uvedeno, zdroje a stopové prvky. Mohou se přidávat induktory pracovníkům v oboru známo, míní se induktory růstu sloučeniny, které iniciují nebo podporují žádanou enzymatickou, to je oxdidoreduktázovou aktivitu v buňkách pro vytváření žádaného produktu. Induktorem může becného vzorce II zvláště v případě, kdy se dukce se provádí až do vhodné růstové uh1í ku, dus í ku růstu. Jak je být sloučenina opřidává v malých

množstvích v průběhu růstu mikroorganismu.

Jakožto vhodné zdroje uhlíku pro růstové prostředí se uvádějí cukry, například maltóza, laktóza, glukóza, fruktóza, glycerol, sorbit, sacharóza, škrob, manit a propy1englykol, organické kyseliny a jejich solí, například acetát sodný a citrát sodný, aminokyseliny a jejich soli, například glutamát sodný, a alkoholy, například ethanol a propanol. Jakožto vhodné zdroje dusíku pro růstové prostředí se uvádějí příkladně N-Z amin A, kukuřičný výluh, sojová moučka, hovězí extrakt, kvasnicové extrakty, melasa, pekařské kvasnice, tryptofan, nutriční sója, pepton, kvasnicový amin, dusičnan sodný a síran amonný. Jakožto vhodné stopové prvky se uvádějí příkladně fosfáty, a soli hořčíku, manganu, vápníku, kobaltu, niklu, železa, sodíku a draslíku. Vhodná používaná media pro způsob podle vynálezu mohou zahrnovat četné složky ze souboru zahrnujícího kteroukoliv z těchto kategorií. Příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, se uvádějí vhodná prostředí obsahující následující složky (procenta jsou míněna hmotnostně):

Složka Obsah v procentech

Číslo 1
PH 7,0	sladový extrakt kvasnicový extrakt pepton glukóza	1 . o 1,0 1,0 2, 0
Číslo 2
pH 7, 0	sladový extrakt	1 , o
	kvasnicový extrakt	1,0
	pepton	0, 3
	glukóza	4, O
Číslo 3
pH 7, 0	sladový extrakt	1,0
	kvasnicový extrakt	1 , o

• · · · »4 · 4

4 4

pepton O,3 glycerol 2, O

Číslo 4 pH 7,0 sladový extrakt kvasnicový extrakt pepton jantaran sodný

Číslo 5 pH 7,0 Nzamin A kvasn i cový aai n glycerol Na₂HP0₄KH2PO4 (NH4>2S0₄MgSO₄ . 7H₂O

1,0 1 , O O, 3 2, O

1,0 2, O 2, O O, 6 0, 3 0, 125 0,0246

Po autklávování prostředí číslo 5 se přidají filtrované sterilizované roztoky neomycinu (ve vodě) a chloraafenikolu (ve 200 ethanolu) na konečnou koncentraci ÍO mg/1 nebo 33 mg/1.

Před starilizací se hodnota pH nastaví na rozmezí 6 až 8, s výhodou na hodnotu pH 6,8. Prostředí se sterilizuje napřiko lad udržováním na teplotě 121 C po dobu 30 minut. Po sterilizaci se hodnota pH nastaví na rozmezí 6,5 až 7,5, nejvýhodněji na pH 7. V průběhu mikrobiálního růstu a redukčního procesu se udržuje hodnota pH v rozmezí 4,0 až 9,0, s výhodou v rozmezí 6,0 až 8,0. Pro nastavení hodnoty pH se používá vhodná sůl zásady nebo kyseliny shora uvedená.

Teplota reakční směsi je dána tepelnou energii, dostupnou pro redukční proces, a z toho důvodu se má udržovat vhodná teplota k zajištěni dostatečné energie pro proběhnutí způsobu až do konce. Vhodnou teplotou pro způsob podle vynálezu je • ♦ · · teplota v rozmezí přibližně 5 až 60 C, s výhodou v rozmezí přibližně 25 až 40 C. Při způsobu podle vynálezu nemá tlak rozhodující význam a zpravidla se udržuje tlak okolí.

Způsob podle vynálezu se s výhodu provádí za aerobních podmínek. Příznivé je také míchání a provzdušňování reakční směsi, protože ovlivňuje množství dostupného kyslíku pro biotransformaci. Způsob podle vynálezu se s výhodou provádí například v kultuře v třepačce nebo ve fermentačním tanku v průběhu růstu mikroorganismů při shora popsaném jednostupňovém nebo dvoustupňovém způsobu. Výhodné je míchání otáčkami v rozmezí 10 až 100/min, přičemž nezvýhodněji otáčkami v rozmezí 50 až 500/min. Výhodné je provzdušňování přibližně O, 1 až 10 objemy vzduchu na objem prostředí za minutu (v/Vt), přičemž je obzvláště výhodné provzdušňování přibližně 5 objemy vzduchu na objem prostředí za minutu.

Dokonalá konverze sloučeniny obecného vzorce II vyžaduje například dobu přibližně jedné až 72 hodin, zpravidla přibližně 4 až 48 hodin, měřeno od chvíle přidání sloučeniny obecného vzorce II do prostředí. Výhodné je prostředí na vodné bázi, jakkoliv se stejně dobře může používat prostředí na bází organické kapaliny nebo mísitelné nebo nemísítelné, to je dvoufázové prostředí na bázi směsi organická kapal ina/voda.

Stereose1ektivní enzymatický redukční způsob podle vynálezu se může provádět přidáním kofaktoru, jako jsou redukovaný ni kot inamidadenindinuk 1eotid (NADH) nebo nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADPH), zvláště v případech, kdy se používá izolovaného enzymu. NADH nebo NADPH se například posléze regeneruje a znova používá. Může se používat dalšího enzymu, který generuje NADH nebo NADPH in šitu, například formátdehydrogenáza, glukóz-6-fosfát, dehydrogenáza nebo glukózdehydrogenáza, Jakožto vhodné donory vodíku se uvádějí příkladně molekulární vodík, formát (například formát alkalického kovu nebo aoonia), • ·· · glukóza, fosfoman, nebo elektrochemická redukce v přítomnosti viologenu například methylviologenu. Je také možné regenerovat NADH nebo NADPH bez použití dalšího enzymu, například ethanolem nebo formátem.

Je dále výhodné vnášet sloučeninu obecného vzorce II do reakční ho prostředí ve hmotnostním množství v rozmezí přibližně 0,2 až přibližně 5 %, vztaženo na hmotnost výchozí sloučeniny a prostředí jako celku. Inokulum mikroorganismu se zřetelem na množství výchozího materiálu má být dostatečné pro enzymatickou redukci sloučeniny obecného vzorce II ve shora uvedeném čase obecně ve hmotnostním množství buněčné koncentrace v rozmezí přibližně 5 až 30 %. Za použití popsaných výhodných reakčních parametrů s mikroorganismy se získá reakční výtěžek větší než 70%, optimálně nad 90 % a s nadbytkem enantiomerů větším než 93 % optimálně větším než 99 % žádaného enantiomerů sloučeniny obecného vzorce I. Produkty redukčního způsobu podle vynálezu, to je sloučeniny obecného vzorce I, se mohou izolovat jakýmkoliv o sobě známým způsobem pro izolací a/nebo čištění, jako jsou například extrakce, adsorpce/desorpce za použití pryskyřice, destilace, krystalizace a sloupcová chromatograf i e.

