CZ20023921A3

CZ20023921A3 - Farmaceutický prostředek pro léčení choroby způsobené virem chřipky, HIV, HSV, HPV, HAV, HBV nebo HCV

Info

Publication number: CZ20023921A3
Application number: CZ20023921A
Authority: CZ
Inventors: Klaus M. Esser; Martin Rosenberg; Ruth Tal-Singer; Gary Woodnutt; Francis V. Chisari
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2003-10-15
Also published as: HUP0302233A3; CA2411354A1; US20030113292A1; PL363166A1; ZA200209757B; HUP0302233A2; EP1296707A4; BR0111393A; AU7516601A; WO2001093898A1; CN1457258A; MXPA02011969A; NO20025722D0; NZ523123A; KR20030007840A; NO20025722L; JP2004514652A; IL153201A0; AU2001275166B2; EP1296707A1

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká obecně použití IL-18, rovněž známého jako interferon indukující faktor (IGIF), a IL-18 v kombinaci s dalšími činidly pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení virových chorob.

Dosavadní stav techniky

IL-18 je v nedávné době nalezený nový cytokin. Aktivní IL-18 obsahuje 157 aminokyselinových zbytků. Má silné biologické aktivity včetně indukce produkce interferonů gamma T-buňkami a splenocyty, posílení zabiječské aktivity buněk NK a usnadnění diferenciace naivních T-buněk DT4⁺ na buňky Thi. Navíc lidský IL-18 usnadňuje tvorbu GM-CSF a snižuje tvorbu IL-10. Bylo ukázáno, že IL-18 má vyšší schopnosti indukovat interferon gamma než IL-12 a zdá se, že mají rozdílné receptory a využívají rozdílné cesty přenosu signálu.

T-buňky CD4⁺ jsou centrálními regulatorními prvky všech imunitních odpovědí. Jsou rozděleny do dvou podsouborů, Thi a Th2. Každý podsoubor je definován svou schopností secernovat různé cytokiny. Je zajímavé, že nejsilnějšími induktory diferenciace jsou cytokiny samotné. Vývoj buněk Th2 z naivních prekurzorů je indukován IL-4. Před nalezením IL-18 se mělo za to, že IL-12 je hlavním cytokinem indukujícím vznik Thi. IL-18 je rovněž cytokinem indukujícím Thi a je při stimulaci tvorby interferonů gamma mocnější než IL-12.

·· ··· · • ·

Buňky Thi secernují IL-2, interferon γ a TNF-β. Interferon γ, což je podpisový cytokin. buněk Thi, působí přímo na makrofágy k posílení jejich mikrobiocidní a fagocytické aktivity. V důsledku toho mohou aktivované makrofágy účinně ničit intracelulární patogeny a nádorové buňky. Buňky Th2 vytvářejí IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 a IL13, které působí pomáháním B buňkám vyvinout se do buněk vytvářejících protilátky. Dohromady vzato, buňky Thi jsou primárně odpovědné za buněčnou imunitu, zatímco buňky Th2 jsou odpovědné za imunitu látkovou.

IL-18, jeho kódující nukleotidová sekvence a jisté fyzikálně chemické vlastnosti vyčištěného proteinu jsou známy.

Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kayaku Kenkyujoův („Hayashibara) US patent č. 5 912 324, který odpovídá EP 0 692 536 publikovaé 17. ledna 199, popisuje myší protein, který indukuje tvorbu IFN-gama imunokompetentními buňkami, kterýžto protein je dále charakterizová jako protein s jistými fyzikálně chemickými vlastnostmi a definovanou částečnou aminokyselinovou sekvencí. Popisuje také protein, který má aminokyelinovou sekvenci se 157 zbytky, její dva fagmenty, DNA (471 párů bází), která jej kóduje, hybridomy, způsoby čištění proteinu a způsoby detekce proteinu.

Hayashibarův US patent č. 6 214 584, který odpovídá EP 0 712 931, publikované 22.. května 1996, popisuje lidský protein ze 157 aminokyselinových zbytků a jeho homology, DNA, která tento protein kóduje, transformanty, způsoby přípravy tohoto proteinu, • · »

I) · * monoklonální protilátky proti tomuto proteinu, hybridomy, způsoby čištění proteinu, způsoby detekce proteinu a způsoby léčení a/nebo proevence maligních tumorů, virové choroby, bakteriální infekční choroby a imunitní choroby.

Dokument firmy Incyte Pharmaceuticals, lne.,

WO 97/24441, publikovaný 10. července 1997, popisuje protein ze 193 aminokyselinových zbytků odpovídající prekurzoru IL-18 a jej kódující DNA.

Virové choroby, jako je HIV, HSV, HPV, HAV, HBV a HCV, jsou v současnosti léčeny a/nebo je proti nim používána prevence pomocí například antivirových činidel, imunoterapie a vakcín. Současné způsoby léčení však nejsou vždy účinné. Existuje tedy potřeba účinnějšího léčení takových virových chorob.

Podstata vynálezu

V jednom aspektu poskytuje předložený vynález použití polypeptidu, který má alespoň 70% shodu aminokyselinové sekvence se sekvencí SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO:2 po celé délce sekvence, samotného nebo v kombinaci s antivirovými činidly, jako jsou foskarnet, acyklovir (ACV), ACV fosfonát, brivudin (bromvinyldeoxyuridin, BVDU), cidofovir (HPMPC, GS504), cyklický HPMPC, famcyklovir, gancyklovir (GCV), GCV fosfonát, lobukavir (bishydroxymethylcyklobutylguanin, BHCG), pencyklovir, ribavirin, adefovir, lamivudin (3TC), abakavir, stavudin, zidovudin, tenovir, výčet tím však není omezen, další cytokiny, jako je IL-2, IL-12, IFN nebo imunomodulátory, jako je ribavirin, thymosin alfa, kortikosteroidy, thalidomid, imichimod, výčet tím však není omezen, stejně jako pomocí vakcín, jako je Havrix^R nebo Engerix^R, výčet tím však není omezen, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci virové choroby, jako je

HIV, HSV, HPV, HAV, HBV a HCV.

V dalším aspektu poskytuje předložený vynález použití IL-18, samotného nebo v kombinaci s antivirovými činidly, jako jsou foskarnet, acyklovir (ACV), ACV fosfonát, brivudin (bromvinyldeoxyuridin, BVDU), cidofovir (HPMPC, GS504), cyklický HPMPC, famcyklovir, gancyklovir (GCV), GCV fosfonát, lobukavir (bishydroxymethylcyklobutylguanin, BHCG), pencyklovir, ribavirin, adefovir, lamivudin (3TC), abakavir, stavudin, zidovudin, tenovir, výčet tím však není omezen, další cytokiny, jako je IL-2, IL-12, IFN nebo imunomodulátory, jako je ribavirin, thymosin alfa, kortikosteroidy, thalidomid, imichimod, výčet tím však není omezen, stejně jako pomocí vakcín, jako je Havrix¹* nebo Engerix^R, výčet tím však není omezen, pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení virové choroby, jako je HIV, HSV, HPV, HAV, HBV a HCV.

