CZ20022352A3 - 4-pyridinyl-N-acyl-L-fenylalaniny - Google Patents

Description

Dosavadní stav techniky:

Molekula cévní buněčné adheze 1 (Vascular cell adhesion molecule 1; VCAM-1), člen supergenové rodiny imunoglobulinů (Ig), je exprimována na endothelu v aktivovaném, ale nikoliv v klidovém stavu. Integrin VLA-4 (α₄βι), který je exprimován na mnoha typech buněk, včetně cirkulujících lymfocytů, eosinofilů, bazofilů, monocytů, ale ne neutrofilů, je hlavní receptor pro VCAM-1. Protilátky proti VCAM-1 či VLA-4 mohou bránit adhezi těchto mononukleárních leukocytů k aktivovanému endothelu in vitro. Protilátky proti oběma proteinům byly efektivní v potlačení leukocytární infiltrace a v prevenci tkáňového poškození na několika zvířecích modelech zánětu. Anti-VLA-4 monoklonální protilátky dokázaly blokovat emigraci Tbuněk u léky navozené artritidy, bránit akumulaci eosinofilů a bronchokonstrikci u modelů astma, omezit paralýzu a inhibovat monocytární i lymfocytární infiltraci u experimentální autoimunní encefalitidy (EAE). AntiVCAM-1 monoklonální protilátky dokázaly prodloužit dobu přežití srdečního alotransplantátu. Nedávné studie ukázaly, že anti-VLA-4 mAbs mohou bránit vzniku zánětu Langerhansových buněk a diabetů u neobézních diabetických myší a mohou významným způsobem zmírnit zánět střev na modelu šlechtěného kosmana. Dále se ukázalo, že VCAM je exprimována na buňkách endothelu zanícené střevní tkáně na TNB/ethanol krysím modelu zánětlivého střevního onemocnění (Gastroenterology 1999, 116, 874-883).

Podstata vynálezu:

Sloučeniny, které inhibují interakci mezi a₄ podjednotkami integrinů a VCAM-1 mohou být použitelné jako léčebný prostředek pro léčbu chronických zánětlivých onemocnění jako je revmatoidní artritida (RA), roztroušená skleróza (multiple sclerosis, MS), astma a zánětlivé střevní onemocnění (inflammatory bowel disease, IBD). Sloučeniny předkládaného vynálezu mají tento účinek.

Jak je použito v tomto popisu, termín halogen znamená jakýkoliv ze čtyř halogenů: brom, chlór, fluor a jód, pokud není uvedeno jinak. Preferované halogeny jsou brom, fluor a chlór.

Termín nižší alkyl, samostatně nebo ve spojení, označuje jednoduché či rozvětvené řetězce alkylové skupiny, obsahující jeden až nanejvýš šest uhlíkových atomů (C1-C6), jako např. methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, nbutyl, sekundární butyl, isobutyl, terč. butyl, n-pentyl, n-hexyl a další.

Termín substituovaný nižší alkyl označuje nižší alkylovou skupinu, jak již byla definována, která je substituována jedním či více skupinami vybranými nezávisle z cykloalkylu, nitro, aryloxy, arylu, hydroxy, kyano, nižšího alkoxy, nižšího alkanoyl, nižšího alkylthio, nižšího alkylsulfinylu, nižšího alkylsulfonylu, amino či mono nebo di-nižšího amino. Příklady substituovaných nižších alkylových skupin zahrnují 2-hydroxyethyl, 3-oxobutyl, kyanomethyl, 2-nitropropyl. Ačkoliv je tento vynález speciálně zaměřen na substituovanou nižší alkylovou skupinu trifluoromethyl v pozici R-2 a R5, pentafluoroethyl je v této pozici rovněž zvažován. Totéž platí o R22 a R23.

Termín cykloalkyl (nebo nižší cykloalkyl) označuje nesubstituovaný nebo substituovaný tří- až sedmičlenný karbacyklický kruh. Substituenty použitelné v souladu s předkládaným vynálezem jsou: hydroxy, halogen, kyano, nižší alkoxy, nižší alkanoyl, nižší alkyl, aroyl, nižší alkylthio, nižší alkylsulfinyl, nižší alkylsulfonyl, aryl, heteroaryl a mono- či di-nižší alkyl substituovaný amino.

Termín nižší alkenyl označuje alkenylovou skupinu, mající od dvou do deseti uhlíků, s dvojnou vazbou mezi kterýmikoliv dvěma sousedními uhlíky.

• · · · ·· · · · · · · • Β ΒΒ Β Β Β Β

Termín nižší alkoxy označuje jednoduché či rozvětvené řetězce alkoxylových skupin, obsahující maximálně šest uhlíkových atomů, jako methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, terč.butoxy a jiné.

Termín nižší alkylthio označuje nižší alkylovou skupinu navázanou na zbytek molekuly přes dvoj vazný atom síry, např. methy lmerkapto či isopropylmerkapto skupinu. Termín nižší alkylsulfinyl označuje nižší alkylovou skupinu, jak již byla definována, navázanou na zbytek molekuly přes atom síry sulfinylové skupiny. Termín nižší alkylsulfonyl označuje nižší alkylovou skupinu, jak již byla definována, navázanou na zbytek molekuly přes atom síry sulfonylové skupiny.

Termín aryl označuje mono- či bicyklickou aromatickou skupinu, jako je fenyl nebo naftyl, která je nesubstituována, neboje substituována běžnými substituenty. Preferované substituenty jsou nižší alkyl, nižší alkoxy, hydroxy nižší alkyl, hydroxy, hydroxyalkoxy, halogen, nižší alkylthio, nižší alkylsulfinyl, nižší alkylsulfonyl, kyano, nitro, perfluoro nižší alkyl, aroyl, arylalkynyl, nižší alkynyl a nižší alkanoylamino. Příklady arylových skupin, které mohou být použity v souladu s tímto vynálezem, jsou: fenyl, p-tolyl, pmethoxyfenyl, p-chlorofenyl, m-hydroxyfenyl, m-methylthiofenyl, 2-methyl5-nitrofenyl, 2,6-dichlorofenyl, 1-naftyl a další.

Termín arylalkyl označuje nižší alkylovou skupinu, již dříve zde definovanou, kde je jeden nebo více uhlíkových atomů nahrazeno arylovou nebo heteroarylovou skupinou, zde definovanou. Jakékoliv běžné arylalkyly mohou být použity v souladu s tímto vynálezem, jako např. benzyl a jiné.

Termín heteroaryl označuje nesubstituované či substituované pětinebo šestičlenné monocyklické heteroaromatické kruhy nebo devíti- či desetičlenné heteroaromatické kruhy obsahující 1,2,3 nebo 4 heteroatomy, které jsou nezávisle N,S nebo O. Příklady heteroarylových kruhů jsou pyridin, benzimidazol, indol, imidazol, thiofen, isochinolon, chinzolin a další. Substituenty již dříve popsané pro aryl jsou zahrnuty i v definici heteroarylu.

Termín nižší alkoxykarbonyl označuje nižší alkoxylovou skupinu, vázanou přes karbonylovou skupinu. Příkladem alkoxykarbonylové skupiny je ethoxykarbonyl a další.

Termín alkylkarbonyloxy označuje nižší alkylkarbonyloxy skupinu, vázanou přes atom kyslíku, například acetoxy skupinu. Termín acyloxy má stejný význam.

Termín nižší alkanoyl označuje nižší alkylovou skupinu vázanou přes karbonylovou skupinu a zahrnuje ve smyslu předchozí definice skupiny jako acetyl, propionyl a podobně. Termín perfluoro- nižší alkanoyl označuje perfluoro-nižší alkylovou skupinu (substituovaná nižší alkylová skupina, kde jsou všechny atomy vodíku substituovány fluorem, nejlépe trifluoromethylem nebo pentafluoroethylem), navázanou na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu. Termín perfluro nižší alkanoylamino označuje nižší perfluoroalkanoyl skupinu navázanou na zbytek molekuly přes aminoskupinu.

Termín nižší alkylkarbonylamino označuje skupinu nižšího alkylkarbonylu, navázanou na zbytek molekuly přes atom dusíku, jako například acetylamin. Termín nižší alkylaminokarbonyl označuje nižší alkylaminoskupinu navázanou na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu. Termín arylaminokarbonyl označuje arylovou skupinu navázanou na aminoskupinu dále navázanou na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu.

Termín aroyl označuje mono- či bicyklicko arylovou či heteroarylovou skupinu navázanou na zbytek molekuly přes karbonylovou skupinu. Příklady arylových skupin jsou: benzoyl, 3-kyanobenzoyl, 2-naftoyl, nikotinoyl a další.

Farmaceuticky přijatelné soli, dobře známé ze stavu techniky, mohou být připraveny běžnými metodami beroucími v potaz chemickou povahu sloučenin. Příklady farmaceuticky přijatelných solí kyselých sloučenin jsou alkalické kovy a kovy alkalických zemin, jako sodík, draslík, hořčík, vápník; bazické aminy a bazické aminokyseliny, amonné a alkylamonné soli.

0 9 0

0 0 0 9 0 9 0 0

099 0 099 0 0 •90 999 0990

009 0· 09 9090 ·0 00

Obzvláště vhodné soli, co se týče tohoto vynálezu, jsou soli sodíku, např. kde Re je H. Sodné soli kterékoliv kyseliny v tomto vynálezu lze snadno získat z kyseliny zpracováním s hydroxidem sodným. Příklady zásaditých sloučenin jsou soli anorganických i organických kyselin: kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, sírové, dusičné, fosforečné, citrónové, mravenčí, fumarové, maleinové, octové, jantarové, vinné, methasulfonové a p-toluensulfonové.

Předložený vynález zahrnuje sloučeninu vzorce I:

a její farmaceuticky přijatelné soli. Také zahrnuje farmaceutické prostředky, které je obsahují, jejich použití jako léků při léčbě určitých chorob a dále postupy a meziprodukty pro jejich přípravu.

V souladu s vynálezem, Ri je skupina Y-l, Y-2 nebo Y-3 jak bude popsána dále: Y-l je skupina vzorce:

Y-l kde: R22 a R23 jsou nezávisle vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, cykloalkyl, aryl, arylalkyl, nitro, kyano, nižší alkylthio, nižší alkylsulfinyl, nižší alkylsulfonyl, nižší alkanoyl, halogen, perfluoroalkyl, přičemž alespoň jeden z R₂2 a R23 je jiný než vodík; R24 je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, aryl, nitro, kyano, nižší alkylsulfinyl, či halogen;

Y-2 je skupina vzorce Y-2, což je pěti- nebo šestičlenný heteroaromatický kruh vázaný přes atom uhlíku na karbonylamid, kde zmíněný kruh obsahuje jeden, dva, nebo tri heteroatomy vybrané ze skupiny N,O, nebo S a jeden nebo dva atomy zmíněného kruhu jsou nezávisle substituovány nižším alkylem, cykloalkylem, halogenem, kyano, nižším perfluoroalkylem, arylem a alespoň jeden ze zmíněných substituentů sousedí s atomem uhlíku navázaným na amid karbonyl;

Y-3 je tří- až sedmičlenný kruh vzorce:

R25 Q-u

Y-3 kde: R25 je nižší alkyl, nesubstituovaný, či fluorem substituovaný nižší alkenyl, nebo skupina vzorce R₂6-(CH₂)_e- , R26 je aryl, heteroaryl, azido, kyano, hydroxy, nižší alkoxy, nižší alkoxykarbonyl, nižší alkanoyl, nižší alkylthio, nižší alkylsulfonyl, nižší alkylsulfinyl, nižší perfluoroalkanoyl, nitro, nebo je R₂6 skupina vzorce -NR₂gR₂9, kde R₂s je vodík nebo nižší alkyl, R₂g je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxykarbonyl, nižší alkanoyl, aroyl, nižší perfluoroalkanoylamino, nižší alkylsulfonyl, nižší alkylaminokarbonyl, nebo R₂s a R₂9 tvoří spolu s připojeným atomem dusíku čtyř-, pěti- či šestičlenný nasycený heterocyklický kruh, který může obsahovat jeden přidaný atom vybraný z O, S a N-R₄₀ . Q je -(CH₂)_f O- , -(CH₂)_f S-, -(CH₂)_f N(R₂₇)-,

-(CH₂)f -, R₂₇ je vodík, nižší alkyl, aryl, nižší alkanoyl, aroyl nebo alkoxykarbonyl, R₄₀ je vodík, alkyl, aryl, nižší alkanoyl, aroyl nebo nižší alkoxykarbonyl, atomy uhlíku v kruhu jsou nesubstituované nebo substituované nižším alkylem, či halogenem, e je celé číslo od nuly do čtyř a f je celé číslo- od nuly do tří;

R₂ je vodík, nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl, aryl nebo nižší arylalkyl,

R3 je vodík, halogen, nižší alkyl nebo aryl a může rovněž obsahovat trifluoromethyl,

R₄ je vodík, halogen, nižší alkyl nebo aryl,

Rs je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, trifluoromethyl nebo hydroxy,

R₆ je vodík, nižší alkyl, nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl, nebo skupina vzorce P-3:

·· · · ^32 _R

-(CHaJh-C-ÍCHágX ^{33 H} R34

P-3 kde: R32 je vodík nebo nižší alkyl, R33 je vodík, nižší alkyl, aryl, R34 je vodík, nebo nižší alkyl, h je celé číslo od nuly do dvou, g je celé číslo od nuly do dvou, součet g a h je 1-3; nebo je Re skupina vzorce P-4:

r~\

4CH2)h—c~(CH^g-f^ μ

P-4 kde:R32, g a h jsou jako dříve definované, Q'je O,S, -(CPhjj- nebo skupina vzorce N-R35, R35 je vodík, nižší alkyl, nižší alkanoyl, nižší alkoxykarbonyl, j je O, 1 či 2, R7 je vodík, chlór, nižší alkoxy, nižší alkyl.

Q je přednostně -(CH2)f 0-, -(CH₂)f S- nebo -(CH₂)f - (vzorec la). Ve sloučenině vzorce I nebo laje přednostně R5 vodík, nižší alkyl nebo trifluoromethyl (vzorec lb).

Sloučeniny vynálezu mohou existovat jako stereoisomery a diastereomery, z nichž jsou všechny zahrnuty v rámci předkládaného vynálezu.

V prvním výhodném provedení sloučeniny vzorce I, la nebo lb, je R2 vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl, R₃ je vodík, nižší alkyl nebo trifluoromethyl, přednostně vodík, R4 je vodík nebo halogen, přednostně halogen, R5 je vodík, nižší alkyl, trifluoromethyl a může to být i nižší alkoxy, ale preferován je vodík, Ró je vodík nebo nižší alkyl a R7 je vodík, chlór, nižší alkoxy nebo nižší alkyl.

Další výhodnější provedení prvního výhodného provedení předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce I, la nebo lb:

0« ·· 00 0« 0000 00 0000 00 0

000 0 000 0 0 000 000 0000

000 00 00 0000 00 00

kde R.22 a R23 jsou nezávisle: vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, cykloalkyl, aryl, arylalkyl, nitro, kyano, nižší alkylthio, nižší alkylsulfinyl, nižší alkylsulfonyl, nižší alkanoyl, halogen nebo nižší perfluoroalkyl a alespoň jeden z R22 a R23 je jiný než vodík a R24 je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, aryl, nitro, kyano, nižší alkylsulfonyl nebo halogen, přičemž nejčastěji R22 a R₂3 jsou nezávisle nižší alkyl nebo halogen a R₂4 je vodík nebo nižší alkoxy; nebo kde R22 a R23 jsou nezávisle vodík, nižší alkyl nebo halogen a R24 je vodík, nižší alkyl nebo nižší alkoxy, zejména vodík. V těchto sloučeninách je přednostně R2 vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl, zejména nižší arylalkyl. Mimoto v takových sloučeninách je přednostně R3 vodík, R4 je vodík, halogen, nebo i nižší alkyl (ale přednostně halogen); R₅ je vodík, nižší alkyl, trifluoromethyl nebo i nižší alkoxy (ale přednostně vodík); Rg je vodík nebo nižší alkyl; R7 je vodík, chlór, nižší alkoxy nebo nižší alkyl.

Výhodnější provedení předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce I, la, nebo lb shora uvedené, kde Ri je skupina Y-l

kde R22 a R23 jsou nezávisle vodík, nižší alkyl či halogen, především nižší • 44 44 ·« · · ····

4 4 4 4 9 4 4 «φ 4 • 4 ♦ 4 4 4 44 4

444 4 444 4 4

444 444 4444

444 94 44 4444 49 44 alkyl nebo halogen; R₂4 je vodík, nižší alkyl nebo nižší alkoxy, především halogen. V těchto sloučeninách je přednostně R2 vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R3 je vodík; R<je vodík nebo halogen; R5 je vodík nebo nižší alkyl; Rg je vodík nebo nižší alkyl; R7 je vodík, chlór, nižší alkoxy, nižší alkyl. V obzvlášť preferovaných sloučeninách tohoto výhodnějšího provedení jsou R22 a R23 nezávisle vodík, nižší alkyl nebo halogen; R24 je vodík nebo nižší alkoxy, R2 je nižší arylalkyl. Nebo je v těchto sloučeninách preferováno, že R₂ je vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R₃ je vodík; R4 je vodík, halogen nebo i nižší alkyl (ale přednostně halogen); R5 je vodík, nižší alkyl, trifluoromethyl, nebo i nižší alkyl (ale přednostně vodík); Rg je vodík nebo nižší alkyl; R7 je vodík, chlór, nižší alkoxy, nižší alkyl.

Další výhodné provedení předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce I, la nebo lb shora uvedená, především z prvního výhodného provedení, kde Ri je pěti- nebo šestičlenný heteroaromatický kruh vázaný přes uhlíkový atom na karbonylamid, kde zmíněný kruh obsahuje jeden, dva, nebo tři heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z N,0 a S a jeden nebo dva atomy zmíněného kruhu jsou nezávisle substituovány nižším alkylem, cykloalky lem, halogenem, kyano, nižším perfluoroalkylem nebo arylem a alespoň jeden ze zmíněných substituovaných atomů přiléhá k uhlíku navázanému na karbonylamid. V těchto sloučeninách je obzvláště preferováno, že R₂ je vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R₃ je vodík; R4 je vodík nebo halogen (přednostně halogen); R₅ je vodík, trifluoromethyl nebo nižší alkyl (přednostně vodík); Ré je vodík nebo nižší alkyl; R7 je vodík, chlór, nižší alkoxy, nižší alkyl. Jako alternativa je v těchto sloučeninách preferováno, že R₂je vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R₃ je vodík; R₄ je vodík, halogen, nebo i nižší alkyl (ale přednostně halogen); R5 je vodík, nižší alkyl, trifluoromethyl, nebo i nižší alkoxy (ale přednostně vodík); Rg je vodík nebo nižší alkyl; R₇ je vodík, chlór, nižší alkoxy, nižší alkyl.

Další výhodné provedení předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce I, la nebo lb shora uvedené, kde Ri je skupina vzorce Y-3, což je tří- až sedmičlenný kruh o vzorci;

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 · · · •4 4444 44 44

R25

Y-3 kde R25 je nižší alkyl, nesubstituovaný nebo fluorem substituovaný nižší alkenyl, nebo skupina vzorce R₂6-(CH2)_e-; R₂6 je aryl, heteroaryl, azido, kyano, hydroxy, nižší alkoxy, nižší alkoxykarbonyl, nižší alkanoyl, nižší alkylthio, nižší alkylsulfonyl, nižší alkylsulfinyl, nižší perfluoroalkanoyl, nitro, nebo je R₂6 skupina vzorce -NR₂«R₂9 , kde R₂g je vodík nebo nižší alkyl, R₂9 je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxykarbonyl, nižší alkanoyl, aroyl, nižší perfluoroalkanoy lamino, nižší alkylsulfonyl, nižší alkylaminokarbonyl, arylaminokarbonyl, nebo R₂g a R₂g spolu s připojeným atomem dusíku tvoří čtyř, pěti- nebo šestičlenný nasycený heterocyklický kruh, který může obsahovat jeden přidaný heteroatom vybraný z O,S, N-R40. Q je -(CH₂)f O-, -(CH₂)f S-. -(CH₂)f N(R₂₇)- , -(CH₂)f- , R₂7 je vodík, nižší alkyl, aryl, nižší alkanoyl, aroyl nebo nižší alkoxykarbonyl, R₄o je vodík, nižší alkyl, aryl, nižší alkanoyl, aroyl nebo nižší alkoxykarbonyl, atomy uhlíku jsou v kruhu nesubstituovány nebo substituovány nižším alkylem či halogenem, e je celé číslo od nuly do čtyř, f je celé číslo od nuly do tří. V těchto sloučeninách je přednostně R₂ vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R3 je vodík, nižší alkyl nebo trifluoromethyl; R₄ je vodík nebo halogen (přednostně halogen); R5 je vodík, trifluoromethyl nebo nižší alkyl (přednostně vodík); Rg je vodík nebo nižší alkyl; R₇ je vodík, chlór, nižší alkoxy, nižší alkyl. Alternativně je v těchto sloučeninách přednostně R₂ vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R3 je vodík; R₄je vodík, halogen, nebo i nižší alkyl (ale přednostně vodík); R5 je vodík, nižší alkyl, trifluoromethyl, může spolu s tím nižší alkoxy (ale přednostně vodík); Rg je vodík nebo nižší alkyl; R₇ je vodík, chlór, nižší alkoxy nebo nižší alkyl.