Přirozeně jsou možná různá provedení a modifikace v rámci vynálezu, jak je pracovníkům v oboru známo. Rozsah vynálezu není proto omezen na shora uvedený objasňující popis ale také na rovnocenná provedení popsaného způsobu.

Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklad 1

Stereoselektivní enzymatická redukce 2-brom-4-f1uoracetofenonu (sloučenina vzorce III) :

Použití dvoustupňového způsobu s celými buňkami

Různé mikrobiální kultury (1 ml) se naočkují do 100 ml prostředí 1 shora charakterizovaného v 500 ml baňce a inkubují β

se při teplotě 28 C a za otáček 200/min v třepačce po dobu 48 hodiny. Buňky se sklidí odstředěním a suspendují se v 10 ml 100 mM pufru fosforečnanu draselného, hodnota pH 7. Do buněčné suspenze se přidá glukóza v množství 25 mg/ml a 15 mg 2-broa-4-f1uoracetofenonu (susbstrát vzorce III) ^:

B i otransf oraiace (redukce) se provádí při teplotě 28 C za otáček 200/min v třepačce po dobu 24 až 48 hodin. V předem stanovené době se reakce rychle ukončí přidáním čtyř objemů acetonitrilu, směs se mísí ve vířivém mixeru, zfiltruje se filtrem s otvory 0,2 mikrometrů a shromáždí se a 1 ml vzorku se analyzuje chromatografií HPLC způsobem 1 ke stanovení koncentrace substrátu a produktu. Zbylý roztok se odpaří k suchu v proudu dusíku a zbytek se vyjme do 1 ml ethanolu, zfiltruje se a analyzuje se chromatografií HPLC způsobem 2 ke stanovení enantiomerního nadbytku produktu. Výsledky jsou v následující tabulce I. Produktem pro tento příklad je sloučenina vzorce IV

Způsob 1

Tento způsob je vyvinutý k monitorování redukce ketonu vzorce III na alkohol vzorce IV.

Sloupec- fenylhexyl (4,6 X 150 mm, 5 μ®) společnosti Fenomenex Mobilní fáze: aceton itri 1/voda (1 = 1).

Průtok: 1 ml/min.

c

Teplota sloupce: 50 C.

Detekce ·' UV při 210 nm.

Injektovaný objem: 5 ju 1 .

2-Brom-4-f1uoracetofenon vzorce III eluuje přibližně při 6,3 minutách, S-1-(2‘ -brom-4’ -f1uorfenyl)ethanol vzorce IV nebo jeho enantiomer eluuje přibližně v 5,4 minutách.

Způsob 2

Tento způsob je toty alkoholu vzorce vyv i nutý IV .

k monitorování enantiomerní čisSloupec: Chiralpak AD (4,6 X Chemical Industries

Mobilní fáze: objemově 0,249 Průtok: i ml/min.

Teplota sloupce: okolí. Detekce: UV při 210 nm. Injektovaný objem: 2 a 5 μΐ.

250 mm, 10 μ®, společnost Daicel Ltd) .

% absolutního ethanolu v hexanu.

Enantionery ((R/S)- 1-(2-brom-4-f1uorfenyl)ethanolu elují přibližně při 48 minutách (R) a při 54 minutách (S). Substrát, 2-brom-4-fluoracetofenon, eluuje přibližně při 15 minutách.

Tabulka I objasňuje způsob mikrobiální redukce 1-brom-4-f1uoracetof enonu na žádaný odpovídající chirální alkohol.

• » 9 • ···· ·* ·· • · « · · · · • » · · · ♦* · « ♦ · · * · · ♦ • · · * · »««·«· · · ·<

Tabulka I

Microorganism vs	AICC	Alkohol	EE S-Alkohol
		o/ /O	©r /©
Control		0%
Candida sonorens/s	56511	100%	99.2
Candída boidim	26175	100%	9-⁷/
Candida gutlliermondii	9058	100%	99,0
Candida utilis	9950	99%	99_;6
Candida maltosa	20184	81%	98,6
Candida kefir	14244	86%	96,8
Candida parapsilosis	52820	98%	97,6
Geotrichum candidum	34614	98%	97,9
Geotrichum candidum	34014	100%	99.4
Rhodotorula glutinis	26207	100%	99.0
Rhodotorula glutinis	201718	’ 100%	99.9
Hansenula fabianii	58045	94%	99,0
Hansenula polymorpha	34438	100%	99,8
Hansenula polymorpha	58401	100%	99,0
Hansenula polymorpha	26012	, 100%	99,0
Hansenula saturnus	16762	100%	99,0
Nocardia salmomcolor	19149	; 100%	99,3
Pichia anomala	66094	100%	99,0
Pichia capsulata	29204	100%	99,0
Pichia membranafaciens	20101	95%	99,0
Pichia methanolica	56510	100%	99,0
Pichia pinus	28780	100%	99,0
Pichia silvicola	16764	99%	99.0
Pichia stipitis	59785	100%	99.0
Sphingomonas paucimobilis	^; 202027	100%	99,0
Saccharomyces cerevisiae	12341	93%	99,9
Saccharomyces cerevisiae	44953	72%	99.3
Active Dry Yeast, Red Star		78%	99,.9

Příklad 2

Použtí pekařskýc kvasnic

Substrát (vzorce III) a produkt (vzorce IV) pro toto příkladné provedení je objasněn v příkladu 1.

• v m · » » ► * « · · · » 9 · • « » « ♦ · * « *

9 9 9 9 9 9 9 9 · « · · · ί # «

Popis způsobu

Použije se bioreaktoru o obsahu 3 libry (Braun Bi ostat B) s elektrodou pří. Otáčky míchadla se nastaví na 500/min a teplota na 28 C. Do biorektoru se vnese 800 ml 10 mM fosfátového pufru (hodnota pH 7,0). Obsah bioreaktoru se míchá otáčkami o

300 až 500/min a udržuje se teplota 28 C během celého pokusu. Zapne se čerpadlo automatického přidávání 10% roztoku hydroxidu sodného k udržováni hodnoty pH na konstantní výši 6,0. Přidává se pomalu během 30 minut 150 g suchých aktivních kvasnic (společnost Red Star). Přidá se 5 g 2-brom-4-fluoracetofenonu. Použije se minimálního objemu deionizované vody (5 ml) ke spláchnutí zbylého ketonu do reaktoru. Přidá se 0,5 ml proti pěnivého činidla SAG podle potřeby ke zvládnutí pěnění. Ke zvládnutí pěnění se může přidat ihned nebo později podle potřeby 0,5 ml dalšího proti pěn ivého činidla SAG. Začne se přidávat 25% roztok glukózy rychlostí 8 až 10 ml za hodinu. Veškerý glúkosový roztok (200 ml) se přidá během 20 až 24 hodin. Odebírají se 1 ml vzorky po 4, 8, 12, 20, 22, 24 hodinách a popřípadě v dalších dvouhodinových intervalech. Podle příkladu 1 se analyzí vzorky ke zjištění koncentrace substrátu a produktu a enantiomerního nadbytku produktu. Obvykle postačí reakční doba 20 až 28 hodin k dokončení reakce. Tímto postupem je reakční výtěžek produktu 90% a enantiomerní nadbytek žádaného isomeru je 99,5%.

