CZ20011564A3 - Léčivo pro inhibici vaskulární hyperpermeability - Google Patents

Léčivo pro inhibici vaskulární hyperpermeability Download PDF

Info

Publication number
CZ20011564A3
CZ20011564A3 CZ20011564A CZ20011564A CZ20011564A3 CZ 20011564 A3 CZ20011564 A3 CZ 20011564A3 CZ 20011564 A CZ20011564 A CZ 20011564A CZ 20011564 A CZ20011564 A CZ 20011564A CZ 20011564 A3 CZ20011564 A3 CZ 20011564A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
kdr
compound
medicament
manufacture
tyrosine kinase
Prior art date
Application number
CZ20011564A
Other languages
English (en)
Inventor
Lee D. Arnold
Peter F. Bousquet
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of CZ20011564A3 publication Critical patent/CZ20011564A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká použiti určitých sloučenin inhibujících buněčné signální funkce KDR, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulárni hyperpermeability a následných zdravotních poruch.
Dosavadní stav techniky
Edém může být popsán jako nárůst objemu tkáňového moku. Při tomto abnormálním stavu je obvykle vyhledáváno ulehčení. Tento stav často vzniká z toho důvodu, že mok opouští krevní vaskulaturu v důsledku nárůstu endoteliální permeability, která je často spojena s makromolekulárním výronem a dochází k usazení moku ve vmezeřených prostorech.
U jednotlivých lidí existují různé fyziologické a biochemické mechanismy, které jsou základem edému a vzniku těchto edemických stavů. Důležitým mediátorem v jednom či více těchto mechanismů je „vaskulárni endoteliální růstový faktor buněk. Tento faktor řídí transport ve vaskulárních endoteliálních buňkách a zapříčiňuje nárůst permeability ► mnohých cévních (vaskulárních) řečišť, včetně těch, které se nachází v kůži, podkožních tkáních, peritoneální stěně, mezenteriu, bránici, průdušnici, průduškách, dvanáctníku a děloze.
Nárůst permeability může být doprovázen významnou diapedézou, změnami při průchodu přes endotel, výrony, ukládáním makromolekul v těchto místech s dlouhotrvajícím nízkým tlakem (hypotenzí). Předpokládá se, že tyto procesy předcházejí neovaskularizaci. VEGF je exprimován la zánětlivými T buňkami, makrofágy, neutrofily a eozinofily atd. v místech zánětu. Tento faktor je řízen hypoxií, určitými antidiuretickými hormony, růstovými faktory, pohlavními hormony a početnými zánětlivými cytokiny. Vaskulární permeabilita ovlivňovaná VEGF ovlivňuje takové zdravotní poruchy, jako je nádorová vodnatelnost břišní, endometrióza, syndrom respirační úzkosti u dospělých (ARDS), postkardiopulmonární bypass v důsledku nízkého
4 4 4 4 4 • 4 «
4· 4 4 44
40444 ··
4 4 4 · ··
4444 44 44 ·· ' tlaku, hyperpermeabilita zapříčiňující vznik puchýřů, edemické odezvy na popáleniny a poranění, endoteliální dysfunkce při diabetů, komplikace při syndromu hyperstimulace vaječníků a očním edému.
Z výše uvedeného je zřejmé, že inhibice tvorby nebo aktivity VEGF by mohla být užitečná zejména pro zamezení projevů výše uvedených zdravotních poruch. Pro zmírnění těchto poruch by byla užitečná činidla, která jsou schopna blokovat VEGF umožňující hyperpermeabilitu, edém a s tím spojené syndromy.
Proteintyrosinkinasy
Proteintyrosinkinasy (Protein Tyrosine Kinases PTK) zahrnují širokou a různorodou skupinu proteinů, která má enzymatickou aktivitu. PTK hrají důležitou úlohu při řízení buněčného růstu a diferenciaci (Sclessinger, Ulrich, 1992, Neuron 9:383 - 391).
Bylo ukázáno, že aberační stimulace, exprese nebo mutace PTK vedou buď k neřízené proliferaci buněk (například zhoubný nádorový růst) nebo k poruchám v klíčových vývojových, regulačních nebo reparativních procesech. Z tohoto důvodu společnosti zabývající se biomedicínou vynaložily značné prostředky ke zjištění specifické biologické role členů PTK skupiny, jejich funkce v diferenciačních procesech, jejich role při vývoji nádorů a v dalších onemocněních, biochemických mechanismech týkajících se jejich signálních transdukčních cest po stimulaci ligandem a vývoji nových léčiv.
Tyrosinkinasy mohou být receptorového typu (mají extracelulární, transmembránové a intracelulární domény) nebo nereceptorového typu (jsou zcela intracelulární).
• · * * • · · ···· ··
Receptorová tyrosinkinasy (RTK)
RTK (Receptor Tyrosine Kinase) zahrnují širokou skupinu transmembránových receptorů s různými biologickými aktivitami. Do současné doby bylo identifikováno nejméně 19 odlišných podskupin RTK. Skupina receptorových tyrosinkinas obsahuje receptory, které jsou rozhodující pro růst a diferenciaci řady buněčných typů (Yarden a Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 433 - 478, 1988; Ullrich a Schlessinger, Cell 61: 243 - 254, 1990). Vlastní funkce RTK je aktivována po navázání ligandu, což má za následek fosforylaci receptoru a násobných buněčných substrátů a následně dochází k řadě buněčných reakcí (Ullrich a Schlessinger, 1990, Cell 61: 203 - 212). Tak signální transdukce zprostředkovaná receptorovou tyrosinkinasou je iniciována extracelulární interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po které následuje dimerizace receptoru, stimulace vlastní aktivity proteintyrosinkinasy a transfosforylace receptoru. Tímto mechanismem jsou vytvořena vazebná místa pro intracelulární signální transdukční molekuly, což vede ke vzniku komplexů s celou řadou cytoplazmatických signálních molekul, které zabezpečují příslušnou buněčnou odpověď (například dělení buněk, diferenciaci, metabolické účinky, změny v extracelulárním mikroprostředí - Schlessinger a Ullrich, 1992, Neuron 9: 1 - 20.
Proteiny s SH2 (src homologie -2) nebo fosfotyrosinovými vazebnými doménami (phosphotyrosine binding domains PTB) váží aktivované tyrosinkinasové receptory a jejich substráty s vysokou afinitou a šíří signály do buněk. Obě tyto domény poznávají fosfotyrosin. (SH2: Fantle a kol., 1992, Cell 69: 413 - 423; Songyant a kol., 1994, Mol. Cell. Biol. 14; 2777 - 2785; Songyang a kol., 1993, Cell 72: 767 - 778; a Koch a kol., 1991, Science 252: 668 - 678; Schoelson, Curr. Opin.Chem. Biol.
Φ Φ φφφφ • φ φ φ ·φ · » φφφφφφφ*
ΦΦ» Φ Φ 4·4» φ φ Φ φ Φ Φ «φ 9· · · (1997), 1(2), 227 - 234; Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol. (1997), 7(6), 835 - 838). Bylo identifikováno několik intracelulárních substrátových proteinů, které se spojují s receptorovými tyrosinkinasami (RTK). Ty mohou být rozděleny do dvou základních skupin: (1) substráty, které mají katalytickou doménu; a (2) substráty, které nemají takovou doménu, ale slouží jako přizpůsobovací členy (adaptéry) a spojují se s katalyticky aktivními molekulami (Songyang a kol., Cell 72: 767 - 778). Specifita těchto interakcí mezi receptory nebo proteiny a SH2 nebo PTB doménami jejich substrátů je určená zbytky aminokyselin, které bezprostředně obklopují fosforylovaný tyrosinový zbytek. Například rozdíly ve vazebných afinitách mezi SH2 doménami a sekvencemi aminokyselin kolem fosfotyrosinových zbytků u určitých receptorů korelujů s pozorovanými rozdíly u jejich substrátových profilů, které jsou fosforylovány. (Songyang a kol., 1993, Cell 72: 767 - 778). Pozorování naznačují, že funkce každé receptorové tyrosinkinasy není určena pouze jejím vzorcem exprese a dostupností ligandu, ale také uspořádáním ve směru drah signální transdukce, že jsou aktivovány určitým receptorem a rovněž načasováním a trváním těchto podnětů. Fosforylace poskytuje důležitý regulační krok, který určuje selektivitu signálních drah, regulace je dále doplněna receptory specifických růstových faktorů a rovněž diferenciačními faktorovými receptory.
Předpokládá se, že několik receptorových tyrosinkinas a růstových faktorů, které se na ně váží, hraje úlohu při angiogenezi, ačkoliv některé mohou podporovat angiogenezi nepřímo (Mustonen a Alitalo, J. Cell Biol. 129: 895 - 898, 1995). Jednou takovou receptorovou tyrosinkinasou, známou jako „fetální jaterní kinasa 1 (fetal liver kinase FLK-1), která patří k III typu podskupiny RTK. Alternativní označení pro lidskou FLK-1 je „kinasa s vloženou doménou obsahující receptor („kinase insert domain-containing toto · · · · • · · · • to · · ♦ to · · · · · • · · · · · ··· · · · · to receptor) (KDR) (Terman a kol., Oncogene 6: 1677-83,
1991). Dalším alternativním označením pro FLK-l/KDR je „receptor vaskulárního endoteliální buněčného růstového faktoru 2 (VEGFR-2), neboť váže VEGF s vysokou afinitou. Myší verze FLK-1/VEGFR-2 byla také nazvána NYK (Oelrichs a kol., Oncogene 8(1): 11 - 15, 1993). Byly izolovány DNA kódující myší, krysí a lidskou FLK-1 a byly popsány nukleotidy a kódující sekvence aminokyselin (Matthews a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 9026 - 30, 1991;
Terman a kol., výše, Terman a kol., Biochem.Biophys. Res.
Comm. 187: 1579 - 86, 1992; Sarzani a kol., výše; a Millauer a kol., Cell 72: 835 - 846, 1993). Četné studie stejně jak ty uvedené v Millauer a kol., výše, předpokládají, že VEGF a FLK-1/KDR/VEGFR-2 jsou ligandreceptorový pár, který hraje důležitou úlohu při proliferaci vaskulárních endoteliálních buněk a utváření a „pučení krevních cév, tyto procesy jsou nazývány vaskulogeneze a angiogeneze.
Dalším typem III podtřídy RTK je „fms podobná tyrosinkinasa-1 (Flt-1), která je podobá FLK-l/KDR (De Vries a kol., Science 255; 989-991, 1992; Shibuya a kol., Oncogene 5: 519 - 524, 1990). Alternativní označení pro flt-1 je „receptor vaskulárního endoteliální buněčného růstového faktoru 1 (VEGFR-1). Do současné doby bylo zjištěno, že jednotlivé členy podčeledi FLK-1/KDR/VEGFR-2 a flt-l/VEGFR-1 mají vliv zejména na endoteliální buňky. Tyto členy podtřídy jsou specificky stimulovány vaskulárními endoteliálními buněčnými růstovými faktory (VEGF) patřícími do třídy ligandu (Klagsburn a D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7: 259 - 270, 1996). Vaskulární endotheliální buněčný růstový faktor (VEGF) se váže k Flt-1 s vyšší afinitou než k FLK-l/KDR a je mitogenní vůči vaskulárním endoteliálním buňkám (Terman a kol., 1992, viz výše; Mustonen a kol., viz výše; De Vries a kol., viz · ···♦ • · · · · 9 99 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 99 · 9 » 9 9 výše). Věří se, že Flt-1 je nezbytný pro vaskulárni uspořádání během vaskulárního vývoje. Exprese Flt-1 je spojována s počátečním vaskulárním vývojem myších embryi a neovaskularizací během hojení ran (Mustonen a Alitalo, viz výše). Exprese flt-1 v orgánech dospělých, jako jsou ledvinové glomeruly, naznačuje další funkci tohoto receptoru, která nemá vztah k buněčnému růstu (Mustonen a Alitalo, viz výše).
Jak bylo uvedeno dříve, nedávný důkaz naznačuje, že VEGF hraje úlohu při stimulaci jak normální tak i patologické angiogeneze (Jakeman a kol., Endocrinology 133; 848 - 859, 1993; Kolch a kol. Breast Cancer Research and Treatment 36: 139 - 155, 1995; Ferrara a kol., Endocrine Reviews 18(1); 4 - 25, 1997; Ferrara a kol., Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg a E. M. Rosen), 209 - 232, 1997). Kromě toho VEGF má svou roli při kontrole a zvýšení vaskulárni permeability (Connoly a kol., J. Biol. Chem. 264: 20017 - 20024, 1989; Brown a kol. Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg a E. M. Rosen), 233 - 269, 1997).