Prostředek také může obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci lidského IL-18 (sekvence ID NO:1).

Obr. 2 ukazuje aminokyselinovou sekvenci myšího IL-18 (sekvence ID NO:2).

Obr. 3 ukazuje graf demonstrující indukci proteinu INF-γ u myší ošetřovaných různými množstvími myšího IL-18 podávaného intraperitoneálně v pufrovaném fyziologickém roztoku.

Λ · · · i ·

3· · · · · ··· 9999 ·· ····

Obr. 4 ukazuje graf demonstrující indukci mRNA INF-γ u myší ošetřovaných různými množstvími myšího IL-18 podávaného intraperitoneálně v pufrovaném fyziologickém roztoku.

Obr. 5 ukazuje graf demonstrující zlepšené přežívání myší vystavených působení letální dávky HSV-1 (SC-16) po intraperitoneálním podání myšího IL-18 po 2 hodinách, 1 dni a 2 dnech ve srovnání s kontrolami.

Obr. 6 je graf ukazující, že podání IL-18 vedlo ke zlepšení ztráty hmotnosti navozené chřipkou.

Obr. 7 je graf ukazující, že podání IL-18 vedlo ke zlepšení plicních funkcí měřených za použití pulsní oxymetrie.

Obr. 8 ukazuje účinek IL-18 na replikaci HBV.

Obr. 9(a) až 9(d) jsou grafy ukazující, že IL-18 indukuje IL-8 14-krát (obr. 9(a)), Neopterin 7-krát (obr.

9(b) ) , GM-CSF 100-krát (obr. 9(c)) a IFN-gama 8-krát (obr. 9(d)).

Obr. 10 (a) až 10(c) jsou grafy ukazující, že IL-18 indukuje IFN-gama (obr. 10(a)), Neopterinu (obr. 10(b)) a IL-8 (obr. 10(c)). V této studii bylo použito léčení samotným IL-2 jako kontrola.

·· ··· · • · ·

Obr. 11 ukazuje účinek IL-12 a IL-18 na replikaci ; ·* ·: : ·: *· · ^:...........

HBV.

Detailní popis vynálezu

Předložený vynález poskytuje obecně způsoby léčení a/nebo prevence virových chorob, jako je HIV, HSV, HPV, HAV, HVB a HCV, zahrnující podávání množství, které inhibuje virovou chorobu, IL-18 nebo prostředku, který obsahuje IL-18.

Následující definice jsou poskytnuty k usnadnění pochopení jistých pojmů a zkratek často používaných v této přihlášce.

Pojem „shoda jak je v oboru znám, je vztahem mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěma nebo více polynukleotidovými sekvencemi, jak je určen srovnáhím sekvencí. Pojem „shoda v oboru také znamená stupeň příbuznosti sekvence mezi polypeptidovými nebo polynukleotidovými sekvencemi, podle toho, o který případ jde, ja .kLse určíjomocí shody mezi řetězci takových sekvencí. „Shoda a „podobnost se mohou snadno vypočítat známými způsoby, včetně způsobů popsaných v Computational Molecular Biology, Lesk, A. Μ., redaktor, Oxford

University Press, New York (1988), Biocomputing:

Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., redator, Academie Press, New York (1993), Computer Analysis Sequence Data, část I, Griffin, A. M. a Griffin, H. G., redaktoři, Humana Press, New Jersey (1994), Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academie Press (1987), Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. a Devereux, J., redaktoři, M Stockton Press, New York (1991) ·♦ © · ·· ···· a Caríllo, H. a Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48,

1073 (1988), výčet tím však není omezen. Výhodné způsoby k určení shody jsou formovány k poskytnutí nejvyšší shody mezi testovanými sekvencemi. Způsoby k určení shody a podobnosti jsou kodifikovány ve veřejně dostupných počítačových programech. Výhodné způsoby počítačových programů k určení shody a podobnosti mezi dvěma sekvencemi zahrnují programový balík GCG (Devereux, J. a kol.,

Nucleic Acids Research, 12 (1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN a FASTA (Altschul, S. F. a kol., J. Molec. Biol., 215, 403 » až 410 (1990)), výčet tím však není omezen. Program BLAST X je veřejně dostupný od BCBÍ a dalších zdrojů (BLAST ’ Manual, Altschul, S., a kol., NCBI NLM NIH Bethesda, MS 20894, Altschul, S. a kol., J. Molec. Biol., 215, 403 až 410 (1990). K určení shody může také být použit dobře známý Smith Watermanův algoritmus.

Pojem „isolovaný znamená změněný „rukou člověka od přírodního stavu. Pokud se „isolovaný prostředek nebo látka vyswkytují v přírodě, byly změněny nebo vyjmuty ze svého původního prostředí nebo obojí. Například polynukleotid nebo polypeptid přirozeně přítomný v živém zvířeti není „isolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený od koexistujících materiálů svého přirozeného stavu je „isolovaný, jak je zde tento pojem používán.

Pojem „polypeptid odkazuje na jakýkoli peptid nebo protein, který obsahuje dvě nebo více aminokyselin spojených dohromady peptidovými vazbami nebo modifikovanými peptidovými vazbami, tj. peptidovými isostery. Pojem „polypeptid odkazuje jak na krátké řetězce, obvykle nazývané jako peptidy, oligopeptidy nebo oligomery, tak na

• · · · · • · · ·· ·· ····

• · delší řetězce, obecně označované jako proteiny. Polypeptidy mohou obsahovat aminokyseliny jiné, než je oněch 20 aminokyselin kódovaných geny. Pojem „polypeptidy zahrnuje aminokyselinové sekvence modifikované buď přirozenými způsoby, jako je postranslační zpracování, nebo technikami chemických modifikací, které jsou v oboru dobře známy. Takovéto modifikace jsou dobře popsány v základních textech a v detailnějších monografiích, stejně jako v objemné výzkumné literatuře. Modifikace se mohou vyskytnout kdekoli v polypeptidu, včetně peptidové kostry, vedlejších řetězcích aminokyselin a na aminokonci nebo karboxylovém konci. Zjistí se, že stejný typ modifikace může být v daném polypeptidu přítomen ve stejném nebo rozdílném stupni na několika místech. Daný polypeptid také může obsahovat mnoho typů modifikací. Polypeptidy mohou být rozvětvené v důsledku ubikvitinace a mohou být cyklické s větvením nebo bez něj. Cyklické, rozvětvené nebo cyklické rozvětvené polypeptidy mohou vzniknout v důsledku postranslačních přirozených procesů nebo synetickými způsoby. Modifikace zahrnují acetylaci, acylaci, ADP-ribosylaci, amidaci, kovalentní navázání flavinu, kovalentní navázání hemové části, kovalentní navázánínukleotidu nebo derivátu nukleotidu, kovalentní navázání lipidu nebo derivátu lipidu, kovalentní navázání fosfotidylinositolu, zesítění, cykizaci, tvorbu dislfidového můstku, demethylaci, tvorbu kovalentního zesítění, tvorbu cystinu, tvorbu pyroglutamátu, formylaci, ' gama-karboxylaci, glykosylaci, tvorbu GP kotvy, hydroxylaci, jodaci, methylaci, myristoylaci, oxidaci, proteolytické zpracování, fosforylaci, prenylaci, racemizaci, selenoylaci, sulfaci, přidání aminokyselin zprostředkované transferovou RNA k proteinům, jako je arginylace a ubikvitinace (viz například PROTEINS ·· ···· • ·

• · ·

STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2.. vydání, Creighton, Τ. E. a Freeman, W. H. a kol., New York (1993), Wols, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1 až 12 v POSTTRANSLATIONAL COVALENT

MODIFÍCATION OF PROTEINS, Johnson, B. C., redaktor, Academie Press, Nwe York (1983), Seifter a kol., „Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol., 182, 626 až 646 (1990) a Rattan a kol., „Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann. NY Acad. Sci., 663, 48 až 62 (1992).