Příklad 3

Redukce keto methylesteru vzorce V na odpovídající alkohol vzorce VI

Naočkují se různé mikrobiální kultury (1 ml) do 100 ml prostředí 1 nebo 3, jak shora uvedeno, v 500 ml baňce a inkubují se při teplotě 28 Ca za otáček 200/min na třebačce 48 hodin. Buňky se sklidí odstředěním a suspendují se v 10 ml 100 mM pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0. Do buněčné suspenze se přidá glukóza v množství 25 mg/ml a 10 mg keto nethylesteru (substrátu vzorce V) .

COOMe ( V)

Biotransfornace (redukce) se provádí při teplotě 28 C a za otáček 200/min na třepačce 24 až 48 hodin. Reakční směs se extrahuje dvěma objemy ethylacetátu a odpaří se k suchu v proudu dusíku. Část ethylacetátového extraktu se rozpustí v acetonitrílu a analyzuje se chromatografií HPLC, způsob 3, ke zjištění koncentrací substrátu a produktu. Jiná část se rozpustí ve směsi hexan/isopropanol (1^;1) a analyzuje se chromatografií HPLC, způsob 4, ke zjištění enantiomerního přebytku produktu.

Výsledky jsou shrnuty příklad je sloučenina vzorce v tabulce II.

VI

Produktem pro tento

COOMe ( VI)

Způsob 3

Sloupec: Kroaasil C-8 (4,6 X 150 mm, 5 μο, Waters).

Mobilní fáze: eluční gradient ze 100% rozpouštědla A (0,2% kyselina fosforečná) a 0 % rozpouštědla B (acetonitril/

0,2% kyseliny fosforečné 90:10) do 70 rozpouštědla B pří 20 minutách pak až 100 % rozpouštědla B při 25 minutách a pokračuje se do 100 % rozpouštědla B do 30 mi nut.

• Φ·Φ φφ *· ·· ‘ · * · • φφφ · *» * • φφφ « · · • φφφ φφ ··· • * » · · φ» >·

Průtok: 1 ml/min.

Teplota sloupce: okolí.

Detekce: UV při 210 nm.

Retenční doby: ketomethylester (vzorce V) 20,3 min a hydroxymethyl ester (vzorce VI) 18 minut.

Způsob 4

Sloupec·' Chiralpak AD (4,6 X 250 mm, 10 pm, Daicel).

Mobilní fáze: hexan/ethanol/isopropanol (98,32-1,43:0,25). Průtok:1 ml/min.

Detekce: (JV při 210 nffi.

Enantíomery (R/S) hydroxymethylesterový eluát při přibližně 23,6 (R) a 31,1 (S) minutách.

Tabulka II

Mikrobiální redukce ketomethylesteru (vzorce V) na odpovídající (S)-hydroxymethy1 ester (vzorce VI)

Název	ATCCtt	Hydroxy- methylester (výtěžek)	EE S-hydroxy- methyl esteru
Pichia methanolica	58403	40%	>99 %
Pichia methanolica	56510	41%	99 %
Pichia methanolica	56508	33%	>96 %
Geotrichum candidum	34614	6%	>99 %
Mortierella ronanniana	34194	5%	ND
Apiotrichum humicola	26699	3%	ND
Cand i da bo i d i n i i	56507	1 1%	>99 %
Nocardiodes albus	55425	4%	ND
Socardiodes luteus	55426	1%	ND
Sreptomyces rimosus	10970	4%	ND

ND nestanoveno

Př í k1 ad 4

Redukce keto ethylesteru vzorce VII na odpovídající alkohol vzorce VIII

Naočkují se různé mikrobiální kultury (1 ml) do 100 ml prostředí 1 nebo 3, jak shora uvedeno, v 500 ml baňce a inkubují o

se při teplotě 28 C a za otáček 200/ffiin na třebačce 48 hodin. Buňky se sklidí odstředěním a suspendují se v 10 ml 100 mM pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0. Do buněčné suspenze se přidá glukóza v množství 25 mg/ml a 10 mg keto ethylesteru (substrátu vzorce VII).

COOEt (VII)

Biotransfornace (redukce) se provádí při teplotě 28 Ca za otáček 200/min na třepačce 24 až 48 hodin. Reakční extrahuje dvěma objemy ethylacetátu směs se k suchu odpař í se v proudu dusíku. Část ethylacetátového extraktu se rozpustí v acetonitrilu a analyzuje se chromatografií HPLC, způsob 5, ke zjištění koncentrací substrátu a produktu. Jiná část se rozpustí ve směsi hexan/isopropanol (1-1) a analyzuje se chromatografií HPLC, způsob 6, ke zjištění enantiomerního přebytku produktu.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce III. Produktem pro tento příklad je sloučenina vzorce VIII

COOEt .OH (VIII) • · · · · ··· · · · · · · · ···· · · · · · * · • ··· ······ · · • ··· · · · · ·

Způsob 5

Sloupec: Fenylbexyl (4,6 X 150 mm, 5 ua, Phenomenex).

Mobilní fáze: aceton itri 1/voda (1:1),

Průtok: 1 ml/min.

Teplota sloupce: okolí.

Detekce: (JV při 210 nm.

Retenční doby: keto ethylester (vzorce VII) 12,4 min a hydroxyethylester (vzorce Vlili) 8,9 minut.

Způsob 6

Sloupec: Chiralpak AD (4,6 X 250 mm, 10 μι&, Daicel) .

Mobilní fáze: hexan/ethanol/isopropanol ( 96, 9^:2,85·O,25) . Průtok:1 ml/min.

Detekce '· UV při 210 nm.

Enantiomery (R/S) hydroxyethylesterový eluát při přibližně 15 (R) a 19 (S) minutách.