Byla popsány rozdílné formy VEGF, které vznikají při alternativním splétání mRNA, mezi ně patří i 4 druhy popsané ve Ferrara a kol. (J. Cell. Biochem. 47: 211 -218, 1991). Jak vylučované tak převážně na buňky vázané druhy VEGF identifikoval Ferrara a kol., viz výše, a je známo, že protein existuje ve formě dimerů spojených disulfidovým můstkem.
Nedávno bylo identifikováno několik příbuzných homologů VEGF. Avšak jejich role v obvyklém fyziologickém procesu a v průběhu nemoci nebyla dosud objasněna. Kromě toho jsou příslušníci skupiny VEGF často koexprimováni společně s VEGF v mnoha tkáních a jsou obecně schopni vytvářet heterodimery s VEGF. Tato vlastnost pravděpodobně
9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 9·
9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 · · · · · · 9 mění specifitu receptoru a biologické účinky heterodimerů a dále komplikuje objasnění jejich specifických funkcí, jak je vysvětleno níže (Korpelainen a Alitalo, Curr. Opin. Cell Biol., 159 - 164, 1998).
Placentární růstový faktor (P1GF) má sekvenci aminokyselin, která vykazuje významnou homologii se sekvencí VEGF (Park a kol., J. Biol. Chem. 269: 25646 -54, 1994; Maglione a kol., Oncogene 8: 925 - 31, 1993). Stejně ► jako u VEGF vznikají rozdílné druhy P1GF z alternativního splétání mRNA a protein existuje v dimerní formě (Park a kol., viz výše). P1GF-1 a P1GF-2 se váží na Flt-1 s vysokou afinitou a P1GF-2 se také aktivně váže na neuropilin-1 (Migdal a kol., J. Biol. Chem. 273 (35): 22272 - 22278), ale žádný se neváže na FLK-l/KDR (Park a kol., viz výše). Bylo popsáno, že P1GF zvyšuje jak vaskulární permeabilitu, tak i mitogenní účinek VEGF na endoteliální buňky za přítomnosti nízkých koncentrací VEGF (údajně z důvodu heterodimerního utváření) (Park a kol. viz výše).
VEGF-B je produkován ve dvou isoformách (167 a 185 zbytků) a také se zdá, že se váže na Flt-l/VEGFR-1. VEGF-B může hrát úlohu při regulaci odbourávání extracelulární matrice, při buněčné adhezi, migraci během modulace exprese, může mít význam pro aktivitu plasminogenového aktivátoru urokinasového typu a pro inhibitor 1 plasminogenového aktivátoru (Pepper a kol., Proč. Nati.
r Acad. Sci. USA. (1998), 95(20): 11709 - 11714).
VEGF-C byl původně klonován jako ligand pro VEGFR3/Flt-4, který je především produkován lymfatickými endoteliálními buňkami. V této úplně procesní formě se VEGF-C může také vázat na KDR/VEGFR-2 a stimuluje v modelových příkladech proliferaci a migraci endoteliálních buněk in vitro a angiogenezi in vivo (Lymboussaki a kol., Am. J. Pathol. (1998), 153(2):
«··« • · • · t··*
395 - 403; Witzenbichler a kol., Am. J. Pathol. (1998), 153(2), 381 - 394). Přílišná exprese VEGF-C zapříčiňuje proliferaci a zvětšení lymfatických cév, zatímco krevní cévy neovlivňuje. Na rozdíl od exprese VEGF není exprese VEGF-C vyvolána hypoxií (Ristimaki a kol., J. Biol. Chem. (1998), 273(14), 8413 - 8418).
V poslední době objevený VEGF-D je strukturálně velmi podobný VEGF-C. Je popsáno, že VEGF-D se váže a aktivuje nejméně dva VEGFR, VEGFR-3/Flt-4 a KDR/VEGFR-2. Původně byl klonován jako a c-fos indukovatelný mitogen pro fibroblasty a je nejvíce produkován v mezenchymálních buňkách plic a kůže (Achen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1998), 95(2), 548 - 553 a odkazy zde obsažené).
Bylo zjištěno, že VEGF-C a VEGF-D indukují zvýšení vaskulární permeability in vivo při Milesově zkoušce po injektáži do kožní tkáně (PCT/US97/14696; WO 98/07832, Witzenbichler a kol., viz výše). Fyziologická úloha a význam těchto ligandů při modulování vaskulární hyperpermeability a pro endoteliálni odezvy v tkáních, kde jsou produkovány, zůstává nevyjasněna.
Na základě objevování dalších homologů VEGF a VEGFR a zákonitostí pro heterodimerizaci ligandů a receptorů se předpokládá, že působením takových homologů VEGF se mohou vytvářet ligandní heterodimery VEGF a/nebo může docházet k heterodimerizaci receptorů nebo vazbě na dosud neobjevené VEGFR (Witzenbichler a kol., viz výše). Nedávno publikované články naznačují, že možná neuropilin-1 (Migdal a kol., viz výše) nebo VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler a kol., viz výše) a receptory jiné než KDR/VEGFR-2 jsou odpovědné za indukci vaskulární permeability (Stacker, S. A., Vítali, A., Domagala, T., Nice, E. a Wilks, A. F., „Angiogenesis and Cancer Conference, Amer. Assoc. Cancer Res., leden 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetelogia 40: S118-120(1997 ) .
·· ··«« «φ φφφφ φφ • φφφ φφφφ φ · φ φ φ . φ φ φ ΦΦΦΦ· φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ·· φ ♦ · ·· ·
Vývoj sloučenin pro modulaci PTK
Vzhledem k předpokládané důležitosti PTK pro řízení, regulaci a modulaci proliferace buněk a rovněž pro léčbu onemocnění a zdravotních poruch spojených s abnormální proliferací buněk bylo provedeno mnoho pokusů identifikovat inhibitory receptorové a nereceptorové tyrosinkinasy. Byla použita řada přístupů včetně použití mutantních ligandů (U.S. přihláška č. 4 966 849), rozpustných receptoru a protilátek (přihláška WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 10705 - 09; Kim a kol. 1993, Nátuře 362: 841 - 844), RNA ligandů (Jellinek a kol., Biochemistry 33: 10450 - 56; Takano a kol., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella a kol., 1992, Exp. Cell Res. 199: 56 - 62; Wright a kol., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448 - 57) a inhibitorů tyrosinkinasy (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 94/14808; US patent č. 5 330 992; Mariani a kol., 1994, Proč. Am. Assoc. Cancer Res. 35: 2268).
V nedávné době byly dělány pokusy, jejichž snahou bylo identifikovat malé molekuly, které působí jako inhibitory tyrosinkinas. Například bis(monocyklické, bicyklické, nebo heterocyklické) arylové sloučeniny (PCT WO 92/20642) a deriváty vinylen-azaindolu (PCT WO 94/14808) byly obecně popsány jako inhibitory tyrosinkinas. Styrylové sloučeniny (US patent č. 5 217 999), pyridylové sloučeniny substituované styrylem (US patent č. 5 302 606), určité deriváty chinazolinu (EP přihláška č. 0 566 266 Al); Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8(4): 475 - 478, selenoindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylové sloučeniny (PCT WO 92/21660) a sloučeniny kyseliny benzylfosfonové (PCT WO 91/15495) byly popsány pro použití jako inhibitory tyrosinkinas při léčbě rakoviny. Anilinocinnoliny (PCT WO 97/34876), deriváty sloučenin chinazolinu (PCT WO 97/22596; PCT WO 97/42187), byly • ·
- -10 popsány jako inhibitory angiogeneze a vaskulárni permeability.
Dále byly prováděny pokusy za účelem identifikace malých molekul, které působí jako inhibitory serin/ threoninkinas. Zejména bylo uvedeno, že sloučeniny bis(indolylmaleimidu) inhibují jednotlivé isoformy PKC serin/threoninkinas, jejichž dysfunkce je spojována se změněnou vaskulárni permeability u nemocí majících vztah k VEGF (PCT WO 97/40830; PCT WO 97/40831).
Je proto žádoucí identifikace účinných makromolekul a malých organických sloučenin, které specificky inhibují tyrosinovou signální transdukci modulováním aktivity receptorových a nereceptorových tyrosinkinas z důvodu regulace a modulace abnormálních nebo nevhodných buněčných funkcí, proliferace buněk nebo diferenciace.
Zejména by byla žádoucí identifikace metod a sloučenin specificky inhibujících funkci tyrosinkinas, které jsou nezbytné pro vznik vaskulárni hyperpermeability vedoucí k edému, efúzím, exudátům a makromolekulárním extravasacím (výronům) a depozicím a rovněž s tím souvisejícím zdravotním poruchám.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je použití sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulárni hyperpermeability.
Z výše uvedeného předmětu je zřejmé, že cílem tohoto vynálezu je zabránit vzniku vaskulárni hyperpermeability pomocí inhibice buněčné signální funkce KDR tyrosinkinas.
♦ · ·
- 10a
Tento vynález také umožňuje dosáhnout způsob inhibice vaskulárni hyperpermeability pomoci selektivního rušení katalytické kinasové odezvy KDR/VEGFR-2 bez významného ovlivnění aktivity Flt-1/VEGFR1 nebo jiných tyrosinkinas. Přípravky fungující tímto způsobem jsou zřetelně farmakologicky výhodnější oproti běžným léčebným přístupům, které využívají látky, jako jsou steroidy, které «4 ··♦· •4 ··«·
4 · · 444
- ií ·««··* · · · ·♦ « 9 jsou náchylné k četným nežádoucím vedlejším účinkům.
Použité metody podle tohoto vynálezu jsou také výhodné z hlediska použití méně specifických inhibitorů kinas, včetně těch, které inhibují násobné receptory VEGF, protože tyto způsoby nebudou přímo rušit důležité běžné fyziologické funkce jiných kinas. Jako důsledek inhibice hyperpermeability vaskulárního endotelu potlačením tyrosinkinasové aktivity KDR jsou také inhibovány následně vznikající edém, s tím spojená diapedéza, změny v transendoteliálni výměně, výrony, exudáty a efúze. Protože posledně zmiňované projevy často vedou k nadměrnému ukládání matrice, aberantní stromální proliferaci a poruchám činnosti orgánů, je inhibice KDR tyrosinkinasy také účelná při léčbě mnohých nerakovinných zdravotních poruch, které se vyznačují těmito etiologickými znaky.
Kromě toho vaskulární hypotenze, která může být zapříčiněna vazbou příbuzného aktivačního ligandu VEGF na receptor KDR tyrosinkinasy, je také minimalizována inhibováním aktivity KDR tyrosinkinasy.
Tento vynález také poskytuje terapeutický přístup k zabránění vaskulární hyperpermeability a vzniku edému u jedinců podáváním sloučeniny, která specificky inhibuje aktivitu KDR tyrosinkinasy.
Podrobný popis vynálezu
Tento vynález popisuje způsob inhibice vaskulární hyperpermeability inhibováním buněčné signální funkce KDR tyrosinkinasy. Tento vynález také popisuje způsob inhibice vaskulární hyperpermeability za využití činidel, která selektivně inhibují buněčnou signální funkci KDR.
Identifikací a využitím vysoce selektivních inhibitorů KDR, které účinně blokují signalizaci KDR a následně vaskulární hyperpermeabilitu způsoby podle tohoto vynálezu byla ·
«9 99·· prokázána nezastupitelná role KDR při zprostředkováni vaskulární permeabilitni odezvy na VEGF. Tyto vysoce selektivní inhibitory KDR prokázaly účinnost při modulování vaskulární permeability bez toho, že by inhibovaly funkci vyššího afinitního receptoru VEGFR-l/Flt-1. Tato vlastnost by mohla poskytovat lepší snášenlivost oproti stávajícím léčbám či ošetřením za použití léčiv, které méně selektivně přerušují funkci jiných ne-KDR kinas.
KDR tyrosinkinasa je aktivována, když se vaskulární endoteliální buněčný růstový faktor (VEGF) nebo jiný aktivační ligand (jako je HIV Tat protein, VEGF-C nebo VEGF-D) naváže na receptor KDR tyrosinkinasy, který leží na povrchu vaskulárních endoteliálních buněk. Ačkoliv u KDR nebyly dosud identifikovány přirozeně se kinasu aktivující mutace a deformace, byly popsány u EGFR a Tie-2 receptorových kinas. Proto jsou také očekávány příklady konstitutivní aktivace KDR. KDR tyrosinkinasa může být také označována jako FLK-1 tyrosinkinasa, NYK tyrosinkinasa nebo VEGFR-2 tyrosinkinasa.