Pojem „varianta odkazuje na polynukleotid nebo ' polypeptid, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptidu, ale zachovává si podstané vlastnosti. Typická varianta polynukleotidu se liší v nukleotidové sekvenci od jiného, referenčního polynukleotidu. Změny nukleotidové sekvence varianty mohou nebo nemusejí měnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím a delecím aminokyselin a k fúzím a zkrácením polypeptidu kódovaného referenční sekvencí, jak je diskutováno dále. Typická varianta polypeptidu se liší v aminokyselinové sekvenci od jiného, referenčního polypeptidu. Obecně jsou rozdíly omezeny tak, že sekvence referenčního polypeptidu a variantya jsou celkově blízce podobné a, v mnoha oblastech, shodné. Varianta a referenční polypeptid se mohou lišit v aminokyselinové sekvenci jednou nebo více substitucemi, adicemi, delecemi v jakékoli kombinaci. Substituovaný nebo vložený zbytek aminokyseliny může nebo nemusí být kódován genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polypeptidu se může vyskytovat přirozeně, jako je alelická varianta, nebo může jít o variantu, o níž není známo, že by se vyskytovala ·· ···· to ·····»· ·· ···· přirozeně. Varianty polynukleotidů a polypeptidu, které se nevyskytují přirozeně se mohou připravit technikami mutageneze nebo přímou syntézou.

Výhodné parametry pro srovnání polypeptidové sekvenče zahrnují následující:

1) algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol., 4 8, 443 .až 453 (1970) srovnávací matrix: BLOSSUM62 od Hentikoffa a Hentikoffa, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 8 9, 10915 až 10919 (1992)

Gap Penalty: 12

Gap Length Penalty: 4.

Program užitečný s těmito parametry je veřejně dostupný jako „gap program od firmy Genetics Computer Group, madison WI. Výše uvedené parametry jsou trvající parametry pro peptidová srovnání (spolu s žádným postihem za koncové mezery).

Polypeptidová sekvence podle předloženého vynálezu může být shodná s referenční sekvencí SEQ ID NO:

nebo SEQ ID NO:2, tj. 100% shodná, nebo může obsahovat až do jistého celého čísla změn aminokyselin ve srovnání s referenční sekvencí tak, že procento shody je nižší než 100 %. Takové změny jsou zvoleny ze skupiny sestávající z elespoň jedné delece, substituce, včetně konzervativní a nekonzervativní, nebo inzerce aminokyseliny, přičemž kde uvedené změny se mohou vyskytovat v polohách aminokonce nebo karboxykonce referenční sekvence polypeptidu nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, promíchány buď jednotlivě mezi aminokyselina! referenční sekvence nebo • ·· · • · ·· ·· řl ·«· ··»· ·· ·· • · · · ;

• · · · · > · · · ·· *«·· v jedné nebo více kontinuálních skupinách v referenční sekvenci. Počet změn aminokyselin pro dané procento shody se určí vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:2 numerickým procentem příslušné procentní shody (děleno 100) a poté odečtením tohoto výsledku od uvedeného celkového čísla aminokyselin v SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:2, nebo n_a < x_a — (x_a . y) kde n_a je poct změn aminokyselin, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:2 a y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd., a kde jakýkoli výsledek x_a a y, který není celým číslem se zaokrouhlí dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_a.

Pojem „fúzní proteinů odkazuje na protein kódovaný dvěma, často nesouvisejícími, geny nebo jejich fragmenty. V jednom příkladu popisuje EP-A-0464 fúzní proteiny zahrnující různé části konstantní oblasti imunoglobulinových molekul spolu s dalším lidským proteinem nebo jeho částí. V mnoha případech je využití oblasti Fc imunoglobulinu jako součásti fúzního proteinu výhodné pro použití v terapii a diagnóze, což vede například ke zlepšeným farmakokinetickým vlastnostem (viz např. EP-A 0 232 262). Na druhou stranu pro některá použití by bylo žádoucí být schopen deletovat část Fc po expresi, detekci a vyčištění fúzního proteinu.

Polypeptid fL-18

Polypeptid IL-18 je popsán v EP 0 692 536A, • · • · • · · · · ·

EP O 712 931A, EP O 767 178A1 a ve WO 97/2441. Tento polypeptid zahrnuje isolované polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% shodu, výhodně alespoň 80% shodu, výhodněji alespoň 90% shodu, ještě výhodněji alespoň 95% shodu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% shodu s SEQ ID NO:1 (lidský IL-18) nebo SEQ ID NO:2 (myší IL-18) po celé délce SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:2. Takové polypeptidy zahrnují polypeptidy zahrnující aminokyselinu SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:2.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu jsou polypeptidy indukující interferon γ. Ty hrají primární roli při indukci buňkami zprostředkované imunity včetně indukce tvorby interferonu γ T buňkami a splenocytárního usnadnění zabijácké aktivity buněk NK a posílení diferenciace naivních T buněk CD4⁺ na buňky Thi. Tyto vlastnosti jsou zde dále označovány jako „aktivita IL-18 nebo „aktivita polypeptidu IL-18 nebo „biologická aktivita IL-18. Mezi, tyto aktivity se také řadí antigenní čí imunogenní aktivity uvedených polypeptidu IL-18, obzvláště antigenní a imunogenní aktivita polypeptidu SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:2. Výhodně vykazuje polypeptid podle tohoto vynálezu alespoň jednu biologickou aktivitu IL-18.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu mohou být ve formě „zralého proteinu nebo mohou být součástí většího proteinu, jako je fúzní protein. Je často výhodné zahrnout další sekvenci aminokyselin, která obsahuje sekreční nebo vodicí sekvence, prosekvence, sekvence, které napomáhají při čištění, jako jsou mnohočetné zbytky histidinu, nebo další sekvence pro stabilitu během rekombinantní produkce.