Výhodné provedením předkládaného vynálezu je sloučenina vzorce I, la nebo lb shora uvedené, především prvního výhodného provedení, kde Ri je skupina vzorce Y-3 jak již definován, přesněji, kde je, 3-7členný kruh vzorce: R25

Q—

Y-3

4* 4« «·

4 4 0 9 4 4 · · 0 • · 4 4 4 · 4 4 4 • 44404 ««·» 0 • · · 4 4 4 4900

044 44 44 4444 04 40 kde R₂5 je skupina vzorce R₂₆-(CH₂)_e- , kde R₂₆ je nižší alkoxy, Q je -(CH₂)f, e je celé číslo od nuly do čtyř a f je celé číslo od nuly do tří; tyto sloučeniny jsou zejména preferovány, kde R₂ je vodík, nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl, aryl nebo nižší arylalkyl, zejména nižší arylalkyl. Tyto sloučeniny jsou rovněž preferovány, když R₂ je nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R3 je vodík; R4 je vodík nebo halogen; R₅ je vodík; Rg je vodík nebo nižší alkyl; R₇ je vodík, chlór, nižší alkoxy nebo nižší alkyl. Nebo je v těchto sloučeninách preferováno, že R₂ je vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R3 je vodík; R4 je vodík, halogen, kromě toho může být i nižší alkyl (ale přednostně halogen); R₅ je vodík, nižší alkyl, trifluoromethyl, kromě toho může být i nižší alkoxy (ale přednostně vodík); Rď je vodík nebo nižší alkyl; R? je vodík, chlór, nižší alkoxy nebo nižší alkyl.

V kterékoliv sloučenině tohoto vynálezu o vzorci I, la nebo lb může být skupina vzorce Y-l nebo skupina vzorce Y-3; R₂ může být vodík, nižší alkyl nebo nižší arylalkyl, přednostně nižší alkyl, zejména methyl, u nižšího arylalkylu přednostně benzyl; R3 může být vodík, nižší alkyl,trifluoromethyl, přednostně vodík nebo nižší alkyl; R4 může být vodík nebo halogen; R₅ může být vodík, nižší alkyl nebo trifluoromethyl; R6 může být vodík, nižší alkyl, nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl, nebo skupina vzorce P-3 a může to být i skupina vzorce P-4; R₇, může být nižší alkyl nebo vodík, přednostně vodík.

V kterékoliv sloučenině v tomto vynálezu o vzorci I, la nebo lb, nebo preferovaných sloučeninách popsaných hned v předchozím odstavci skupiny s Y-l a Y-3 mohou být konkrétně vybrány takto: R₂₂ a R₂3 jsou vodík, halogen, nižší alkyl, R₂4 je vodík nebo nižší alkoxy, R₂5 je skupina o vzorci

R₂₆-(CH₂)_e- , kde R₂6 je nižší alkoxy; Q je -(CH₂)f- , e je celé číslo od nuly do čtyř, f je celé číslo od nuly do tří, a/nebo kde R₂ je nižší alkyl, R4 je 'vodík, R₃ a R₅ jsou nižší alkyly nebo trifluoromethyl, Reje vodík, nižší alkyl, nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl, nebo skupina vzorce P-3, přednostně kde R₃₂ je vodík; R33 a R34 jsou nižší alkyl; jeden z dvojice g a h je nula a druhý jedna. V těchto sloučeninách jsou přednostně R₆ a R₇ vodík, a/nebo R₂ je nižší alkyl; R3 je vodík; R4 je vodík nebo halogen, především halogen; R₂₄ je vodík nebo nižší alkoxy; přednostně vodík nebo Rj je Y-3. Konkrétní sloučeniny jsou:

• <4· • 4 4 • · »	44 4 4	4 4 • 4 4	·· • 4 4 4	4·(*4 4 •
4	»
4 4 *	4	4	4	4 4	4 4
·· 4·	4 4		4 444	4·	44

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyrinidyl ]-L-fenylalanin;

N-[(2-ethyl-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoro-methyl)2-oxo-3-pyrinidyl ] -L-fenylalanin;

N- [(2-( 1 -methylethyl)-6-methylfenyl)karbonyl] -4-[ 1,6-dimethyl-4(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyrinidyl ]-L-fenylalanin;

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyrinidyl ]-L-fenylalanin; nebo

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonylJ-4-(l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyrinidyl)-L-fenylalanin; nebo

N-[(2-chloro-6-methylfenyi)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyrinidyl)-L-fenylalanin.

V dalších takových sloučeninách, R22 a R23 jsou přednostně halogen nebo nižší alkyl; R24 je vodík nebo nižší alkoxy; R25 je skupina vzorce R26-(CH2)_e- , kde R26 je nižší alkoxy; Q je -(CH2)f- ,e je celé číslo od nuly do čtyř a f je celé číslo od nuly do tří, zvláště

N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl] karbonyl-4-[l,6-dimethyl-4(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl ]-L-fenylalanin, a/nebo R2 je aryl nižší-alkyl; R3 je vodík; R4 je halogen a R5, Ró a R7 jsou vodíky. Také je preferováno, aby Ri byl ¥-1.

V obzvláště výhodné sloučenině vzorce I, la nebo lb, Ri je skupina vzorce Y-l nebo skupina vzorce Y-3; R2 je nižší alkyl nebo nižší arylalkyl; R3 je vodík, nižší alkyl nebo trifluoromethyl; R4 je vodík nebo halogen; R5 je vodík, nižší alkyl nebo trifluoromethyl; Ró je vodík, nižší alkyl, nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl, nebo skupina vzorce P-3; a R₇ je vodík (vzorec A).

V preferované sloučenině vzorce A, skupiny v Y-l a Y-3 mohou být konkrétně vybrány takto: R22 a R23 jsou vodík, halogen nebo nižší alkyl; R24 je vodík nebo nižší alkoxy; R₂s je skupina vzorce R2ó-(CH₂)_e- , kde R26 je nižší alkoxy; Q je -(CHhjf - , e je celé číslo od nuly do čtyř a f je celé číslo od nuly do tří (vzorec A-l).

V preferované sloučenině vzorce A-l, R2 je nižší alkyl, R₄ je vodík a R3 a R5 jsou nižší alkyl nebo trifluoromethyl (vzorec A-l a). V jednom provedení vzorce A-l a, Ró je vodík. V tomto provedení, Ri může být y-1, zejména kde R22 a R23 jsou halogen nebo nižší alkyl, nebo Ri může být Y-3. V dalších provedeních vzorce A-la, Rg je nižší alkyl, především methyl, nebo nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl, především l-(acetoxy)ethyl, nebo skupina vzorce P-3, kde R32 je vodík; R33 a R34 jsou nižší alkyl, především ethyl nebo methyl; jeden z dvojice g a h je jedna, druhý nula.

Když je R6 nižší alkyl, jednotlivé sloučeniny jsou:

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyrinidyl]-L-fenylalanin ethylester;

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyrinidyl]-L-fenylalanin ethylester;

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyrinidyl]-L-fenylalanin ethylester; nebo

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyrinidyl] -L-fenylalanin ethylester.

Když je Rg nižší alkylkarbonyloxy-nižší alkyl, jednotlivé sloučeniny jsou:

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 1-(aceto xy)ethylester;

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyrinidyl3-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylester;

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylester; nebo

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl] -L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylester.

Když Rg odpovídá P-3, jednotlivé sloučeniny jsou: N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyrinidyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylester;

• ·

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonylJ-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyrinidyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylester;

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyrinidyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylester; nebo

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyrinidyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylester.

V jiné preferované sloučenině vzorce A-l, Rď je vodík. Je výhodné, když R2 je nižší alkyl; R3 je vodík; R4 je vodík nebo halogen; R₅ je vodík nebo nižší alkyl (vzorec A-lb). V jednom provedení vzorce A-lb, Ri je Y-l. Přednostně R22 a R23 jsou nižší alkyl nebo halogen a R24 je vodík; nebo R22 a R23 jsou halogeny a R24 je vodík, zejména

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin;

N-[(2-chÍoro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyrinidyl)-Lfenylalanin;

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3- - pyrinidyl)-L-fenylalanin; nebo

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-Lfenylalanin, nebo R22 a R24 jsou vodíky nebo halogen a R23 je nižší alkoxy. V jiném provedení vzorce A-lb, Ri je Y-3, především 4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyrinidyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)-cyklopentyl]karbonyl3-L-fenylalanin.

V jiném provedení sloučeniny vzorce A, kde Ri je Y-l, přičemž R22 a R23 jsou halogen nebo nižší alkyl; R24 je vodík nebo nižší alkoxy, nebo kde Ri je Y-3, přičemž R25 je skupina vzorce R26-(CH2)_e kde R26 je nižší alkoxy, Q je -(CIDf - , e je celé číslo od nuly do čtyř a f je celé číslo od nuly do tří. Přednostně, R2 je nižší arylalkyl; R₃ je vodík; R4 je halogen a R5, Rg a R₇jsou vodíky. Přednostně, Ri je Y-l, zejména

4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[(2-chloro-6-methylfenyl)-karbonyl]-L-fenylalanin; nebo

4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)♦ · 4

4 4 4 karbonyl]-L-fenylalanin.

Z dalšího hlediska se předkládaný vynález týká sloučenin vzorce II:

R4

kde R-2 -Rs a R7 jsou jak již dříve definované ve vzorci I, Pi a P2 jsou chránící skupiny. Podrobněji, Pi je standardní skupina chránící dusík jako např. terciální butyloxykarbonyl a P2 je standardní chránící skupina uhlíku, jako např. nižší alkyl nebo substituovaný nižší alkyl. Tyto sloučeniny jsou užitečné meziprodukty při přípravě sloučenin vzorce I.

Sloučeniny vynálezu inhibují vazbu VCAM-1 a fíbronektinu na VLA-4 cirkulujících lymfocytů, eosinofilů, basofilů a monocytů (VLA-4-exprimující buňky). Vazba VCAM-1 a fíbronektinu na VLA-4 těchto buněk je prokázána u určitých chorobných stavů, jako je revmatoidní artritida, zánětlivá onemocnění střev, roztroušená skleróza a obzvláště ve vazbě eosinofilů na endothel dýchacích cest, která přispívá ke vzniku plicního zánětu, jenž se objevuje u astma. Sloučeniny předkládaného vynálezu tak mohou být použity k léčbě astma.

Na základě jejich schopnosti inhibovat vazbu VCAM-1 a fíbronektinu k VLA-4 cirkulujících lymfocytů, eosinofilů, basofilů a monocytů, sloučeniny vynálezu mohou být použity jako léčivo nebo farmaceutický prostředek obzvláště k léčbě poruch, které jsou známy svým spojením s touto vazbou. Příkladem takových poruch je revmatoidní artritida, roztroušená skleróza, astma a zánětlivá střevní onemocnění. Sloučeniny podle vynálezu slouží přednostně k léčbě chorob, jež zahrnují plicní zánět, jako je astma. Plicní zánět, který se objevuje u astma, je spojen s plicní infiltrací aktivovanými eosinofily, monocyty a lymfocyty, jež byly aktivovány nějakou astmaspouštěcí událostí či látkou.

Kromě toho, sloučeniny vynálezu také potlačují vazbu VCAM-1 a MadCAM na buněčný receptor alfa4-beta7, známý též jako LPAM, který je exprimován na lymfocytech, eosinofilech a T-buňkách. Ačkoliv přesná úloha alfa4-beta7 interakce s různými ligandy v podmínkách zánětu typu astma není zcela objasněna, sloučeniny podle vynálezu které inhibují obě alfa4-betal i alfa4-beta7 receptorové vazby, jsou obzvláště účinné na zvířecích modelech astma. Mimoto práce s monoklonálními protilátkami k alfa4-beta7 ukazují, že sloučeniny, které inhibují alfa4-beta7 vazbu na MadCAM nebo VCAM, jsou použitelné pro léčbu zánětlivého onemocnění střev. Mohou být také použitelné v léčbě jiných nemocí, kde je takováto vazba prokázána jako příčina postižení nebo příznaků nemoci.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podány orálně, rektálně, či parenterálně, např. intravenózně, intramuskulárně, subkutánně, intrathékálně nebo transdermálně; či sublinguálně nebo jako oční preparáty nebo jako aerosol v případě zánětu plic. Tobolky, tablety, suspenze nebo roztoky pro orální použití, čípky, injekční roztoky, oční kapky, masti nebo roztoky ve spreji jsou příklady způsobů aplikace.

Intravenózní, intramuskulární^ orální nebo inhalační podání je přednostní forma použití. Dávky, při kterých jsou sloučeniny vynálezu podávány v účinném množství, závisí na povaze specifické aktivní složky, na věku a potřebách pacienta a na způsobu použití. Dávky mohou být určeny některým z běžných způsobů, například na základě klinických testů. Vynález dále zahrnuje metodu léčení hostitele trpícího nemocí, u níž je vazba VCAM1 či fibronektinu na VLA-4 exprimující buňky příčinným faktorem příznaků nemoci nebo poškození; zavedením množství sloučenin podle vynálezu postačujících k inhibici VCAM-1 nebo fibronektinové vazby na VLA-4 exprimující buňky tak, aby zmíněné příznaky či poškození byly redukovány. Obecně jsou preferovány dávky okolo 0,1-100 mg/kg tělesné hmotnosti na ·· ··· · den, se spíše výhodnými dávkami 1-25 mg/ kg /den a s obzvláště výhodnými dávkami 1-10 mg/kg/den.

Z dalšího hlediska se dále vynález týká léků nebo farmaceutických prostředků, zahrnujících farmaceuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu, včetně jejích farmaceuticky přijatelných solí, a farmaceuticky přijatelný nosič. Také se týká postupu přípravy farmaceutických prostředků, který zahrnuje přivedení sloučeniny v souladu s vynálezem, včetně farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelného nosiče do galenické formy podávání. Tyto prostředky mohou být vytvořeny kterýmkoliv běžným způsobem. Tablety či granule mohou obsahovat řadu pojiv, náplní, nosičů nebo rozpouštědel. Tekuté směsi mohou být například ve formě sterilního, s vodou mísitelného roztoku. Tobolky mohou obsahovat plnivo či zahušťovadlo navíc kromě aktivní složky. Dále mohou být přítomny chuť vylepšující přísady, stejně jako látky běžně používané jako konzervační, stabilizující, vlhkost zadržující přísady a emulgační přísady, rovněž soli pro měnící se osmotický tlak a další přísady.

Dříve zmíněné nosičové materiály a rozpouštědla mohou zahrnovat libovolné klasické farmaceuticky přijatelné organické i anorganické látky, např. vodu, želatinu, laktózu, stearát hořečnatý, mastek, arabskou pryskyřici, polyalkenové glykoly a pod.

Jednotka orálních dávkových forem, jako např. tablety nebo kapsule, výhodně obsahuje od 25 mg do 1000 mg sloučeniny vynálezu.

Všeobecně sloučenina vynálezu může být připravena z vhodných derivátu fenylalaninu prostřednictvím paládiem katalyzovaná reakce s 3halo-2 pyridonem.

Jak je ukázáno na schématu reakce 1, deriváty 4- jodo nebo 4-bromfenylalaninu, jako např. 1, se mění na chráněný fenylalaninový derivát 2, v němž R7' je vodík, chlór, nižší alkyl nebo nižší alkoxy, PÍ standardní dusík chránící skupina jako např. Boc, nebo karbobenzyloxy skupina a P2 je nižší ·· 9999 ·· 99 alkyl nebo substituovaný nižší alkyl přiměřeně vybraný, aby sloužil jako chránící skupina nebo součást léčiva. Skupina P2 může být zavedena klasickými prostředky, které jsou známé odborníkům v oblasti peptidové chemie. Pořadí přidání Pia P2 není rozhodující a bude záviset na konkrétním výběru reaktantů. Diskuse o použití a uvedení chránících skupin je poskytnuta v publikaci Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts., Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley Interscience, New York, 1991. Alternativně, sloučenina se vzorcem 1 může být změněna na sloučeninu se vzorcem 4, v němž R1 představuje součást acylové skupiny vynálezu. Výhodné je zavést nejdříve esterovou skupinu P2 a pak pokračovat slučovací reakcí s volným aminem, použitím běžných reaktantů slučujících bílkoviny, jako např. HBTU v přítomnosti terciální aminové zásady, jako např. diethylisopropylaminu. Opět, konkrétní výběr reaktantů může způsobit změnu v pořadí přidání Rl' a P2. Změna sloučenin se vzorcem 2 nebo 4 na deriváty 3 nebo 5, v kterých M reprezentuje substituovaný atom cínu nebo bóru, může být ovlivněna přítomností vhodného činidla, např. hexametyldicínu, hexabutyldicínu nebo tetraalkoxydiboru v přítomnosti zdroje paládia. Metodologie je načrtnuta v publikaci F. Dietrich and P.J. Stang, ed, Metal Catalyzed Cross Coupling Reactions, Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 1998.

Reakční schéma 1

9 0 9

Substituované pyridony se vzorcem 6, kde R3', R/a Rs'jsou vodík, nižší alkyl, perfluoro nižší alkyl, halogen, aryl, hydroxy, nebo nižší alkoxy jsou komerčně přístupné nebo mohou být připraveny podle metod popsaných v literatuře (např. diskuse o některých známých postupech jsou k nalezení v : P. Wirth, a kol., Ger. Offen. 28 17 293, Aug. 12, 1979, Masaru Hojo, a kol., Chem Lett 1976, 499-502, Robert W. Lang, a kol., Helvetica Chimica Acta, 1988, 71, 596-601). Sloučeniny vzorce 7, kde R2 je nižší alkyl nebo aryl nižší alkyl, jsou získané alkylací sloučenin se vzorcem 6 a zpracováním s alkylačními činidly jako např. uhličitanem draselným a volitelně i fázovým transferovým katalyzátorem. Pro méně reaktivní alkylační činidla může být nezbytné použít silnější zásadu jako např. hydroxidy alkalických kovů a reakční směs zahřát. Sloučeniny vzorce 7 (definovány výše) můžou být halogenované na 3. pozici zpracováním s tradičními halogenačními reaktanty jako např. bromem, N- jodosukcinimidem nebo N- bromosukcinimidem ve vhodném rozpouštědle jako např. kyselině octové v pevném nebo kapalném skupenství při vzniku halopyridonů se vzorcem 8, X=Br nebo I, R₂'je volný vodík, nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl nebo aryl nižší alkyl, R₃'a R5'jsou vodík, nižší alkyl nebo perflouro nižší alkyl. Zpracování s nadbytkem halogenačního činidla vede ke vzniku sloučeniny 8 s R4' halogenem. Pro sloučeniny vzorce 8, v kterých R2' je aryl, je výhodné začít s N-arylpyridony, které jsou již známými sloučeninami nebo uvést určitý podíl arylu např. použitím Ullmanovy slučovací reakce, která je popsaná v publikaci Makatusu, a kol., Chem. Pharm. Bull. 1997, 45, 719.

Reakční schéma 2

···*·· · · · · · • · · · · · ···· ··· ·* ·· ···· ·· ··

Podobně jako v Schématu reakce 3, sloučenina vzorce 8 může být použita v slučovací reakci s deriváty fenylalaninu vzorce 3 nebo 5, katalyzované paládiem. Např., když M je substituováno cínem, zpracování směsi sloučeniny 8 a fenylalaninu vzorce 3 nebo 5 se zdrojem paládia nula jako např. tetraakis(trifenylfosfin)paladiem nebo bis(trifenylfosfin)paladium dichloridem v přítomnosti inertního rozpouštědla jako např. DMF při teplotě v rozmezí od teploty místnosti do 100°C, dá vznik sloučeniny vzorce 9 nebo

10. Sloučeniny vzorce 9 mohou být změněny na sloučeniny vzorce 10 odstraněním chránící skupiny Pj, čehož je možné dosáhnout klasickými postupy v závislosti na výběru Pi. Např. jestli Pí je Boc skupina, tato může být odstraněna přidáním silné kyseliny jako např. kyseliny trifluorooctové, volitelně v přítomnosti rozpouštědla jako např. methylchloridu a zachytávacím činidlem. Výsledný volný amin pak může být acylovaný kyselinou vzorce R1CO2H použitím klasických technik pro slučování bílkovin. Např. zpracováním HBTU v přítomnosti terciálního aminu jako např. dietylisopropylaminu v přítomnosti aprotického rozpouštědla jako např. DMF se získá sloučenina vzorce 10.