Kromě stimulace angiogeneze, endoteliální buněčné migrace a proliferace indukuje VEGF hyperpermeabilitu krevních cév. V důsledku toho mok odtéká z krevního proudu mimo stěny krevních cév do intersticiálních (vmezeřených) prostor a tím vytváří oblasti edému. Tato reakce je často doprovázena diapedézou. Podobně může přílišná vaskulární hyperpermeabilita přerušit normální molekulární výměnu přes endotel v rozhodujících tkáních a orgánech (například plíce a ledviny), a tím zapříčinit poruchy činnosti orgánů, makromolekulární extravazáty a ukládání matrice doprovázené stromální proliferací. V omezených prostorech může edém vést ke snížení funkce orgánu nebo jeho poškození (například mozkový edém).
0« 0004 • 0 ··«·
Buněčná signální funkce KDR může být inhibována mnoha postupy, a to buď blokováním produkce aktivovaného ligandů, blokováním aktivovaného ligandů vazbou na receptor KDR tyrosinkinasy, zabránění dimerizaci a trasfosforylaci receptorů, inhibicí enzynové aktivity KDR tyrosinkinasy (inhibicí fosforylační kapacity enzymu) nebo nějakým jiným mechanismem, který přeruší další přenos signálu (D. Mukhopedhyay a kol., Cancer Res. 58: 1278 - 1284 (1998). Podle zde popsané metody takové postupy, které selektivně přerušují buněčnou signální funkci KDR, budou redukovat vaskulární hyperpermeabilitu a rovněž s tím spojené výrony, následný vznik edémů a ukládáni matrice.
Existuje řada sloučenin, které mají potřebnou KDR tyrosinkinasovou inhibiční vlastnost. Mezi tyto sloučeniny patří protilátky (přičemž zde uvedený pojem zahrnuje protilátky s jednoduchým řetězcem), které se váží na extracelulární KDR receptorovou doménu nebo na buněčnou část enzymu kinasa nebo alternativně váží samotný VEGF. Tyto protilátky interferují s VEGF, který se váže na receptor tyrosinkinasy a/nebo, což je důležité, s buněčnou signální funkcí KDR tyrosinkinasy. Protilátky, které se váží na KDR tyrosinkinasu mohou působit jako antagonisty VEGF nebo obecněji jako aktivátory antogonistů VEGF. Alternativně tyto protilátky mohou blokovat funkční receptor dimerizace nebo mohou být inhibitory KDR tyrosinkinasy. Protilátky, které se váží na VEGF nebo na aktivační ligand, jsou neutralizační protilátky VEGF nebo aktivačního ligandů. Je třeba zmínit, že tyto neutralizační protilátky mohou blokovat odezvy VEGF prostřednictvím jak KDR receptorů tak i Flt-1 receptorů, obvykle jsou specifické pro jednoduché aktivační ligandy. Ve většině případů není nutné ani žádoucí, aby VEGF odezvy byly blokovány prostřednictvím Flt-1 receptorů. Protože bylo popsáno, že VEGFR rozpoznávají odlišné epitopy na VEGF, ·· ·♦ ♦· φ φ
může být dosaženo požadované aktivace specifické blokády KDR za použití protilátek, které se specificky váží na „masku KDR-vazebného epitopu VEGF nebo jiného aktivačního ligandu.
Peptidy a organické molekuly patří mezi další sloučeniny, které mohou inhibovat aktivitu KDR tyrosinkinasy a tím i minimalizovat vaskulárni hyperpermeabilitu a vznik edému. Mezi tyto peptidy patří rozpustné extracelulární domény KDR a vazebné fragmenty KDR. Dalšími užitečnými peptidy jsou mutanty VEGF nebo VEGF-příbuzných růstových faktorů (například VEGF-C, VEGF-D nebo HIV Tat protein nebo z nich složené fúzní proteiny), které se váží a blokují navázání dalšího ligandu k tomuto receptoru, ale nestimulují dimerizaci, aktivaci nebo transfosforylaci KDR tyrosinkinasy. Takové mutanty mohou působit jako monomery nebo nefunkční heterodimery, a tím blokuji navázání nativního dimerického VEFG nebo aktivačního ligandu. Podobně mohou být úspěšně použity jiné peptidy nebo malé molekuly, které blokují dimerizaci receptoru a/nebo aktivaci. Tyto sloučeniny působí také jako antagonisty aktivačních ligandu nebo jsou inhibitory aktivity KDR tyrosinkinasy. Výhodnými sloučeninami jsou malé organické molekuly.
Molekuly, jako jsou KDR-specifické ribozymy, protisměrné polynukleotidy (jako je protisměrná mRNA) nebo intracelulární protilátky s jednoduchým řetězcem (SCFV) , které inhibují biosyntézu nebo řádné působení aktivní a funkční KDR tyrosinkinasy, budou účinně blokovat odezvu na VEGF zprostředkovanou KDR. Tyto molekuly mohou být zavedeny do živých buněk nebo jejich produkce může být indukována intracelulárně (například za použití vhodných adenovirových, retrovirových nebo baculovirových vektorů).
·· 0000 • 0 0 0·· 0 0 0 ······ · 0 • 000 ·· 00 0 00 ·
Výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu inhibují buněčnou signální funkci KDR bez toho, že by významně inhibovaly buněčnou signální funkci Flt-1 (Flt-1 tyrosinkinasa je také označována jako VEGFR-1 tyrosinkinasa). Jak KDR tyrosinkinasa, tak i Flt-1 tyrosinkinasa jsou aktivovány VEGF, který se váže na receptory KDR tyrosikinasy a receptory Flt-1 tyrosinkinasy. Neboť aktivita Flt-1 tyrosinkinasy může zprostředkovat důležité děje v endoteliálním zásobování a vaskulární funkci, inhibice této enzymové aktivity nebo s tím spojených transdukčních signálů by mohla vést k toxickým či nepříznivým účinkům. Přinejmenším je taková inhibice bránící indukci vaskulární hyperpermeability a tvorbě edému nadbytečná, dále je nákladná a nemá smysl pro pacienta. Výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou unikátní, neboť inhibují aktivitu jednoho VEGF receptorů tyrosinkinasy (KDR), který je aktivován aktivačními ligandy, ale neinhibuje jiné receptory tyrosinkinas, jako je Flt-1, který je také aktivován určitými aktivačními ligandy. Nejvýhodnějšími sloučeninami podle tohoto vynálezu jsou sloučeniny^ které mají selektivní inhibiční aktivitu vůči tyrosinkinasám.
Je známo, že VEGF má vliv na vaskulární hyperpermeabilitu a vznik edému. VEGF je produkován zánětlivými T-buňkami, makrofágy, neutrofily a eozinofily atd. v místech zánětu. Tvorba tohoto faktoru je rychle řízena hypoxií, určitými vasopresními hormony, růstovými faktory, pohlavními hormony a četnými zánětlivými cytokiny. Zdá se, že vaskulární hyperpermeabilita a edém, které jsou spojovány s expresí nebo podávání mnoha jiných růstových faktorů, jsou zprostředkovány prostřednictvím produkce VEGF. Vaskulární hyperpermeabilita a s ní spojený edém, změněná transendoteliální výměna a makromolekulám! výron, který je často doprovázen diapedézouf mohou mít za následek • Φ «φφφ • · φφφ· nadměrné ukládání matrice, aberační stromální proliferaci, fibrózu atd. Z tohoto důvodu může mít hypermeabilita zprostředkovaná VEGF značný vliv na zdravotní poruchy s těmito etiologickými znaky. Například:
1) Hladina VEGF je značně zvýšeny v pokožce, která je poškozená lupénkou. Tento faktor silně stimuluje proliferaci kožních endoteliálních buněk a mikrovaskulární hyperpermeabilitu spojenou s lupénkou.
2) Následkem popálenin a silných opařenin jsou často poškozeny důležité orgány. Zdá se, že důsledky se projevují neřízenou „mediátořovou poruchou, která je způsobena poškozením ischemické r.eperfuze, zduřením a otokem viscerálních tkání, t.j. poškozením endoteliálních buněk. U postižených popáleninami je inhalační poranění jednou z primárních příčin úmrtnosti. Tracheobronchiální epitel se odloupává a spojuje se s exudátem bohatým na proteiny za vzniku útvarů v dýchacích cestách, které mohou vést k ucpání dýchacích cest. Kombinace inhalačních popálenin a hypoxie (nedostatečný přívod kyslíku), a následné vystavení vysokým koncentracím kyslíku ve snaze pomoci pacientovi, může vést ke zhoršení situace, jejíž příčinou jsou postupující změny v plících, jako je vznik difuzních výpotků, krvácení do průdušnice a edemické změny ve stěně krevních cév. U pacientů s popáleninami a četnými úrazy dramaticky roste koncentrace VEGF v oběhovém systému (nárůst až 20-násobný) a VEGF tak může být primárním mediátořem těchto komplikací (Grád a kol., Clin. Chem. Lab. Med. 36: 379 - 383, 1998).
3) Popáleniny od slunce jsou také spojovány s tvorbou edému. Je známo, že produkce VEGF je řízena po expozici UV záření. Mezi další zdravotní poruchy kůže, při kterých se tvoří edém, patří: zpuchýřující symptomatický erytém (akrodýnie), perzistentní akrodem, puchýřové poškození, φ φ
ΦΦΦΦ φ φφφφφ φφφ φφφ φφφ φ φ ·ΦΦ·Φ· φφ φ φφ φ jako je multiformní erytém, puchýřový pemfigoid a herpetiformni dermatitida (t.j. při stavech akutních nebo chronických zánětů). Edemické skvrny a trudovina růžovitá (rosacea) a s ní spojená telangiektázie patří mezi další zdravotní poruchy, u kterých se projevuje edém.
4) Zvýšená mikrovaskulární permeabilita a edém jsou společné charakteristické vlastnosti zánětlivých a neoplastických poruch. Mozkové nádory, jako jsou gliomy, ve kterých se tvoří tumorální a peritumorální mozkový edém a cysty naplněné tekutinou, a meningiomy doprovázené masivním mozkovým edémem jsou příklady takových zdravotních poruch.
S těmito poruchami jsou spojeny lokálně vysoké hladiny VEGF. Indukce zhoubné ascitní tekutiny a nádorové efúze (zejména zhoubné pleurální a perikardiální efúze) jsou dalšími příklady zdravotních poruch, při kterých je tvořen edém, a je známo, že tyto děje zahrnují produkci VEGF. Dále edém po poranění hlavy může způsobovat poruchy a snížení mozkových funkcí. Podobně se v případě komunikujícího hydrocefalu ukázalo, že zahrnuje cytokiny, jako je IGF-1 a TGF-βΙ, o kterých je známo, že moduluji produkci VEGF.
5) K tvorbě edému dochází i v některých příkladech chronických zánětů, jako je tvorba nazálních polypů, uterinních-cervikálních polypů a žaludečních hyperplastických polypů. V takových případech bylo dokázáno, že zánětlivé buňky hrají důležitou úlohu při vývoji těchto edemických stavů, přinejmenším při produkci VEGF.
6) Cytokiny aktivované eozinofily mohou být důležitým zdrojem VEGF a tímto se podílí na vzniku tkáňových edémů v místech alergických zánětů. Edém a exudáty jsou běžné komplikace, ke kterým dochází v průběhu alergických a zpožděných hypersenzitivních reakcích; (do této skupiny patří také často anafylaxie). VEGF se zvláště podílí na ·· ···· • «···· ··· • · · ··· · ···· ·· ·· · ·· ♦ těch reakcích, které nejsou odezvou na antihistaminika nebo aspirin, jeho regulace byla zkoumána v případech otravy břečťanem a při kontaktní dermatitidě. Dále tuberkulóza, určité virové infekce, angioedém, kopřivka, pohybem indukovaná anafylaxie jsou příklady takových alergických a zpožděných hypersenzitivních reakcí, do těchto reakcí může být také zapojen VEGF. Edém se také často tvoří v důsledku citlivosti k lékům nebo v důsledku hypersenzitivních reakcí nebo v odezvě na podávání růstového faktoru regulujícího VEGF nebo cytokinů (například IGF-1, FGF-2 nebo IL-2). Radioanafylaxie a radiodermatitida jsou spojovány s vaskulární hyperpermeabilitou.