♦ · e © · © ίο* ·©»··©·· ·

U · · ©·· ···· ··· ···· ·* ··©· «· ·»

Předložený vynález také zahrnuje varianty výše uvedených polypeptidu, tj. polypeptidu, které se liší od referenčních polypeptidu konzervativními substitucemi aminokyselin, kde je zbytek substituován jiným s podobnými charakteristikami. Typické takové substituce jsou mezi Ala, Val, Leu a Ile, mezi Ser a Thr, mezi kyselými zbytky Asp a Glu, mezi Asn a Gin a mezi bázickými zbytky Lys a Arg nebo mezi aromatickými zbytky Phe a Tyr. Obzvláště výhodné jsou varianty, kde je substituováno, deletováno nebo přidáno v jakékoli kombinaci několik, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 1 nebo 2 nebo 1, aminokyselin.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu mohou být připraveny jakýmkli vhodným způsobem. Takové polypeptidy zahrnují isolované přirozeně se vyskytující polypeptidy, rekombinantně vytvořené polypeptidy, synteticky vytvořené polypeptidy nebo polypeptidy vytvořené kombinací těchto způsobů. Prostředky pro přípravu takových polypeptidů jsou v oboru dobře známy.

Rekombinantní polypeptidy podle předloženého vynálezu se mohou připravit způsoby v oboru dobře známými z geneticky upravených hostitelských buněk obsahujících expresní systémy. V dalším aspektu se předložený vynález tudíž týká expresních systémů, které zahrnují polynukleotid nebo polynukleotidy kódující polypeptidy podle předloženého vynálezu, hostitelských buněk, které jsou geneticky upraveny takovými expresními systémy a výroby polypeptidů podle tohoto vynálezu rekombinantními technikami. K výrobě takových proteinů mohou také být použity bezbuněčné translační systémy za použití molekul RNA z konstruktů DNA podle předloženého vynálezu.

··

• · « • · β · * · · · · • · · · · ··« · ·. «Reprezentativní příklady příhodných hostitelských buněk zahrnují všechny bakteriální buňky, jako jsou buňky streptokoků, stafylokoků, E. coli, Streptomyces a Bacillus subtilis, houbové buňky, jako jsou buňky kvasinek a buňky aspergillu, buňky hmyzu, jak jsou buňky Drosophilla z S2 a Spodoptera Sf9, živočišné buňky, jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 a buňky Bowesova melanomu, a rostlinné buňky.

Může se použít celá řada expresních systémů, například systémy chromosomální, episomální a systémy odvozené od virů, např. vektory odvozené od bakteriálních plasmidu, od bakteriofágů, od transpozonů, od kvasinkvých episomů, od inzerčních prvků, od kvasinkových chromosomálních prvků, od virů, jako jsou bakuloviry, papovaviry, jako je SV40, viry vakcinie, adenoviry, viry neštovic drůbeže, viry psudorabies a retroviry, a vekory odvozené od jejich kombinací, jako jsou vektory odvozené od plasmidu a geneticých elementů bakteriofágů, jako jsou kosmidy a fagemidy. Expresní systémy mohou obsahovat řídicí oblasti, které expresi .regulují, stejně jako jí dávají vzniknout. Obecně může být použit jakýkoli systém nebo vektor, který je schopen udržet, propagovat nebo exprimovat polynukleotid k vytvoření polypeptidu v hostiteli. Příslušná nukleotidová sekvence se může vložit do expresního systému kteroukoli z četných doře známých a rutinních technik, jako jsou například techniky uvedené v Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratoy Mannual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Příslušné sekreční signály mohou být inkorporovány do požadovaného polypeptidu k umožnění sekrece translatovaného proteinu do lumina endoplasmatíckého retikula, periplasmatického prostoru • φ φ · ·« φ φ φ· · φ φφφ φ · · β

ΦΦΦ · ΦΦΦ ·

Φ φ . Φ Φ Φ Φ · Φ

ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ «Φ nebo extracelulárního prostředí. Tyto signály mohou být k polypeptidu endogenní nebo to mohou být heterologní signály.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu mohou být získány a vyčištěny z kultur rekombinantních buněk dobře známými způsoby včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, kyselé extrakce, anionto- nebo kationtoměničové chromatografie, fosfocelulózové chromatogrfie, hydrofobní interakční chromatografie, kapalinové chromatografie s vysokým rozlišením, hydroxylapatitové chromatografie a lektinové chromatografie. Nejvýhodněji se pro čištění ’ použije afinitní chromatografie. Pro znovusložení proteinů se mohou použít dobře známé techniky k regeneraci aktivní konformace, když je polypeptid během isolace a nebo čištění denaturován.

Terapeutické potenciály pro IL-18 při. prevenci/léčení jistých virových chorob byly vyhodnoceny na zvířecích modelech, přičemž byly ukázány protektivní účinky. Podání IL-18 normální, nahé nebo SCID myši zlepšuje přežití při infekcích HSV-1, ochrana je zprostředkována alespoň zčásti prostřednictvím IFNy (Fujioka a kol., J. Virology, 73, 2401 (1999) ) . Navíc současné údaje naznačují, že IFNy je důležitý pro rychlou supresi HSV po reaktivaci z latence (Cantin a kol., J. Virology, 73, 5196 (1999), Cantin a kol., J. Virology, 73, 3418 (1999)), což· naznačuje potenciál pro terapii pomocí IL-18 při potlačování rekurentní choroby v důsledku reaktivace. Tvorba vyrážky indukovaná virem vakcinie se sníží v odpovědi na léčení IL-18, což je výsledek konsistentí s usnadněnou replikací viru vakcinie u myši s vypnutým receptorem IFNy. Jak v herpetickém, tak ve vakciniovém

•4 ···· • · modelu virové infekce se IL-18 podá buď profylakticky a/ne.bo časně po infekci.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu se mohou použít samotné nebo mohou být kombinovány s antivirovými činidly, dalšími cytokiny, IFN, antibiotiky nebo antivirovými vakcínami k léčení a/nebo prevenci různých virových chorob.

HIV

V případě infekce HIV mohou být polypeptidy podle tohoto vynálezu použity samotné nebo mohou být kombinovány s inhibitory proteázy (Pl), inhibitory reverzní transkriptázy z nukleosidových analogů (NRTI), nenukleosidovými inhibitory reverzní transkriptázy (NNRTI), inhibitory receptoru nebo koreceptoru HIV, inhibitory fúze, protismyslovými oligonukleotidovými inhibitory, inhibitory glukosidázy, dalšími cytokiny, IFN, antibiotiky nebo imunomodulačními činidly. Příklady inhibitorů proteázy zahrnují amprenavir, krixivan, DMP-323, DMPt-450, indinavir, KNI-727, lasinavir, lopinavir, viracept, PD178390, ritonavir, RPI 312, sakvinavir, SC-52151, SDZ PŘI 053, tipranavir, U-103017 a A-77003, výčet tím však není omezen. Příklady inhibitorů reverzní transkriptázy z nukleosidových analogů zahrnují abakavir, adefovir, alovudin, AzdU, CS-92, DAPD, didanosin, dOTC, koviracil, lamivudin, lobukavir, jodenosin, stavudin, tenofovir, zalcitabin a zidovudin, výčet tím však není omezen.