Pokud je žádaným výsledným produktem volná kyselina 11, esterová skupina P2 může být odstraněna konvenčními postupy. Např., jestliže je P2 nižší alkyl např. metyl, tento může být odstraněn přidáním hydroxidu alkalických kovů, např. hydroxidu lithného, ve vhodném rozpouštědle, např. kapalném THF volitelně obsahujícím methanol na podporu rozpustnosti. Kdyby byl P2 benzyl nebo substituovaná benzylová skupina, tato by mohla být odstraněna hydrogenací katalyzovanou použitím vzácných kovů, např. paladia na uhlíku.

• ·♦· • · · • ·

Reakční schéma 3 • · · · · · ·*· ··· fcfc ·· ···· ·· ··

Alternativně, jak znázorňuje Schéma reakce 4, sloučenina vzorce 8, kde X je bromid nebo jodid, může být změněna na sloučeninu vzorce 12, v které M' reprezentuje substituovaný atom cínu nebo bor. Tato reakče může být ovlivněna přidáním vhodného činidla např. hexamethyldicínu, hexabutyldicínu nebo tetraalkoxydiboťu v přítomnosti zdroje paládia nula. Při tvorbě derivátu zinku, 12, M'=Zn (halogen) může být tato reakce ovlivněna

zpracováním sloučeniny vzorce 8, X=I se zdrojem aktivovaného zinku ve vhodném inertním rozpouštědle, např. dimethylacetamidu při teplotě v rozmezí od teploty místnosti po 1O0°C, pokud výsledkem nebude sloučenina se vzorcem 12, M'=Zn(halogen).

Reakční schéma 4

9’

Tyto sloučeniny vzorce 12 mohou reagovat s 4-substituovaným fenylalaninovým derivátem vzorce 4', ve kterém X' je jodo, bromo, nebo trifluoromethylsulfonyloxy- v přítomnosti zdroje paladia nula za vzniku sloučeniny vzorce 10'. V případě, že esterová skupina reprezentována P₂ není součástí žádané sloučeniny, tato může být odstraněna použitím postupů hydrolýzy esterů přiměřených pro konkrétní P₂. Např. když P₂ je nižší alkyl,

např. methyl, je možné jej odstranit standardní bazickou hydrolýzou, použitím hydroxidu alkalických kovů např. hydroxidu lithného. Jako variaci na tento postup může být žádoucí nést chránící skupinu během slučovací reakce a substituovat ji později. V tomto případě sloučenina vzorce 2', kde Pl'je nižší alkoxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl a X'je jako výše definovaný, může být slučování s pyridonem o struktuře 12 za poskytnutí sloučeniny o struktuře 9', která může být obratem přeměněna na sloučeninu dle vynálezu použitím obecných postupů výše zmíněných v reakčním schématu 3.

Alternativní cestou k tvorbě sloučenin tohoto vynálezu, jak je ukázáno v Schématu reakce 5, která je obzvláště použitelná pro sloučeniny, v nichž R7' je jiný zbytek než vodík, je vytvořit aldehyd vzorce 14. Toto může být dosaženo reakcí sloučeniny vzorce 12 se sloučeninou vzorce 13, kde R7' představuje nižší alkyl nebo nižší alkoxy, X' představuje jodid, bromid trifluoromethylsulfonyloxy části a R8 představuje chránící alkohol nebo aldehyd. Co se týče alkoholů, vhodné chránící skupiny zahrnují silylethery, benzylethery. Pokud je nutné, aldehydy mohou být chráněny jako jejich acetalové deriváty. Sloučenina vzorce 12 může být přeměněna na aldehyd vzorce 15 krokem, který, pokud je R8 alkohol, může zahrnovat odstranění chránící skupiny, pokud je nutné, a následně oxidaci. Kterékoliv z běžných činidel pro selektivní oxidaci primárních benzylalkoholů na aldehydy může být použito, např. zpracování s aktivovaným oxidem hořečnatým v inertním rozpouštědle. V tomto případě, kde R8 představuje chránící aldehyd, přeměna na aldehyd vzorce 15 může být uskutečněna vhodným odstraněním chránící skupiny, např. hydrolýzou acetalu se zředěnou kyselinou, Reakce 15 poskytující dehydroaminokyselinu vzorce 16 může být provedena zpracováním s Wittigovým činidlem, vzorce 17, kde Pi'je nižší alkoxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl a P2 je jak bylo výše definováno. Například zpracování 15 s (±)-N-(benzyloxykarbonyl)a -fosfonoglycin trimethylesterem za přítomnosti vhodné zásady, např. tetramethylguanidinu, vede přímo k dehydroaminokyselině vzorce 16, P2=methyl, Pi = benzyloxykarbonyl. Enantioselektivní redukce sloučeniny 16 na L-aminokyselinu 18 může být provedena použitím množství redukčních činidel k tomuto účelu

·· ·* ·* ···· • 9 · « 9 9 vhodných, např. nedávno popsané ethyl-DuPHOS rhodium reagens (Burk, M. J., Feaster, J. E.; Nugent, W.A.; Harlow, R.L.J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10125) při použití převážně postupů z literatury. Další konverze sloučeniny 18 na sloučeninu dle vynálezu může být uskutečněna při použití obecných postupů diskutovaných výše. Alternativně, obecné metody načrtnuty v reakčním schématu 5 mohou být použity k přípravě sloučenin o struktuře 4 nebo 4', kde R₇- je jiný zbytek než vodík. Tyto sloučeniny o struktuře 4 nebo 4’ mohou být použity k přípravě sloučenin, jak již byly načrtnuty v reakčních schématech 1 až 4.

Reakční schéma 5

V jednom provedení, N-acylová skupina s Rl'o struktuře 11 je odvozena z kyseliny benzoové substituované poloze 2. Vhodné 2-substituované kyseliny benzoové jsou buď komerčně dostupné, nebo mohou být připraveny běžným

• 44	44	44	44	4 44 4
·♦ · ·	4 4	4 4	4	•	4
• 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4«	4 4 • 4 4 4	• 4 4 4 44	4 4 4 4 4	• 4	4 4 4 4

způsobem. Například ortho-substituované aryljodidy nebo trifluormethansulfonáty (triflaty) mohou být karbonylovány za přítomnosti oxidu uhelnatého a vhodného palladiového katalyzátoru. Příprava takového jodidových nebo trifluormethansulfonátových meziproduktů závisí na konkrétním požadovaném substitušním vzorci a mohou být získány přímou jodací nebo diazotací anilinu s následným zpracováním se zdrojem jodidu, např. s jodidem draselným. Trifluormethansulfonáty mohou být odvozeny z příslušných fenolů běžnými způsoby jako např. zpracováním s trifluoromethansulfonovým anhydridem v přítomnosti zásady jako je triethylamin nebo diisopropylethylamin v inertním rozpouštědle. Jak je znázorněno v Schématu reakce 6, další způsob získání ortho-substituovaných benzoových kyselin zahrnuje zpracování 2methoxyfenyloxazolinových derivátů jako je sloučenina 19, Zi a Z2 = vodík, alkyl, chlór, perfluoro nižší alkyl, nižší alkoxy s alkyl Grignardovým činidlem následováno hydrolýzou oxazolinového kruhu sledující obecný postup popsaný Meyerem, A. I., Gabelem, R., Mhelickem, E.D, J. Org. Chem. 1978, 43, 1372-1379, za poskytnutí kyseliny vzorce 20. 2- nebo 2,6-disubstituované benzonitrily také slouží jako běžné prekursory příslušných benzoových kyselin. V případě velice bráněných nitrilů, např. 2-chloro-6methylbenzonitrilu, je běžná hydrolýza v kyselých či zásaditých podmínkách obtížná a lepších výsledků je dosaženo DIBAL redukcí na patřičné benzaldehydy a následnou oxidací při použití oxidačního činidla na bázi chrómu. Další metody jsou uvedeny v Chen, a kol., WO 9910312.

Reakční schéma 6

1. RMgCI

2. CH31

Co se týče schématu reakce 7, cyklické kyseliny vzorce 23 jsou známé

• ··		fcfc	fcfc		• fc	• •fcfc
·· « ·	>	«	• 9	«1	•	•
• fc fcfc	fc	fc	•	• ·
fcfcfc ·«· fcfc	fc	• • fc	• • fcfcfc	•	fc fc ·	• · * r

sloučeniny, nebo mohou být připraveny použitím standardních metodologií. Pro přípravu nasycených alkyl- nebo cykloalkylkarbonylových kyselin může být alkalická reakce dosažena použitím dianionu alkalického kovu kyseliny nebo monoanionu příslušného esteru. Například cykloalkylester kyseliny karboxylové vzorce 21 může být zpracován se silnou zásadou, například lithium diisopropylamidem v inertním rozpouštědle, např. THF, následován přidáním skupiny R41-LV, kde R41 představuje žádaný postranní řetězec, jako např. substituovaný benzyl, nižší alkyl, nižší alkoxyalkyl, nižší azídoalkyl a podobně, Lv představuje zbylou skupinu, např. bromid, jodid, methylsulfonát nebo podobnou skupinu známou z účasti v esterenolátových alkylačních reakcích. Produkt - ester 22 může být hydrolyzován na kyselinu 23 použitím hydroxidu alkalického kovu ve vhodném rozpouštědle, např. ve vodném alkoholu. V závislosti na povaze R41 a cílového produktu může být sloučenina 23 připojena k aminu jako např. sloučenina 1 a tak přímo přeměněna na cílovou sloučeninu, nebo R41 může být podrobeno další spolupráci na vhodných místech syntézy. Například, pokud je R41 azido-nižší alkyl-část, azid může být redukován použitím např. trialkylfosforečného činidla a výsledný amin poté funkcionalizován alkylací, acetylací, sulfonací a podobnými postupy dobře známými odborníkům v dané oblasti. Pokud R41 zahrnuje odstupující skupinu, např. terminální atom bromu, tato skupina může být nahrazena vhodným nukleofilem, například methylmerkaptanem sodným, aby vznikl v tomto případě thioether, který může být žádaným produktem, nebo může být dále zpracován, např. oxidací na sulfoxid či sulfon za standardních reakčních podmínek. Další nukleofily, které mohou být použity pro dosažení meziproduktů vedoucích ke sloučeninám dle tohoto vynálezu, jsou: kyanid sodný, methoxid sodný, azid sodný, morfolin a další. Jestliže R41 zahrnuje ketalovou skupinu, tato může být hydrolyzována ve vhodném okamžiku syntézy k poskytnutí ketoskupiny. Tato slupina může být dále zpracována, např. redukcí na alkohol nebo konverzí na derivát typu oximu.

Příklady aplikace těchto metod syntézy sloučenin vzorce 23 možno nalézt v Chen,&kol., WO9910313.

·4· ··

Reakční schéma 7:

Obecně, ortho-substituované aromatické kyseliny potřebné k přípravě sloučenin, kde Ri = Y-l, mohou být připraveny jako uvedené příklady v Chen, WO9910312.

Pro syntézu 2-chloro-6-alkylbenzoových kyselin vzorce 28, kde R43 je nižší alkyl nebo cykloalkyl, je postup popsaný v reakčním schématu 8 obzvláště vhodný. Takto je komerčně vhodný aldehyd vzorce 24 přeměněn na imin 25 (kde R42 je nižší alkyl, přednostně butyl) zpracováním s butylaminem v inertním, hydrofobním organickém rozpouštědle, jako kupř. v heptanu. Výsledná sloučenina vzorce 25 je zpracována s Grignardovým činidlem v inertním rozpouštědle, např. THF, následně během postupu přípravy zpracována kyselinou, aby vznikl aldehyd vzorce 27. Oxidace 27 na kyselinu vzorce 28 může být vyřešena běžným způsobem, např. zpracováním roztoku látky 27 ve vhodném rozpouštědle jako např. vodný acetonitril s chloritanem sodným a 30% peroxidem vodíku při teplotě místnosti nebo nižší.

Reakční schéma 8

Může být žádoucí vytvořit jako proléčiva estery sloučenin podle tohoto vynálezu, pro které by bylo výhodnější zavést esterovou část ke konci syntézy. Pro tento účel může být použito mnoho běžných technik výroby esterů z karboxylových kyselin. Typické metody, které mohou být použity, • · · • · · ·· · · ·· ···« • · · · · 4 • · · · · • · · · · ι • · · · · · I ·· ···· ·· ·· zahrnují kuplování alkoholu s karboxylovou kyselinou v přítomnosti kyseliny, např. chlorovodíkové, postupem běžně známým jako Fischerova esterifikace. Nebo může být využito diimidem zprostředkované kuplování karboxylové kyseliny a alkoholu s případným použitím promotoru, jako např. 4,4dimethylaminopyridinu. Typickým diimidem je dicyklohexylkarbodiímid. Další variantou je nechat reagovat karboxylovou kyselinu s reaktivním alkylhalidem, např. s alkyljodidem nebo acyloxymethylchloridem v přítomnosti zásady, např. hydrogenuhličitanu sodného a inertního rozpouštědla, např. DMF. Konkrétní volba metody bude určována povahou konkrétní kombinace karboxylové kyseliny a žádané esterové části a bude odborníkovi v dané oblasti zřejmá. Esterové skupiny, které mohou tvořit proléčiva, mohou být zavedeny v kterémkoliv okamžiku syntézy. Například skupina P₂ ve vzorci 1 může reprezentovat žádaný ester proléčiva a může být uchována v konečném produktu.

Příklady provedení vynálezu

Příklady které následují jsou pro účely znázornění a neměly by v žádném případě nijak omezovat vynález.

Obecné postupy;

Teploty tání byly zjišťovány na Thomas-Hooverově zařízení a jsou nekorigované. Optické rotace byly stanoveny pomocí Perkin-Elmerova polarimetru modelu 241. 1H-NMR spektra byla zaznamenána pomocí Varian XL-200, Mercury 300 a Unithyplus 400 MHz spektrometrů používající tetramethylsilan (TMS) jako vnitřní standard. Dopad elektronů (El, 70 eV) a hmotnostní spektrum bombardováním rychlými atomy (FAB) bylo zjišťováno na VG Autospec nebo VG 70E-HF hmotnostních spektrometrech. Silikagel použitý pro chromatografii na koloně byl Mallinkrodt SiliCar 230400 mesh silikagel pro mžikovou chromatografii; kolony pracovaly pod tlakem 0-5 psi dusíku v hlavě kolony, aby byl umožněn průtok. Chromatogramy na tenké vrstvě byly získány na tenkých skleněných deskách potažených silikagelem, dodávaných fou E.Merck (E.Merck & num; 1. 05719) a byly vizualizovány prohlížením pod UV lampou 254 nm v prohlížecím boxu,

...........

vystavením páře, nebo postřikem buď fosfomolybdenovou kyselinou (PMA) ve vodném ethanolu, nebo po exponování Cl2, s 4,4-tetramethyldiaminofenylmethanovým činidlem připraveným podle Arx, M. Faupel a M Brugger,

J. Chromatography, 1976, 120, 224-228.

Vysokotlaká kapalinová chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC) se prováděla použitím Rainin HPLC používající 41,4 x 300 mm, 8um, Dynamix - C-18 kolonu o průtoku 49 ml/min, využívající gradientu acetonitril:voda (obsahující 0,75% TFA) typicky od 5 do 95% acetonitrilu po 35-40 min. Podmínky HPLC jsou typicky popsány ve formátu (5-95-35-214); toto se týká lineárního gradientu od 5 % do 95 % acetonitrilu ve vodě po 35 min za stálého sledování odtoku pomocí UV detektoru při vlnové délce 214 nm.

Methylenchlorid (dičhloromethan), 2-propanol, DMF, THF, toluen, hexan, ether a methanol měly kvalitu Fischerova činidla a byly použity bez další purifikace kromě již zmíněných, acetonitril byl Fischerova či Bakerova hplc stupně a byl použit jako takový.

Definice zde použité:

THF je tetrahydrofuran,

DMF je N, N-dimethylformamid,

DMA je N, N-dimethylacetamid,

HOBT je 1-hydroxybenzotriazol,

BOP je [(benzotriazol-l-yl)oxy3tris-(dimethylamino)fosfonium hexafluorofosfát,

HATU je O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfát,

HBTU je O-benzotriazol-N,N,N',N',-tetramethyluronium hexafluorofosfát, DIPEA je diisopropylethylamin,

DMAP je 4- (N,N-dimethylamino)pyridin,

DPPP je l,3-bis(difenylfosfino)propan,

DBU je l,8-diazabicyklo[5.4.0]undeka-7-en,

NaH je hydrid sodný,

• ·

Solanka je nasycený roztok chloridu sodného ve vodě,

TLC je chromatografie na tenké vrstvě,

LDA je lithiumdiisopropylamid,

BOP-C1 je bis 2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfinchlorid,

NMP je N-methylpyrrolidinin,

Lawessonovo činidlo je [2,4-bis(4-methoxyfenyl)-l,3-dithio-2,4-difosfetan2,4-disulfid],

NIS je N-jodosukcinimid.

Chromatografie na silikagelu na kolonách Biotage se vztahuje na použití systému mžikové chromatografie dodávaného Biotage oddělením Dyax Corporation používající balení 40g (40 kolon), 90g (40m kolony) či 800g (75m kolony). Promývání se provádí směsmi hexan-ethylacetát pod tlakem dusíku 10-15 psi.

Příklad 1:

N-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-4-[(tributyl)stannyl]-L-fenylalanin— methylester

Roztok N-[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl}-4-[(tributyl)stannyl]-L-fenylalanin-methylesteru (5.3 g, 13mol) a hexabutyldicínu (27,5ml, 54 mmol) v toluenu (50 ml) byl odkysličen střídavým zmrazováním směsi v lázni tekutého dusíku ve vakuu a rozpouštěním pod argonem (3 x). Byl přidán tetrakis(trifenylfosfin)palladium (280 mg, 0,22 mol) a reakční směs byla zahřívána až do refluxu po dobu 45 min, dokud se barva nezměnila ze žluté na černou. TLC (1:6 ethylacetát : hexan) zaznamenala přítomnost výchozího jódu a bylo přidáno další množství (140 mg, 0,11 mmol) katalyzátoru. Reflux pokračoval

po dobu 1 hodiny. Směs byla ponechána ochladit a byla zkoncentrována. Zbytek byl dán do hexanu (200 ml) a triethylaminu (30 ml), míchán po dobu 30 minut a poté zfiltrován. Filtrát byl zkoncentrován a poté byl podroben chromatografií na koloně se suchým silikagelem obsahujícím 150 g silikagelu a promýváním hexanem a následně 1 ; 6 ethylacetátem : hexanem za vzniku N-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-4[(tributyl)stannyl]-L-fenylalanin-methylesteru (5,7 g, 77 %) ve formě čistého oleje.

LR (+) LSIMS (C27H47NO4Sn) : m/z 1081 (2M-C4H9) 570 (M+H).

Příklad 2

2-Amino-3-bromo-5-chloropyridin

Cl

Ck Br_a> NaOAc, HOAc 'N' 'NH,

Suspenze 2-amino-5-chloropyridinu (5.14g, 40mmol) a acetoanhydridu sodného (3.29g, 40mmol) v kyselině octové (25ml) byla mechanicky míchána a poté ohřátá na teplotu lázně 45 °C. Roztok bromu (2,1 ml, 40 mmol) v kyselině octové (2 ml) byl přidán za hodinu. Vzniklá oranžová směs byla ochlazena na 15 °C a filtrována. Pevné části byly dány do 400 ml vody, suspenze se stala zásaditou po přidání 1 N NaOH a byla extrahována ethylacetátem (5 x 100 ml). Sloučené extrakty byly promyty 10% NaHSO3 (1 x 100 ml) a sušeny nad MgSO₄ . Koncentrace poskytla 2-amino-3bromo-5chloropyridin (4 g, 48%), t.t. 82-84 C.

Příklad 3

3-Bromo-5-chloro-lH-2-pyridon

Roztok 2-amino-3-bromo-5-chloropyridinu (4.0 g, 19.3 mmol) ve vodě (30ml) a konc. kyselině chlorovodíkové (5.2 ml) byl zchlazen pomocí ledové lázně na 0 oC a poté zpracován s roztokem dusitanu sodného (1.33 g, 19. 3mmol) ve vodě (12ml) po dobu 10 minut. Směs byla míchána 10 min a ponechána ohřát 48 hodin při teplotě místnosti. Poté byla směs filtrována. Pevné části byly promyty vodou, dále CC1₄ a sušeny ve vakuu při teplotě 50 °C po tři hodiny, aby vznikl 3bromo-5-chloro-lH-2-pyridon (2.77 g, 69%), t.t. 173,5-175 °C.

Příklad 4:

3-Bromo-5-chloro-1 -methyl-2-pyridon

I

H

Směs 3-bromo-5-chloro-lH-2-pyridonu (930 mg, 4.46 mmol), uhličitanu draselného (1.25 g, 9.1 mmol) a jodomethanu (2.8 mL, 45 mmol) v 10 mL DME byla zahřána k refluxu po dobu 18 hod. Směs byla filtrována za horka a koncentrována. Zbytek byl rekrystalizován z ethylacetátu za získání 3-bromo- 5-chloro-l-methyl-2-pyridonu (740 mg, 74%), t.t. 162-163 °C. HRMS (C6H5BrClNO) : hmotn. 220, 9249. Vypočt.hmotn 220.9243 (M+H).