7) VEGF je zapojen do okulární neovaskularizace vedoucí k diabetické retinopatii, mikroangiopatii, stařecké slepotě z důvodu makulární degenerace, neonatální slepoty z důvodu hyperoxického působení. V mnoha případech makulární nebo jiný okulární edém předchází stavům popsaným v bodě 7. VEGF byl identifikován jako prvotní mediátor neovaskularizace duhovky, rohovky a sítnice v případech okulární ischémie a vaskulárního edému. Vaskulární hyperpermeabilita indukovaná VEGF přispívá k rozpadu hematoretinální bariéry v celé řadě okulárních poruch s výrony a ukládáním matrice vytváří základy pro následnou angiogenezi. Po chemických popáleninách, korneálních zánětech a edému dochází ke korneální neovaskularizaci. Nedávno bylo dokázáno, že VEGF se podílí na procesech po poranění oka. Cheletační činidlo železa deferoxamin bylo použito v klinických testech pro léčbu rakoviny u pacientů. Avšak tato léčba často vyvolává skvrnitý edém. Při koncentracích chelatačního činidla železa u pacientů je indukován tři až 5-násobný nárůst exprese mRNA-VEGF u všech studovaných normálních a nádorových buněčných linií a VEGF se pravděpodobně účastni těchto procesů jako mediátor tvorby edému. Zvýšené intraokulární tlaky způsobené nadprodukcí VEGF a edém mohou ·· ···>* • · · · · « · · · ··· ··· ·· ······ ·· · · ♦ · vést k nevhodnému ukládáni matrice, okulárním deformacím, změnám v papile zrakového nervu, poruchám v poli vidění a může docházet k zelenému očnímu zákalu. Vaskulární hyperpermeabilita je také často spojována se zánětem očních spojivek.
8) Chronická onemocnění plic u novorozenců a dospělých mají příčinu jak v poškození plic, tak i v neadekvátních opravných procesech. Produkce VEGF byla popsána v několika modelových pokusech se zvířaty, při kterých bylo sledováno poškození plic. Destrukce plicních endoteliálních buněk je také charakteristická vlastnost hyperoxického poškození plic. Během uzdravování po hyperoxii je VEGF řízen alveolárním typem buněk II a později způsobuje proliferaci a regeneraci plicních endoteliálních buněk. Avšak tento výsledek může způsobit přerušení výměny přes plicní endotel a plicní edém. Při astmatu a zánětu průdušek dochází k bronchiální vaskulární dilataci, vaskulárnímu překrvení, edému bronchiálních stěn a exudátům, což má za následek zbytnění sliznice dýchacích cest a zúžení bronchiálního průchodu. Při těchto dějích dochází nejen k edému, ale i k exudátům proteinů a aberantnímu stromálnímu růstu. Při podobných procesech dochází k tvorbě plicního edému během syndromu respirační úzkosti u dospělých. Mezi příčiny syndromu respirační úzkosti u dospělých obvykle patří zápal plic, vdechování škodlivých látek, pohmoždění plic, stavy blízké utonutí a vdechnutí zvratků.
9) Kortikosteroidy, jako je kortizon, hydrokortizon, dexamethazon nebo prednisolon, patří mezi nejpoužívanější léčebné přípravky pro léčbu edemických stavů a jsou silnými inhibitory exprese VEGF. V současné době se věří, že tato vlastnost významně přispívá k dobře známému antiedemickému působení těchto steroidů. Avšak jejich různorodé biologické aktivity jsou také zodpovědné za nežádoucí vedlejší účinky těchto léčebných přípravků. Steroidní hormony, jejich ··
9
9 ·· ·· • · ·
9 agonisty a antagonisty také dramaticky ovlivňují produkci VEGF, zejména v reprodučních tkáních. K endometritidě a endometrióze může docházet během těhotenství, menstruačního cyklu a léčby pohlavními hormony. Otoky a menstruační křeče jsou spojovány s vaskulární hyperpermeabilitou. Tamaxifen je činidlo, které snižuje nebezpečí rakoviny prsu, ale také zvyšuje proliferaci děložních buněk a výskyt nádorů. Bylo dokázáno, že tento steroidní analog a rovněž estradiol způsobují děložní edém a proliferaci buněk, které zahrnují místní nárůst produkce VEGF. Syndrom hyperstimulace vaječníků je vážnou komplikací ovlivňující vyvolání ovulace. Nej silnějšími projevy tohoto syndromu je masivní zvětšení vaječníků, vícenásobné cysty, ascites, hemokoncentrace a akumulace tekutiny ve třetím prostoru. Předpokládá se, že zvýšená kapilární permeabilita vyvolaná uvolněním VEGF z luteinizovaných buněk membrány granulosy vaječníků a následná stimulace lidským gonadotropinem hraje klíčovou roli u těchto syndromů. Bylo ukázáno, že VEGF je nadměrně produkován v hyperthekotickém vaječníkovém stromatu polycystických ovárií u Stein-Leventhalova syndromu.
10) Byla demonstrována rychlá diferenční indukce exprese VEGF genu v jak neuronových, tak i piálních buňkách po dočasné okluzi střední mozkové tepny u modelu zvířat, přičemž byl sledován průběh mrtvice u těchto jedinců. VEGF může také přispět k léčbě mozkových buněk po ischemickém poškození (mrtvice, poranění hlavy, mozkový infarkt) potenciováním neovaskularizace, ale poškození mozku se také může opět zhoršit průvodním vytvořením edému mozku. Také malárie může vyvolat edém v důsledku mozkové hypoxie indukované VEGF. Mozkový nádor a s tím spojený mozkový edém a cysty naplněné kapalinou vznikají z toho důvodu, že nádorovým kapilárám chybí běžná hematoencefalická bariéra. VEGF produkovaný in šitu buňkami gliomu nejpravděpodobněji • ♦
·· <··· • · 9 • re « · · odpovídá za patognomonicko-histopatologické a klinické rysy glioblastomových nádorů u pacientů a také za nárůst mozkového edému. Syndrom karpálního tunelu je doprovázen zvýšenou nervovou hydratací a často následným zvýšením ukládání extracelulární matrice (záchytná neuropathie). Zvýšení koncentrace VEGF k tkáních, které obalují nerv, může způsobit zachycení nervu v perineurálních tkáních z důvodu vyvolání vaskulární permeability, odtékání kapaliny a stromálního ukládání.
11) Produkce VEGF v tkáních je dramaticky řízena v odezvě na hypoxii (nedostatečný přívod kyslíku). Proto jsou prováděna pozorování, že v oblastech nekróz, ischémií, infarktů, okluzí, anémií, oběhových poruch nebo jiných případů s nedostatečným přívodem kyslíku je zvýšená koncentrace VEGF, je indukována vaskulární hyperpermeabilita a běžně dochází k edémům a výronům. Nižší tlak kyslíku, který je odpovědný za „vysokohorskou nemoc, vyvolává rychlou produkci VEGF, která pravděpodobně způsobuje ohrožení života mozkovým a plicním edémem (HÁCE a HAPE). K této „nemoci může docházet u neaklimatizovaných osob.
12) Při zvýšené produkci VEGF rovněž dochází k perikardiálním a pleurálním efúzím z důvodu vaskulární hyperpermeability, která je způsobena radiačním poškozením, revmatickými poruchami, sžíravým vředem (lupus), infarktem myokardu, traumaty a reakcí na exogenní cizorodé látky. Proto zvýšená produkce VEGF spojovaná s perikardiálními a pleurálními efúzemí je běžně pozorována při pitvě pacientů s karcinony plic a prsu, lymfomy a leukémiemi. Množství VEGF je také významně zvýšeno v synoviální tekutině z oteklých kloubů u jedinců s revmatickou arthritidou. Podvrknutí a zlomeniny, ačkoliv jsou spojovány s některými otoky a vaskulární hyperpermeabilitou, která je užitečná pro svou podporu angiogeneze a uzdravování, mohou být
9999 · · • · • · 9
9 • 9 9
9 9 9 9 • 9 9999 > 9 9 9 9
9999 99 99 9 doprovázeny bolestivým, nadměrným a nežádoucím edémem. Podobně se předpokládá, že VEGF je zapojen do stavů, jako je synovitida nebo poškození menisku s efúzí („voda v koleně).
13) Zvředovatění spojené s oběhovými omezeními (například dekubitální, gravitační a varikózní vředy) jsou také často doprovázeny edémem a proteinovými exudáty. Diabetické komplikace často vznikají v důsledku zvýšené koncentrace glukózy v oběhovém systému (hyperglykémie) a tvorby složitých konečných produktů cukrů (advanced glycation endproducts - AGE). Tyto komplikace jsou často doprovázeny sníženým oběhem. Je známo, že tyto stavy buď samotné nebo v kombinaci stimulují produkci VEGF a proto vaskulární hyperpermeabilita může vést k mnoha diabetickým komplikacím.
14) Z důvodů významné konstitutivní produkce endogenního VEGF ledvinovými podocyty a známých účinků vaskulární hyperpermeability při zvýšené koncentraci VEGF může docházet ke zdravotním poruchám ledvin, jako je mikroalbuminurie, proteinurie, oligurie, elektrolytická nerovnováha (často označována jako diabetické komplikace), nefrotický syndrom (zejména v případě hypoxie vyvoláné popáleninami, šokem nebo traumatem). Tyto poruchy ledvin mohou být léčeny způsobem podle tohoto vynálezu.
15) Proteinové výrony a diapedéza, která běžně doprovází edém, vedou k nadměrnému ukládání matrice a stromální proliferaci. Tyto poruchy přispívají k vývoji jiných zdravotních poruch, jako je syndrom hyperviskozity, cirhóza jater, fibrózy keloidy a vznik nežádoucích jizev. Inhibice hyperpermeability zprostředkované VEGF bude bránit progresi takových zdravotních poruch.
16) Je známo, že významné množství isoforem VEGF je uloženo v destičkách, žírných buňkách a extracelulárních matricích.
• · ··· · · · • · · · · · · · · 0 ··· ··· · · · ···· ·· ·· · ·· 999
Za určitých okolností mohou být tyto zásoby VEGF/VPF okamžitě uvolněny, a tím mohou přispět k akutní vaskulární hyperpermeabilitě.
Z těchto rozdílných příkladů je zřejmé, že k edému dochází za různých fyziologických podmínek a VEGF/VPF nebo příbuzné analogy se silně zapojují do tvorby edému a výronů. Sloučeniny podle tohoto vynálezu minimalizuji edemické stavy spojené se skvrnitým edémem, afakickým/pseudoafakickým cystoidním skvrnitým edémem, retinoblastem, zrakovou ischémií, zánětlivými onemocněními nebo infekcemi očí, choroidálním melanomem, edemickými vedlejšími účinky vyvolaných cheletační železitou terapií, plicním edémem, pleurálními efúzemi, perikardiálními efúzemi, infarktem myokardu, revmatickými onemocněními, tkáňovým edémem v místech poranění nebo alergickým zánětem, polypovým edémem v místech chronického zánětu, cerebrálním edémem, mozkovým tumorem a cystami naplněnými tekutinou, komunikujícím hydrocefalem, edémem spojeným s poškozením orgánů následkem popálenin a edémem vzniklým inhalačním popálením. Sloučeniny podle tohoto vynálezu také minimalizuji edemické stavy spojené s popáleninami kůže, puchýři, multiformním erytémem, endemickými skvrnami a jinými poruchami kůže, mozkovým nádory, vodnatelností břišní a různými efúzemi spojenými s karcinomy, syndromem karpálního tunelu, vysokohorskou „nemocí, alergiemi a hypersenzitivními reakcemi, radioanafylaxí, radiodermatitidou, zeleným zákalem očí, zánětem očních spojivek, syndromem respirační úzkosti u dospělých, astmatem, bronchitidou, syndromem hyperstimulace vaječníků, polycistickým syndromem vaječníků, menstruačními otoky a křečemi, mrtvicí, poraněním hlavy, cerebrálním infarktem nebo okluzemi, zvředovatěním, podvrknutími, zlomeninami, efúzemi spojenými se synovitidou, diabetickými komplikacemi, cirhózou jater a podáváním růstových faktorů.
• · ···♦
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být také použity pro léčbu mikroalbuminurie, proteinurie, oligurie, elektrolytické nerovnováhy, nefrotického syndromu, syndromu hyperviskozity, exudátů, fibróz, keloidů a proti vzniku nežádoucích jizev.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány s jedním či více farmaceutickými přípravky, které inhibují nebo braní produkci VEGF, tlumí intracelularní odezvy vůči VEFG, inhibují vaskulárni hyperpermeabilitu, redukují záněty a inhibují nebo brání vzniku edému. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány před, následně nebo současně s dalšími farmaceutickými prostředky (kterýkoliv způsob podávání je vhodný). Další farmaceutické přípravky zahrnují ale nejsou omezeny na antiedemické steroidy, NSAIDS, ras inhibitory, anti- TNF činidla, anti-ILl činidla, antihistaminika, PAF-antagonisty, COX-1 inhibitory, COX-2 inhibitory, inhibitory NO synthasy, PKC inhibitory a inhibitory PI3 kinasy. Sloučeniny podle tohoto vynálezu a další farmaceutická činidla působí buď doplňkově nebo synergicky. Podávání takových kombinací látek, které inhibují vaskulárni hyperpermeabilitu a/nebo inhibují tvorbu edému může poskytnout větší úlevu od škodlivých účinků vaskulárni hyperpermeability nebo edému oproti podávaní kterékoliv látky samostatně.