Příklady nenukleosidových inhibitorů reverzní transkriptázy zahrnují atevirdin mesylát, kalanolid A, kapravirin, delavirdin, efavirenz, emivírin, GW420 867X,

HBY 097, loviridin, nevirapin, PETT-5, tivirapin a • ·· »· ·· 0000·· • · · * · · · · 00 • · 0 0 · 0 0 0 trovirdin, výčet tím však není omezen.. Příklady inhibitorů, receptorů, koreceptoru a fúze, AMD 3100, TAK 779, T-20 a T-1249, výčet tím však není omezen. Příklady těchto a dalších antivirových činidel různých mechanismů účinku proti HIV se mohou nalézt periodicky shrnuty v International Antiviral Review, například v díle 8, č. 1, leden 2000. Příklady cytokinů a imunomodulačních činidel zahrnují IL-2, steroidy a thalidomid, výčet tím však není omezen. Předložený vynález se také může podat jako monoterapie infikovaným jednotlivcům k posílení přirozené imunitní odpovědi, k dosažení buď zvládání nebo zničení infekce.

HSV

Herpes simplex virus je členem rodiny Herpesviridae, která obvykle infikuje slizniční povrchy nebo kůži. K latenci dochází v neuronech senzorických a autonomních ganglií. Po jistých podnětech, jako je stres, horečka, UV záření nebo imunosuprese se virus může reaktivovat a objeví se v původním místě infekce nebo na jakémkoli místě inervovaném gangliem. Antivirová činidla jsou v současnosti dostupná a vysoe účinná při inhibici alfaherpesvirových replikací. Ačkoliv však poskytují mírné snížení času uzdravování, je zde omezený přínosný účinek na ustavení virové latence. Současné údaje ukazují, že INFy je důležitý pro rychlé potlačení HSV po reaktivací z latence (Cantin a kol., Journal of Virology, 73, 3418 až 3423, 7 3, 5196 až 5200), což naznačuje potenciál pro terapii IL-18 k potlačení rekurentní choroby v důsledku reaktivace.

• · • ·· · • · ·« · · · · ι Λ · · ♦ · · »··· · · · V·· 44·· ······· ·· ···· · · ··

Encefalitida způsobená virem herpes simplex (HSE) je závažná sporadická choroba, která tvoří 10 až 20 % případů virových encefalitid. Je to nej závažnější forma infekce virem herpes simplex (HSV), která způsobuje fokální nekrotizující léze, které mohou v mnoha případech vést k závažným neuroligickým následkům (Whitley a Roizman, Clin. Inf. Dis., 26, 541 až 547 (1998)).

S infekcemi centrálního nervového systému je spojován jak HSV-1, tak HSV-2. Antivirové léčení může snížit mortalitu spojenou s encefalitidou způsobenou virem herpes simplex (HSE) na přibližně 30 %, ale přeživší stále moou trpět závažným neurologickým postižením (Skoldenberg, Sc. J.

Inf. Dis., 100, 8 až 13 (1996), Kimberlin a kol., J. Neurovirology, 4_, 474 až 485 (1998)).

Polypeptidy podle předloženého vynálezu se mohou použít samotné nebo v kombinaci s antívirotiky jako jsou inhibitory virové polymerázy (například acyklovir, valacyklovir, pencyklovir, famcyklovir, gancyklovir, vangacyklovir, foskarnet, kodofovir a další nukleosidy a nukleotidy). Tyto polypeptidy také mohou být použity v kombinaci s cytokiny jako je IFN, IL-2, IL-12 a další, stejně jako s dalšími imunomodulátory. Předložený vynález také může být podáván jako monoterapie infikovaným jednotlivcům k posílení přirozené imunitní odpovědi, k dosažení buď zvládání nebo zničení infekce.

HPV

Existuje neuspokojená potřeba prevence a/nebo léčení infekcí HPV. Dosud bylo identifikováno 100 typů HPV. Infekce může být asymptomatická, může vytvářet bradavice nebo může vést k různým benigním nebo maligním * · 9 9 9 9 • · * * * · · • · * · · · · φ • · · φ φ • · φ φ · t • · · · · ······· ·· ···· genitalním neoplásiím včetně karcinomu děložního čípku (přehled sestavil Koutsky, Am. J. Med., 102, 3 až 8 (1997)). Ačkoliv přesná čísla nejsou dostupná, bylo odhadnuto, že viditelné genitální bradavice jsou v USA přítomny u 1 % sexuálně aktivních dospělých, přičemž alespoň u 15 % z nich existuje molekulární důkaz infekce HPV. Výsledkem je přibližně 65 000 případů karcinomu děložního čípku nebo genitálií za rok. V současnosti nejsou dostpná žádná antivirová léčiva a choroba HPV se léčí chemickou nebo fyzikální ablací, cytotoxickými činidly nebo imunoterapií (Miller, R. L. a kol., Int. J. Immunopharmacology, 21, 1 až 14 (1999) ) . Ačkoliv většina současných terapií je eventuálně schopna odstranit bradavice u většiny pacientů, neovlivňují transmisis viru neo progresi choroby (Buetner a Ferenczy, Am. J. Med.,

102, 28 až 37 (1997)). Ženy s abormálními papilárníi výtoky a HPV sérotypem s vysokým rizikem by mohly být potenciálně identifikovány pro léčení s perspektivou indkce trvalé imunity a prevence vývoje karcinomu děložního čípku.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu se mohou použít v kombinaci s antivirotiky jako jsou cidofovir (HPMPC, GS504), BVDU. BVRU a dalšími nukleosidy a nukleotidy. Předložený vynález také může být použit v kombinaci s dalšími imunomodulátory, jako je interferon nebo induktory interferonu (imichinod, Aldatra; IL-12). Předložený vynález také může být použit v kombinaci s dalšími rekombinantními vakcínami (buď preventivně nebo terapeuticky), které jsou v současnosti ve vývoji. Předložený vynález také může být podán jako monoterapie infikovaným jednotlivcům k posílení přirozené imunitní odpovědi, k dosažení buď zvládání nebo zničení infekce.

• 0 ·· · · · 0 «000 • 00 0 0 0 «

00 « t«·· 0

000 0000 009 99 99·· ·· 00

Současná data naznačují potenciálně protektivní roli pro IL-18 při onkogenezi související s herpesviry. IL-18, stejně jako interferon gama, jsou upregulovány v buňkách akutně infikovaných EBV a downregulovány při posttranslační lymfoproliferativní chorobě indukované EBV (Setsuda a kol., American Journal of Pathology, 155, 257 až 265 (1999)). Tato data naznačují, že tyto mediátory se účastní obrany hostitele proti onkogenním vlastnostem EBV. Předložený vynález může být použit v kombinaci s činidly jako jsou činidla uvedená pro HSV. Předložený vynález také může být podáván jako monoterapie infikovaným jednotlivcům k posílení přirozené imunitní odpovědi, k dosažení buď zvládání nebo zničení infekce.

HAV

Virus hepatitidy A (HAV) patří do rodiny pikornavirů. Hepatitida A je vysoce přenosná z osoby na osobu cestou fekálně-orální přes kontaminovanou potravu, osoby zacházející s potravou, kontaminovanou vodou, požitím mořských plodů z kontaminované vody a jiným přímým kontaktem člověk-člověk. HAV se replikuje v játrech a vylučuje se do žluči. Infekce je akutní a obecně symptomatická se symptomy sahajícími od mírných a přechodných po závažné a dlouhodobé, které mohou zahrnovat horečku, zvracení, průjem, žloutenku a hepatomegalii. Léčba je obecně podpůrná, přičemž transplantace jater se provádí vzácně u ozvláště závažných případů. Prevence se provádí cestou předexpoziční aktivní imunizace inaktivovaným virem (Havrix) nebo poexpoziční pasivní imunizací shromážděným imunoglobulinem.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu se mohou použít v kombinací buď se současnými vakcínami k posílení imunity nebo k dosažení terapeutického účinku (jakmile je pacient již infikován). Předložený vynález také může být podáván jako monoterapie infikovaným jednotlivcům k posílení přirozené imunitní odpovědi, k dosažení buď zvládání nebo zničení infekce.