Tabulka III

Mikrobiální redukce ketomethylesteru na odpovídající (S)-hydroxymethyl ester

Název	ATCCtt	Hydroxy- ethylester (výtěžek)	EE S-hydroxyethyl esteru
Pichia methanolica	56508	18%	93, 0 %
P i ch i a me thano1 i ca	58403	51%	> 99,9 %
Geotrichum candidum	34614	33%	98,5 %

• · · ·

Př í k 1 ad 5

Redukce keto-terc-butylesteru (IX) na odpovídající alkohol (X)

Naočkují se různé mikrobiální kultury (1 ml) do 100 ml prostředí 1 nebo 3, jak shora uvedeno, v 500 ml baňce a inkubují se při teplotě 28 C a za otáček 200/min na třebačce 48 hodin. Buňky se sklidí odstředěním a suspendují se v 10 ml 100 mM pufru fosforečnanu draselného o hodnotě pH 7,0. Do buněčné suspenze se přidá glukóza v množství 25 mg/ml a 10 mg keto terc-butylesteru (substrátu vzorce IX).

COOt-buivl ( IX)

Biotransfornace (redukce) se provádí při teplotě 28 C a za otáček 200/min na třepačce. Reakční směs se extrahuje dvěma objemy ethylacetátu a odpaří se k suchu v proudu dusíku. Část ethylacetátového extraktu se rozpust! v acetonitrilu a analyzuje se chromatografií HPLC, způsob 5 podle přikladu 4 ke zjištění koncentraci substrátu a produktu. Retenční doby jsou^:keto terč-butylester (vzorce IX) 28,3 minut a hydroxy-terc-butylester (vzorce X) 19,2 minut.

Jiná část se rozpustí ve směsi hexan/isopropanol (11) a analyzuje se chromatografi i HPLC způsob 7 ke zjištění enantiomerního přebytku produktu.

Způsob 7

Sloupec^: Chiralpak AD (4,6 X 250 mm, 10 jim, Daicel) Mobilní fáze^: hexan/isopropano1 (90-10)

Průtok ' 1 ml / m i n .

Teplota sloupce- okolí.

Detekce: UV při 210 η».

Enantiomery (R/S) hydroxy-terč-butylesterový eluát při přibližně 23,6 (R) a 32,8 (S) minutách.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce IV. Produktem pro tento příklad je sloučenina vzorce X

COOt-butv ( X)

Tabulka IV

Mikrobiální redukce keto terč-thylesteru na odpovídající (S)-hydroxy-terc-butylester

Název

ATCCtt

Hydroxy- terč - butylester

EE (S) terc-bu- ty1hydroxyesteru

Mucor roux i i	24905	9%	>99,0
Mucor hiemalis	16636	22%	93, O
Pichia methanolica	58403	4%	92,6

Příklad 6

Redukce keto methylesteru čištěným enzymem keto-reduktáza

Čištění keto-reduktázy

Homogenizuje se 20% buněčná suspenze Pichia methanolíca ATCC 58403 s 10 % glycerolu, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF a 1OmM pufru fosforečnanu draselného (hodnoty pH 7,0) před roztrháním buněk. Buňky se roztrhají několikanásobným průchodem buněčné

suspenze mikrofluidiséren. Suspenze roztrhaných buněk se odstřeďuje 20 minut při otáčkách 18 OOO/min k odstranění úlomků buněk. Extrakt prostý buněk se dekantuje a použije se pro proteinové čistění. Všechny stupně čištěni se provádějí při tepo lotě 4 C. K čištění se použije tří různých podmínek k eluování enzymu z afinitního sloupce sefarózy Hi-Trap Blue Sepharose. Protein se vnese na afinitní sloupec, který je vyvážen pufrem A ( 10 % glycerolu, 2 mM DTT a 10 mM fosforečnanu draselného, hodnota pH 6,5). Protein se z afinitního sloupce eluuje třemi způsoby: (1) gradientem hodnoty pH (plnění při pH 6,5 a eluování při hodnotě pH 8,5), (2) gradienem chloridu sodného (O až 0,8 M) v pufru A a (3) gradientem NADP (0,1 až 0,5 mM ) v pufru A.

Schéma čištění enzymu
Extrakt r	prostý buněk
Hi Trap Blue	afinitní sloupec eluování 10 mM fosforečnanu draselného pH 6,5, 2 mM DTT a 10 % glycerolu s gradientem chloridu sodného (0-0.8M) nebo eluování 10 mM fosforečnanu draselného pH 6,5-8,5, 2M DTT a 10 % glycerolu
HiTrap Blue	afinitní sloupec Eluování 10 mM fosforečnanu draselného pH 6,5 s gradientem NADP (0,l-0,5mM)
Vyčištěná ketoreduktáza

Enzym se čisti do homogenity. Podle zjištění má vyčištěný enzym molekulovou hmotnost přibližně 40 Kd. Enzymem je na NADPH závislý protein. Stanoví se N-terminálová a internální peptidové sekvence proteinu k usnadnění klonování a nadexprese • · · ·

N- term inálová sekvence

NH2-x-x-Tyr-Arg-Leu-Val -Arg-Arg-G1n-Arg-Ser- Ala-Asp-G1u-GlnCOOH

Poznámka: x= neidentifikovaná aminokyselina

Internální peptidové sekvence

Pept i d 1 :

NH2 - Lys-Va 1 - Phe-Phe- Pro-A1 a- Pro-G1u-Glu-Tyr-G1u-x-Phe-Val Valí Leu)-Phe-Asn-x-x-Phe-Pro-COOH

Peptid 2:

N2-Lys-Val-Pro-Gln-Glu-Leu-Tyr-Thr-Asn- Leu-Gly-Ser-Ser-GlyLeu-Gln-Ile-Ser-Lys-COOH

Peptid 3=

N2-Lys-Va1 -Asp-Asp-Ala-Leu-Asp-G1y-COOH

Vyčištěný enzym se testuje na redukci keto methylesteru (substrát vzorce V) na odpovídající (S)-hydroxymethylester (produkt vzorce VI). Reakční směs 5 ml pufru fosforečnanu draselného (hodnota pH 7,0) obsahuje 3 jednotky vyčištěné keto reduktázy, 5 mg substrátu vzorce V, 0,1 mM NADP, 25 mg glukózy a 15 jednotek glukozové dehydrogenázy (k regeneraci NADPH). Reakce probíhá podle popisu v příkladu 3. Koncentrace substrátu V a produktu VI a enantiomerní nadbytek produktu se stanoví podle popisu v příkladu 3. Získá se 90% reakční výtěžek a enantiomerní nadbytek 99,9%.