Protože edém často vzniká výronem tekutiny z krevního oběhu, současně dochází i ke snížení tlaku (hypotenze). K hypotenzi také dochází v důsledku vazby VEGF nebo aktivátoru VEGF na receptory VEGF umístěné na povrchu vaskulárních endoteliálních buněk. Jeví se, že sloučeniny podle tohoto vynálezu minimalizují vznik hypotenze inhibicí buněčné signální funkce KDR, což je důsledek navázání VEGF (nebo jiného aktivačního ligandu) na příslušný receptor. Sloučeniny podle tohoto vynálezu inhibují po podání hypotenzi u léčených pacientů.
- 25 Farmaceutické kompozice
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány lidskému pacientovi jako takové nebo ve farmaceutických kompozicích, kde jsou smíchány s vhodnými nosiči nebo pomocnou látkou/pomocnými látkami v dávkách pro léčení nebo zlepšení vaskulární hyperpermeability, edému a spojených chorob. Směsi těchto sloučeni mohou být také podávány pacientovi jako jednoduché směsi nebo ve vhodně formulovaných farmaceutických kompozicích. Terapeuticky aktivní dávka dále označuje množství sloučeniny nebo sloučenin schopných působeni při prevenci edému, VEGFasociaované hyperpermeability a/nebo s VEGF-spojené progresi hypotenze. Způsoby přípravy a podávání sloučenin podle této přihlášky mohou být nalezeny v publikaci „Remington's Pharameutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, poslední vydání.
Způsoby (cesty) podávání
Vhodné způsoby podávání mohou například zahrnovat orální způsob, pomocí očních kapek, rektální, transmukosální, topický nebo transtestinální způsob podávání; parenterální dodávání včetně intramuskulární, subkutánní, intramedulární (nitromíšní) injekce, stejně jako intratekální, přímá intraventrikulární, intravenózní, intraperitoneální, intranazální nebo intraokulární injekce.
Alternativně je možno podávat tyto sloučeniny spíše lokálním než systemickým způsobem, například pomocí injekce sloučeniny přímo do místa edému, často jako depot nebo forma s postupným uvolňováním.
• ··· · · · · · • · · · · · · · ······ ·· · · · ·
Kromě toho lze dále podávat léčivo v cíleném podávacím systému, například v liposomu potaženém endotheliální buněčně specifickou protilátkou.
Kompozice/formulace
Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být vyráběny způsobem , který je sám o sobě známý, například pomocí běžného míchání, rozpouštění, granulace, výroby dražé, rozmělnění, emulgace, zapouzdření, zabalení nebo lyofilizační procedurou.
Farmaceutické kompozice pro použití podle tohoto vynálezu tak mohou být připraveny obvyklým způsobem za použití jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů zahrnujících vehikula a pomocné látky, které usnadňují zpracování aktivních látek na přípravky, které mohou být použity farmaceuticky. Vhodnost kompozice je závislá na zvoleném způsobu podávání.
Pro injekce lze z účinných látek podle vynálezu vytvořit vodné roztoky, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, jako je Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo fyziologický solný roztok. Pro transmukosální podávání se používá v kompozicích penetrantů pro vhodnou penetraci bariér. Tyto penetranty jsou obecné známé ze stavu techniky.
Pro orální podávání mohou být ze sloučenin snadno vtvořeny kompozice smícháním aktivních sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči dobře známými ze stavu techniky. Tyto nosiče umožňují, aby byly ze sloučenin podle vynálezu vytvořeny pro orální požití ošetřovaným pacientem tabletky, pilulky, dražé, kapsle, kapaliny, gely, sirupy, kaše, suspenze a podobně. Farmaceutické přípravky pro orální použití mohou být získány kombinací aktivní
4444 • a · · ··
4
sloučeniny s pevným vehikulem, případně drcením výsledné směsi a zpracováním směsi granulí po přidání vhodných pomocných látek, pokud je to žádoucí, k získání tablet nebo základů dražé. Vhodná vehikula jsou zvláště plnidla, jako jsou cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu, celulózové přípravků, jako jsou například kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragantová guma, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná karboxymethylcelulóza a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). Pokud je to žádoucí, mohou být přidána desintegrační činidla, jako je zesíťovaný polyvinylpyrrolidon, agar nebo alginová kyselina nebo její sůl, jako je alginát sodný.
Jádra dražé jsou opatřena vhodnými povlaky. Pro tento účel může být použito koncentrovaných cukerných roztoků, které mohou případně obsahovat arabskou gumu, mastek, polyvinylpyrrolidon, gel karbopolu, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky laku a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Do tablet nebo povlaků dražé mohou být přidána barviva a pigmenty pro identifikaci nebo charakterizaci různých kombinaci dávek aktivních látek.
Farmaceutické přípravky, které mohou být použity orálně, zahrnují hotové kapsle vyrobené z želatiny, stejně jako měkké uzavřené kapsle vyrobené z želatiny a plastifikátoru, jako je glycerol nebo sorbitol. Hotové kapsle mohou obsahovat aktivní složky ve směsi s plnidly, jako je laktóza, pojivý, jako jsou škroby, a/nebo lubrikanty, jako je mastek nebo stearát horečnatý, případně stabilizátory. V měkkých kapslích mohou být aktivní sloučeniny rozpuštěny nebo z nich mohou být vytvořeny suspenze ve vhodných kapalinách, jako jsou mastné oleje, kapalný parafin nebo kapalné polyethylenglykoly. Kromě toho mohou být přidány stabilizátory. Všechny kompozice pro •4 4444 • «44*4444
44 44444
444444 44 444 4 orální podávány by měly být v dávkách vhodných pro toto podávání.
Pro bukální podávání mohou mít kompozice formu tablet nebo dražé vytvořených obvyklým způsobem.
Pro podávání inhalací jsou sloučeniny pro použití podle tohoto vynálezu obvykle podávány ve formě aerosolového spreje z natlakované nádobky nebo rozprašovače za použití vhodného nosného plynu, například dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého nebo jiných vhodných plynů. V případě tlakového aerosolu může být dávkovači jednotka dána použitím ventilu k dodání odměřeného množství. Kapsle a kazety, například želatinové, pro použití v inhalátoru nebo insuflátoru mohou být vytvořeny s obsahem práškové směsi sloučenin a vhodné práškové báze, jako je laktóza nebo škrob.
Kompozice mohou být vytvořeny pro parenterální podávání injekci například injekcí bolusu nebo kontinuální infúzí. Kompozice pro injekci mohou být přítomné v jednotkové dávkovači formě, například v ampuli nebo vícedávkových kontejnerech s přidanými konzervovadly. Kompozice mohou být ve formách jako jsou suspenze, roztoky nebo emulze v olejových nebo vodných vehikůlech a mohou obsahovat pomocné látky, jako jsou suspendační, stabilizační nebo dispergační činidla.
Farmaceutické kompozice pro parenterální podávání zahrnují vodné roztoky aktivních sloučenin ve ve vodě rozpustné formě. Dále mohou být suspenze aktivních sloučenin připraveny jako odpovídající olejové injekční suspenze. Vhodná lipofilni rozpouštědla nebo vehikula zahrnují mastné oleje, jako je sezamový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleát nebo triglyceridy, nebo liposomy. Vodné injekční suspenze mohou • · · · # · · · · • · · «·· · · ••••a* ·♦ · ·· obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je sodná karboxymethylcelulóza, sorbitol nebo dextran.
Suspenze mohou případně také obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvyšují rozpustnost sloučenin k dosažení přípravků ve formě vysoce koncentrovaných roztoků.
Aktivní složka může být alternativně ve formě prášku pro rekonstituci s vhodným vehikulem před použitím, například se sterilní bezpyrogenni vodou.
Kompozice mohou být také vytvořeny jako rektální kompozice, jako jsou čípky nebo retenční klystýry obsahující například obvyklé čípkové báze, jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.
Kromě výše popsaných kompozic mohou být sloučeniny také formulovány jako depotní přípravky. Tyto dlouhopůsobící kompozice mohou být podávány implantací (například podkožně nebo intramuskulárně nebo intramuskulární injekcí). Ze sloučenin tak mohou být vytvořeny směsi s vhodnými polymerními nebo hydrofobními látkami (například jako emulze v přijatelném oleji) nebo s iontoměničovými pryskyřicemi nebo jako omezeně rozpustné deriváty nebo omezeně rozpustné soli.
Příkladem farmaceutického nosiče pro hydrofobní sloučeniny podle vynálezu je vícerozpouštědlový systém obsahující benzylalkohol, nepolární povrchově aktivní činidlo, s vodou mísitelný organický polymer a vodnou fázi. Vícerozpouštědlový systém může být vícerozpouštědlový systém VPD. VPD je roztok 3 % hmotn./obj. benzylalkoholu, 8 % hmotn./obj. nepolárního povrchově aktivního činidla polysorbát 80 a 65 % hmotn./obj. polyethylenglykolu 300, doplněno na objem v absolutním ethanolu.
Vícerozpouštědlový systém VPD (VRP:5W) sestává z VPD zředěného v poměru 1:15% dextrózou ve vodném roztoku.
• · · · · · · · · · · · · · • ··· · · · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 · · 9 9 9 9 9 99 9
Tento vícerozpouštědlový systém dobře hydrofobni sloučenin a sám vykazuje nízkou toxicitu po systemickém podávání. Poměry vícerozpouštědlového systému mohou být přirozeně značně měněny bez změny jeho rozpustnosti a toxických vlastností. Kromě toho může být měněn i druh sloučenin ve vícerozpouštědlovém systému: například místo polysorbatu 80 může být použito jiných nízkotoxických nepolárních povrchově aktivních látek; může se měnit hmotnost polyethylenglykolu; polyethylenglykol může být nahrazen jinými biokompatibilními polymery, například polyvinylpyrrolidonem; a dextrózu mohou nahradit jiné cukry nebo polysacharidy.
V alternativní provedeni může být použito jiných podávačích systémů pro hydrofobni farmaceutické sloučeniny. Dobře známými příklady podávačích vehikul nebo nosičů pro hydrofobni léčiva jsou liposomy a emulze. Může být použito určitých organických rozpouštědel, jako je dimethylsulfoxid, obvykle však za cenu vyšší toxicity. Kromě toho mohou být sloučeniny podávány za použití systémů se zpomaleným uvolňováním, jako jsou polopropustné matrice pevných hydrofobních polymerů obsahující léčebnou látku. Byly vytvořeny a odborníkovi v oboru jsou známé různé materiály se zpožděným uvolňováním. Kapsle ze zpožděným uvolňováním mohou v závislosti na své chemické povaze uvolňovat sloučeniny po dobu několika týdnů až více než 100 dní. V závislosti na chemické povaze a biologické stabilitě terapeutických činidel může být použito jiných strategií pro stabilizaci proteinu.
Farmaceutické kompozice mohou také zahrnovat vhodné pevné nebo gelové nosiče nebo vehikula. Příklady takovýchto nosičů a vehikul zahrnují ale nejsou omezeny na uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, jako jsou polyethylenglykoly.
• · • · · · · ···· ·♦ ···· ·· ··· · • ····· · · · ··· · to · ·· ······ ·· · ·· ·
Mnoho organických molekulových sloučenin podle vynálezu může být poskytnuto jako soli s farmaceuticky kompatibilními protiionty. Farmaceuticky kompatibilní soli mohou být vytvořeny s mnoha kyselinami, včetně ale bez omezení na kyselinu chlorovodíkovou, sírovou, mléčnou, vinnou, jablečnou, jantarovou atd. Soli mají tendenci k vyšší rozpustnosti ve vodných nebo jiných protických rozpouštědlech než odpovídající formy volných bází.
Účinné dávky
Farmaceutické kompozice vhodné pro použití v tomto vynálezu zahrnují kompozice, kde aktivní složky jsou obsaženy v účinném množství k dosažení zamýšleného účelu. Konkrétněji znamená terapeuticky účinné množství množství účinné k prevenci rozvoje nebo omezení existujících symptomů u ošetřovaného subjektu. Určení účinných množství je v rozsahu znalostí odborníka v oboru.
Účinná dávka sloučeniny inhibuje buněčnou signální funkci KDL účinně k potlačení vaskulární hyperpermeability bez působení závažných nežádoucích efektů v důsledku inhibice funkce Flt-1 nebo jiné tyrosinkinasy. Určité sloučeniny, které mají tuto aktivitu, mohou být identifikované zkouškami in vitro, které stanovují na dávce závislou inhibici KDR tyrosinkinasy. Výhodné sloučeniny mají IC50 proti KDR, které je značně nižší než IC50 proti Flt-1 nebo jiné PTK stanovené za obdobných podmínek a [ATP]/Km(ATP) substrátu (ideálně ~100x selektivní pro KDR tyrosinkinasu).