HBV

Virus hepatitidy B (HBV) je členem rodiny Hepatdnaviridae DNA virů. HBV se přenáší z osoby na osobu krví nebo tělními tekutinai podobnými cestami jako přenos HIV. HBV se replikuje primárně v játrech, přičemž virus se šíří do krevního řečiště a následně se nalézá v tělesných sekretech včetně semene a slin. Mezi expozicí a klinickými symptomy je inkubační doba 60 až 180 dní, přičemž klinické symptomy jsou od asymptomatické infekce do cholestatické hepatitidy se žloutenkou a případně s selháním jater. Po aktuní fázi se většina pacientů viru zbaví a jsou imunní.

U některých pacientů se vyvine chronická infekce, která může vést k chronické chorobě jater, fibróze a hepatocelulárnímu karcinomu.

Ppro léčení HBV je dostupná řada činidel, ačkoliv většina je účinná pouze u části chronických infekcí HBV.

V současnosti dostupná schválená a experimentální činidla zahrnují antivirotika (lamivudin[3TC], famcyklovir, lobukavir, Adefovir a četná další nukleosidová a nukleotidová činidla), imunomodulátory (interferon alfa, beta, gama, kortikosteroidy, levamizol, thymosin alfa, IL2, ribavirin) a terapeutické vakcíny nebo hyperimunitní globulin.

4 4 4 4

4

Polypeptidy podle předloženého vynálezu se mohou použít v kombinaci s kteroukoli z těchto současných terapií nebo podobnými činidly. Předložený vynález také může být podáván jako monoterapie infikovaným jednotlivcům k posílení přirozené imunitní odpovědí, k dosažení buď zvládání nebo zničení infekce.

HCV

Virus hepatitidy C (HCV) je RNA virus s jedním řetězcem, který ej členem rodin Hepacivirus nebo Flavivirus. HCV se přenáší z osoby na osobu velmi podobným způsobem jako HIV a HBV, přičemž virus je přítomen v krvi a tělesných sekretech. HCV se replikuje primárně v játrech, ačkoliv virus lze nalézt v jiných buněčných typech jako jsou lymfocyty a dendritické buňky. Akutní infekce je často asymptomatická nebo je charakterizována mírným průběhem často zastíněným obvyklejšími virovými infekcemi. Ve vzácných případech může akutní infekce vést k fulminantní hepatitidě a smrti. Většina infekcí vede ke chronické, často asymptomatické infekci, která může pokračovat desetiletí s pouze příležitostnými zvýšeními jaterních enzymů nebo mírnou cirhózou. 4ást případů pokračuje k závažnější jaterní chorobě až k selhání jater a hepatocelulárnímu karcinomu.

Léčení HCV se provádí obecně pomocí interferonu alfa, konsensuálním interferonem nebo interferonem v kombinaci s ribavirinem. Pravé antivirové sloučeniny jsou právě nyní ve fázi časných klinických zkoušek a zahrnují inhibitory vorové polymerázy, protismyslné polynukleotidy nebo ribozymy.

»999

Předložený vynález se může použít v kombinaci s kteroukoli z těchto současných terapií nebo podobnými činidly. Předložený vynález také může být podáván jako monoterapie infikovaným jednotlivcům k posílení přirozené imunitní odpovědi, k dosažení buď zvládání nebo zničení infekce.

Má se za to, že podání IL-18 během chronické infekce HCV očekávaně sníží hladiny viru indukcí necytolytických antivirových cytokinů, jako je IFNy nebo TNFa nebo prostřednictvím posílení odpovědí T-buněk na virové antigeny, což vede k zvýšené a trvající protektivní imunitě.

Předložený vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství IL-18, případně v kombinaci s dalším činidlem, jak je popsáno výše. Farmaceuticky přijatelné nosiče nebo pomocné látky mohou také být využity. Použitým farmaceutickým nosičem může být například buď tuhá látka nebo kapalina. Příklady tuhých nosičů zahrnují laktózu, bílou hlinku, sacharózu, mastek, želatinu, agar, pektin, arabskou gumu, stearát hořečnatý, kyselinu stearovou apod., výčet tím však není omezen. Příklady kapalných nosičů zahrnují roztok chloridu sodného, pufrovaný roztok chloridu sodného, dextrózu, vodu, glycerol, ethanolový sirup, olej z podzemnice olejně a jejich kombinace, výčet tím však není omezen. Podobně nocič nebo ředidlo může obsahovat zpožďovací materiál v oboru dobře známý, jako je monostearát glycerylu nebo distearát glycerylu samotné nebo s voskovou ethylcelulózou, hydroxypropylmethylcelulózou, methylakrylátem apod.

99 9

Tento vynález se dále týká farmaceutických balení a kitů obsahujících jednu nebo více nádob naplněných jednou nebo víc e složek výše uvedených prostředků podle tohoto vynálezu. Tyto polypeptidy mohou být použity samotné nebo v kombinaci s dalšími sloučeninami, jako jsou terapeutické sloučeniny.

Prostředek bude adaptován na cestu podání, například systémovou nebo orální cestu. Výhodné formy systémového podání zahrnují injekci, obvykle intravenózní injekci. Mohou být použity další injekční cesty, jako je subkutánní, intramuskulární nebo intraperitoneální. Navíc pokud může být předložený vynález formulován do enterického nebo enkapsulovaného prostředku, může být možné orální podání. Alternativní prostředky pro systémové podání zahrnují transmukozální a transdermální podání za použití penetrantů, jako jsou žlučové soli nebo kyselina fusidová nebo další povrchově aktivní látky. Podání těchto kombinací také může být topické a/nebo lokalizované ve formě balzámů, past, gelů apod.

Dávkové rozmezí požadovaného IL18 závisí na volbě adjuvancia, pokud se použije, cestě podání, povaze prostředku, povaze stavu subjektu a posouzení ošetřujícího lékaře. Vhodné dávky prostředku však jsou pro IL-18 v rozmezí od 1 ng/kg do lmg/kg subjektu. Je však třeba očekávat velké variace potřebné dávky s ohledem na řadu dostupných sloučenin a lišící se účinnosti různých cest podání. Například u transdermálního podání se očekává, že bude vyžadovat vyšší dávky než podání intravenózní injekcí. Variace těchto dávkových hladin se mohou upravit • · ··· · za použití standardních empirických rutinních postupů pro optimalizaci, jak je v oboru dobře známo.