Příklad 5:

4-(5-Chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[( 1,1-dimethy lethoxy )karbonyljL-fenylalanin-methylester

Roztok 3-bromo-5-chloro-l-methyl-2-pyridonu (660 mg, 2. 97 mmol) a N-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-4-[(tributyl)stannyl]-L-fenylalanin-methyl• 000 • ·« ·· ·» ·» ·*·· 0 0 0 0 « • * 0 · « 0 «»••00 ·00

0« 0 0 0 « ·’· ·· esteru (1.7 g, 2.99 mmol) v DMF (30 mL) byl deoxygenován střídavým vymrazováním směsi v lázni tekutého dusíku ve vakuu a jejím tavením pod argonem (3 X). Bylo přidáno tetrakis(trifenylfosfin)palladium (140mg, 0.20 mmol) a směs zahřívána na 90 °C po dobu 3 hodin, dokud neztmavla. TLC indikovala, že reakce není ukončena a bylo přidáno další množství 140 mg katalyzátoru a zahřívání pokračovalo ještě 4 hod. Směs byla zchlazena, zředěna dichloromethanem a filtrována přes podložku z celitu. Filtrát byl odpařen do sucha a zbytek byl rozpuštěn v 1 : 1 ether : ethylacetátu (60 ml). Roztok byl promyt vodou (3 x 10ml)a solankou (1x10 ml) a sušen (MgSO4). Zbytek získaný koncentrací byl chromatografován přes 150g silikagel promýváním s ethylacetátem : hexanem v poměru 7 : 3 za vzniku 4-(5-chloro1 -methyl-2-oxo-3 -pyridinyl)-N-[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl] -L-fenylalanin-methylesteru (670 mg, 54%). LRMS-Elektrospray : m/z 863 (2M+Na), 858 (2M+NH4), 443 (M+Na), 438 (M+NH4), 421 (M+H).

Příklad 6:

4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylester hydrochlorid

Roztok 4-(5-chloro-1 -methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N~[( 1,1 dimethylethoxy)karbonyl]-L-fenylalanin-methylesteru (210 mg, 0. 50 mmol) v 4 N HCl v dioxanu (10 mL) byl míchán po dobu 1 hod a koncentrován za poskytnutí 4(5-ehloro-l-methyl-2-oxo~3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru (140 mg) jako bílého prášku. LR (+) LSIMS : m/z 641 (2M+H), 321 (M+H).

Příklad 7:

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin-methylester

Roztok 4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru hydrochloridu (89.5 mg, 0.25 mmol), 2-chloro-6-methylbenzoové kyseliny (47 mg, 0.28 mmol), DIEA (175 pL, 1.0 mmol) a HBTU (133 mg, 0. 35 mmol) v DMF (3 mL) byl míchán při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Směs byla koncentrována, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (15ml), promyt 0.5 N HCL (1 x 5ml), nasyc. NaHCCh (1 x 5ml), solankou (1 x 5ml) a byl sušen (MgSCU). Zbytek získaný po odpaření byl podroben chromatografií na 25 g silikagelu, promýváním ethylacetátem-hexanem v poměru 3 : 1 za získání N[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonylJ-4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)L-fenylalanin-methylesteru (54 mg). LR (+) LSIMS : m/z 962 (2M+NH4), 945 (2M+H), 490 (M+NH4), 473 (M+H (2 Cl)).

Příklad 8:

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin.

Roztok N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (51 mg, 0. 108 mmol) v THF (3ml) zreagoval s roztokem monohydrátu hydroxidu lithného (18mg, 0. 43 mmol) ve • · · « · · • * » «35 • · ** vodě (1.0 ml). Další THF byl přidán za účelem vytvoření čirého roztoku a reakční směs byla míchána 1 hodinu. TLC (ethylacetát) indikoval, že výchozí látky byly spotřebovány. Bylo přidáno několik kapek kyseliny octové a celá reakční směs byla vložena na 4 x 30 cm, C-18 HPLC kolonu s reverzní fází a byla promývána s lineárním gradientem acetonitrilu ve vodě o hodnotě 595% po dobu 35 min. Frakce obsahující produkt byla lyofilizována za poskytnutí N- [(2-chloro-6-methylfenyl)-karbonyl]-4-(5 -chloro-1 -methy 1-2oxo-3-pyridiňyl)-L-fenylalaninu (40 mg, 82%) jako bílé pevné látky. LRElektrospray : m/z kladný iont, 481 (M+Na), 459 (M+H (2 Cl)) ; záporný iont, 457 (M-H (2 Cl)).

Příklad 9:

4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin methýlester

Roztok 4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru hydrochloridu (47.4 mg, 0.25 mmol), l-(2-methoxyethyl)cyklopentankarboxylové kyseliny (47 mg, 0,28 mmol), DIEA (175 pL, 1,0 mmol) a HBTU (133 mg, 0.35 mmol) v DMF (3 mL) byl míchán při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Směs byla koncentrována, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (15ml), promyt s 0.5 N HCL (1 x 5ml), nasyc. NaHCO3 (1 x 5ml), solankou (1 x 5ml) a byl sušen (MgSO4). Zbylá část vzniklá po odpaření byla podrobena chromatografií na 25 g silikagelu, promýváním s ethyl-acetátem za poskytnutí 4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2- methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin methylesteru (70.5 mg, 59%). LRElektrospray : m/z kladný iont, 943 (2M+Na), 483 (M+Na), 478, (M+NH4), 461 (M+H); záporný iont 919 (2M-H), 521, 459 (M-H).

·· » « · ···» • * « *

Příklad 10:

4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l -(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin

Roztok 4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoXyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanine methylesteru (69 mg, 0.145 mmol) v THF (3 ml) byl zpracován s roztokem monohydrátu hydroxidu lithného (24.3 mg, 0.58 mmol) ve vodě (1.0 ml). Pro umožnění rozpouštění bylo přidáno do směsi dostatečné množství THF. Směs byla míchána 1 hodinu a bylo přidáno několik kapek kyseliny octové. Celá reakčni směs byla nanesena na 4 x 30 cm, C-18 HPLV kolonu HPLC s reverzní fází a promývána s lineárním gradientem acetonitrilu ve vodě 5-95%, po dobu 35 min. Frakce obsahující produkt byla lyofilizována za poskytnutí 4-(5-chloro-l-methyl-2oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalaninu (48 mg, 72%) jako bílé pevné látky. LR-Elektrospray : m/z kladný iont 943 (2M+Na), 483 (M+Na), 478 (M+NH4), 461 (M+H) ; záporný iont 919 (2M-H), 521,459 (M-H).

Příklad 11:

l-Benzyl-3-bromo-5-chloro-2-pyridon

Cl

O

Br

Směs 3-bromo-5-chloro-lH-2-pyridonu (950 mg, 4. 56 mmol), čerstvě • · » 4 0 0 0 • · «» připraveného uhličitanu draselného (1.26 g, 9.1 mmol) a tetrabutylammoniumchloridu (100 mg) byla mechanicky míchána bez rozpouštědla 30 min. a poté byl přidán benzylbromid (0.56 ml, 4.7 mmol). Směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 72 hod. Pak byla směs zředěna ethylacetátem a filtrována, přičemž byly pevné části promývány ethylacetátem. Filtrát byl odpařen do sucha a zbytek byl rozetřen s několika podíly hexanu. Zbytek byl podroben chromatografii přes 90 g silikagelu promýváním s hexanem-ethylacetátem v poměru 3:1, následován 100% ethylacetátem za poskytnutí l-benzyl-3-bromo-5-chloro-2-pyridonu (423 mg, 31%), t.t. 108-110 °C. LR (+) LSIMS : m/z 595 (2M+H, 2 Cl, 2 Br), 298 (M+H, 1 Cl, 1 Br).

Příklad 12:

4- (l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N- [ (1, 1-dimethylethoxy)karbonyl]-L- phenylalanin methyl ester

Roztok l-benzyl-3-bromo-5-chloro-2-pyridonu (296 mg, 0. 98 mmol) a N— [(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-4-[(tributyl)stannyl]-L-fenylalanin-methylesteru (560 mg, 0.99 mmol) v DMF (15 mL byl odkysličen střídavým zmrazováním v lázni tekutého dusíku ve vakuu a tavením pod argonem (3 x). Byl přidán bis(trifenylfosfin)palladium-dichlorid (80mg, 0,11 mmol) a směs byla zahřívána na 90 °C po dobu 4 hod, dokud směs neztmavla. Bylo přidáno 60 mg katalyzátoru a zahřívání pokračovalo 2 hod. Směs byla ponechána ochladit, byla zředěna dichlormethanem a filtrována přes podložku z celitu. Filtrát byl odpařen do sucha a zbytek byl podroben chromatografii přes 150 g silikagelu promýváním ethylacetátem-hexanem v poměru 1 : 2 za poskytnutí

99 9 * * * 9 9 9 9 9 9 9 *·* ·* ** ♦*·· 99 «·

4-(l-benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]L-fenylalanin methylesteru (255 mg, 52%). LMS-Elektrospray : m/z 1015 (2M+Na) (4 Cl) 519 (M+Na) 514 (M+NH4) 497 (M+H).

Příklad 13:

4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylester hydrochlorid

Roztok l-benzyl-4-(5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl]-L-fenyl alanin methylesteru (248 mg, 0. 50 mmol) v 4 N HCl v dioxanu (10 mL) byl míchán po dobu 1 hodiny a koncentrován. Zbytek byl rozetřen s etherem (15 ml) a byl filtrován za poskytnutí 4-(l-benzyl-5-chloro2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (202 mg, 94%) jako bílého prášku. LR Elektrospray: m/z 1015 (2M+Na, 4 Cl), 519 (M+Na) 514 (M+NH4), 497 (M+H). HRMS: Hmotn. 496,1774,.Vypočt.hmotn.469,1765 (M+H).

Příklad 14:

4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3 -pyridinyl)-N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-L-fenylalanin methylester • ···

Roztok 4-(l-benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru hydrochloridu (100 mg, 0.23 mmol), 2-chloro-6-methylbenzoové kyseliny (47 mg, 0.28 mmol), DIEA (200 pL, 1.2 mmol) a HBTU (133 mg, 0.35 mmol) v DMF (2 mL) byl míchán při teplotě místnosti 18 hodin. Směs byla koncentrována, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (15ml), promyt 0.5 N HCL (1x5 ml), nasyc. NaHCCb (1x5 ml), solankou (1x5 ml) a poté byl sušen (MgSCh). Zbytek získaný při odpaření byl podroben chromatografií na 25g silikagelu s promýváním ethylacetátem-hexanem v poměru 45 : 55 za poskytnutí 4-(l-benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-L-fenylalanin methylesteru (74 mg, 58%). Hmotn. 397,1313; vypoět. hmotn. 397,1320 (M+H)

Příklad 15:

4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-L-fenylalanín

·· ·· ♦ 0 0 ·

Roztok N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(1-benzyl-5-chloro-2-oxopyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (72 mg, 0. 13 mmol) v THF (3 mL) byl zpracován s roztokem monohydrátu hydroxidu lithného (22g, 0.52 mmol) ve vodě (1.0 ml). Další THF byl přidán, aby se docílilo čirého roztoku a reakční směs byla míchána jeden a půl hodiny, kdy TLC (ethylacetát) indikovala spotřebování výchozí látky reakce. Bylo přidáno několik kapek kys. octové a celá reakční směs byla podrobena chromatografií na 4 x 30 cm, C-18 HPLC koloně s reverzní fází a promývána s lineárním gradientem acetonitrilu ve vodě 5-95% po 35 min. Frakce obsahující produkt byla lyofilizována za získání 4-(l-benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-L-fenylalaninu (50 mg, 71%) jako bílého prášku. LR-Elektrospray : m/z záporný iont 533 (M-H (2 Cl)) ; kladný iont 557 (M+Na), 552 (M+NH4), 535 (M+H (2 Cl)). HRMS : Hmot.535,1190. Vypočt.hmot. 535,1191.

Příklad 16:

4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin methylester.

Roztok 4-(l-benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru hydrochloridu (100 mg, 0.25 mmol), l-(2-ethoxyethyl)cyklopentankarboxylové kyseliny (47 mg, 0.28 mmol), DIEA (200 gL, 1,2 mmol) a HBTU (133 mg, 0.35 mmol) v DMF (2 mL) byl míchán při teplotě místnosti 18 h. Směs byla koncentrována, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (15ml), promyt 0.5 N HCL (1x5 ml), nasyc. NaCCh (1x5 ml), solance (1x5 ml) a poté vysušen (MgSO4). Zbytek po odpaření byl podroben chromatografií ha 25 g ·· • · • · · ·

* ·« ·· »· 9 1 11

111 11

II 19 1 1

III 11

919 11 91 silikagelu, promýváním s ethylacetátem-hexanem v poměru 6 ; 4 za získání 4(l-benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalaninu methylesteru (80 mg, 63%). LR-Elektrospray : m/z 1123 (2M+Na), 1118 (2M+NH4), 573 (M+Na), 568 (M+NH4), 551 (M+H (1 Cl)). HRMS: Hmot. 551,2297. vypočt. hmot. 551,2313 (M+H).

Příklad 17:

4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin

Roztok 4-(l-benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin-methylesteru (78 mg, 0.142 mmol) v THF (3 mL) byl zpracován s roztokem monohydrátu hydroxidu lithného (24mg, 0.57 mmol) ve vodě (1.0 ml). Bylo přidáno dostatečné množství THF pro vytvoření roztoku. Směs byla míchána 1 hodinu a poté bylo přidáno několik kapek kyseliny octové. Celá reakční směs byla aplikována na 4 x 30 cm, C-18 kolonu s reverzní fází HPLC a promývána s gradientem acetonitrilu ve vodě 5-95% po 35 minut. Frakce obsahující produkt byla lyofilizována za získání 4-(5-chloro-l-benzyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonylj-L-fenylalaninu (45 mg, 60%) jako bílého prášku. LRMS-Elektrospray : m/z kladný iont 559 (M+Na), 554 (M+NH4), 537 (M+H (1 Cl)); záporný iont 535 (ΜΗ (1 Cl)). HRMS: Hmot. 537.2151. vypočt. hmot. 537,2156 (M+H).

Příklad 18:

fc fcfc ·· ·· fcfc fcfcfc· • •fcfc · · fc · fc* fc

fcfc fcfcfc fcfcfcfc ·· fcfc fcfc ·· fcfc «·

3-Bromo-lH-2-pyridon

Br

O

K roztoku ΙΗ-2-pyridonu (1.9g, 20 mmol)v 1M vodném bromidu draselném (20 ml) byl přidán roztok brómu (3.2 g, 20 mmol) v 1M vodném bromidu draselném (40 ml) po 5 minut. Reakce byla ponechána probíhat celou noc a výsledná sraženina byla spojena za získání 1,4 g. Rekrystalizace z acetonitrilu poskytla 0.78g 3-bromo-lH-2-pyridonu.

Příklad 19:

3-Bromo-l-methyl-2-pyridon.

Směs 3-bromo-lH-2-pyridonu (740 mg, 4.25 mmol), uhličitanu draselného (1.18 g, 8.5 mmol) a jodomethanu (2.65ml, 42.5 mmol) v DME (lOml) byla zahřívána přes noc k refluxu. Směs byla filtrována, propláchnuta ethylacetátem a filtrát byl odpařen do sucha. Zbytek byl purifikován chromatografií na koloně přes 27 g silikagelu, promýváním ethylacetátem za získání 3-bromo-l-methyl-2-pyridonu (0.63 g, 79%). LRMS (elektrospray), kladný iont, 188 (M+H).

Příklad 20:

3-bromo-l-methyl-2-pyridon a 3,5-dibromo-l-methyl-2-pyridon

• ·»· ···♦·· * 4 · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 9999 99 99

Roztok 1-methy 1-2-pyridonu (2.73 g, 25 mmol) a brómu (1.4 ml, 27 mmol) v ledové kyselině octové (150ml) byl míchán 48 hodin při teplotě místnosti. Směs byla koncentrována. Zbytek byl dán do vody (100 ml), dal zásaditou reakci na lakmusovém papírku s ION hydroxidem sodným, a byl extrahován dichloromethanem (3 x 50 ml). Spojené extrakty byly promyty solankou (30 ml) a sušeny (MgSCU) Filtrace a odpaření rozpouštědla poskytly 4,7 g látky, která byla vyčištěna suchou chromatografií na 150 g silikagelu, promýváním ethylacetátem-hexanem v poměru 1 : 6, následně ethylacetátem-hexanem v poměru 1 ; 1. První složkou eluátu byl 3,5-dibrom-l-methyl-2-pyridon (2.0 g, 30 %), LR-Elektrospray : m/z 266 (M+H (2 Br)). NMR (CDC13) 8 3.597 (s, 3H), 7,426 (d, j = 2.7, 1H), 7.791 (d, j - 2.7, 1H). Druhou složkou eluátu byl 3-brom-l-methyl-2-pyridon (1.39 g, 30%), LR-Elektrospray ; m/z kladný ion 251 (M+Na+CH3CN), 188 (M+H).

Přiklad 21:

N-[(l,l-Dimethylethoxyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-Lfenylalanin methylester

Roztok 3-bromo-l-methyl-2-pyridonu (94 mg, 0.50 mmol) a N-[(l,ldimethylethoxy)karbonyl]-4-[(tributyl)stannyl]-L-fenylalanin methylesteru (284 mg, 0.50 mmol) v DMF (3 mL) byl odkysličen střídavým zmrazováním směsi v lázni tekutého dusíku ve vakuu a tavením pod argonem (3 X). Byl přidán bis(trifenylfosfin)palladium-dichlorid (40mg, 0.057 mmol) a směs byla zahřívána na 90 °C po dobu 3 hodin, kdy směs ztmavla. TLC indikovala, že reakce není ukončena, a tak byl přidán další díl 20 mg katalyzátoru a zahřívání pokračovalo po dobu 4 hodin. Směs byla ponechána ochladit, byla zředěna dichloromethanem (20 ml) a byla filtrována přes podložku z celitu. Filtrát byl odpařen do sucha a zbytek byl rozpuštěn v ether : ethylacetátu (20

4444

4

4 4 4 4 4 4 ·*4 44 ·4 4444 44 ml) v poměru 1:1. Roztok byl promyt vodou (1 x 10 ml), 5% fluoridem draselným (2x5 ml), opět vodou (1 x 10 ml) a byl sušen (MgSO-l·). Zbytek obdržený po koncentraci byl podroben chromatografií na 25 g silikagelu promýváním ethylacetátem-hexanem v poměru 4 : 6 za získání N-[(l,ldimethylethoxyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyí)-L-fenylaIanin methylesteru (64 mg, 33%). LRMS-Elektrospray: m/z kladný iont, 795 (2M+Na) 409 (M+Na) 387 (M+H). HRMS: Hmotn.387.1935. vypočt. hmotn. 387.1920 (M+H).

Příklad 22:

4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylester hydrochlorid

Roztok N-[( 1,1 -dimethylethoxyl)karbonyl]-4-( 1 -methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-Lfenylalanin methylesteru (60 mg, 0. 155 mmol) v 4 N HCI v dioxanu (4 mL) byl míchán 2 hodiny a koncentrován. Koncentrát byl rozetřen s několika díly etheru za získání 4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru hydrochloridu (55 mg, kvant.) jako bílého prášku. LRMS-Elektrospray : m/z kladný iont 573 (2M+H) 328 (M+H+CH3CN) 319 (M+H+CH30H) 287 (M+H). HRMS : Hmot. 287.1396. vypočt. hmot. 287.1396 (M+H)

Příklad 23:

N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-( 1-methyl-2-ΟΧΟ-3-pyridinyl)-Lfenylalanin methylester.

Roztok 4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru hydrochloridu (52 mg, 0.16 mmol), 2-bromo-5-methoxybenzoové kyseliny (45 mg, 0.19 mmol), DIEA (140 pL, 0.80 mmol) a HBTU (85 mg, 0.22 mmol) v DMF (3 mL) byl míchán při teplotě místnosti 18 hodin. Směs byla koncentrována, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (15ml), promyt 0.5 N HCL (1x5 ml), nasyc. NaHCO₃ (1 x 5 ml), solankou vodou (1 x 5ml) a vysušen (MgSO₄). Zbytek obdržený po odpaření (85mg) byl podroben chromatografií na 25 g silikagelu s promýváním ethylacetátem za poskytnutí N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-Lfenylalanin methylesteru (54 mg, 68%). HRMS Hmot. 499.0872. vypočt. hmot. 499,0869 (M+H)

Příklad 24:

N-[(2-bromo-5-methoxyfenyI)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-Lfenylalanin

Roztok N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (52 mg, 0.104 mmol) v THF (3 mL) byl zpracován s roztokem monohydrátu hydroxidu litného (20mg, 0.47 mmol) ve • 4* *» ·· ·· ♦ ··· ·· 4 4 4 4 4 4 44 *

444444 444 4 ·

444 4·· 4444 • 44 44 44 4444 44 «4 vodě (1.0 ml). Methanol (0.5 ml) byl přidán k projasnění roztoku a reakční směs byla míchána 18 hodin. Byla přidána kyselina octová (0,5 ml) a celá reakční směs byla nanesena na 4 x 30 cm, kolonu C - 18 HPLC s reverzní fází a promývána elutována gradientem acetonitrilu ve vodě 5-95% po 35 minut. Frakce obsahující produkt byla lyofilizována za získání poskytla N-[(2bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalaninu (39 mg, 78%) jako bílé pevné látky. HRMS: hmot. 485,0703 vypočt.hmot. 485,0712 (M+H).