Pro jakoukoli sloučeninu použitou při způsobu podle vynálezu může být terapeuticky účinná dávka stanovena nejprve pomocí buněčných zkoušek. Dávka může být zjištěna například u buněčných a zvířecích modelových systémů, aby se dosáhlo v oběhu koncentračního rozmezí, který zahrnuje
ΦΦ ···φ ·· φφφφ • · φ φ φ · φφφ φ φ · φφφ ΦΦ • ΦΦΦΦ· φφφ φφφ
IC5or jak je zjištěna v buněčných zkouškách (tj. koncentrace testované sloučenin, která dosahuje poloviny maximální inhibice buněčné signální funkce KDR, obvykle v odezvě na VEGF nebo jiný aktivační podnět). Stanovení buněčné IC50 v přítomnosti 3 až 5 % sérového albuminu může přiblížit vazebné účinky plazmového proteinu na sloučeninu. Tyto informace může být použita k přesnějšímu stanovení vhodných dávek u lidí. Nejvýhodnější sloučeniny pro systemické podávání účinně inhibují buněčnou signální funkci KDR v intaktních buňkách v hladinách, které jsou bezpečně dosažitelné v plazmě.
Terapeuticky účinná dávka označuje množství sloučeniny, které vyúsťuje ve zlepšení symptomů u pacienta. Toxicita a terapeutická účinnost těchto sloučenin může být stanovena standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, například pro zjištění maximální tolerované dávky (MTD) a ED50 (účinná dávka pro 50 % maximální odezvy). Poměr dávky mezi toxickými a terapeutickými účinky je terapeutický index a ten může být vyjádřen jako poměr mezi MTD a ED50.
Sloučeniny, které vykazují vysoké terapeutické účinky, jsou výhodné. Data získaná z těchto zkoušek na buněčných kulturách a zvířatech mohou být použita při stanovení rozmezí dávek pro použití u lidí. Dávky těchto sloučenin leží výhodně v rozmezí koncentrací v oběhu, které zahrnují ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Dávka se může pohybovat v tomto rozmezí v závislosti na použité dávkové formě a na použitém způsobu podáváni. Přesné složení (formulace), způsob podávání a dávka mohou být zvoleny konkrétním lékařem v závislosti na stavu pacienta (viz např. Fengl a kol., 1975, v „The Pharmoacological Basis of Therapeutics, kap. 1 str. 1). v případě krize může být doporučen k užití akutní bolus nebo infúze MTD k dosažení rychlé odezvy.
— 33 - ·· ···· ·· ···· ··
ΦΦ φ φφ φ φφφ * φ φφφ φ φ φ ΦΦΦΦ· φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφ · φφ φ
Dávkové množství a intervaly mohou být zvoleny individuálně k získání koncentrací aktivní složky v plazmě, která je dostatečná k udržení modulačních účinků KDR nebo minimální účinné koncentrace (minimal efective concentration MEC). MEC se může lišit pro každou sloučeninu, ale může být stanovena z údajů zjištěných in vitro; například koncentrace nezbytná k dosažení 50 - 90% inhibice KDR tyrosinkinasy za použití zde popsaných zkoušek. Dávky nezbytné k dosažení MEC budou záviset na individuálních vlastnostech a způsobu podávání. Ke zjišťování koncentrace v plazmě mohou být použity metody HPLC nebo biologické zkoušky.
Rozmezí dávkování může být také zjištěno za použití hodnoty MEC. Sloučeniny by měly být podávány za použití režimu, který udržuje koncentrace v plazmě nad MEC po 10 až 90 % času, výhodně po 30 až 90 % a nejvýhodněji po 50 až 90 %, dokud se nedosáhne požadovaného zlepšení symptomů. V případě lokálního podávání nebo selektivního podávání účinné lokální koncentrace léčiva nemusí být ve vztahu ke koncentraci v plazmě.
Množství podávaných sloučenin bude samozřejmě záviset na léčeném subjektu, na hmotnosti subjektu, vážnosti stavu, způsobu podávání a úsudku lékaře, který předepisuje léčiva.
Balení
Pokud je to žádoucí, mohou být kompozice předkládány v balení nebo zařízení pro aplikaci, která mohou obsahovat jednu nebo více forem dávkovačích jednotek aktivní složky. Balení může například obsahovat kovovou nebo plastickou folii, jako je balení jako náplast. Balení nebo zařízení pro aplikaci může být doprovázeno instrukcemi pro podávání. Mohou být také vytvořeny kompozice zahrnující sloučeninu podle vynálezu vytvořené jako kombinace s farmaceutickým ·♦ ··♦· ·· ··♦· nosičem, které jsou umístěné ve vhodné nádobě a označené nálepkou pro léčbu indikovaných stavů. Vhodné podmínky uvedené na nálepce mohou zahrnovat ošetření edému, inhibici vaskulární hyperpermeability a extravasace, depozici týkající se stromatu (stromální), minimalizaci s VEGF spojené hypertenze a podobně.
Příklady provedení vynálezu
In Vitro zkoušky PTK
Ke stanovení úrovně aktivity a účinků různých sloučeninu podle tohoto vynálezu na jednu nebo více PTK mohou být použity následující zkoušky in vitro. Obdobné zkoušky mohou být provedeny po stejné linii pro jiné tyrosinkinasy za použití metod známých ze stavu techniky.
A. Produkce KDR tyrosinkinasy za použití baculovirového systému
Kódující sekvence pro lidskou KDR intracelulární doménu (aa 789 - 1354) byla generována PCR za použiti cDNA izolovaných z buněk HUVEC. Sekvence poly-Hisg byla zavedena na N-konec proteinu. Tento fragment byl klonován do transfekčního vektoru pVL139/3 na místě Xba 1 a Not 1. Rekombinantní baculovirus byl generován pomocí kotransfekce za použití činidla BaculoGold Transfection reagent (PharMingen). Rekombinantní BV byl přečištěn a ověřen Western analýzou. Pro produkci proteinu byly kultivovány buňky SF-9 v kultivačním médiu SF-900-II do 2 x 106/ml a byly infikovány na 0,5 plak tvořících jednotek na buňku (MOI). Buňky byly kultivovány po dobu 48 hodin po infekci.
• 0 · · · ♦ • · · 0 4· ·« 0 00 0 0>· • 0 0 0 0 0 0
00000 000
000 000 00
0000 00 00 0 00 0
B. Přečištění KDR
Buňky SF-9 exprimující (His)6KDR (aa789-1354) byly lyžovány přídavkem 50 ml pufru pro lýzu Triton X-100 (20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCI, 10% glycerol, 1% triton X-100, 1 mM PMSF, 10 pg/ml aprotinu, 1 pg/ml leupeptinu) na buněčné pelety z 1 1 buněčné kultury. Lyzát byl odstřeďován při 19 000 ot./min v přístroji Sorval SS-34 po dobu 30 minut při 4 °C. Buněčný lyzát byl nanesen v 5 ml NÍCI2 na sepharosovou kolonu, ustálen 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCI. KDR byl eluován za použití stejného pufru obsahujícího 0,25 M imidazolu. Frakce z kolony byly analyzovány za použití .zkoušek SDS-PAGE a ELISA (dále), které stanovují aktivitu kinasy. Přečištěný KDR byl přenesen do pufru 25 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM NaCI, 5 mM DTT a uskladněn při -80 °C.
C. Produkce a přečištění lidské Tie-2 kinasy
Kódující sekvence pro lidskou Tie-2 intracelulární doménu (aa 775 - 1124) byly generovány pomocí PCR za použití cDNA izolovaných z lidské placenty jako templát. Sekvence poly-His6 byla zavedena na N-konce a tento konstrukt byl klonován do transfekčního vektoru pVL 1939 na místech Xba 1 a Not 1. Rekombinantni BV byl vytvořen kotransfekcí za použití činidla BaculoGold Transfection reagent (PharMingen). Rekombinantni BV byl přečištěn a ověřen Western analýzou. Pro produkci proteinu byly kultivovány buňky SF-9 v kultivačním médiu SF-900-II do 2 x 106/ml a byly infikovány na MOI 0,5. Přečištění Hisoznačené kinasy použité při screeningu bylo stejné, jako u KDR.
·· ···· ·· ···· ·· » · · · · · · · · • · · · · · · 9·
9 9 9 9 9 99
9999 99 9 9 99 9 9
D. Produkce a přečištěni lidské Flt-1 tyrosinkinasy
Bylo použito baculovirového expresního vektoru pVL
1393 (Phar Mingen. Los Angeles, CA) . Nukleotidová sekvence kódující poly-His6 byla umístěna do 5' nukleotidového místa kódujícího celou intraceulární kinasovou doménu lidského Flt-1 (aminokyseliny 786 - 1338). Nukleotidová sekvence kódující kinasovou doménu byla vytvořena PCR za použití knihoven cDNA izolovaných z buněk HUVEC. Histidinové zbytky umožnily afinitní přečištění proteinu obdobným způsobem jako u KDR (část B) a ZAP70 (část F). Hmyzí buňky SF-9 byly infikovány na 0,5 násobek a byly kultivovány 48 hodin po infekci.
E. Zdroje Lek a EGFR tyrosinkinasy
Lek a zkrácené formy Lek byly získány komerčně (například Ustáté Biotechnology lne., Saranac Lake, NY nebo Santa Cruz Biotechnolgy, lne., Santa Cruz, Ca) nebo byly přečištěny ze známých přírodních nebo rekombinantních zdrojů použitím obvyklých metod. EGFR byl získán od Sigma (kat # E-3641; ~ 500 jednotek/50 μΐ) a ligand EGF byl získán od Oncogene Research Products/Calbiochem (kat. # PF011-100).
F. Produkce ZAP70 tyrosinkinasy
Bylo použito baculovirového expresního vektoru pVL
1393 (Phar Mingen. Los Angeles, CA). Nukleotidová sekvence kódující poly-His6 byla umístěna do 5' nukleotidového místa kódujícího celou ZAP70 (aminokyseliny 1 - 619).
Nukleotidová sekvence kódující ZAP70 kódující oblast byla vytvořena PCR za použití knihoven cDNA izolovaných z umrtvených buněk Jurkat. Histidinové zbytky umožnily afinitní přečištění proteinu (viz část B). Můstky LVPRGS = 37 -=
·· ··♦· ·· ··
• · • • • • • • ·
• • • • • • •
•
• • · • • • • •
• · · · • · 99 • ·♦ ·
tvořily poznávací sekvenci pro proteolytické štěpeni pomoci thrombinu, čímž umožňovaly odstranění afinitního značení z enzymu. Hmyzí buňky SF-9 byly infikovány na 0,5 násobek a byly kultivovány 48 hodin po infekci.
G. Přečištění ZAP70
Buňky SF—9 byly lyžovány Tris, PH 8,0, 137 mM NaCI, 1% pg/ml leupeptmu, 10 pg/ml ap sodného. Rozpustný lyzát byl Sepharose Hi Trap (Pharmacia) 7,5, 0,3 M Naci. Fúzni pro imidazolem. Získaný enzym byl 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaC v pufru obsahujícím 20 mM
Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 rotinu a 1 mM orthovanadatu nanesen na chelatovanou kolonu ustálenou v 50 mM HEPES, pH tein byl eluován 250 mM skladován v pufru obsahujícím
Ί -v C •η-ΐ'Τ ΤΆΓΤΊ rn j_ d nu.·! u x x .
H. ELISA test (Enzyme Linked
Liimunosorbent Assay) pro
RTK
ELISA test byl použit pro detekci a měření přítomnosti aktivity tyrosinkinasy. Testy Elisa byly prováděny podle známých postupů, které jsou popsány například v Voliér a kol., 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, v Manual of Clinical Immunology, 2. vydání, Rose and Friedman, str. 359 - 379, Am. Soc. of Microbiology, Washingtron, D.C.
Popsaný způsob byl přizpůsoben pro stanovení aktivity s ohledem na specifika RTK. Výhodný způsob pro provedení zkoušek ELISA pro KDR je například popsán níže. Adaptace tohoto způsobu pro stanovení aktivity sloučenin jiných členů skupiny RTK, stejně jako nereceptorových tyrosinkinas jsou v rozsahu schopností odborníka v oboru. Pro účely stanovení inhibiční selektivity byl použit PTK substrát (například kopolymer poly(Clu4 Tyr), molekulová hmotnost ·· ··· ·
• · • · ♦ ·«·· ··
20000 až 50 000) spolu s ATP (typicky 5 μΜ) při koncentracích přibližně dvojnásobných než je zjevná Km při zkoušce.