Schéma pro podávání prostředku závisí na dávce, volbě adju.vancia, cestě podání, povaze prostředku, povaze stavu subjektu a posouzení ošetřujícího lékaře. Vhodná schémata pro podání jsou denně, týdně nebo měsíčně. Je však třeba očekávat velké variace potřebné dávky s ohledem na řadu dostupných sloučenin a lišící se účinnosti různých cest podání. Například u transdermálního podání se očekává, že bude vyžadovat vyšší dávky než podání intravenózní injekcí. Variace těchto schémat pro podání prostředku se mohou upravit za použití standardních empirických rutinních postupů pro optimalizaci, jak je v oboru dobře známo.

Všechny publikace včetně patentů a přihlášek vynálezů, výčet tím však není omezen, citované v tomto popise jsou zde zahrnuty formou odkazu jako kdyby každá jednotlivá publikace zde byla specificky a individuálně určena k zahrnutí formou odkazu jako kdyby byla uvedena ve své celistvosti.

Má se za to, že odborník v oboru za použití předchozího popisu využije předložený vynález do jeho nejúplnějšího rozsahu. Příklady zde uvedené je tedy třeba vykládat jako pouze ilustrativní a ne jako omezení rozsahu předloženého vynálezu jakýmkoli způsobem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 ·· ···· • · · · · ·. .

: ·······. »

2o · · ··· ···* ······· ·· ···· · · ·< *

Ošetření myší myším IL-18 indukuje IFNy a GM-CSF

Aktivita myšího IL-18 se vyhodnotí profilováním kinetiky cytokinové zprávy a indukce proteinu v neinfikované myši. Samice myší Balb/C se ošetří intraperitoneálně (IP) 10 nebo 100 μς myšího IL-18 a vzorky se odeberou 0, 2,5, 4 nebo 6 hodin po ošetření. Shromážděná séra (n = 3) a individuální homogenáty sleziny se vyhodnotí pomocí ELISA na TNF-a, IFN-γ a GM-CSF. IL-18 indukuje hladiny IFN v séru a slezinách (2 ng/ml) 2,5 hodiny po ošetření, což je konsistnentí s aktivitou. Detekuje se minimální indukce TNF-a (100 pg/ml) s žádná indukce GM-CSF. Naproti tomu se pozoruje indukce mRNA GMCSF, IFN-γ a TNF pomocí kvantitativního PCR v reálném čase MRNA IFN-γ se indukuje až 20-krát ve srovnání s vehikulem po 2,5 až 6 hodinách po injekci (obr. 3) a GM-CSF se indukuje 6- až 10-krát (neukázáno) ve srovnání s kontrolními hodnotami vehikula. Vyhodnotí se tedy aktivita myšího IL-18 při indukci cytokinů.

Obr. 3 ukazuje indukci proteinu IFN-γ u myší ošetřených různými množstvími myšího IL-18 podaného intraperitoneálně v pufrovaném fyziologickém roztoku. Hladiny proteinu se detekují v séru a homogenátech sleziny za použití kitů ELISA podle pokynů výrobce (R & D Systems)

Obr. 4 ukazuje indukci mRNA IFN-γ u myší ošetřených různými množstvími myšího IL-18 podaného intraperitoneálně v pufrovaném fyziologickém roztoku. Celková RNA se zachytí ze slezin a cDNA se analyzuje v individuálních vzorcích za použití PCR v reálném čase na ·» · ·· · udržovací gen GAPDH a IFN-γ (způsob je popsán v Cohrs, R.

J., a kol., J. Virology, 24, 11464 až 11471 (2000)).

Příklad 2

Myší IL-18 chrání myši před letálním podnětem HSV-1

Několik studií vyhodnotilo účinek myšího IL-18 v modelu letální systémové infekce HSV. Myší IL-18 se podá intraperitoneálně v čase -2 hodiny, 24 hodin a 48 hodin po intraperitoneální infekci HSV-1 (SC-16). Ošetření IL-18 v dávce 10 μρ/:τηγέ vede ve všech studiích ke 40% přežití ve srovnání s žádným přežití u zvířat ošetřených vehikulem obr. 5). Ve všech studiích vedlo ošetření IL-18 k oddálení smrti. V jediné studii dvě denní dávky IL-18 ve výši 100 μρ/πιγέ vedlo k 70% přežití (neukázáno) .

Obr. 5 ukazuje zlepšené přežití myší, kterým byla podána letální dávka HSV-1 (SC-16), po intraperitoneálním podání myšího IL-18 v čase -2 hodiny, 1 den a 2 dny ve srovnání s kontrolami.

Příklad 3

IL-18 zlepšuje patogenezi indukovanou chřipkou

Ošetření IL-18 má přínosný účinek na klinickou chorobu v modelu myší chřipkové pneumonie. Myši Balb/C se inokulují intranasálně subletální dávkou na myši adaptovaného viru chřipky A/PR/8/34. Podání IL-18, jak je popsáno v příkladu 2 vede ke zlepšení chřipkou indukovaného snížení hmotnosti (obr. 6), stejně jako plicních • fe ···· • ·· ·· ·· ·· ·· »··· · · · : · · · · · ; ·

->0 · · · · · · ··· ·

Zo · · » · · ···· ··· ···· ·· β©·· ·· ♦<

funkcí měřených za použití pulzní oxymetrie (obr. 7) a celotělové pletysmografie (Buxco Electronics, neukázáno).

Příklad 4

Podání IL-18 snižuje replikaci viru HBV

Ošetření IL-18 transgenních myší s virem hepatitidy B (HBV) vede ke snížení replikace viru závislému na dávce, jak je ukázáo snížením hladin virové DNA (obr. 8). Transgenní myši s virem HBV (Guidotti a kol., J. Virol., 69, 6158 až 6169 (1995)) se ošetří třemi • denními subkutánními injekcemi (den 0, 1 a 2) 4 různých dávek (100, 1 a 0,1 pg) rekombinantního myšího IL-18, přičemž analyýza jater na obsah HBV DNA v den 3 se provede metodou Southern blot. Všechny dávkové hladiny IL-18 mají účinek, přičemž určité snížení se pozoruje při nejnižší dávce (0,1 pg) a vyšší snížení při vyšších dávkách.

Příklad 5

IL-18 působí synergicky v kombinaci s IL-2 pro indukci tvorby IFN v šimpanzích a lidských mononukleárních buněk z periferní krve (PBMC)

Šimpanzí nebo lidské mononukleární buňky z periferní krve se isolují a ošetří buď kontrolním prostředím, lidským IL-18 v dávce 100 ng/1 nebo IL-18 (100 ng/ml) v kombinaci s IL-2 v dávce 3 ng/ml. Supernatanty se zmrazí po inkubaci 24, 48, 72 nebo 96 hodin. Hladiny mediátorů se analyzují pomocí ELISA. Data ukázaná na obr.

a 10 ukazují, že lidský IL-18 je aktivní při indukování exprese cytokinů v šimpanzích mononukleárních buňkách z

999»

99 • · · 9 9 9 · • · 9 9« 9 » · 9 9 9 9 · • · 9 9 9 9 9 ·· «*·· 99 99 jeho účinky na krve. Navíc ·· • 9 • 9

99 99 periferní krve s podobnou kinetikou na lidské mononukleární buňky z periferní existuje synergie mezi IL-2 a IL-18 při indukci GM-CSF, IL-8, Neopterinu a IFN-γ (obr. 9 a 10). Tato pozorování se potvrdí na četných šimpanzích a lidských dárcích.