Příklad 25:

4-(5-bromo-1 -methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[( 1,1 -dimethylethoxyl)karbonyljL-fenylalanin methylester.

Roztok 3,5-dibromo-l-methyl-2-pyridonu (267 mg, 1,0 mmol) a N-[(l,ldimethylethoxy)karbonyl]-4-[(tributyl)stannylj-L-fenylalanin methylesteru (568 mg, 1,0 mmol) v DMF (7 mL) byl deoxygenován střídavým zmrazováním v lázni tekutého dusíku pod vakuem a zahříváním pod argonem (3 X). Bis(trifenylfosfin) palladium-dichlorid (80 mg, 0.11 mmol) byl přidán a směs byla zahřána na 90 °C po dobu 3 h, kdy směs ztmavla. TLC indikovala, že reakce není ukončena a bylo přidáno 40 mg katalyzátoru v jedné dávce a zahřívání pokračovalo po dobu 4 hodin. Směs byla ponechána k vychladnutí a poté zředěna dichlomethanem (40ml) a filtrována přes podložku z celitu. Filtrát byl odpařen do sucha a koncentrát byl rozpuštěn v ethylacetátu (30 ml). Roztok byl promyt vodou (1 x 10 ml), 5% fluoridem draselným (2 x 10 ml), solankou (1x5 ml) a poté sušen (MgSO₄). Zbytek získaný zahuštěním byl podroben chromatografií přes 45g silikagelu promýváním ethylacetátem*« e • ♦ »9 ····

90 00 * · * · 0 0 ♦

0 0 * · 0 0 • 90 990 0000 • 90 90 09 0900 00 00 hexanem v poměru 3 : 7 za poskytnutí 4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-N-[( 1,1- dimethylethoxyl)karbonyl]-L-fenylalanin methylesteru (140 mg, 30%). FAB MS : 465 (M+H (1 Br)).

Příklad 26:

4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylester hydrochlorid

Roztok N-[(l,l-dimethylethoxyl)karbonyl]-4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (135 mg, 0. 29 mmol) v 4 N HCl v dioxanu (5 mL) byl míchán 2 hodiny a byl koncentrován. Zbytek byl rozetřen s několika díly etheru za vzniku 4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-Lfenylalanin methylesteru hydrochloridu (120 mg, quant) ve formě bílého prášku. LRMS-Elektrospray : m/z kladný iont 729, 2M+H (2 Br), 406 (M+H+CH3CN), 397 (M+H+CH3CN (1 Br)), 365 (M+H (1 Br)). HRMS : hmotn.365,0504.vypoět.hmotn. 365,0501 (M+H).

Příklad 27:

N-[(2-bromo-5-methoxyfnyl)kabonyl]-4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin-methylester

Br

	• 4 • ·	44 • ·	• 4 « «	• 4 ··« » ·
	4 ·	« ·	4	• 4 «
• ·		4·	• 4··	• * «·

Roztok 4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru hydrochloridu (120 mg, 0,30 mmol), 2-bromo-5-methoxybenzoové kyseliny (82 mg, 0. 36 mmol), DIEA (260 pL, 1,5 mmol) a HBTU (157 mg, 0,41 mmol) v DMF (4 ml) byl míchán při teplotě místnosti 18 hodin. Směs byla zahuštěna a koncentrát rozpuštěn v ethylacetátu (15 ml), poté byl promyt 0,5 N HCL (1 x 5 ml), nasyc. NaHCC>3 (1x5 ml), solankou (1x5 ml) a pak vysušen (MgSO₄). Zbytek získaný při odpařování (180 ml) podstoupil chromatografii na 25 g silikagelu, s promýváním ethylacetátem-hexanem v poměru 3:1 za získání N-[(2-bromo-5methoxyfenyl)karbonyl]-4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (130 mg, 76%). HRMS: hmotn. 576,9959. vypoět.hmot. 576, 9973 (M+H)

Příklad 28:

N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin

Roztok N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylaIanin methylesteru (29 mg, 0,05 mmol) v THF (3 mL) byl zpracován s roztokem monohydrátu hydroxidu litného (20 mg, 0.47 mmol) ve vodě (1.0 ml). Methanol (0.5 ml) byl přidán k vyčeření roztoku a reakční směs byla míchána 18 hodin. Byla přidána kyselina octová (0,5 ml), celá reakční směs byla nanesena na 4 x 30 cm, kolonu HPLC s reverzní fází a promýváním s gradientem acetonitrilu ve vodě 5-95% po 35 minut. Frakce obsahující produkt byla lyofilizována za poskytnutí N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalaninu (22 mg, 79%) ve formě bílé pevné látky. HRMS : hmotn. 562,9814. Vypoět.hmot.

» fc· • fc ·	•	fc	fcfc «	fcfc • ·	fc	• fc •	• fcfcfc •
• ·	•	fc ·	•	•	fc ·	•	•
• ·	«	•	•	•	»	fc	fc «
fcfcfc fcfc			• fc	fcfcfc·		• ·	fcfc

562,9817 (M+H).

Příklad 29:

Příprava N-[(2-chIoro-6-methyífenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru

c₁₆h₁₉cin₂o₃ Mol.Wt.: 322.79

C^HaClNA Mol. Wt.: 438.90

K suspenzi 4-(l -methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru hydrochloridové soli (101 mg, 0. 313 mmol), 2-chloro-6-methylbenzoové kyseliny (60 mg, 0,35 mmol) a HBTU (133 mg, 0,35 mmol) v DMF (2 mL) byl přidán DIEA (122 pL, 0,88 mmol) při teplotě místnsoti. Výsledná směs byla míchána 15 hodin. Poté byla směs nalita do vody (25 ml) a organická sloučenina byla extrahována do ethylacetátu (2 x 15 ml). Spojené ethylacetátové extrakty byly promyty postupně 0,5 N HCL (25 ml), nasyceným roztokem NaHCCb (25 ml), solankou (25 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silokagelu s použitím Biotage (40s) kolony za vzniku 122 mg (88% výtěžek) N-[(2-chloro-6methylfenyl)karbonyl] -4-( 1 -methyl-2 -oxo-3 -pyridinyl)-L-fenylalaninumethylesteru jako amorfní bílé látky. FAB-HRMS m/e vypoět pro C24H23C1N204 (M+H) 439,1425, nalez. 439,1414.

Příklad 30:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalaninu

• ··	··	··	··	9999
·· · ·	• ·	• ·	9	9	9
• i · ·	• ·	•	9 9	9	9
• · ·	• ·	•	9	9	9 9
··· ··	··	····		99	99

K suspenzi N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo- -3-pyridinyI)-L-fenylalanin methylesteru (118 mg, 0,269 mmol) v ethanolu (6 mL) byl přidán vodný roztok hydroxidu sodného (4 ml) při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl zahřát na 50 °C a míchán po dobu 2 hodin. Poté byl pod vakuem odstraněn alkohol a zbytek byl zředěn vodou (25 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (25 ml) za účelem odstranění neutrálních nečistot. Vodná vrstva byla okyselena 1,0N HCL a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty solankou (50 ml) a pak vysušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly 81 mg (71% výtěžek) N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L- fenylalaninu jako bílé pevné látky : mp 204-210 °C. FAB-HRMS m/e vypočt. pro C23H21C1N204 (M+H) 425,1268, nalez. 425,1267.

Příklad 31:

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)L-fenylalaninu

a) Příprava l,4-dimethyl-2 (IH)-pyridonu

C₆H₇NO Mol. Wt.: 109.13

C₇H₉NO

Mol. Wt.: 123.15 • ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · ··· ·· · ·· ······ ···· · • · · · · · ···· 51 ...............

K suspenzi 4-methyl-2(lH)-pyridonu (5 g, 45,82 mmol) a uhličitanu draselného (12,64 g, 91,64 mmol) v DME (100 mL) byl přidán jodomethan (50,5 g, 366 mmol) při teplotě místnosti a reakční směs byla zahřívána přes noc k refluxu. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti, nalita do vody (200 ml) a extrahována ethylacetátem (3 x 100 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (200 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrování poskytly produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu nakoloně Biotage (40m) za poskytnutí 2,5g (44% výtěžek) 1, 4-dimethyl-2 (IH)-pyridonu jako amorfní bílé pevné látky. FAB-HRMS m/ě vypočt. pro C7H9NO (M+H) 123,0241, nalezno 123,0246.

b) Příprava l,4-dimethyl-3-jodo-2-(lH)-pyridonu a l,4-dimethyl-5-jodo-2(lH)-pyridonu

CjHjNO C₇H₈INO C₇H_gINO

Mol. Wt.: 123.15 ^Mo1· Wt.: 249.05 Mol. Wt.: 249.05

Reakční směs obsahující l,4-dimethyl-2-pyridon (2. 46 g, 20 mmol), trifluoroctovou kyselinu (31 mL) a trifluoroacetanhydrid (6,25 ml) byla refluxována 5 minut. Poté byl přidán NIS (5.62 g, 25 mmol) a směs byla míchána po dobu 15 hodin. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a rozpouštědlo bylo pod vakuem odstraněno. Zbytek byl zředěn ethylacetátem (100 ml) a bílá pevná látka, kterou vytvořil, byla zachycena filtrací. Filtrát byl promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 x 100 ml), roztokem solanky (100 ml) a byl sušen nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace rozpouštědla poskytla surový produkt, který byl purifikován silikagelovou chromatografií na koloně Biotage (40m) za poskytnutí 0,92g (5% výtěžek) asi 1:1 směsí l,4-dimethyl-3-jodo-2(lH)pyridonu a l,4-dimethyl-5-jodo-2(lH)- pyridonu, který byl přímo použit v

··· ·· ·· ···· ·· ·· dalším kroku. 1H NMR (300 MHz, D6-DMSO, ppm) 8.06 (s, 1H), 7.6 (d, 1H,

J = 5.5 Hz), 6.4 (s, 1H), 6.2 (d, 1H, J = 5.5 Hz), 3.4 (s, 3H), 3.3 (s, 3H), 2.3 (s,3H), 2.15 (s, 3H).

c) Příprava N-[( 1,1 -dimethylethoxyl)karbonyl]-4-( 1,4-dimethyl-2-oxo—3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru a N-[(l,l-dimethylethoxyl)karbonyl]-4-(1,4-dimethyl-2-oxo-5-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru

Mol. Wt.: 405.23

K suspenzi zinkového prášku (0.66 g, 10 mmol) v THF (1.0 ml) byl přidán 1,2-dibromoethan (86 m, 1 mmol) při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána na 60-65 °C pomocí tepelného zdroje tak dlouho, než se přestal uvolňovat ethylenový plyn. Poté byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti, byl přidán trimethylchlorosilan (0.126 ml, 1 mmol) a směs byla míchána po dobu 15 minut. Směs l,4-dimethyl-3-jodo-2(lH)-pyridonu a 1,4dimethyl-5-jodo-2 (IH)-pyridonu (0. 92 g, 3. 69 mmol) v DMA (3 mL) byla ohřána kvůli usnadnění rozpuštění a v jedné dávce byla přidána k reakční směsi. Po tomto doplnění byla reakční směs zahřána na 70 °C a byla míchána 15 hodin, kdy TLC anylýza alikvotu, zchlazeného nasyceným roztokem chloridu amonného, ukázala spotřebování výchozích látek. Reakční směs byla zředěna pomocí THF (4 ml) a ochlazena na teplotu místnosti. Přebytečný zinkový prášek byl ponechán usadit, až se vytvořila čirá vrstva supernantu (asi po 3 h).

Výše připravený roztok obsahující sloučeninu zinku (3,69 mmol) byl přidán k roztoku Pd(dba)₂ (54 mg, 0.1 mmol), trifurylfosfinu (102 mg, 0.4 mmol) a N-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyl)-4-jodo-L-fenylalanin methylesteru (1. 01 g, 2. 5 mmol) v THF (4 mL) při teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána 15 h při teplotě 50 °C. Poté byla směs nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného a byla extrahována ethylacetátem (3 x 50 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (150 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl očištěn na silikagelové chromatografií na koloně Biotage (40m) za získání 0,350 g (35% výtěžek) N-[(l,l-dimethylethoxyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C22H28N205 (M+Na)

423.1890, nalez. 423,1894 a 0,350 g (35% výtěžek) N-[( 1,1-dimethyl ethoxyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-5-pyrídinyl)-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C22H28N205 (M+Na)

423.1890, nalez. 423,1897.

d) Příprava 4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru hydrochloridové soli

Mol. WL: 400.47

OMe

C₁₇H_2IC1N₂O₃ Mol. Wt.: 336.79

K roztoku N-[( 1,1 -dimethylethoxyl)karbonyl]-4-( 1,4-dimethyí-2-oxo—3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (132 mg, 0,33 mmol) v dioxanu (1 mL) byl přidán roztok 4 N HCI v dioxanu (1.5 mL) při teplotě místnosti. Roztok byl míchán 4 hodiny a zahuštěn pod vakuem. Koncentrát byl rozpuštěn v methanolu (5 ml) a toluenu (5 ml) a zahuštěn pod vakuem za poskytnutí 111 mg (99% výtěžek) 4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalaninmethylesterhydrochloridové soli jako amorfní bílé pevné látky. EI-HRMS m/e vypočt. pro C17H20N2O3 (M+) 300.1474, nalez. 300.1486.

e) Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3- pyridinyl)-L-fenylalanin-methylesteru

Ci₇H2iClN₂O₃ Mol. Wt.: 209.46

Mol. Wt.: 336.85

C^CljNA Mol. Wt: 473.35

K suspenzi 4-(l, 4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru hydrochloridové soli (34 mg, 0.1 mmol) a 2,6-dichlorobenzoylchloridu (25 mg, 0.12 mmol) v dichloromethanu (2 mL) byl přidán DIEA (174 1L, 1.0 mmol) při teplotě místnosti. Po pěti minutách byl získán čirý roztok, který byl míchán 72 hodin. Poté byla směs zahuštěna, koncentrát byl rozpuštěn v ethylacetátu (25 ml), promyt 0.5 N HCL (25 ml), nasyceným roztokem NaHCO3 (25 ml), roztokem solanky (15 ml) a byl vysušen přes bezvodý síranu hořečnatý. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl vyčištěn silikagelovou chromatografií při použití kolony Biotage (40s) za poskytnutí 23 mg (49% výtěžek) N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4dimethyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C24H22C12N204 (M+Na) 495.0850, nalez. 495.0859.

f) Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(1,4-dimethyl-2-oxo-3-

OH • · • · · · • ·

K suspenzi N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (20 mg, 0.04 mmol) v ethanolu (1 mL) byl přidán IN vodný roztok hydroxidu sodného (0.5 ml) při teplotě místnosti. Směs byla zahřáta na 40-45 °C a míchána po dobu 3 hodin. Poté byl pod vakuem odstraněn ethanol a zbytek byl zředěn vodou (10 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (25 ml) za účelem odstranění neutrálních nečistot. Vodná vrstva byla okyselena 1.0 N HCL a produkt byl extrahován do ethylacetátu (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a vysušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly 17 mg (89% žádaného) N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalaninu jako amorfní bílé látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C23H2oC12N204 (M+Na) 481.0691, nalez. 481.0699.

Příklad 32:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl)-4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3- pyridinyl)-L-fenylalaninu

a) Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl3-4-(l,4-dimethyl-2-oxo3— pyridinyi)-L-fenylalanin methylesteru

Mol. Wt.: 452.93

K suspenzi 4-(l,4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru hydrochloridové soli (68 mg, 0. 2 mmol), 2-chloro-6-methyIbenzoové kyseliny (45 mg, 0.25 mmol) a HBTU (95 mg, 0.25 mmol) v DMF (1.5 ml) byl přidán DIEA (174 μΐ, 1.0 mmol) při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl míchán 72 hodin, směs byla nalita do vody (25 ml) a byla extrahována

ethylacetátem (2 χ 15 ml). Spojené ethylacetátové extrakty byly postupně promyty 0.5 N HCL (25 ml), nasyceným roztokem NaHCO₃ (25 ml), roztokem solanky (25 ml) a byly sušeny přes bezvodý síran hořečnatý. Filtrace sušidla a koncentrace rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl vyčištěn silikagelovou chromatografií při použití kolony Biotage (40s) za získání 24 mg (27% výtěžek) N[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé látky. ESHRMS m/e vypočt.pro C25H25C1N204 (M+Na) 475.1395, nalez. 475.1400.

b) Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,4.dimethyl-2-oxo3pyridinyl)-L-fenylalaninu

K suspenzi N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-2oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin methylesteru (22 mg, 0. 048 mmol) v ethanolu (1 mL) byl přidán IN vodný roztok hydroxidu sodného (0.5 ml) při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl zahříván na 40-45 °C a míchán 2 hodiny.

Poté byl pod vakuem odstraněn ethanol a zbytek zředěn vodou (25 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (25 ml), aby se odstranily neutrální nečistoty. Vrstva vody byla okyselena 1.0N HCL a produkt byl extrahován ethylacetátem (2 x 25 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a sušeny přes bezvodý síran hořečnatý. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly 18 mg (86% výtěžek) N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,4dimethyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalaninu jako amorfní bílé pevné látky. ESHRMS m/e vypočt. pro C24H23C1N204 (M+H) 439.1419, nalez. 439.1425.

Příklad 33:

• ·· ·· ·· ·· ··«· « · · · ···· · · ·

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

a) Příprava 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-pyridonu

C₇H₆F₃NO C₈HgF₃NO

Mol. Wt.: 177.12 Mol. Wt.: 191.15

K suspenzi 6-methyl-4-(trifluoromethyl)-lH-2-pyridonu (2 g, 11.25 mmol) a uhličitanu draselného (4.68 g, 33.9 mmol) v DME (25 mL) byl přidán jodomethan (9.62 g, 67.8 mmol) při teplotě místnosti a reakční směs byla zahřívána k relfuxu po celou noc. Reakční směs byla poté ochlazena na teplotu místnosti, nalita do vody (100 ml) a extrahována s ethylacetátem (3 x 100 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (200 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl vyčištěn silikagelovou chromatografií na koloně Biotage (40m) za získání 2.1 g (97% výtěžek) 1,6dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-pyridonu jako bílé pevné látky: t.t. 80-82 °C. EI-HRMS m/e vypočt. pro C8H8F3NO (M+) 191.0558, nalez. 191.0559.

b) Příprava 1,6-dimethyl-3-jodo-4-(trifluoromethyl)-2-pyridonu

CgHgFjNO Mol. Wt.: 191.15

C₈H₇F₃INO Mol. Wt.: 317.05

Směs obsahující l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-pyridon (2.1 g, 10.98 mmol), kyselinu trifluorooctovou (18 mL) a trifluoroacetanhydrid (3.5 ml) byla refluxována po dobu 5 min. Poté byl přidán NIS (3.15g, 14 mmol) a

reakční směs byla míchána 15 hodin. Reakční směs byla dále ochlazena na teplotu místnosti a rozpouštědlo bylo pod vakuem odstraněno. Zbytek byl zředěn ethylacetátem (100 ml), promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 x lOOml), roztokem solanky (lOOml) a byl sušen přes bezvodý síran sodný. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl vyčištěn silikagelovou chromatografií na koloně Biotage (40m) za získání 2,15 g (62% výtěžek) l,6-dimethyL3-jodo-4-(trifluoromethyl)-2-pyridonu jako amorfní bílé pevné látky. EI-HRMS m/e vypočt.pro C8H7F3INO (M+) 316.9524, nalez. 316.9527.

c) Příprava N-[( 1,1 -dimethylethoxyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4 (trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru

K suspenzi zinkového prášku (1.96 g, 30 mmol) v THF (2.0 ml) byl přidán 1,2-dibromoethan (172 pl, 2 mmol) při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána na 60-65 °C pomocí zdroje tepla, dokud neustalo uvolňování ethylenového plynu. Potom byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti, byl přidán trimethylchlorosilan (127 ul, 1 mmol) a směs byla míchána 15 minut. Suspenze l,6-dimethyl-3-jodo-4-(trifluoromethyl)-2-pyridonu (2.15 g, 6.78 mmol) v DMA (6 mL) byla zahřáta pomocí zdroje tepla k usnadnění rozpouštění a část byla přidána do reakční směsi. Po přidání byla směs zahřata na 70 °C a byla míchána po dobu 15 h, kdy TLC analýza alikvotu, který byl zchlazen nasyceným roztokem chloridu amonného, indikoval spotřebování výchozích látek. Reakční směs byla zředěna THF (6 ml), ochlazena na teplotu místnosti a přebytek zinkového prášku byl ponechán ·· ·· • ·· • · · ·· ···· usadit. Výše připravený roztok obsahující sloučeninu zinku (6,78 mmol) byl přidán k roztoku Pd(dba)₂ (108 mg, 0,2 mmol), trifurylfosfinu (204 mg, 0.8 mmol) a N-[(l,l-dimethylethoxy)karbonyí3-4-jodo-L-fenyIalanin methylesteru (1.62 g, 4 mmol) v THF (8 mL) při teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána 15 hodin při 50 °C. Reakční směs byla nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného a byla extrahována ethylacetátem (3 x 70 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (150 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace daly surový produkt, který byl dočištěn silikagelovou chromatografií na koloně Biotage (40m) za získání 0.711 g (38% výtěžek) N-[(l,l-dimethylethoxyl)karbonyl3-4-[l,6-dimethyl-4(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C23H27F3N205 (M+Na) 491.1764, nalez. 491.1770.

d) Příprava 4-[l,6-dimethyl-4-(trífIuoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl3-L-fenylalanin-methylesteru hydrochloridové soli

^C23^H27^F3^N2O₅

MoH/Vt.: 468.47 C₁₈H₂₀CIF₃N₂O₃

Mol. Wt.: 404.81

K roztoku N-[( 1,1 -dimethylethoxyljkarbonyl]-4-[ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyI]-L-fenylalanin methylesteru (132 mg, 0.33 mmol) v dioxanu (3 mL) byl přidán roztok 4 N HCL v dioxanu (4.5 ml) při teplotě místnosti. Roztok byl míchán 4 h, než se vytvořilá bílá pevná hmota. Směs byla dále zředěna diethyletherem (50 ml) a pevná část byla spojena filtrací za promývani diethyletherem. Po susení v hlubokém vakuu bylo získáno 315 mg (92% výtěžek) 4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-Lfenylalanin-methylester hydrochloridové soli jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt.pro Ci8Hi₉F₃N₂O₃ (M+Na) 391,1241, nalez. 391.1241.