ELISA KDR in vitro
Následující procedura byla použita ke stanovení inhibičního účinku sloučenin podle tohoto vynálezu na KDR tyrosinkinasovou aktivitu.
Pufry a roztoky:
PGT: Póly (Glu, Tyr) 4 : 1
Skladování prášku při -20 °C. Rozpuštění prášku ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS - phosphate buffered šalině) pro 50 mg/ml roztoku. Skladování 1 ml alikvotních dílů při
-20 °C. Poté výroba desek, zředění na 250 pg/ml v Gibco PBS.
Reakční pufr:
100 mM Hepes, 20 mM MgCl2, 4 mM MnCl2, 5 mM DTT, 0,02%
BSA, 20 μΜ NaV04, pH 7,10
ATP:
Skladování alikvotních dílů při 100 mM při -20 °C.
Zředění na 20 μΜ vodou.
Promývací pufr:
PBS s 0,1 % Tween 20 • · · · · · · • · a · ♦ · ··· aaa ··· · · ·· ·♦*· r···
Ředicí pufr protilátek:
0,1 hovězí sérový albumin (BSA) v PBS
TMB substrát:
Smíchání substrátu TMB a peroxidového roztoku 9 : 1 právě před použitím nebo použiti K-Blue Substráte od Neogen
Stop roztok
1M kyselina fosforečná
Postup
1. Příprava desky:
Zředění zásobního PGT (50 mg/ml, zmražený) v PBS na
250 pg/ml. Přídavek 125 μΐ na jamku Corningových modifikovaných vysoce afinitních ELISA desek s plochým dnem (Cornin # 25805-96). Přídavek 125 μΐ PBS do jamek se slepými pokusy. Zakrytí krycí páskou a inkubace přes noc při 37 °C. Promytí Ix 250 μΐ promývacího pufru a sušení po dobu asi 2 hodin při 37 °C v suchém inkubátoru.
Skladování povlečených desek v zataveném sáčku při 4 °C do použití.
2. Reakce tyrosinkinasy
- Příprava roztoků inhibitoru v 4x koncentraci v 20% DMSO ve vodě.
- Příprava reakčního pufru ·· toto·· toto «·«· «
« e to# ·>· · · to • >»·<·* · · · · » · to » » ♦ · to · ···· ·· ·· · ·· ·*·
- Příprava roztoku enzymu tak, aby požadované jednotky byly v 50 μΐ, například pro KDR na 1 ng/pl pro celkově 50 ng na jamku v reakcích. Skladování na ledu.
- příprava 4x roztoku ATP na 20 μΜ z 100 mM zásobního roztoku ve vodě.
uložení na ledu.
- Přídavek 50 μΐ roztoku v enzymu na jamku (typicky 5-50 ng enzymu/jamku v závislosti na specifické aktivitě kinasy).
- Přídavek 25 μΐ inhibitoru 4x
- Přídavek 25 μΐ ATP pro zkoušku inhibitoru 4x
- Inkubace 10 minut při pokojové teplotě
- Zastaveni reakce přídavkem 50 μΐ 0,05 N HC1 na jamku
- Omytí desky *★ Konečná koncentrace pro reakci:
ATP: 5 μΜ % DMSO
Vazba protilátek
- Zředění 1 mg/ml alikvotních dílů protilátek PY20-HPR (Pierce) (fosfotyrosinová protilátka) na 50 ng/ml v 0,1 % BSA v PBS dvoustupňovým zředěním (100 x, poté 200 x)
- Přídavek 1000 μΐ Ab na jamku. Inkubace 1 hodinu při pokojové teplotě. Inkubace 1 hodinu při 4 °C.
• · φ · • ΦΦΦ
Opláchnuti desky 4χ,
Barevná reakce
- Příprava TMB substrátu a přídavek 100 μΐ na jamku
- Zjištění OD při 650nm dokud se nedosáhne 0,6
- Zastavení 1 M kyselinou fosforečnou. Protřepání na odečítači desek.
- Odečtení OD ihned při 450 nm.
Optimální inkubační doby a podmínky enzymové reakce se mohou mírně odlišovat podle enzymových přípravků a mohou být stanoveny empiricky při pokojové teplotě.
Analogické podmínky při zkouškách byly použity pro Flt-1, Tie-2, EGFR a ZAP70. Pro Lek byl použitým reakčnim pufrem 100 mM MOPSO, pH 6,5, 4 mM MnCl2, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,2 % BSA, 20 mM NaVO4 za analogických podmínek.
Zdroj PKC kinasy
Katalytické subjednotky PKC mohou být získány komerčně (Calibiochem).
Test PKC kinasy
Test s radioaktivní kinasou byl proveden podle publikovaného způsobu (Yasud, I., Kirshimoto, A., Tanaka,
S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y. Biochemical and biophysicel Research Comunication 3:166, 1220 - 1227 (1990)). Krátce, všechny reakce byly provedeny v kinasovém pufru sestávajícím z 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, lmM EGTA, 100 μΜ ATP, 8 μΜ peptidu, 5 % DMSO a 33P ATP (8 Ci/mM). Sloučenina a enzym byly smíchány v reakční nádobě a reakce byla inicializována přídavkem ATP a směsi substrátu. Po ukončení reakcí přídavkem 10 ,μΐ stop pufru (5 mM ATP v 75 mM kyselině fosforečné) byla část směsi nanesena na fosfocelulózové filtry. Nanesené vzorky byly promývány 3 krát v 75 mM kyselině octové při pokojové teplotě po dobu 5 až 15 minut. Inkorporace radioaktivních značek vyla kvantitativně vyhodnocena v kapalině scintilačním odečtem.
Vazná zkouška estrogenového receptorů
Vazba 1 nM radioaktivně značeného 17p~estradiolu na lidský receptor estrogenu v cytosolu savčích rakovinných buněk MCF-7 byla stanovena po inkubaci po dobu 20 hodin při 4 °C za použití reakčních podmínek uvedených v Shein a kol., Cancer Res. 45:4192 (1985) (na který se tímto odkazuje). Po inkubaci byly frakce cytosolu míchány se suspenzí dextranem povlečeného aktivního uhlí po dobu 10 minut při 4 °C, odstředěny a supernatanty byly shromážděny. Navázaná radioaktivita zbylá na supernatantu byla měřena scintilačním čítačem (LS 6000, Beckman) a za použiti kapalného scintilačního koktejlu (Formula 989 Packard). Sloučeniny byly testovány simultánně duplicitně při osmi koncentracích k získání kompetiční křivky za účelem kvantitativního stanovení inhibiční aktivity. Specifická vazba radioaktivně značeného ligandu na receptor estrogenu byla definována jako rozdíl mezi celkovým vázáním a nespecifickým vázáním stanovených v přítomnosti přebytku neznačeného 17P~estradiolu (6 μΜ).
Výsledky
Byly získány následující inhibiční koncentrace reprezentativních sloučenin se strukturním vzorcem:
• · ♦ · • ·
Zkouška IC50 pro sloučeninu
KDR 0,20 μΜ
Flt-1 > 50,0 μΜ
Lek > 50,0 μΜ
TIE2 > 50,0 μΜ
ZAP70 > 50,0 μΜ
EGFR > 50,0 μΜ
PKC > 20 μΜ
receptor estrogenu > 10,0 μΜ (< 10% inh @ 10 μΜ)
Tyto výsledky dokazují, že sloučeniny podle tohoto vynálezu a zde uvedené jako příklady mají významnou inhibiční aktivitu pro KDR tyrosinkinasu a jsou zvláště selektivní jako inhibitory KDR tyrosinkinasy.
···· ·· · «Σ i ♦ · 0 0·· * • 000·· · * * 000 000·· ·«·· 00 0· · ··
II. Buněčné RTK zkoušky
Následující zkoušky byly použity ke zjištěni hladiny aktivity a účinku různých sloučenin podle tohoto vynálezu na KDR. Obdobné zkoušky mohou být vytvořeny ve stejném duchu pro jiné tyrosinkinasy za použiti vhodných protilátkových činidel a technik, jako jsou imunoprecipitace a Westernblott, které jsou dobře známé v oboru.
A. VEGF-indukovaná KDR fosforylace v buňkách endothelu lidské umbilikálni žíly (Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC) zjištěná metodou Westernblot
1. Buňky HUVEC (od vybraných dárců) byly získány od Clonetics (San Diego, CA) a kultivovány podle instrukcí výrobce. Pro tuto zkoušku byly použity pouze rané pasáže (3-8). Buňky byly kultivovány v lOOmm miskách (Falcon pro tkáňové kultury; Becton Dickinson; Plymouth, Anglie) za použití kompletního media EBM (Clonetics).
2. Pro vyhodnocení inhibiční aktivity sloučenin byly buňky trypsinizovány a naočkovány v množství 0,5 - 1,0 x 103 * 5 buněk/jamku do každé jamky 6-jamkových desek (Costar; Cambridge, ΜΆ).
3. Po 3 až 4 dnech po naočkování byly z 90 - 100 % ztekucené. Medium bylo ze všech jamek odstraněno, buňky byly promyty 5 - 10 ml PBS a inkubovány 18 - 24 hodin s 5 ml základního media EBM bez přídavku dalších doplňku (tj.
hladové sérum).
• · · ·
4. Sériová ředění inhibitoru byla přidána v 1 ml média EBM (25 μΜ, 5 μΜ nebo 1 μΜ konečné koncentrace) k buňkám a směs byla inkubována jednu hodinu při 37 °C. Poté byly přidány do všech jamek lidské rekombinantní VEGF(i65) (R & D Systems) a v 2 ml média EBD při konečné koncentraci 50 ng/ml a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 10 minut.
K posouzeni fosforylace a VEGF indukované fosforylace byly jako slepý pokus použity kontrolní buňky podrobené nebo nepodrobené působení VEGF.
5. Všechny jamky byly poté promyty 5 - 10 ml chladného PBS obsahujícího 1 mM orthovanadátu sodného (Sigma) a buňky byly lyžovány a rozetřeny v 200 μΐ RIPA pufru (50 mM TrisHC1) pH 7, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,35 % deoxycholatu sodného, 1 mM EDTA) obsahující inhibitory proteasy (PMSF 1 mM, aprotin 1 pg/ml, pepstatin 1 pg/ml, leupeptin 1 pg/ml, vanadat sodný 1 mM, fluorid sodný 1 mM) a 1 pg/ml DNasy (všechny chemikálie od Sigma Chemical Company, St Louis, MO). Lyzát byl poté odstřeďován při 14 000 otáčkách po dobu 30 minut k odstranění jader.
6. Stejná množství proteinů pak byla vysrážena přídavkem chladného (-20 °C) ethanolu (2 objemy) na minimálně 1 hodinu nebo maximálně přes noc. Pelety byly rekonstituovány v Laemliově pufru obsahujícím 5 % β-merkaptoethanolu (BioRad; Hercules, CA) a vařeny po dobu 5 minut. Proteiny byly zpracovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu (6 %, 1,5 mm Novex, San Diego, CA) a převedeny na nitrocelulosovou membránu za použití systému Novex. Po blokování pomocí hovězího sérového albuminu (3 %) byly proteiny přes noc podrobeny zkoušce s anti-KDR polyklonální protilátkou (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Crutz, CA) nebo s anti-fosfotyrosinovou monoklonální protilátkou ·«··
(4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) při 4 °C. Po promytí a inkubaci po dobu 1 hodiny s HPR-konjugovaným F(ab)2 nebo kozím anti-králičím nebo kozím-anti-myším IgG byly pásky zviditelněny použitím emisního chemiluminiscenčního systému (ECL) (Amerham Life Science, Arlington Height, IL).
Výsledky
Inhibiční koncentrace reprezentativních sloučenin I vzorce:
byly:
Huvec Buněčné IC50 pro sloučeninu
fosforylace KDR 5 - 10 μΜ
Tyto sloučeniny také vykazovaly KDR tyrosinkinasovou selektivitu (viz sekci I).
• · · ··· ·· ······ ·· · ··
Tyto výsledky dokazují, že vhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu mají významnou inhibiční aktivitu pro VEGF indukovanou fosforylaci tyrosinu KDR tyrosinkinasy v buňkách endothelu.