Obr. 9 ukazuje, že lidský IL-18 indukuje IL-8 (14-násobně), Neopterin (7-násobně), GM-CSF (100-násobně) a IFN-γ (8-násobně). Nejvyšší hladiny proteinu se detekují ve vzorcích získaných 96 hodin po ošetření, kromě IFN-γ, který dosáhne maximální hladinu za 24 hodin. Kombinované ošetření lidským IL-18 a IL-2 vede k významně vyšší indukci.

Obr. 10 ukazuje reprodukovatelnost těchto zjištění u různých zvířat. V této studii se použije jako kontrola ošetření samotným IL-2. IFN-γ je ukázá na obr.

10(a), Neopterin na obr. 10(b) a IL-8 je ukázán na obr.

(c).

Příklad 6

Inhibice replikace HBV pomocí IL-18 je aditivní nebo synergická s IL-12

V podobných studiích jako jsou studie popsané v příkladu 4 a obr. 8 má ošetření IL-18 transgenních myší s virem hepatitidy B (HBV) v kombinaci s IL-12 vyšší účinnost přisnižování replikace viru stejně jako transkripce vorové DNA než každý z cytokinů samotný. Aditivní nebo synergiccký účinek se pozoruje po jediném subkutánním ošetření transgenní myši s virem HBV v den 0 pomocí IL-18 (10 pg) spolu s IL-12 (1 pg). Při vyšetření • · • · · * •ΟΛ · ··· · * · · • wM· ··· · · · · · · ·· 0« jater těchto myší v den 3 je replikace HBV výrazně snížena, jak je evidentní z detekce virové DNA pomocí metody Southern blot (obr. 11). Kombinace IL-18 a IL-2 také netoliko snižuje tvorbu HBV DNA, ale také dramaticky snižuje tvobu virové RNA, jak je evidentní ze zjišťování pomocí metody Northern blot provedených na těchto stejných vzorcích jater (obr. 11).

• 00 0*0 0

00 0 0 0 0 0 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9999 99

Seznáni sekvencí <110> Klaus M ESSER

Martin ROSENBERG Ruth TAL-SINGER Gary WOODNOTT ^<120> Způsoby léčení virových chorob pomocí IL-18 a kombinací IL-18 <130> P51144 <140> neznámý <141> 2001-06-01 <150> 60/208,869 <151> 2000-06-02 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> lidský <400> 1

Tyr

Phe

Gly

Lys

Leu

Glu

Ser

Lys

Leu

Ser

Val

Ile

Arg

Asn

Leu

Asn

1

5

10

15

Asp

Gin

Val

Leu

Phe

Ile

Asp

Gin

Gly

Asn

Arg

Pro

Leu

Phe

Glu

Asp

20

25

30

Met

Thr

Asp

Ser.

Asp

Cys

Arg Asp

Asn

Ala

Pro

Arg

Thr

Ile

Phe

Ile

35

40

45

Ile

Ser

Met

Tyr

Lys

Asp

Ser

Gin

Pr.o

Arg

Gly

Met

Ala

Val

Thr

Ile

50

55

60

Ser

Val

Lys

Cys

Glu

Lys

Ile

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Glu

Asn

Lys

Ile

65

70

75

80

Ile

Ser

Phe

Lys

Glu

Met

Asn

Pro

Asp

Asn

Ile

Lys

Asp

Thr

Lys

85

90

95

Ser

Asp

Ile

Phe

Gin

Arg

Ser

Val

Pro

Gly

His

Asp

Asn

Lys

100

105

110

Met

Gin

Phe

Glu

Ser

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Phe

Leu

Ala

Cys

Glu

115

120

125

Lys

Glu

Arg

Asp

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Leu

Lys

Glu

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Gly

Asp

Arg

Ser

Ile

Met

Phe

Thr

Val

Gin

Asn

Glu

Asp

145

150

155

1/2

9999 ·· ·· • · ♦ 9

9 9 • e 9 9

9 9 · ·· ···· <210> 2 <211> 157 <212> PRT <213> myší <400> 2

Asn

Phe

Gly Arg

Leu

His

Cys

Thr

Ala

Val

Ile

Arg

Asn

Ile

Asn

1

5

10

15

Asp

Gin

Val

Leu

Phe

Val

Asp

Lys

Arg

Gin

Pro

Val

Phe

Glu

Asp

Met

20

25

30

Thr

Asp

Ile

Asp

Gin

Ser

Ala

Ser

Glu

Pro

Gin

Thr

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Met

Tyr

Lys

Asp

Ser

Glu

Val

Arg

Gly

Leu

Ala

Val

Thr

Leu

Ser

50

55

60

Val

Lys

Asp

Ser

Lys

Met

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Asn

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Phe

Glu

Met

Asp

Pro

Glu

Asn

Ile

Asp

Ile

Gin

Ser

85

90

95

Asp

Leu

Ile

Phe

Gin

Lys

Arg

Val

Pro

Gly

His

Asn

Lys

Mat

Glu

100

105

110

Phe

Glu

Ser

Leu

Tyr

Glu

Gly

His

Phe

Leu

Ala

Cys

Gin

Lys

Glu

115

120

125

Asp

Ala

Phe

Lys

Leu

Ile

Leu

Lys

Asp

GlU

Asn

Gly Asp

130

135

140

Lys

Ser

Val

Met

Phe

Thr

Leu

Thr

Asn

Leu

His

Gin

Ser

145

150

155

2/2

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití polypeptidu, který má alespoň 90% shodu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:1 po celé délce SEQ ID NO:1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem chřipky, HIV, HSV, HPV, HAV, HBV nebo HCV.
2. Použití polypeptidu, který má alespoň 90% shodu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2 po celé délce SEQ ID NO:2 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem chřipky, HIV, HSV, HPV, HAV, HBV nebo HCV.
3. Použití polypeptidu podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci choroby způsobené virem chřipky, HIV, HSV, HPV, HAV, HBV nebo HCV.
4. Použití polypeptidu podle nároku 2 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci choroby způsobené virem chřipky, HIV, HSV, HPV, HAV, HBV nebo HCV.
5. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 a antivirového činidla pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem.
6. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 a imunomodulačního cytokinů pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem.
7. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 a činidla zvoleného ze skupiny sestávající z ribavirinu, interferonu a nebo β, IL-2, IL-12, GM, CSF, TNF, lamivudinu, rebetronu, tedy ribavirinu a interferonu a, cidofoviru, acykloviru, • · 0 0 0 0 • · «0 00 0000 0 · 0 0 0 0 00 0 0 0 00000 00 0 0 000 00 000 0 0 valacykloviru, pencykloviru, famcykloviru, gancykloviru nebo valgancykloviru pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem.
8. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 a imunogenu odvozeného od virového proteinu nebo nukleotidové sekvence pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem.
9. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 a virové vakcíny pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem.
10. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 a vakcíny zvolené z přípravků Havrix, Engerix B a Recombivax pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení choroby způsobené virem.