4

e) Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]~4-[l,6-dimetliyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru

C, 20 θ’ F₃N₂O₃

CgsH^CIgFaNgO, Mol. WV.541.35

Mol. Wt.: 404.81 suspenzi 4- [ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3 -pyridinyl] -Lfenylalanín-methylester-hydrochloridové soli (150 mg, 0.37 mmol) a 2,6 dichlorobenzoylchloridu (85 mg, 0.4 mmol) v dichloromethanu (6 ml) byl přidán DIEA (257 μΐ, 1.48 mmol) při teplotě místnosti. Po pěti minutách byl získán čirý roztok, jenž byl míchán 48 h. Poté byla směs koncentrována a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (50 ml). Roztok ethylacetátu byl promyt 0.5 N HCL (50 ml), nasyceným roztokem NaHCCh (50 ml), roztokem solanky (50 ml) a byl sušen nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl dočištěn silikagelovou chromatografii na koloně Biotage (40m) za získání 190 mg (95% výtěžku) N— [(2,6-dichlorofenyl)karbonyl3-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ESHRMS m/e vypoět. pro C25H21CI2F3N2O4 (M+Na) 563.0724, nalez. 563.0726. f) Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

CH,

c₂₅h₂₁ci₂f₃n₂o₄ Mol. Wt.: 541.35

O

OH gCI₂F₃N₂O₄

Mol. Wt.: 527.32 • 4 ·»4 · • 44 44 44

4444 4444 4 9 4

444 44 4 44 4

449 9 444 9 4

4 4 44 4 94 4 ¢1 ··· ............

K suspenzi N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru (177 mg, 0.326 mmol) v ethanolu (6 ml) byl přidán IN vodný roztok hydroxidu sodného (4 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána 5 h. Potom byl odstraněn ve vakuu ethanol a zbytek byl zředěn vodou (20 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (50 ml), aby se odstranily nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena 1.0 N HCL a produkt byl extrahován ethylacetátem (2 x 50 ml). Filtrace sušidla a koncentrace poskytly 159 mg (92% výtěžek) N-[(2,6— dichlorofenyl)karbonyl]-4-[ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3 pyridinyl]-L-fenylalaninu jako bílé pevné látky:t.t. 238-240 °C. ES-HRMS m/e vypoět. pro C₂4Hi₉C1₂F₃N₂O₄ (M+Na) 549.0567, nalez. 549.0570.

Příklad 34:

Příprava N-[(2-ethyl-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

a) Příprava 2-ethyl-6-methylbenzoové kyseliny

Pd(OAc)₂, dppp, CO CH3CN, H₂O, NEta 83 °C, 15 h

CgHnl

Mol. Wt.: 246.09

250 ml tlaková baňka byla naplněna 2-ethyl-6-methyljodobenzenem (30.07 mmol, 7.4 g), Pd(OAc)₂ (1.43 mmol, 334 mg) a dppp (1.43 mmol, 620 mg). Láhev byla uzavřena přepážkou a evakuována třikrát argonem. Poté byl stříkačkou postupně přidán acetonitril (96 mL), triethylamin (189 mmol, 19.0 g, 26.25 mL) a voda (19.1 ml) a gumová zátka byla nahrazena teflonovou látkou spojenou se zdrojem oxidu uhelnatého. Nyní byla baňka natlakována oxidem uhelnatým (40 psí) a přebytečný tlak byl vypuštěn. Celý postup se opakoval třikrát a nakonec byla směs míchána 5 min pod tlakem 40 psi oxidem uhelnatým. Potom byla baňka odpojena od zdroje oxidu uhelnatého a ponořena do olejové lázně (83-85 °C). Reakční směs po hodině zčernala a byla míchána dalších 14 h při stejné teplotě. Poté byla reakční směs ochlazena na teplotu místnosti a tlak byl uvolněn. Výsledná směs byla zředěna etherem (200 ml) a 1.0N NaOH (20 ml). Vzniklá kyselina byla extrahována vodou (2 x

CC

C₁₀H₁₂O₂ Mol. Wt.: 164.20 • · ··

100 ml). Spojení vodné extrakty byly neutralizovány l,0N HCl a kyselina byla extrahována do vody (3 x 100 ml). Spojené dichloromethanové extrakty byly promyty roztokem solanky a sušeny nad MgSCL Filtrace sušidla a odstranění rozpouštědla ve vakuu daly 3.58 g (72. 5%) viskózního hnědého oleje, který pomalu tuhnul přes noc. HR MS : hmot. 164.0833. vypoět.hm. 164.0837 (M+).

b) Příprava 2-ethyl-ó-methylbenzoylchloridu

CO₂H

COCI

Molekul, hmotnost = 182.65 Molekul, vzorec = CtoHnClO

Roztok 2-ethyl-6-methylbenzoové kyseliny (49 mg, 0.30 mmol) v dichlormethanu (3 mL), obsahující DMF (1 kapku) byl zpracován s oxalylchloridem (0.14 ml, 1.6 mmol) a směs byla míchána 15 hodin. Směs byla zahuštěna, podrobena azeotropii s toluenem k odstranění stop oxalylchloridu a zbytek byl použit přímo v dalším kroku.

c) Příprava N-[(2-ethyl-6-methylfenyl)karbonylJ-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyí)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru

Mol. hmotnost = 514.54 Mol. vzorec = C28H29F3N2O4

Směs výše připraveného kyselého chloridu, 4-(l,3-dimethyl-2,4-dioxo-6(trifluoromethyl)-5-pyrímidinyl)-L-fenylalaninu (100 mg, 0.25 mmol) v dichloromethanu (5 mL) byla zpracována s DIPEA (0,17 ml, 1,0 mmol) a

4* ·44« ·4 44 4* • 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 «4 444 4 «4

4 4 4 4 4

444 44 44 4444

4

4

4

4 4 • · výsledný světle hnědý roztok byl míchán 3 dny. Směs byla zahuštěna, zředěna ethylacetátem, promyta 1 N HCL a solankou a byla sušena nad síranem hořečnatým. Filtrace a odpaření poskytly zbytek, který byl purifikován chromatografií na silice při použití kolony Biotage (40m) za získání N-[(2ethyl-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,3-dimethy-2,4-dioxo-6-(trifluoromethyl)5- pyrimidinyl]-L-fenyIalanin methylesteru ve formě bílé pěny (79 mg, 62%). ES HRMS m/e vypočt. pro C28H29F3NO4 (M+Na) 537.1974, nalez.537.1972.

d) Příprava N-[(2-ethyl-6-methylfhenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

C27H27F3N2O4 Mol.hm.: 500.51

Roztok N-[(2-ethyl-6-methylfenyl)karbonyl]-4-( 1,3-dimethy-2,4-dioxo-6-(trifluoromethyl)-5-pyrimidinyl)-L-fenylalanin methylesteru (74 mg, 0.14 mmol) a IN hydroxidu sodného (2 ml, 2 mmol) v ethanolu (3 ml) byl zahříván na 40-45 °C po dobu 3 h. Poté byl pod vakuem odstraněn ethanol a zbytek byl rozpuštěn ve vodě. Vodný roztok byl promyt diethyletherem, aby se odstranily nečistoty. Vodná vrstva byla okyselena 1.0 N HCI a produkt byl extrahován ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly 68 mg (95% výtěžek) N[(2-ethyl-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu (t.t. 219-221 °C). ES-HRMS m/e vypočt. pro C27H27F3N2O4 (M+Na) 523.1815, nalez. 523.1816.

Příklad 35:

Příprava N-[(2-(l-methylethyl)-6-methylfenyl)karbonylj-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

44 «4 4* 1111 • 111 9 9 9 1 9 9 1

9 9 9 9 1 1 9 1

9 9 9 9 9 19 9 9

911 19 11 1199 ·· ti

a) Příprava 2-(l-methylethyl)-6-methyljodbenzenu

NH, >Molekul, hmotnost - 260.11 Molekul, vzorec = Cl OHI 31

K suspenzi 2-(l-methylethyl)-6-methylanilinu (15.57 mmol, 14.9 g), v konc. HCI (50 mL) a 30 g ledu byl přidán po kapkách roztok NaNO₂ (110 mmol, 8

g) v H₂O (35 mL) při -5 °C po dobu 30 min. Po přidání byl červeně zbarvený roztok míchán dalších 30 min. Poté byl během 20 min při teplotě 0-5 °C po kapkách přidán roztok KI (200 ml, 33.2 g) ve vodě (50 ml). Po tomto přidání byla směs zahřáta na teplotu místnosti, přičemž byla pozorována exothermní reakce s uvolňováním plynu. Výsledný červeně zbarvený roztok byl míchán 18 h. Poté byla směs extrahována ethylacetátem (3 x 100 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem thiosíranu sodného (200 ml), roztokem solanky a sušeny nad MgSO₄. Filtrace sušidla a koncentrace rozpouštědla pod vakuem daly zbarvenou sloučeninu, která byla purifikována chromatografií na silikagelu za získání čistého 2-(l-methylethyl)-6- methyljodobenzenu (17.8 g, 68%) jako žlutého oleje. HRMS: hmot. 260.0063, vypočt.hm. 260.0062 (M+).

b) Příprava 2-( 1-methyIethyl)-6-methylbenzoové kyseliny.

co₂h >Molek.hmotnost = 260.11 Molek.hmotnost = 178.23

Molek.vzorec = Ci₀H₁₃ I Molek.vzorec = CiiH₁₄O₂

250 ml tlaková baňka byla naplněna 2-(l-methylethyl)-6- methyljodobenzenem (25.2 mmol, 6.55 g), Pd(OAc)₂ (1.2 mmol, 280 mg) a dppp (1.2 mmol, 520 mg). Poté byla uzavřena pomocí přepážky a třikrát evakuována

argonem. Potom byl postupně pomocí stříkačky přidán acetonitril (96 ml), triethylamin (188.7 mmol, 19.0 g, 36.25 ml) a voda (19.1 ml). Potom byla gumová přepážka nahražena teflonovým víčkem spojeným se zdrojem oxidu uhelnatého (CO). Láhev byla nyní natlakována oxidem uhelnatým (40psi) a přebytečný tlak byl uvolněn. Tento proces se opakoval třikrát a nakonec byla směs míchána 5 min pod tlakem CO 40 psi. Potom byla baňka odpojena od zdroje oxidu uhenatého a ponořena do předehřáté olejové lázně (83-85 °C). Reakění směs byla potom ochlazena na teplotu místnosti, tlak byl uvolněn a směs byla zředěna etherem (200 ml) a 1.0N NaOH (10 ml). Kyselina byla extrahována do vody (2 x lOOml). Spojené vodné extrakty byly neutralizovány

1.0N HCl a kyselina byla extrahována do ethylacetátu (2 x 100 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky a sušeny nad MgSO4 . Filtrace sušidla a koncentrace poskytly 2.8 g (62%) viskozního žlutého oleje. HR MS: Hmotn. 178.0996. vypočt.hm. 178.0994 (M+).

c) Příprava 2-(l -methylethyl)-6-methylbenzoylchloridu

CO_aH

Molekulová hmotonost = 196.68 Molekulární vzorec = Cl 1H13C1O

Roztok 2-(l-methylethyl)-6-methylbenzoové kyseliny (64 mg, 0.35 mmol) v dichlorometbanu (3 mL) obsahující DMF (2 kapky) byl zpracován s oxalylchloridem (0.16 ml, 1.8 mmol) a směs byla míchána 15 hodin. Směs byla dále zahuštěna, podrobena azeotropii s toluenem k odstranění stop oxalylchloridu a zbytek byl použit přímo v dalším kroku.

d) Příprava N-[[2-(l-methylethyl)-6-methylfenyl]karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridiny l]-L-fenylalaninu

N-[[2~(l-methylethyl)-6-methylfenyl3karbonylj-4-fl,6-dimethyl-4-(trifluorómethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin byl připraven z 4-[l,6-dimethyl-4(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru a 2-(lmethylethyl)-6-methylbenzoylchloridu použitím obecných postupů popsaných v příkladu 33. ES-HRMS m/e vypočt.pro C28H29F3N2O4 (M+Na) 537.1972, nalez. 537.1977.

Příklad 36:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl3-4-fl,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

a) Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru

C18H20C1F3N2O3 C26H24C1F3N2O4

Mol.hm: 404,81 Mol.hm: 520,93

K suspenzi 4-[l,6~dimethyl-4-(trifIuoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-Lfenylalanin methylesterhydrochloridové soli (100 mg, 0.25 mmol), 2-chloro- 6-methylbenzoové kyseliny (60 mg, 0.35 mmol) a HBTU (132 mg, 0.35 mmol) v DMF (2 ml) byla přidána DIEA (174 pL, 1,0 mmol) při teplotě místnosti. Výsledná směs byla míchána 72 hodin. Poté byla směs nalita do vody (25 ml)

a byla extrahována ethylacetátem (2x15 ml). Spojené ethylacetátové extrakty byly postupně promyty 0.5 N HCI (25 ml), nasyceným roztokem NaHCO₃ (25 ml), roztokem solanky (25 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace daly surový produkt, jenž byl vyčištěn silikagelovou chromatografií na koloně Biotage (40s) za poskytnutí 98 mg (75% výtěžek) N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C26H24C1F3N2O4 (M+Na) 543.1268, nalez. 543.1275.

b) Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

C26H24C1F3N2O4 C25H22C1F3N2O4

Mol.hm.: 520.93 mol.hm.: 506.90

K suspenzi N-[(2-chloro-ó-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru (91 mg, 0.174 mmol) v ethanolu (5 mL) byl přidán IN vodný roztok hydroxidu sodného (4 ml) při teplotě místnosti. Výsledný roztok byl zahřán na 40-45 °C a míchán po dobu 4 h. Potom byl pod vakuem odstraněn ethanol a zbytek zředěn vodou (25 ml). Vodný roztok byl promyt diethyletherem (25 ml) pro odstranění nečistot. Vodná vrstva byla okyselena 1.0 N HCI a extrahována ethylacetátem (2 x 25 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace filtrátu poskytla 71 mg (80% výtěžek) N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-Lfenylalaninu jako bílé pevné látky: t.t. 220-223 °C. ES-HRMS m/e vypočt.pro • · · ·

C25H22C1F3N2O4 (M+Na) 529.1111, nalez. 529.1119.

Příklad 37:

Příprava N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4— (trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu

C25H31F3N2O5

Mol.hm:508,53

N-[[l-(2-methoxyethyl)cylopentylJkarbonyl3-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin (t.t.181-183 °C) byl připraven ze 4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-óxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru a l-(2-methoxyethyl)cyklopentakarboxylové kyseliny (získané jako bylo popsáno ve WO 0010313) při použití obecných postupů popsaných v příkladě 36, ES-HRMS m/e vypoět.pro C26H31F3N2Q5 (M+Na) 531.2077, nalez 531.2084.

Příklad. 3.8,\

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ethylesteru

K suspenzi N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-jT,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu (145 mg, 0.275 mmol) a

hydrogenuhličitanu sodného (185 mg, 2.2 mmol) v DMF (2 mL) byl přidán jodoethan (343 mg, 2.2 mmol) při teplotě místnosti. Směs byla míchána 72 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs nalita do vody (30 ml) a extrahována pomocí ethylacetátu (3 x 20 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (60 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace filtrátu poskytly 129 mg (85% výtěžek) N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluormethyl)2-oxo-3-pyridinyj]-L-fenylalanin ethylesteru ve formě krystalické pevné látky: t.t. 86-91 °C. ES-HRMS m/e vypočt. pro C26H23C12F3N2O4 (M+Na) 577.0876, nalez 577.0887.

Příklad 39:

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluormethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylesteru

C24H19C12F3N2O4 C30H32C12F3N3O4

Mol.hm.: 527.32 Mol.hm: 626.49

Do směsi N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin (145 mg, 0.275 mmol), 2-diethylaminoethylchlorid-hydrochloridu (487 mg, 2.75 mmol) a uhličitanu draselného (380 mg, 2.7 mmol) byl přidán ethylacetát (3 ml) a voda (3 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána 72 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs nalita do směsi vody (30 ml) a ethylacetátu (30 ml). Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla extrahována ethylacetátem (2 x 20 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (60 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu na koloně

Biotage (40s) za poskytnutí 122 mg (71% výtěžek) N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl}-4-[ l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl] -Lfenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylesteru jako amorfní bílé látky. ESHRMS m/e vypočt.pro C30H32C12F3N3O4 (M+H) 626.1796, nalez. 626.1802.

Příklad 40:

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru ** ·» ·* ·«

C24H19CI2F3N2O4 C28H25CI2F3N2O6

Mo.hm: 527,32 Mol.hm:613,41

K suspenzi N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl3-L-fenylalaninu (145 mg, 0.275 mmol) a hydrogenuhličitanu sodného (185 mg, 2.2 mmol) v DMF (2 mL) byl přidán 1-chlorethylacetát (270 mg, 2.2 mmol) při teplotě místnosti. Směs byla míchána 48 h při teplotě místnoosti. Potom byla reakční směs nalita do vody (30 ml) a extrahována ethylacetátem (3 x 20 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (60 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu na koloně Biotage (40s) za poskytnutí 110 mg (65% výtěžek) N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru ve formě amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt. pro C28H25C12F3N2O6 (M+Na) 635.0931, nalez 635.0932.

Příklad 41:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluormethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ethylesteru

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2— oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ethylester může být připraven z N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karhonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3pyridinyl]-L-fenylalaninu a jodoethanu použitím obecných postupů popsaných v příkladě 38.

Příklad 42

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl3-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylesteru

C₃₁H₃₅C1F₃N₃O₄

Mol.hm:606,08

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylester může být připraven z N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[ 1,6-dimethyl-4-(trífluormethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu a 2-[(N,N-diethyl)amino]-ethylchloridu hydrochloridu použitím obecného postupu popsaného v příkladu 39.

Příklad 43:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylkenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru * * · · ·· · · · · • ···· ·« · • · · · » · ·

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy) ethylester může být připraven z N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu a 1-chloroethylacetátu při použití obecných postupů popsaných v příkladě 40.