Příklad 7

Izolace genu kódujícího keto-reduktázu z P.methanolica

A. Příprava chromosomálni DNA z P,methanolica

Zásobní kultury P.methano1 ica ATCC 13825 se kultivují v prostředí F7 (10,0 g sladového extraktu, 10,0 g kvasnicového extraktu, 1,0 g peptonu, 20,0 g dextrózy [hodnota pH 7,0] na • · • · • · · · ··· · · · · · · · ··« · ····« · · • · · · · · · · ··· ·« ·» ·· · · litr) a uskladní se ve lékovkách jako 1 ml podíly v tekutém dusíku. Lékovka se nechá ohřát na teplotu místnosti a naočkuje se 20 ml prostředí YPD ve 250 ml baňce. YPD sestává obsahuje v 1 litru 10,0 g kvasnicvého extraktu, 20,0 g peptonu a 20,0 g o

dextrózy. Baňka se inkubuje při teplotě 30 C za třepání 20 hodin při otáčkách 250/min. Použije se postupu k rychlé izolaci Saccharomyces cerevisiae chromosomální DNA, jak je popsáno pro přípravu P. methanolica DNA (Ausubel a kol., Curent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1990). Vysrážená DNA se promyje 70% ethanolem, vysuší se na vzduchu a resuspenduje se na konečnou koncentraci 1,0 mg/ml v pufru TE (0,01 M Tris-HCl, 0,001 MEDTA, hodnota pH 8,0) podle spektrofotometrické analýzy při 260 nm.

B. Konstrukce parciální Sau3Al knihovny P.methanolica

P. methanolica chromosomální DNA, připravená podle popisu v odstavci l.A, se parciálně štěpí restrikční endonukleázou Sau3Al v 0,25 ml reakčním objemu sestávajícím z 25 gg DNA, 5 jednotek enzymu (Promega, Madison,WI), 0,006 M Tris-HCl, 0,006 M chloridu hořečnatého, 0,10 M chloridu sodného a 0,001 M dio thiotreitolu (hodnota pH 7,5) 5 minut při teplotě 37 C. Reakční směs se extrahuje jednou stejným množstvím systému fenol/ chloroform 1=1. Po odstředění se horní vodná fáze uchová a přidá se do ní 0,1 objemu 3M octanu sodného a 0,6 objemu isopropanolu. DNA se peletizuje odstřeďováním po dobu 5 minut při 16 000 g v mikroodstředivce a promyje se jednou 0,5 ml 70% ethanolu. Po vysušení ve SpeedVac (Savant Instruments, Farmingdale NY) 5 minut, se peleta resuspenduje v 0,06 ml TE pufru. DNA se e1ektrofořezuje přes 0,8% agarový gel v pufru TAE (0,04 M Trizma base, 0,02 M kyseliny octové a 0,001 M EDTA, hodnota pH 8,3) obsahujícím 0,5 jjg/ml ethidiumbromidu 20 hodin při 15 v. Oblast, obsahující fragmenty DNA přibližně 5 až 10 kb, se identifikuje porovnáním s 1 kb DNA kmenovou (Life Technologies Gaithersburg, MD) a excisuje se z gelu. DNA se extrahuje za použití soupravy QIAquick Gel Purification Kit (Quiagen lne., Valencia, CA) podle doporučeného protokolu. Podíl se podrobí e1ektroforéze na 0,8% TAE agarové® gelu 20 hodin při 15 v k potvrzení, že bylo dosaženo žádaného rozsahu velikosti fragmentu a ke stanovení koncentrace fragmentu porovnáním s DNA kmenovou (Life Technologies).

Plasmid pZerol (Invitrogen, Carlsbad, CA) se digeruje s BamHI (Promega) v reakčním objemu 0,05 μ 1 sestávajícím ze 2 pg DNA, 0,006 M Tris-HCl, 0,006 M chloridu horečnatého, 0,1 M chloridu sodného a 0,001 M DTT (hodnota pH 7,5). Přidá se 10 jednotek restríkční endonukleázy a směs se inkubuje 20 minut e

při teplotě 37 C. Reakce se ukončí přidáním stejného objemu směsi fenol/chloroform 1=1. Po odstřeďování 5 minut při 13 000 g se horní (vodná) fáze vyjme a umístí se do čerstvé mikroodstředivkové zkumavky. Smísí se 5 μΐ 3Í1 octanu sodného (hodnota pH 7,5) a 110 pl ledově studeného 100% ethanolu (Shelton Scientific, Shelton, CT) s vodnou fází a DNA se pelet i zuje 10 minut při 13 000 g. Veškerá kapalina se odtáhne a peleta se prorayje jednou 70% ledově studeným ethanolem. Ethanol se odtáhne a peleta se suší 5 minut ve SpeedVac. Digerovaná plasmidová DNA se resuspenduje ve sterilní destilované vodě na konečnou koncentraci 0,01 mg/ml.

Obohacené fragmenty DNA P.methanolica (5-10 kb) se ligují na BamHI-štěpený pZero 2 v 0,02 ml reakčním prostředí obsahujícím 0,1 jjg chroaosoraální DNA, 0,03 yg plasmidu DNA, 0,03 M Tris-HCl (hodnota pH 7,8), 0,01 M chloridu hořečnatého, 0,01 M dithiothreitolu a 0,0005 M adenosin-5 -trifosfátu a 3 Weiss jednotky T4 DNA ligázy (Promega). Reakce probíhá 18 hodin při teplotě 16 C. DNA se zkoncentruje a extrahuje se 15 pl sterilně destilované vody a 250 jal 1-butanolu. Směs se odstřeďuje 10 minut při 13 000 g a veškerá kapalina se odtáhne. Peleta se suší 5 minut ve SpeedVac a resuspenduje se v 5 μ 1 sterilně destilované vody. Vázaná DNA se transformuje do elektrokompe• · · · « · · · • · • · « · « · · I · · · • · · · tentních buněk DH10B (Life Technologies) podle doporučení výrobce. Po transformaci se přidá 0,96 ml prostředí LB a buňky m

se kultivují jednu hodinu při teplotě 37 C. Na vrch 150 mm Petři misky, obsahující 75 ml systému LB agar + kanamycin se položí 137 mm kotouč Hybond-N+ (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Podíl parciální Sau3Al knihovny, postačující k získání 5 000 kolonii vytvářející jednotky se zředí do 1 ml prostředí LB a rozestře se rovnoměrně na filtru. Destička se inβ kubuje 24 hodin při teplotě 37 C. Kolonie se replikují na dvou čerstvých filtrech, které se uloží na prostředí LB + kao namycin agar a inkubují se šest hodin při teplotě 37 C. Lyse buněk a neutralizace uvolněné DNA se provede podle pokynů uvedených na filtrech. DNA se na filtrech zesíti za použití jednotky UV Strat-al inker 2400 (Stratagene, lne., LaJolla, CA) způsobem ”autozesítění. Úlomky buněk se odstraní umístěním filtrů do kontejneru s roztokem 3x SSC (20 x SSC obsahující na litr, 173,5 g chloridu sodného, 88,2 g citrátu sodného, hodnota pH se nastaví na 7,0 10N roztokem hydroxidu sodného), 0,1% SDS a odškrabáním lysovaných kolonií použitím vlhkého Kimwipe. Filtry se pak inkubují se stejným promývacím roztokem alespoň α

tři hodiny při teplotě 65 C.

C. Selekce klonů obsahujících ketoreduktázový gen

Připraví se smíšené oligonuk1eidové primery na bázi sekvence parciální aminokyseliny vyčištěné ketoreduktázy P. methanol ica (obr. 1). Všechny možné kombinace souproudých a protiproudových primerů se využijí k po1ymerázovým řetězovým reakcím (PCR). Reakční směs sestává z 0,05 M Tris-HCl (hodnota pH 8,3), 250 ug/ml albuminu hovězího séra, 2 % (hmotnost/objem) sacharózy, 0,1 mM kresolové červeně, 0,2 mM vždy dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 4 mM chloridu hořečnatého, 0,0005 mM každého prineru, 0,25 jjl (0,625 U) Takara Z-Tag polymerázy DNA (PanVera, Madison, WI) a 0,1 yg P. methanolica chromosomál ηí DNA v celkovém objemu 0,05 ml. Zesílení se provede v jednotce Per• · · · kin-Elmer Thermal Cycleru model 480 2a následujících podmínek94 C, následovaná 30 cykly e

min: 72 C, 1,5 m i n: a koDenaturace 4 minuty pří teplotě při teplotě 94 C, 1 min: 50 C, β

nečná extenze 5 minut při teplotě 72 C. Pozoruje se silné zesílení fragmentů 650 a 850 bp pomocí oligonuk1eotidových párů 183 + 186 a 185 + 188 po elektroforéze vzorku v každé reakční směsi na 1,0% agarovém gelu TAE.

Fragmenty se isolují z agarového gelu a vyčistí za použití soupravy QIAquick Gel Extraction Kit. DNA se váže na vektor pCR2.1 (Invitrogen Calrsbad.CA) podle výrobcova protokolu a transformuje se na E.coli DH10B elektroporací. Buňky se rozmělní do LB agarového prostředí obsahujícího 50 yg/ml kanamycinu a Bluo-gal (Life Technologies, 75 yl 2% [hmotnost/objeml roztoku v dimethy1formidu) a inkubují se 20 hodin při teplotě e

C. Naočkuje se 5 bílých kolonií volených náhodně z každé 1igační-transformace do kapalného prostředí LB + kanamycin o

a kultivují se 20 hodin při teplotě 37 C a za otáček 250/min. Plasmid DNA se připraví z každého vzorku za použití soupravy QIAprep Spin Miniplasmid Kit (Quiagen). Přítomnost očekávaného insertu se potvrdí PCR za shora popsaných podmínek. Jeden representativni plasmid se sekvencuje za použití soupravy ALFexpress AutoRead kit (Amershara Pharmacia) a analyzuje se na automatizované DNA sekvenční jednotce ALFexpress. V obou případech byly také zjištěny parciální sekvence aminokyselin získané z vyčištěného enzymu, avšak nepoužité k syntéze oligonukleotidu zakódované uvnitř fragmentů PCR.

Na základě těchto výsledků se při prav i digoxi geninem značené sondy za použití dvou shora popsaných souborů primerů a soupravy PCR DIG Probe Synthesis kit (Rocbe Biochemical, Indianopolis, IN) podle doporučení výrobce. Přibližně 10 ng izolovaných, shora popsaných, fragmentů PCR je zahrnuto v matrici o

DNA. Podmínky zesílení: Denaturace 4 minuty při teplotě 94 C: následovaná 30 cykly při teplotě 94 C, 1 min: 50 C, 1 min:

C, 1 min. Podrob! se 5 ul podíl reakční směsi elektroforéze na 1,0% agarovém gelu TAE spolu s neznačený® fragmentem. Inkorporace nukleotidu digoxigenin-dUTP muže být ověřena významným nárůstem molekulové hmotnosti značeného fragmentu. Význačné začlenění se získá použitím oligonuk1eotidů 183 + 186.

Duplikátové filtry, obsahující lysovanou a denaturovanou DNA z P.methanolica Sau3Al knihovny se inkubují v 10 ml roztoku DIG EasyHyb (Roche) a 5 yl denaturovaného značeného fragmentu PCR ve válcové baňce (roller bottle”). Hybridizace poβ kračuje 18 hodin při teplotě 42 C. Filtry se promyjí dvakrát 2X SSC (připraveným z 20X roztoku: 20 X SSC obsahuje na litr 173,5 g chloridu sodného, 88,2 g citrátu sodného, (hodnota pH nastavená na 7,0 10N roztokem hydroxidu sodného), 0,1% dodecylsíranu sodného (SDS) 5 minut při teplotě místnosti, pak 2x Při teplotě 68 °C s 0,5% SSC, 15 minut 0,1% SDS. Vazba protilátky anti -digoxi genu, promytí a detekce se provede pomocí reakčních značených činidel DIG, soupravy Detection Kit a protokolu (Roche). Membrány se vloží na papír Whatman 3 mm k odstranění přebytku kapaliny, překryje se Saran Wrap a exponuje se na autoradiografický flim (Kodak X-OMAT LS). Samotná hybridizační kolonie se z master filmu sejme a rozetře se na LB + kanamycin aragové prostředí a inkubuje se 24 hodin při teplotě 37 C. Kolonie se kultivuje na kapalném mediu LB + kanamycin k izolaci plasmidu pomocí soupravy QIAfiletr Plasmid Midi Kit (Qiagen). Restrikční mapování obsahuje insert přibližně 50 kb v rekombinantním plasmidu. Izolovaná DNA se testuje na svou schopnost podpořit zesílení pomocí oligo 183 + 186 a 185 + 188, který byl potvrzen. Oligonukleotidové primery na bázi sekvence DNA izolovaných fragmentů PCR slouží k analýze insertu vpKR5,0. Získá se otevřený čtecí rámec 1059 bp, který kóduje protein 353 aminokyselin s molekulovou hmotností 39 800 daltonů (obr. 1). To je v těsném souhlasu s velikostí izolované ketoreduktázy (40 OOO daltonů gelovou filtrací).

Příklad 8

Subklonování P. methanolica koreduktázového genu a exprese v Escherichia coli

Polymerázové řetězové reakce se použije k zesílení úplného koreduktázového genu obsahujícího restrikčnl místa vhodná pro klonování do expresního vektoru pBMS2000. Použitými primery j sou:

BspHI

a) 5' tgctcatgaattgggaaaaagttccacaag 3' (nukleotidy v hrubých rysech indikují rozpoznávací sekvenci pro restríkční enzym BspHI: uvedené nukleotidy indikují počáteční kodon Met ketoreduktázového genu)

BamHI

b) 5 CTCGGATCCTTATAAAATTACAGAATATAAG3' (nukleotidy v hrubých rysech indikují rozpoznávací sekvenci restríkční enzym BspHI: uvedené nukleotidy indikují koncový kodon na 3 konci ketoreduktázového genu).