Příklad 44:

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalaninu

a) Příprava 4-methoxy-l,l,l-trifluoropent-3-en-2-onu

-O

-o

C4H8O

Mol.hm: 72.11

C4F6O3 Mol.hm: 210.03

C6H7F3O2 Mol.hm: 168.11

K roztoku 2-methoxypropenu (3.68 g, 51.03 mmol) a pyridinu (1.35 g, 16.69 mmol) v dichloromethanu (15 mL) byl přidán roztok trifluoroacetanhydridu (10 ml, 46.56 mmol) v dichloromethanu (8 ml) při teplotě 0 °C po 10-12 min. Po přidání roztok nabyl tmavé červeno-hnědé barvy a potom byla chladící lázeň odstraněna a míchání zastaveno. Směs byla ponechána 16 h v klidu a byla zředěna ledovou vodou (45 ml) a dichloromethanem (120 ml). Byly odděleny dvě vrstvy a organická vrstva byla postupně promyta 2N HCl (35 ml), nasyceným roztokem uhličitanu sodného (75 ml), roztokem solanky (25 ml) a byla sušena nad bezvodým síranem sodným. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl purifikován destilací za vysokého vakua za poskytnutí 5.546 g (65% výtěžek) 4-methoxy-1,1,1 — ·* ·· ·· ·· • · · · · · « ····· ··«· > ·· * * a a · · · • ·· ·* aaaa · a · · trifluoropent-3-en-2-onu jako světle žlutého oleje.

b) Příprava ethylesteru 4-methyl-2 (lH)-oxo-6- (trifluoromethyl)pyridin-3karboxylové kyseliny

F ř ₊

0,

-o

C6H7F3O2

Mol.hm: 168.11 Mol.hm: 131.13 Mol.hm:249.19

K suspenzi 4-methoxy-l,l,l-trifluoropent-3-en-2-onu (5.53 g, 32.89 mmol) a ethylmalonátu monoamidu (4.31 g, 32.89 mmol) v ethanolu (30 mL) byl přidán ethoxid sodný (11.72 g, 36.18 mmol, 21% čistota) při teplotě místnosti a reakční směs byla zahřáta na 85 °C. Po míchání po dobu 18 h byla reakční směs ochlazena na teplotu místnosti a byla přidána 15% HC1 (100 ml). Potom byla zředěna vodou (10 ml) a extrahována chloroformem (2 x 50 ml).

Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (100 ml) a sušeny nad bezvodým síranem sodným. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografii na silikagelu na koloně Biotage (40m) za získání 5.22 g (62% výtěžek) 4-methyl-2(lH)-oxo-6-(trifluoromethyl)pyridin-3-karboxylové kyseliny jako amorfní bílé látky. ES-LRMS: m/z 313.4 (M+Na+CH3CN).

c) Příprava ethylesteru T,4-dimethyl-2-(lH)-oxo-6-(trifluoromethyl)pyridin—

3-karboxylové kyseliny

C10H10F3N03 Mol.hm:249.19

C11H12F3NO3 Mol.hm: 263. 22 ·· • · · · •·* ··· · · · * *** ** *’ ’·” ** ··

K suspenzi ethylesteru 4-methyl-2-(lH)-oxo-6-(trifluoromethyl)pyridin-3- karboxylové kyseliny (5.2 g, 20.87 mmol) a uhličitanu draselného (8.65 g, 62.59 mmol) v DME (50 mL) byl přidán jodomethan (12 mL, 192.8 mmol) při teplotě místnosti a reakční směs byla zahřívána k refluxu po 18 h. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a anorganické pevné látky byly filtrovány a pevné látky byly promyty. Rozpouštědlo bylo koncentrováno ve vakuu a zbytek byl purifikován chromatografií na silikagelu na koloně Biotage (40m) za poskytnutí 4.02 g (71% výtěžek) ethylesteru l,4-dimethyl-2-(lH)-oxo-6-(trifluoromethyl)pyridin-3-karboxylové kyseliny jako amorfní bílé látky. ES-HRMS m/e výpočt.pro C11H12F3NO3 (M+Na) 286.0661, nalez. 286.0664.

d) Příprava l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-lH-pyridin-2-onu

C11H12F3NO3 C8H8F3NO

Mol.hm.:263.22 Mol.hm.:191.15

Ke směsi ethylesteru l,4-dimethyl-2-(lH)-oxo-6-(trifluoromethyl)pyridin-3-karboxylové kyseliny (2.5 g, 9.5 mmol) a chloridu litného (1.0 g, 23.6 mmol) byl přidán DMF (15 mL) a voda (0.38 mL) při teplotě místnosti. Reakční směs byla zahřáta na teplotu lázně 160 °C a míchána 19 hodin. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a zředěna studeným ethylacetátem a diethyletherem (75 ml, 1:1). Výsledná směs byla promyta studenou vodou (3 x 20 ml) a roztokem solanky (20 ml) a sušena nad bezvodým síranem sodným. Filtrace sušidla a koncentrace rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován silikagelovou chromatografií na koloně Biotage (40s) za poskytnutí 1.45 g (80% výtěžek) l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-lHpyridin-2-onu jako žlutého oleje. ES-HRMS m/e vypočt. pro C8H8F3NO (M+H) 192.0631, nalez. 192.0632.

e) Příprava l,4-dimethyl-3-jodo-6-(trifluoromethyl)-lH-pyridin-2-onu * 99 • 99 9 • 9 9

9 9 «99

9 9 9 9

99

9 · ·

9 9 • · 9 9 9 • 9 9

9999 ·· 9 99 9

C8H8F3NO C8H7F3INO

Mol.hm:191.15 Mol.hm:317.04

K roztoku l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-lH-pyridin-2-onu (1.44 g, 7.23 mmol), kyseliny trifluorooctové (9 mL) a trifluoroacetanhydridu (i.53 mL, 10.85 mmol) byl přidán NIS (2.569 g, 10.85 mmol) při teplotě místnosti. Potom byla směs zahřáta na 70-85 °C a míchána 2 h. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a pro neutralizaci roztoku byl pomalu přidáván nasycený roztok uhličitanu sodného. Potom byla vodná směs extrahována ethylacetátem (2 x 50 ml). Spojené extrakty byly postupně promyty nasyceným roztokem thiosíranu sodného (100 ml) a roztokem solanky (100 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem sodným. Filtrace sušidla a koncentrace rozpouštědla poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu na koloně Biotage (40m) za poskytnutí 1.02 g (45% výtěžek) l,4-dimethyl-3-jodo-6-(trifluoromethyl)-lH-pyridin-2-onu jako amorfní bílé pevné látky.ES-LRMS:m/z 318.1 (M+H), 381.2 (M+Na+CH₃CN).

f) Příprava N-[(l,l-dimethylethoxyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru

Mol. Wt.: 405.23

OMe ·· · ·44 • 4

Κ suspenzi zinkového prášku (1.96 g, 30 mmol) v THF (1.0 ml) byl přidán 1,2-dibromethan (172 μΐ, 2 mmol) při teplotě místnosti. Tato suspenze byla zahřívána při 60-65 °C tepelným zdrojem, dokud neustalo uvolňování ethylenového plynu. Potom byla suspenze ochlazena na teplotu místnosti, byl přidán trimethylchlorosilan (150 μΐ, 1.2 mmol) a směs byla míchána 15 minut. Suspenze l,4-dimethyl-3-jodo-6-(trifluoromethyl)-2-pyridonu (2.4 g, 7.57 mmol) v DMA (6 mL) byla zahřáta pomocí tepelného zdroje pro usnadnění rozpouštění a byla přidána k reakční směsi v jedné dávce. Po přidání byla směs zahřána na 70-75 °C a byla míchána 2 h, kdy TLC analýza alikvotu, zchlazeného nasyceným roztokem chloridu amonného, indikovala absenci výchozích látek. Reakční směs byla zředěna THF (5 ml), ochlazena na teplotu místnosti a přebytek zinkového prachu byl ponechán usadit. Výše připravený roztok obsahující sloučeninu zinku (7.57 mmol) byl přidán k roztoku Pd(dba)₂ (274 mg, 0.478 mmol), trifurylfosfinu (391 mg, 1.287 mmol) a N-[( 1,1 -dimethylethoxy)karbonyl]-4-jodo-L-fenylalanin methylesteru (3 g, 7.411 mmol) v THF (7 mL) při teplotě místnosti a světle žlutá směs byla míchána 40 hodin při teplotě 50-55 °C. Reakční směs byla poté nalita do nasyceného roztoku chloridu amonného a byla extrahována ethylacetátem (3 x 70 ml). Spojené extrakty byly promyty roztokem solanky (100 ml) a sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl purifikován chromatografií na silikagelu na koloně Biotage (40m) za získání 1.289 g (36% výtěžek) N[(l,l-dimethylethoxyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluormethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru jako amorfní bílé látky. ES-HRMS m/e vypoět.pro C23H27F3N2O5 (M+Na) 491.1764, nalez. 491.1764.

g) Příprava 4-[ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin-methylesteru-hydrochloridové soli

·· ·*·· “* ** ..........

C23H27F3N2O5 C18H20C1F3N2O3

Mol.hni: 468.47 Mol.hm: 404.81

N-[( 1,1 -dimethylethoxyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2- oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylester (253 mg, 0.54 mmol) byl zpracován se 4N HCl roztokem v dioxanu (4.0 ml) při teplotě místnosti. Roztok byl míchán 2 h, kdy se vytvořila bílá pevná látka. Směs byla koncentrována a zbytek byl rozpuštěn v methanolu. Po odstranění methanolu byl zbytek sušena pod vysokým vakuem za získání 221 mg (100% výtěžek)

4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninmethylesteru-hydrochloridové soli jako amorfní bílé pevné látky. ES-LRMS m/z 369.3 (M+H), 410.3 (M+CH3CN).

h) Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru

C18H20C1F3N2O3 C25H21C12F3N2O5

Mol.hm: 404.81 Mol.hm: 541.35

K suspenzi 4-[l,4-dimethyl-6,9-trifluormehtyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin-methylesteru-hydrochloridové soli (216 mg, 0.53 mmol) a 2,6-dichlorbenzoylchloridu (120 mg, 0.57 mmol) v THF (6 mL) byl přidán DIEA (210 μΐ, 1.19 mmol) při teplotě místnosti. Po 5 min byl získán čirý roztok, který byl míchán 18 h. Potom byla směs zředěna ethylacetátem (50 ml). Ethylacetáfový roztok byl postupně promyt 0.5 N HCl (50 ml), nasyceným roztokem NaHCO₃ (50 ml), roztokem solanky (50 ml) a sušen nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly surový produkt, který byl • ·« ·· ·* ·· ···· • · · · · · · 9 ·· φ ····· · 9 9 · ······ · · · 9 · ♦ *· · · 9 9 9 9 9 ··· ·· ·9 9999 ·« 99 rozpuštěn v ethylacetátu (asi 3 ml) a hexanu (asi 3-4 ml) a uchován v chladnici. Pevné látky byly spojeny a promyty hexanem. Po usušení ve vysokém vakuu bylo získáno 270 mg (93.5% výtěžek) N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-Lfenylalaninu-methylesteru jako bílé pevné látky: t.t. 170-173 °C. ES-HRMS m/e vypočt.pro C25H21C12F3N2O4 (M+Na) 563.0724, nalez 563.0730.

i) Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalaninu

C25H21C12F3N2O4 C24H19C12F3N2O4

Mol.hm: 541.35 Mol.hm: 527.33

K suspenzi N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru (243 mg, 0.45 mmol) v ethanolu (5 mL) byl přidán IN vodný roztok hydroxidu sodného (1.8 ml) při teplotě místnosti. Směs byla zahřána na 45-50 °C a míchána 2 hodiny. Potom byl pod vakuem odstraněn ethanol a zbytek byl zředěn vodou (20 ml). Vodný roztok byl promyt ethylacetátem (50 ml) pro odstranění nečistot.Vodná vrstva byla okyselena 1.0N HCI a produkt byl extrahován ethylacetátem (2 x 50 ml). Spojené organické extrakty byly promyty roztokem solanky (50 ml) a byly sušeny nad bezvodým síranem hořečnatým. Filtrace sušidla a koncentrace poskytly 186 mg (79% výtěžek) N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu jako amorfní bílé pevné látky. ES-HRMS m/e vypočt.pro C24H19C12F3N2O4 (M+Na) 549.0567, nalez 549.0573.

Příklad 45:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(1,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalaninu

C25H22C1F3N2O4 Mol.hm: 506.90

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin byl připraven z 4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin methylesteru a 2-chloro-6-methylbenzoylchloridu použitím obecných postupů popsaných v příkladu 44. ESLRMS m/z 507.1 (M+H), 529.1 (M+Na).

Příklad 46:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinylJ-L-fenylalanin ethylesteru

C27H26C1F3N2O4 Mol.hm: 534, 95

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonylJ-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinylJ-L-fenylalanin ethylester může být připraven z N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3pyridinyl]-L-fenylalaninu a jodoethanu použitím obecných postupů popsaných v příkladě 38.

•··

• · · »· ·«·· ·· ··

Příklad 47:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl3-L-fenylalaninu 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylesteru

C31H35C1F3N3O4 Mol.hm: 606.08

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)—

2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin-2-[(N,N-diethyl)amino]ethylester může být připraven z N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu a 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylchloridu-hydrochloridu použitím obecných postupů popsaných v příkladě 39.

Příklad 48:

Příprava N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy)ethylesteru

C29H28CIF3N2O6 Mol.hm: 592.99

N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinylj-l-fenylalanin-l-(acetoxy)ethylester může být připraven z N[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l ,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2— oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu a 1-chloroethylacetátu použitím obecných ttt • ·· ·♦ 00 «0 0 0 0 * 0 0 0 0 0 0 ··«·♦ · · c • 0 0 0 0 9 0 00 0 ··· 000 00 ··· ·· »0 0000 0« postupů popsaných y příkladě 40.

Příklad 49:

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[ 1,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ethylesteru

C26H23C12F3N2O4 Mol.hm: 555.37

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo—

3-pyridinyl]-L-fenylalanin ethylester může být připraven z N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-Lfenylalaninu a jodoethanu při použití obecných postupů popsaných v příkladě 38.

Příklad 50:

Příprava N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l_s4-dimethyl-6-(trifluormethyl)~ -2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylesteru

C30H32C12F3N3O4 Mol.hm: 626.49

N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-ó-(trifluoromethyl)-2-oxo— -3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino]ethylester může být připraven z N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[ 1,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalaninu a 2-[(N,N-diethyl)amino]ethyl• · · chloridu hydrochloridu použitím obecných postupů popsaných v příkladě 39/

44*4 ··

4 4 ♦ »444 • 4 4 4 4 4 • · · 4 4 4 4 ·· 4444 44 44

Příklad 51:

Příprava N-[{2,6-dicbJorofenyl)karbonyl]-4-[í_?4-di®ethyl-6-(trifluor0mcthyl)-2-oxo-3-pyridÍnyl]-L-fcnylalanin l-(acetoxy)<?thylesteru

C28H25C12F3N2O6 Mol.hm: 613.41

N-[{2,6-dichloro.feuy,l).karbouyl]-4-[l3ditnethyl-6-(trifluoroinethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalamn l-(acetoxy)ethylester může být připraven z N-[(2,6dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2-oxo-3pyridinylJ-L-fenylalaninu a 1-chloroethylacetátu použitím obecných postupů popsaných v příkladě 40.

Příklady biotestů

Přiklad A

VLA-4/VCAM-1 screening testy

Aktivita antagonisty VLA-4, definovaná jako schopnost ucházet se o vazebnost na imobilizovaný VCAM-1, byla kvantifikována použitím duální protilátkové ELISA, s pevnou fází. VLA-4 (α4β1 integrin) vázaný na VCAM1 byl detekován komplexem anti-integrinu βΐ protilátky; HRP-konjugovaný anti-myší IgG: chromogenní substrát (K-Blue). Nejprve bylo potřeba potažení 96miskových ploten (Nunc Maxisorp) rekombinantním lidským VCAM-1 (0,4 pg ve 100 pl PBS), utěsnění každé plotny a potom ponechání ploten stát při 4 °C po asi 18 h. Plotny potažené VCAM byly postupně blokovány 250 μΐ 1% BSA/0,02% NaN3, aby se redukovala ne-specifická vazebnost. V den

• ··	·*	··			····
• · ·	•	4	* ·	•	•	•
• · ·	•	•	•	•	•	•
• · ·	• ·	•	é	•	• ·
·· ♦·	··	····	··		··»

testování byly všechny plotny promyty dvakrát VCAM testovacím pufrem (200 μΐ/misku 50 mM Tris-HCl,100 mM NaCl, 1 mM MnC12, 0,05% Tween 20; pH 7,4). Testované sloučeniny byly rozpuštěny ve 100% DMSO a potom byly zředěny 1:20 ve VCAM testovacím pufru doplněném 1 mg/ml BSA (tedy finální DMSO=5%). Prováděla se série ředění 1:4, aby se dosáhlo koncentračního rozmezí 0,005 nM-1,563 μΜ pro každou testovanou sloučeninu. Do VCAM-potažených desek bylo přidáno 100 μΐ na misku každého ředění, následovalo 10 μΐ VLA-4 odvozeného z Ramosových buněk. Tyto plotny byly postupně míchány na platformovém mísiči po 1 min, inkubovány po 2 h při 37 °C a potom byly promyty čtyřikrát 200 μΐ/misku VCAM testovacím pufrem. Do každé misky bylo přidáno 100 μΐ protilátky myšího anti-humánního integrinu βΐ (0,6 pg/ml ve VCAM testovacím pufru + 1 mg/ml BSA) a ponecháno inkubovat po 1 h při 37 °C. Na závěr této inkubační periody byly všechny plotny promyty čtyřikrát VCAM testovacím pufrem (200 μΐ/misku). Potom byla do každé misky přidána odpovídající druhá protilátka, HRP-konjugovaný kozí anti-myší IgG (100 μΐ na misku a 1:800 zředění ve VCAM testovacím pufru + 1 mg/ml BSA), následovala 1 hodinová inkubace při teplotě místnosti a byla zakončena třemi promytími (200 μΐ/misku) VCAM testovacího pufru. Vznik barvy byl iniciován přidáním 100 μΐ K-Blue na misku (15 min inkubace, teplota místn.) a zakončena přidáním 100 μΐ Red Stop pufru na misku. Všechny desky potom byly čteny v UV/Vis spektrofotometrem při 650 nm. Výsledky byly vypočteny jako % inhibice celkových vazeb (tedy VLA-4 + VCAM-1 za nepřítomnosti testované sloučeniny). Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce I (A=IC50 < 1 nM, B = IC50 < 10 nM):

• ·

• · · ·

TABULKA 1

Sloučenina z příkladu	Aktivita v testu VCAM/VLA-4 ELISA
8	A
10	B
15	B
17	B
24	A
28	A

PříklacLR

Testovací protokol na Ramos (VLA-4)/VCAM-l buňkách založeného screeningu

Materiály:

Rozpustný rekombinantní lidský VCAM-1 (směs 5- a 7-Ig domén) byl purifikován z CHO buněčného kultivačního média imunoafinitní chromatografii a byl udržován v roztoku obsahujícím 0,1 M Tris-glycin (pH 7,5), O,1M NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,02% 0,02% NaN3 a 10 pg/ml leupeptinu. Calcein-AM byl získán od Molecular Probes lne.

Metody:

Aktivita antagonisty VLA-4 (α4β1 integrin), definovaná jako schopnost ucházet se s buněěně-povrchovým VLA-4 o vazebnost na imobilizovaný VCAM-1, byla kvantifikována použitím testu Ramos-VCAM-1 buněčné adheze. Ramos buňky nesoucí buněčně-povrchový VLA-4 byly označeny fluorescenčním barvivém (Calcein-AM) a ponechány vázat VCAM-1 za přítomnosti nebo absenci testovaných sloučenin. Snížení intenzity fluorescence spojení s připojenými buňkami (%inhibice) odráželo kompetitivní inhibici VLA-4 zprostředkované buněčné adheze testovanou sloučeninou.

Nejprve bylo potřeba potažení 96miskových ploten (Nunc Maxisorp) rekombinantním lidským VCAM-1 (100 ng ve 100 μΐ PBS), utěsnění každé • · · · plotny a potom ponechání ploten stát při 4 °C po asi 18 h. Plotny potažené VCAM byly postupně dvakrát promyty s 0,05% Tween-20 v PBS potom blokovány po 1 h (teplota místnosti) 200 μί blokovacího pufru (1% BSA / 0,02% thimerosal), aby se redukovala ne-specifická vazebnost. Po inkubaci blokovacím pufrem byly plotny invertovány, blottovány a zbývající pufr byl nasát. Potom byla každá plotna promyta 300 μί PBS, invertována a zbývající PBS byl odsát.

Testované sloučeniny byly rozpuštěny ve 100 DMSO a potom byly zředěny 1:25 ve VCAM buněčném adhezním testovacím pufru (4 mM CaC12, 4 mM MgC12 v 50 mM TRIS-HC1, pH 7,5) (finální DMSO= 4%). Prováděla se série osmi ředění 1:4 pro každou sloučeninu (obecné koncentrační rozmezí 1 nM-12 500 nM). Do VCAM-potažených desek bylo přidáno 100 μί/misku každého ředění, následovalo 100 μΐ Ramos buněk (200 000 buněk/misku v 1% BSA/PBS). Plotny obsahující testované sloučeniny a Ramos buňky byly ponechány inkubovat po 45 min při teplotě místnosti, potom bylo přidáno 165 μί/misku PBS. Plotny byly invertovány, aby se odstranily nepřipojené buňky, vysáty, a bylo přidáno 300 μί/misku. Potom byly plotny opět invertovány, vysáty a zbývající pufr byl jemně odsát. Do každé misky bylo přidáno 100 μί lýzového pufru (01% SDS v 50 mM Tris-HCl, pH 8,5) a míšeno po 2 min na rotační třepací platformě. Potom byla odečtena fluorescenční intensita ploten na fluorescenčním měřícím systému Cytofluor 2300 (Millipore) (excitace = 485 nm, emise = 530 nm).

Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce II, kde (A=IC5o < 100 nM, B = IC₅₀ < 10 000 nM, C = IC₅o < 5000 nM ):

• · • ·

TABULKA 2

Sloučenina z příkladu	Aktivita v testu VCAM/VLA-4 Ramos buněk
8	B
10	B
15	C
24	B
28	C
30	B
31	B
32	B
33	A
34	B
35	B
36	A
37	B

Příklad C

Protokol Alfa4-beta 7 testu

Den, který byl dva týdny před testem, byly Nunc vysokovazebné F96 Maxisorp imunoplotny, č.442404 nebo ě.439454, potaženy 25 ng/misku (0,25 pg/ml) MadCAM v objemu 100 pg/misku. Plotny byl pokryty uzávěrem a obaleny, následovala inkubace v chladničce po alespoň 24 hodiny. Použitým povlékacím pufrem bylo: 10 mM uhličitanového / hydrogenuhličitanového pufru připraveného z: 0,8 g/1 uhličitanu sodného a 1,55 g/1 hydrogenuhličitanu sodného upraveného na pH 9,6 IN HCI,

Testovací pufry se skládaly z následujících:

Promývací pufr: Blokovací pufr: Značkovací pufr: Buněčný pufr:

0,05% Tween 20 v PBS

1% Sušené mléko bez tuku v PBS

PBS

RPMI 1640 medium (bez přísad) • ·· ·· ·· ··· • · · · · · · · · φ

4 4 4 4 4·«

Vazebný pufr; 1,5 mM GaC12

Q_f5mM MnC12

50mM TRIS-HG1; přidat NaOH pn kapkách na pH 7,5;

doplnit do objemu v H2O upravit na pH 7,5

Ředící pufr : 4% DMSO ve vazebném pufru

Plotny byly promyty 2x promývacím pufrem a potom blokovány při teplotě místnosti po alespoň 1 hodinu blokovacím pufrem. Utěsněné plotny byly někdy blokovány přes nos v chladničce. Potom byly plotny promyty PBS a ručně vysáty. Zbývající kapalina byla z misek odsáta.

Vhodné RPMI 8866 buňky pro testování byly odebrány z dávky (2x10⁶ buněk/ml a 10 ml/plotnu x počet ploten) a vloženy do zkumavky odstředivky. Zkumavky byly naplněny do objemu s PBS a byly odstřeďovány při 200 x G po 8 minut. Pufr byl vylit a buňky byly resuspendovány na lOx 10⁶/ml v PBS, a zásobní roztok calceinu v DMSO (5 mg/ml) byl přidán při 5 μΐ/ml buněčné suspenze. Suspenze byla inkubována po 30 min při 37 °C ve tmě. Potom byly buňky promyty PBS. PBS bylo vylito a buňky byly resuspendovány v buněčném pufru při koncentraci 2 χ 10⁶ buněk/ml pro povlékání v testu.

Byl připraven zásobní roztok testovaných sloučenin při požadovaném prvním 25násobném ředění ve 100% DMSO. První ředění pro standard, stejně jako testované sloučeniny, byly 1:25 přímo ve vazebném pufru, zatímco zbývající série ředění byly v ředícím pufru (vazebný pufr / 4% DMSO). Zásobní koncentrace a ředění sloučenin pro screening byly stanoveny předpokládanou aktivitou.

Pro testování bylo 129 μΐ vazebného pufru vneseno do první řady misek a 100 μΐ ředícího pufru bylo vneseno do zbývajících misek. 5,4μ1 podíly každé sloučeniny byly pipetovány do příslušných označených misek, vždy třikrát. Potom byly sloučeniny dále ředěny na plotnách (34μ1 + 100μΙ => 4násobné ředění), Pro kontrolní vzorky bylo 100 μΐ ředícího pufru + 100 μΐ buněčného pufru vloženo do nespecifikovaných základních misek (žádné buňky, žádná sloučenina) a 100 μΐ ředícího pufru; 100 μΐ buněk bylo vloženo * · · · · · · ·· · · · · ·· · · do všech vazebných misek (žádná sloučenina = 100% vazebnost). Do každé misky obsahuijící sloučeninu byly vneseny označené buňky v množství 2xl0⁶ buněk/ml, 100 μΙ/misku (= 2 x 10⁵ buněk/misku). Plotny byly uzavřeny a inkubovány ve tmě po 45 minut při teplotě místnosti. Po inkubování byly nevázané buňky odstraněny přidáním 150 μΐ PBS/misku. Plotny byly invertovány, odsáty na papírových ubrouscích a jemně promyty přidáním 200μ1 PBS do misky a opět vysáty. Zbývající pufr byl z misek opatrně odsát. Do každé misky bylo nakonec přidáno 100 μΐ PBS. Potom byla odečtena fluorescenční intensita ploten na fluorescenčním měřícím systému Cytofluor 2300 (Millipore) (excitace=485 nm, emise=530 nm). Hodnoty IC50 každé sloučeniny byly stanoveny lineární regresní analýzou. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce III.

TABULKA 3

Sloučenina z příkladu	Aktivita v testu MadCAM/RPMI buněk (A=IC50<100nM,B=TC50<10000nM,C=IC50 <5000nM)
30	B
31	B
32	B
33	A
34	B
35	C
36	B
37	B

• · · ·

Claims (56)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Sloučenina vzorce přičemž R22 a R23 jsou nezávisle vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, cykloalkyl, aryl, arylalkyl, nitro, kyano, nižší alkylthio, nižší alkylsulfinyl, nižší alkylsulfonyl, nižší alkynoyl,halogen nebo nižší perfluoroalkyl a konečně jeden z R22 a R23 je jiný než vodík a R24 je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, aryl, nitro, kyano, nižší alkylsulfonyl, halogen, nebo

   R] je skupina vzorce Y-2, což je pěti- nebo šestičlenný heteroatomový kruh navázaný přes uhlíkový atom na amidkarbonyl, kde zmíněný kruh obsahuje jeden, dva nebo tři heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z N,0 a S a jeden či dva atomy zmíněného kruhu jsou nezávisle substituovány nižším alkylem či arylem a konečně jeden ze zmíněných substituovaných atomů sousedí s atomem uhlíku, na němž je navázán amidkarbonyl; nebo

   Ri je skupina vzorce Y-3, což je 3-7 členný kruh vzorce:

   • · · · ► 11 ·· · ···

   II 1 1 1111 9 1 1

   111111 19 11 1

   1 · · · · · 1

   III 4« 11 1111 11 19

   R25

   Q-hrd Y—₃ kde R25 je nižší alkyl, nesubstituovaný nebo fluorem substituovaný nižší alkenyl, nebo skupina vzorce Rz6-(CH2)_fi-, R₂e je aryl, heteroaryl, azido, kyano, hydroxy, nižší alkoxy, nižší alkoxykarbonyl, nižší alkynoyl, nižší alkylthio, nižší alkylsulfonyl, nižší alkylsulfinyl, nižší perfluoroalkanoyl, nitro, nebo R₂₆ je skupina vzorce -NR23R29, kde R29 je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxykarbonyl, nižší alkanoyl, aroyl, nižší perfluoroalkanoylamino, nižší alkylsulfonyl, nižší alkylaminokarbonyl, arylaminokarbonyl; nebo Ras a R29, vzaty dohromady s připojeným psíkovým atomem, vytváří 4,5- či 6ti členný nasycený heterocyklický kruh, volitelně obsahující jeden přídavný atom vybraný ze skupiny O,S, N-R40·

   Q je -(CH₂)fO-, -(CH₂)_řS-, -(CH₂)_fN(R₂₇)- , -(CH₂)fR₂₇ je vodík, nižší alkyl, aryl, nižší alkanoyl, aroyl či nižší alkoxykarbonyl, R4Q je vodík, nižší alkyl, aryl, nižší alkanoyl, aroyl či nižší alkoxykarbonyl, atomy uhlíku v kruhu jsou nesubstituované nebo substituované nižším alkylem či halogenem, e je celé číslo od 0 do 4, f je celé číslo od 0 do 3;

   R₂ je vodík, nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl, aryl či nižší arylalkyl;

   R_? je vodík, halogen, nižší alkyl, trifluoromethyl či aryl;

   R4 je vodík, halogen, nižší alkyl či aryl;

   R5 je vodík, nižší alkyl, nižší alkoxy, trifluoromethyl či hydroxy;

   R₆ je vodík, nižší alkyl, nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl, nebo je Re skupina vzorce P-3:

   ^32 _Rs3

   4CH2)h-c-(CH2)g-r< ^{33 M} R34 p-3 kde:

   • · · • · • · · ·

   R₃₂ je vodík nebo nižší alkyl; R₃₃ je vodík, nižší alkyl, aryl; R₃₄ je vodík či nižší alkyl; h je celé číslo od 0 do 2; g je celé číslo od 0 do 2; součet g a h je od 1 do 3; nebo je Re skupina vzorce P-4:

   P-4 kde: R_32? g a h jsou jak v předchozím definované; Q'je O,S, -(CH₂)j-, nebo skupina o vzorci N-R35. kde R₃₅ je vodík, nižší alkyl, nižší alkanoyl, nižší alkoxykarbonyl; j je 0,1 či 2;

   a R₇ je vodík, chlór, nižší alkoxy, nižší alkyl, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde R₃ je vodík, halogen, nižší alkyl či aryl.
3. 3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2 kde Rj je Y-3, kde Q je -(CH₂)fO- , -(CH₂)_fS- , či -(CH₂)f- .
4. 4. Sloučenina nároku 3, kde R5 je vodík, nižší alkyl či trifluoromethyl.
5. 5. Sloučenina nároku 1 nebo 2, kde Rj je skupina Y-l, kde R₂₂ a R₂₃ jsou nezávisle vodík, nižší alkyl či halogen a R₂₄ je vodík, nižší alkyl či nižší alkoxy.
6. 6. Sloučenina nároku 5, kde R₂₂ a R₂₃ jsou nezávisle vodík, nižší alkyl nebo halogen, R₂₄ je vodík nebo nižší alkoxy a R₂ je nižší arylalkyl.
7. 7. Sloučenina nároku 1 nebo nároku 2, kde Ri je skupina vzorce Y-3, kde R₂₃ je skupina vzorce R₂6-(CH₂)_e- , kde R₂g je nižší alkoxy, Q je -(CH₂)f- , e je celé číslo od 0 do 4 a f je celé číslo od 0 do 3.
8. 8. Sloučenina nároku 1 nebo nároku 2, kde Ri je skupina vzorce Y-3 a R₂ je vodík, nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl nebo nižší arylalkyl.
9. 9. Sloučenina nároku 8, kde Ri je skupina vzorce Y-3, kde Ras je skupina vzorce R₂g-(CH₂)_e- . kde Ras je nižší alkoxy, Q je -(CHa)f- , e je celé číslo od 0 do 4, f je celé číslo od 0 do 3, R₂ je nižší arylalkyl.
10. 10. Sloučenina nároku 1 nebo nároku 2, kde R₂ je vodík, nižší alkyl či nižší arylalkyl;

    R₃ je vodík

    R₄ je vodík či halogen;

    Rs je vodík, nižší alkyl, trifluoromethyl či nižší alkoxy;

    Reje vodík či nižší alkyl;

    R7 je vodík, chlór, nižší alkoxy či nižší alkyl.
11. 11. Sloučenina nároku 10, kde Ri je skupina vzorce Y-1.
12. 12. Sloučenina nároku 11, kde Ri je skupina Y-1, kde R₂₂ a R₂₃ jsou nezávisle vodík, nižší alkyl či halogen a R₂₄ je vodík, nižší alkyl či nižší alkoxy.
13. 13. Sloučenina nároku 12, kde Rj je skupina Y-1, kde R₂₄ je vodík a R₂ je nižší arylalkyl.
14. 14. Sloučenina nároku 10, kde Rj je Y-2.
15. 15. Sloučenina nároku 10, kde Rj je skupina vzorce Y-3.
16. 16. Sloučenina nároku 15, kde Rj je skupina vzorce Y-3, kde R₂$ je skupina vzorce R₂6-(CH₂)e-, kde R₂g je nižší alkoxy, Q je -(Cha)f- , e je celé číslo od 0 do 4 a f je celé číslo od 0 do 3.
17. 17. Sloučenina nároku 10, kde

    R₂ je vodík, nižší alkyl či nižší arylalkyl;

    R₃ je vodík;

    • · • ♦ · « · • · • « ·· ···♦

    R₄ je halogen;

    Rs je vodík;

    Ré je vodík či nižší alkyl;

    R₇ je vodík, chlór, nižší alkoxy či nižší alkyl.
18. 18. Sloučenina podle některého z nároků 1,3 nebo 4, kde Ri je skupina vzorce Y-l nebo skupina vzorce Y-3;

    R₂ je vodík, nižší alkyl ěi nižší arylalkyl;

    Rj je vodík, nižší alkyl či trifluoromethyl;

    R₄ je vodík či halogen;

    R₅ je vodík, nižší alkyl či trifluoromethyl;

    R₆ je vodík, nižší alkyl, nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl nebo skupina vzorce P-3, či P-4;

    R₇ je vodík ěi nižší alkyl.
19. 19. Sloučenina podle nároku 18, kde

    R₂ je nižší alkyl ěi nižší arylalkyl;

    R₆ je vodík, nižší alkyl, nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl nebo skupina vzorce P-3; a R₇ je vodík
20. 20. Sloučenina podle nároku 19, kde Ri je Y-l, kde R₂₂ a R23 jsou vodík, halogen ěi nižší alkyl, R₂₄ je vodík, nižší alkoxy, nebo je Ri Y-3, kde R₂s je skupina vzorce R₂6-(CH₂)_B- , kde R_2ťj je nižší alkoxy, Q je -(CH₂)f - , e je celé číslo od 0 do 4 a f je celé číslo od 0 do 3.
21. 21. Sloučenina podle nároku 20, kde R₂ je nižší alkyl, R₄ je vodík a Rj a R₅ jsou nižší alkyl či trifluorometbyl.
22. 22. Sloučenina podle nároku 21, kde Rg je vodík.
23. 23. Sloučenina podle nároku 22, kde Ri je Y-l.
24. 24. Sloučenina podle nároku 23, kde R22 a R23 jsou halogen či nižší alkyl.
25. 25. Sloučenina podle nároku 24, kterou je

    N-[ (2, 6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2- oxo3-pyridinyl]-L-fenylalanin ;

    N-[ (2-ethyl-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ;

    N-[ (2- (l-methylethyl)-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4(trifluoromethyl)-2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ;

    N-[ (2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin;

    N-[ (2, 6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-(l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2- oxo3-pyridinyl)-L-fenylalanin ; nebo

    N-[ (2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l, 4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)2- oxo-3 -pyridinyl)-L-fenylalanin.
26. 26. Sloučenina podle nároku 22, kde Rl je Y-3.
27. 27. Sloučenina podle nároku 26, kterou je: N-[ [l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2-oxo-3pyridinyl]-L-fenylalanin.
28. 28. Sloučenina podle nároku 21, kde Rg je nižší alkyl.
29. 29. Sloučenina podle nároku 28, kterou je:

    N-[ (2,6-dichlorofenyl) karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4- (trifluoromethyl)-2oxo3- pyridinyl]-L-fenylalanin ethylester ;

    N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3pyridinyl]-L-fenylalanin ethylester ;

    N-[ (2-chlorO’-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[ 1,6-dimethyl-4-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ethylester ; nebo

    N-[ (2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6- (trifluoromethyl)2-oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin ethylester.
30. 30. Sloučenina podle nároku 21, kde Rs je nižší alkylkarbonyloxy nižší alkyl.
31. 31. Sloučenina podle nároku 30, kterou je:

    N-[ (2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4- (trifluoromethyl)-2oxo3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy) ethylester ;

    N-[(2, 6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-{ 1,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2- oxo3-pyridínyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy) ethylester ;

    N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4- (trifluoro- methyl)2- oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy) ethylester ; nebo

    N-[ (2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin l-(acetoxy) ethylester.
32. 32. Sloučenina podle nároku 21, kde Ró je skupina vzorce P-3, kde R32 je vodík, R33 a R34 jsou nižší alkyl, jeden z g nebo h je 1 a druhý 0.
33. 33. Sloučenina podle nároku 32, kterou je:

    N-[ (2, 6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4- (trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl) amino] ethylester ; N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2- oxo3- pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl) amino] ethylester ;

    N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,6-dimethyl-4- (trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl) amino] ethylester ; nebo

    N-[ (2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-[l,4-dimethyl-6-(trifluoromethyl)-2oxo-3-pyridinyl]-L-fenylalanin 2-[(N,N-diethyl)amino] ethylester.
34. 34. Sloučenina podle nároku 20, kde R6 je vodík.
35. 35. Sloučenina podle nároku 34, kde R2 je nižší alkyl, R₃ je vodík, R₄ je vodík či halogen, R5 je vodík či nižší alkyl.
36. 36. Sloučenina podle nároku 35, kde Ri je Y-l.
37. 37. Sloučenina podle nároku 36, kde R22 a R23 jsou nižší alkyl či halogen, R₂₄ je vodík.

    00 00 00 0000 0 0 0 0 0 0

    0 0 0 0 0 0 00 0000 00 00
38. 38. Sloučenina podle nároku 37, kterou je:

    N-[ (2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin;

    N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3-pyridinyl)L-fenylalanin ; nebo

    N-[(2-chloro-6-methylfenyl)karbonyl]-4-( 1,4-dimethyl-2-oxo-3- pyridinyl)-Lfenylalanin.
39. 39. Sloučenina podle nároku 36, kde R22 a R₂₃ jsou halogen, R₂₄ je vodík.
40. 40. Sloučenina podle nároku 39, kterou je: N-[(2,6-dichlorofenyl)karbonyl]-4 (1, 4-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)-L-fenylalanin.
41. 41. Sloučenina podle nároku 36, kde R₂₂ a R₂₃ jsou vodík či halogen a R₂₄ je nižší alkoxy.
42. 42. Sloučenina podle nároku 41, kterou je:

    N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(l-methyl-2-oxo-3- pyridinyl)-Lfenylalanin ; nebo

    N-[(2-bromo-5-methoxyfenyl)karbonyl]-4-(5-bromo-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-L-fenylalanin.
43. 43. Sloučenina podle nároku 35, kde Ri je Y-3.
44. 44. Sloučenina podle nároku 43, kterou je: 4-(5-chloro-l-methyl-2-oxo-3pyridinyl)-N- [ [l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin.
45. 45. Sloučenina podle nároku 19, kde R ₂₂ a R₂₃ jsou halogen či nižší alkyl, R₂₄ je vodík či nižší alkoxy, R₂s je skupina vzorce R₂F(CH₂) _s - , kde R₂g je nižší alkoxy, Q je -(CH₂)f- , e je celé číslo od 0 do 4 a f je celé číslo od 0 do

    3.

    9 99 99 9« 9· 9999

    99 99 9999 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 999 9 9

    999 999 9999

    999 99 99 9999 99 99
46. 46. Sloučenina podle nároku 45, kde Ra je nižší arylalkyl, R3 je vodík, R5.7 jsou vodík.
47. 47. Sloučenina podle nároku 46, kde Rj je Y-l.
48. 48. Sloučenina podle nároku 47, kterou je:

    4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)-N-[ (2-chloro-6methylfenyl)— karbonyl]-L-fenylalanin ; nebo

    4-(l-Benzyl-5-chloro-2-oxo-3-pyridinyl)- N-[[l-(2-methoxyethyl)cyklopentyl]karbonyl]-L-fenylalanin.
49. 49. Sloučenina vzorce II

    R4 kde Rj -Rg a R7 jsou definovány v nároku 1 a P) a Pj jsou chránící skupiny.
50. 50. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 48 pro použití jako léčiva.
51. 51. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 48, nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, a farmaceuticky přijatelný nosič.
52. 52. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 48 pro použití v léčbě chorobných stavů, zprostředkovaných vazbou VCAM-1 nebo VLA-4 nebo VLA-4 exprimujících buněk, zejména v léčbě revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánětlivého onemocnění střev a astma.

    • 0 ·*»· • 00 ·· • 0 0« · 0 · · ·· 0 • 09 00 0 9 9 · • 0 900 9 9··· ·

    009 000 000« ·«· ·9 9· ···· · · ·«
53. 53. Použití sloučeniny některého z nároků 1 až 48 nebo jejich farmaceutických solí v léčbě chorobných stavů zprostředkovaných vazbou VCAM-1, VLA-4, nebo VLA-4 exprimujících buněk, zejména v léčbě revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánětlivého onemocnění střev a astma.
54. 54. Způsob přípravy farmaceutických prostředků vyznačující se tím, že zahrnuje přivedení sloučeniny podle některého z nároků 1 až 48, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, a kompatibilních nosičů do galenické formy podávání.
55. 55. Použití sloučeniny podle některých nároků 1-48, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, v přípravě léků k léčbě revmatoidní artritidy, roztroušené sklerózy, zánětlivého onemocnění střev a astma.
56. 56. Vynález, zde dříve důkladně popsán, zejména s odkazy na nové sloučeniny, meziprodukty, farmaceutické přípravky a jejich použití.