Podmínky PCR jsou stejné s podmínami v odstavci I.C s výjimkou, že pKR5,0 DNA je použito jako matrice a objem reakční směsi je zvětšen na 200 μΐ (objemy všech složek jsou úměrně zvětšeny). Podíl reakční směsi je podroben elektroforéze na 1,0% agarovém gelu TAE k potvrzeni přítomnosti pásma očekávané molekulové hmotnosti (1077 bp). Zbytek reakční směsi se extrahuje jednou směsí fenol/chloroform 1:1 a vodnou fází, zbylou po 5 minutovém odstřeďování při 13 000 g. DNA se vysráží přidáním 20 jjl 3M octanu sodného (hodnota pH 7,5) a 440 jj 1 ledově studeného 100% ethanolu. Po odstřeďování 10 minut při 13 000 g se kapalina odtáhne a peleta se promyje 70% ethanolem. Ethanol se odtáhne a DNA se suší 5 minut ve SpeedVacu. Peleta se re32

suspenduje v 0,043 ml sterilně destilované vody před digescí v reakčnim objemu 0,05 ml sestávajícím z 0,006 M Tris-HCl, 0,006 M chloridu hořečnatého, O,1 M chloridu sodného a 0,001 M DTT (hodnota pH 7,5). Přidá se 10 jednotek (1 pl) každé restrikční endonukleázy a směs se inkubuje 1,5 hodin při teplotě 37 C. Reakce s ukončí přidáním stejného objemu směsi fenol/ chloroform 1 '1 . Po 5 minutovém odstřeďování při 13 000 g se horní (vodná) fáze oddělí a umístí se do čerstvé mikroodstředivkové zkumavky. Smísí se 5 pl 3M octanu sodného (hodnota pH 7,5) a 110 pl ledově studeného 100% ethanolu (Shelton Scientific, Shelton, CT) s vodnou fází a DNA se pelet i zuje 10 minut při 13 000 g. Veškerá kapalina se odtáhne a peleta se promyje jednou 70% ledově studeným ethanolem. Ethanol se odtáhne a peleta se suší 5 minut ve SpeedVac. Digerovaný plasmid DNA se resuspenduje ve sterilní destilované vodě na konečnou koncentraci 0,01 mg/ml.

Fragment PCR, digerovaný s BspHI/BamHI, se liguje na BspHI/BamHI rozštěpený pBMS2000 v 0,02 ml reakční směsi sestávající z 0,01 íjg plasmidu, 0,03 pg fragmentu PCR, 0,03 M Tris-HC1 (hodnota pH 7,8), 0,01 M chloridu hořečnatého, 0,01 M dithiotře itolu a 0,0005 M adenosin-5 -trifosfátu a 3 Weiss jednotky T4 DNA ligázy (Promega). Reakce probíhá 18 hodin při o

teplotě 16 C. DNA se zkoncentruje a extrahuje se 15 pl sterilně destilované vody a 250 pl 1-butanolu. Směs se odstřeďuje 10 minut při 13 000 g a veškerá kapalina se odtáhne. Peleta se suší 5 minut ve SpeedVac a resuspenduje se v 5 pl sterilně destilované vody. Vázaná DNA se transformuje do e1ektrokompetentních buněk DH10B (Life Technologies) podle doporučení výrobce. Po transformaci se přidá 0,96 ml prostředí LB a buňky o

se kultivují jednu hodinu při teplotě 37 C. Podíl buněk se rozetře na LB agarové prostředí obsahující 10 pg/ml neouycinsulfátu (Sigma) a destička se inkubuje 20 hodin při teplotě 37 o

C. Přítomnost správného insertu se zjistí pomocí PCR podmínek popsaných v sekci I.C s výjimkou nahodile volených kolonií je • · · ♦ · · • ····· * · • ·· · · · · · zdrojem matrice DNA. Správnou velikost má 14 ze 16 kolonií zesíleného fragmentu. Plasmidem z jednoho z těchto izolátů je PBMS2000-PMKR (pro Pichia methanolica ketoreduktázu).

Transformuje se pBMS2000-PMKR do konkurečního kmene buněk E.coli BL21-CodonPlusíDE3)-RIL (Stratagene) podle výrobcova protokolu. Buňky se rozetřou na prostřel LB agar obsahující 30 yg/ml chloranfenikolu a 10 pg/ml neomycinu. Náhodně se vyberou čtyři kolonie a použije se jich jako zdroje systému DNA pro PCR za použití podmínek popsaných v odstavci IC. Všechny čtyři zesílené fragmenty DNA správné velikosti prokazují, že BL21-CodonPlus(DE3)-RIL byl úspěšně transformován. Jeden z těchto izolátů se vybere jako expresní kmen a použije se ho k dalším pokusům. Fiolové dávky expresního kmene se připraví kultivací β

buněk při teplotě 15 C v živné půdě MT3/neo/chlor do mid-log fáze (0D600 přibližně 3,5) přidáním glycerolu do 10% konečného objemu a zmrazí se v tekutém dusíku. Živná půda MT3/neo/chlor má následující sloužení¹ 1 % NZ-Amin A (Sheffield Products, Norvich, NY, 2 % Yestamin (AE Staley, Decataur IL) , 2 % glycerolu, O, 6 % dinatriumhydrogenfosfátu, 0,3 % ka1 iumdihydrogenfosfátu, 0,125 % amoniumsulfátu, 0,0246 % heptahyxdrátu sulfátu horečnatého (EM Science), 10 yg/ml neomyc i nsul f átu a 30 pig/ ml chloranfenikolu (EM Science).

Exprese ketoreduktázového genu se prokazuje IPTG (isopropyl thio-£-D galaktosidem) indukcí promotoru ptač, který se vyskytl na plasnidu pBMS2OOO. Expresní kmen se kultivuje v prostředí 25 MT3/neo/chlor v 250 ml baňce při teplotě 15 C, za otáček 225/min až do dosažení ODeoo nm přibližně 0,7. V tomto bodě se přidá IPTG (Life Technologies) na konečnou koncentraci 0,5 mM. Kultury se nechají růst přes noc (přibližně 16 hodin) k dosaženi konečné indukce ketoreduktázového genu a produkce ketoreduktázového proteinu.

Vzorky po 1 ml přes noc expresujících kultur se převedou ··· · · · · · * · ···· ♦ ·· · · · · • · · · ······ · · • «·· ····· ······ · · ·· *· ·· do mikroodstředivých zkumavek a buňky se peletuji 2 minuty při 14 000 g. Supernatant se odtáhne ve vakuu a buněčná peleta se resuspenduje v destilované vodě k získání 0D600 30. Přidá se 10 jj 1 buněčné suspenze do 17,5 yl destilované vody, 1O pl 0, 5M dithiothreitolu (Sigma) a 12,5 pl pufru 4X NuPAGE LDS Protein Sample Loading buffer (Invitrogen). Proteinové vzorky inkuboo vaně 10 minut při teplotě 70 C a 15 pl podílů se uloží na gely NuPAGE 10% Bis-Tris (Invitrogen). Gely se podrobují elektroforéze v pufru IX NuPAGE MOPS SDS Running Buffer při 125 mA až do chvíle kdy sledovací barvivo dosáhne dna gelu. V sousedním běhu probíhá protein standardní molekulové hmotnosti (Mid-Range Protein Molecular Weight Markers, Promega Corp., Madison, WI). Po ukončení se gel přemístí do misky obsahující protein barvicí roztok (0,1% modř Coomassie Blue R 250 (Sigma) ve směsi 40 % ethanolu/10 % octové kyseliny/50 % vody. Roztok se umístí na desku třepačky a mírně se míchá jednu hodinu. Barvicí roztok se odstraní a nahradí se odbarvovacím roztokem (lx Gel-Clear Destain, Novex). Gel se vrátí na desku třepačky a odbarvuje se až do vidtelného vyčeření proteinových pruhů. Proteinový vzorek, připravený z ketoreduktázového expresního kmene, vykazuje zřetelně nadměrně expresovaný protein s molekulovou hmotností přibližně 40 000 Dal tonů. Kontrolní kultury jak netransformovaný BL21CodonPlus(DE3)-RIL tak BL21-CodonPlus/DE3-RIL transformovaný pBMS2000 nevykazují porovnatelné pásy po indukci IPTG. Následné pokusy ukázaly, že nadexpresovaný protein se nachází převážně v rozpustné proteinové frakci

K otestování, zda heterologicky expresovaný protein má ketoreduktázovou aktivitu, se nechá expresní kmen růst a indukuje se jak shora popsáno s výjimkou, že objem kultury se zvýší na 1 litr a objem baňky se zvětší na 4 litry. Po indukci IPTG přes noc, se vzorky analyzují na proteinových gelech, jak shora popsáno. Výsledky ukazují, že velikost kultury nemá vliv na schopnost kmenů nadexpresovat heterologický protein. Příkladné použití rekombinantního enzymu v procesu biotransforma« · · · ·« • · ce je popsánov přikladu 9. Sekvence aminokyseliny a nukleotidu ketoreduktá2ového proteinu je na obr. 1.

Příklad 9

Redukce keto methylesteru vzorce V rekombinantním Escherichia coli expresujícím keto-reduktázu z Pichia methanolica

Keto-reduktázový gen z Pichia methanolica se klónuje a nadexpresuje v Escherichia coli. Buňky Escherichia coli (expresuj ící keto-reduktázu) se nechávají růst ve feraentoru o obsahu 15 1 a 250 1 v prostředí 5. Indukce keto-reduktázy v Escherichia coli se provádí, když optická hustota (OD) kultury dosáhne 3,0 přidáním 0,25 mM isopropy1 -β-thiogalaktosidu (IPTG) jakožto induktoru. Buňky se sklidí po 30 hodinovém růstu ve feraentoru po přidání IPTG. Buněk se používá ke katalyzování biokonverze keto methylesteru, substrátu vzorce V, na odpovídajíc! (S)-hydroxymethylester, produkt vzorce VI, buněčnými suspenzemi.

Substrát a produkt podle tohoto příkladu jsou popsány v příkladu 3. Buňky Escherichia coli, expresující ketoreduktázový enzym, se suspendují v 1 litru 100 mM fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0 za buněčné koncentrace 10% (hmotnost/objem). Buněčné suspenze se doplňují 100 μΜ nikotinamidadenindinukleotidfosfátem (NADP), 1 mM fenylmethynsulfonylfluoridem (PMSF), 50 g glukózy, 3400 jednotkami g1ukózdehydrogenázy a 4, 5 g substrátu (keto methylester vzorce V). Biotransformace se provádí

B za otáček 500/min a za teploty 28 C. Koncentrace substrátu vzorce V a produktu vzorce VI a enantiomerní nadbytek produktu vzorce VI se stanovují chromatografickou analýzou HPLC, popsanou v příkladu 3. Reakce je ukončena za 20 hodin, přičemž výtěžek reakčního produktu (hydroxymethylesteru vzorce VI) je 95%. Enantiomerní nadbytek produktu vzorce VI je 99,9%.

• · * · « · · · « » · • · · · · · · • ······ · · « · « · · · · • · ·· 4» · · ·

Průmyslová využitelnost

Stereose1ektivní způsob přípravy (S)- 1 -ary1ethanolu meziproduktu pro přípravu sloučenin, které jsou gama-sekretázovými inhibitory pro ošetřování Alzheimerovy nemocí.

* · · · «« ♦ ♦ · · ·«··

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I kde znamená

X a Y na sobě nezávisle atom vodíku, chloru, bromu, jodu nebo skupinu R¹, kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou nebo (CHz)nCOR², kde znamená n celé číslo 1 až 10,

R² skupinu hydroxylovou nebo OR³ nebo NHz, kde znamená R³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, vyznačující se tím, že se stereose1ekti vně redukuje sloučenina obecného vzorce II, kde znamená

X a Y na sobě nezávisle atom vodíku, chloru, bromu, jodu nebo skupinu R¹, kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylo- 38 vou, alkenylovou nebo (CHs)nCOR², kde znamená n celé číslo 1 až 10,

R² skupinu hydroxylovou nebo OR³ nebo NH2 , kde znamená R³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, reakcí s enzymem oxidoreduktáza schopným katalyzoval enzymatickou redukci ketonů obecného vzorce II.
2. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I kde znamená

X a Y na sobě nezávisle atom vodíku, chloru, bromu, ]odu nebo skupinu R¹, kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou nebo (CHzlnCOR², kde znamená n celé číslo 1 až 10,

R² skupinu hydroxylovou nebo OR³ nebo NH2 , kde znamená R³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, vyznačující se tím, že se stereose1ekti vně redukuje sloučenina obecného vzorce II, • * » » • · kde znamená

X a Y na sobě nezávisle atom vodíku, chloru, bromu, jodu nebo skupinu R¹, kde znamená

R¹ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou nebo (CHz)nCOR², kde znamená n celé číslo 1 až 10,

R² skupinu hydroxylovou nebo OR³ nebo NHz , kde znamená R³ substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou se 3 až 7 atomy uhlíku nebo substituovanou nebo nesubstituovanou skupinu arylovou, reakcí s mikroorganismem, který poskytuje oxidoreduktázový enzymem schopný katalyzovat enzymatickou redukci ketonů obecného vzorce II.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím , že oxidoreduktázovým enzywen je ketoreduktáza Pich i a aethanol ica podle obr. 1 expresovaná v Escherichia coli .
4. Způsob podle nároku 2,vyznačující se t í m, že oxidoreduktázový enzym je volen ze souboru zahrnujícího Pichia methanolica ATCC 56510, ATCC 56508 a ATCC 58403, přičemž oxidoreduktázou je ketoreduktáza.