III. Model edému dělohy
Tato zkouška stanovuje schopnost sloučenin inhibovat zvyšování hmotnosti myší dělohy, ke kterému dochází během prvních několika hodin po stimulaci.' Je známo, že toto zvýšení hmotnosti dělohy je následkem edému způsobeného zvýšenou permeabilitou vaskulatury dělohy. Cullinan-Bove a Koss Endocrinology (1993), 133:829 - 837) ukázali těsnou dočasnou souvislost estrogenem stimulovaného edému dělohy se zvýšenou expresí VEGF mRNA v děloze. Tyto výsledky byly potvrzeny použitím neutralizační monoklonální protilátky k VEGF, které značně snížilo akutní zvýšení hmotnosti dělohy po stimulaci estrogenem (WO 97/42187). Tento systém tak může sloužit jako model in vivo pro inhibici VEGFmediované hyperpemeability a edému.
Materiály:
Všechny hormony byly získány u Sigma (St. Louis, MO) nebo Cal Biochem (La Jolla, Ca) jako lyofilizované prášky a připraveny podle návodu dodavatele.
Složky vehikul (DMSO, Cremaphor EL) byly získány od firmy Sigma (St. Louis, MO).
Myši (Balb/c, 8-12 týdnů staré) byly nakoupeny u Taconic (Germantown, NY) a umístěny v bezpatogenním zařízení pro zvířata v souladu s instrukcemi Animal Care a Use Commitee Guidelines.
·· ···· • · ··· · • · · · · · J ·*·· ··♦ · · ······ ·· · ·· ·
Postup:
Den 1: Myším Balb/c byly dány intraperitoneální (i.
p.) injekce 12,5 jednotek sérového gonadotropinu (pregnant mare's sérum gonadotropin PMSG)
Den 3: Myši dostaly 15 jednotek lidského chorionického gonadotropinu (hCG) i. p.
Den 4: Myši byly náhodně rozděleny do skupin po 5 až 10.
Testované sloučeniny byly podávány i. p., i. v. nebo p. o. v závislosti na rozpustnosti a vehikulu v dávkách pohybujících se od 1 do 200 mg/kg. Kontrolní skupina dostala pouze vehikulum a dvě skupiny byly ponechány bez ošetření.
Obvykle o třicet minut později byly experimentální skupina, skupina s vehikulem a jedna z neošetřených skupin ošetřeny i. p. injekcí 17p-estradiolu (500 pg/kg). Po 2 až 3 hodinách byla zvířata usmrcena inhalací C02. Po rozříznutí uprostřed byla každá děloha izolována a rozříznuta přesně pod cervixem a v místě spojení mezi dělohou a vejcovodem. Před zvážením byly odstraněny opatrně tuk a spojovací tkáně bez narušení celistvosti dělohy. Průměrné hmotnosti u ošetřené skupiny byly srovnání s průměrnými hmotnostmi u skupiny neošetřené a ošetřené vehikulem. Významnost byla stanovena Studentovým testem.
. Nestimulovaná kontrolní skupina byla použita ke sledování odezvy na estradiol.
·· ···· • ·
Výsledky
Procentická inhibice edému dělohy po stimulaci estradiolem pro representativní sloučeniny strukturního vzorce:
byly získány pro tři způsoby podávání při dávkách 100 mg/kg.
Způsob podávání % inhibice Hodnota p
p.o. 17 ns
i .v. 57 0,01
i.p. 52 0,04
U sloučeniny I zde bylo prokázáno, že je KDR selektivní pro inhibici kinasové aktivity in vitro a účinná při blokování buněčné autofosforylace KDR v odezvě na stimulaci VEGF.
·· *··· •9 ·«·· • · · · ·· • · · · · **
99·*· » ·· • · · · · · ·· ···· ·· ··' ♦ ··
Tyto výsledky dokazuji, že vhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu, jako je sloučenina I, které selektivně inhibuji funkci KDR, účinně blokují vznik edému. Tyto výsledky také ukazují, že i.v. a i.p. podávání jsou pro tyto sloučeniny zvláště účinné. Je důležité, že obdobné výsledky v antiedemické účinnosti byly také získány s řadou strukturně odlišných selektivních inhibitorů funkce KDR.
Ekvivalenty
Přestože tento vynález byl konkrétně vysvětlen a popsán s odkazem na svá výhodná provedení, předpokládá se, že odborník v oboru může udělat různé změny ve formě a detailech bez toho, že by se dostal mimo duch a rozsah vynálezu, jak je definován v připojených nárocích. Odborníci v oboru mohou poznat nebo být schopni odhalit mnoho ekvivalentů ke zde popsaným konkrétním provedením použitím ničeho více než rutinních experimentů. Tyto ekvivalenty též spadají do rozsahu nároků.

Claims (29)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použiti sloučeniny inhibujici buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulárni hyperpermeability.
  2. 2. Použiti sloučeniny inhibujici buněčné signální funkce KDR, která je selektivní pro signální funkci KDR, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulárni hyperpermeability.
  3. 3. Použití sloučeniny inhibujici buněčné signální funkce KDR, kde uvedená inhibice buněčné signální funkce KDR je stimulována vazbou aktivačního ligandu na receptorovou část KDR, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulárni hyperpermeability.
  4. 4. Použití sloučeniny inhibujici buněčné signální funkce KDR, kde uvedená inhibice buněčné signální funkce KDR je selektivní pro signální funkci KDR, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulárni hyperpermeability.
  5. 5. Použití sloučeniny inhibujici buněčné signální funkce KDR, kde uvedená inhibice buněčné signální funkce KDR je proces vybraný ze skupiny sestávající z blokování produkce aktivačního ligandu, modulace vazby aktivačního ligandu na receptor KDR tyrosinkinasy, narušení dimerizace receptoru, blokování transfosforylace KDR, inhibice aktivity KDR
    -52 • * 4444 tyrosinkinasy, rušení doplnění intracelulárních substrátů KDR a narušení dalšího přenosu signálu iniciovaného fosforylační aktivitou KDR tyrosinkinasy, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  6. 6. Použití podle nároku 5, kde uvedená inhibice buněčné signální funkce KDR je selektivní pro signální funkci KDR, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  7. 7. Použití sloučeniny inhibující katalytickou kinasovou aktivitu uvedené KDR, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  8. 8. Použití sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR, kde uvedenou sloučeninou je antagonista aktivace KDR tyrosinkinasy, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  9. 9. Použití sloučeniny selektivně inhibující fosforylaci substrátů KDR kinasy, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  10. 10. Použití sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR, kde uvedená sloučenina je selektivní pro uvedenou KDR tyrosinkinasu, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  11. 11. Použiti podle nároku 10, kde uvedená sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající z peptidů, protilátek a organických molekul, přičemž uvedená sloučenina váže uvedenou KDR tyrosinkinasu, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  12. 12. Použití podle nároku 11, pro výrobu léčiva pro inhibici vzniku chorobného stavu vybraného ze souboru sestávajícího ze skvrnitého edému, afakického/ pseudoafakického cystoidního skvrnitého edému, retinoblastomu, zrakové ischémie, zánětlivého onemocnění nebo infekce očí, choroidálniho melanomu, edemických vedlejších účinků vyvolaných železitou chelatační terapií, plicního edému, infarktu myokardu, revmatických onemocnění, anafylaxie, edému tkáně v místech poranění a alergického zánětu, alergií, hypersenzitivních reakcí, polypového edému v místech chronického zánětu, cerebrálního edému, mozkového tumoru s cystami naplněnými tekutinou, komunikujícího hydrocefalu, syndromu karpálního tunelu, poškozeních orgánů následkem popálení, inhalačního popálení, kožního popálení, tvorby puchýřů po popálení sluncem, po podráždění nebo infekci, multiformního erytému, endemických skvrn a jiných kožních chorob, nádorů mozku, nádorových výtoků, rakovinových nádorů plic nebo prsou, vodnatelnosti břišní, pohrudničních výtoků, perikardiálních výtoků, vysokohorské „nemoci, radioanafylaxie, radiodermatitidy, zeleného zákalu očí, zánětu oční spojivky, choroidálniho melanomu, syndromu respirační úzkosti u dospělých, astmatu, bronchitidy, syndromu hyperstimulace vaječníků, polycystického syndromu vaječníků, menstruačního otoku, menstruačních křečí, mrtvice, poranění hlavy, cerebrálního infarktu nebo okluze, hypotenze, zvředovatění, podvrknutí, • · 0 0 ♦ · · 0 • 0 · 0
    0 0 0 0 0 • · · « • ·
    0 0 ·♦ 0 0 0 0 zlomenin, výtoků spojených se synovitidou, diabetických komplikací, syndromu hyperviskozity, cirhózy jater, mikroalbuminurie, proteinurie, oligurie, elektrolytické nerovnováhy, nefrotického syndromu, exudátů, fibrózy, keloidů a podávání růstových faktorů.
  13. 13. Použití podle nároku 10, pro výrobu léčiva pro vyloučení nežádoucího účinku spojeného se změnou v buněčné signální funkci tyrosinkinasy jinou než KDR.
  14. 14. Použití sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR, kde uvedená sloučenina je vybrána ze souboru sestávajícího z protilátek s jednoduchým řetězcem, KDRspecifických ribozymů a protisměrných polynukleotidů, a inhibuje řádné působení funkční KDR tyrosinkinasy, pro výrobu léčiva pro inhibicí vaskulární hyperpermeability.
  15. 15. Použití sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibicí vaskulární hyperpermeability, kde uvedená sloučenina je v kombinaci s farmaceutickým činidlem vybraným ze skupiny sestávající z anitiendemických steroidů, inhibitorů Ras, anti-TNF činidel, anti-ILl činidel, antihistaminu, antagonistů PAF, inhibitoru COX-1, inhibitoru COX-2, inhibitoru NO synthasy, nesteroidního protizánětlivého činidla (NSAID), inhibitoru PKC a PI3 kinasového inhibitoru.
  16. 16. Použití sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibicí fyziologického procesu nebo stavu, který je vybrán ze souboru sestávajícího • · Φ· φφ · φ φ· ··«·»·· · φ · ·· • •φφ φφφφ φ · ·· ·· ΦΦ Φ»·· 4··*·· z tvorby edému, diapedesy, extravasace, efúze, exudace, tvorby vodnatelnosti břišní, ukládání matrice a vaskulární hypotense.
  17. 17. Použití podle nároku 16, kde uvedená sloučenina je selektivní pro uvedenou KDR tyrosinkinasu, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  18. 18. Použití podle nároku 17, kde uvedená sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající z peptidů, protilátek a organických molekul, a váže se na uvedenou KDR tyrosinkinasu, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  19. 19. Použití podle nároku 17, pro výrobu léčiva, které inhibuje vznik chorobného stavu vybraného ze souboru sestávajícího ze skvrnitého edému, afakického/ pseudoafakického cystoidního skvrnitého edému, retinoblastomu, zrakové ischémie, zánětlivého onemocnění nebo infekce očí, choroidálního melanomu, edemických vedlejších účinků vyvolaných železitou chelatační terapií, plicního edému, infarktu myokardu, revmatických onemocnění, anafylaxie, edému tkáně v místech poranění a alergického zánětu, alergií, hypersenzitivních reakcí, polypového edému v místech chronického zánětu, cerebrálního edému, mozkového tumoru s cystami naplněnými tekutinou, komunikujícího hydrocefalu, syndromu karpálního tunelu, poškozeních orgánů následkem popálení, inhalačního popálení, kožního popálení, tvorby puchýřů po popálení sluncem, po podráždění nebo infekci, multiformního erytému, endemických skvrn a jiných kožních chorob, nádorů mozku, nádorových výtoků,
    - 56 • · ·· ·· #· • · · · ···· · • · ♦· · · · · • · · · · · · « · · • ♦ · · ♦ · · · • · ·· ·· · ·· · rakovinových nádorů plic nebo prsou, vodnatelnosti břišní, pohrudničních výtoků, perikardiálních výtoků, vysokohorské „nemoci, radioanafylaxie, radiodermatitidy, zeleného zákalu očí, zánětu oční spojivky, choroidálního melanomu, syndromu respirační úzkosti u dospělých, astmatu, bronchitidy, syndromu hyperstimulace vaječníků, polycystického syndromu vaječníků, menstruačního otoku, menstruačních křečí, mrtvice, poranění hlavy, cerebrálního infarktu nebo okluze, hypotenze, zvředovatění, podvrknutí, zlomenin, výtoků spojených se synovitidou, diabetických komplikací, syndromu hyperviskozity, cirhózy jater, mikroalbuminurie, proteinurie, oligurie, elektrolytické nerovnováhy, nefrotického syndromu, exudátů, fibrózy, keloidů a podávání růstových faktorů.
  20. 20. Použití podle nároku 16, pro výrobu léčiva pro inhibici katalytické kinasové aktivity uvedené KDR.
  21. 21. Použití podle nároku 16, sloučeniny, která je antagonistou aktivace KDR tyrosinkinasy, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  22. 22. Použití podle nároku 16, sloučeniny selektivně inhibující fosforylaci substrátu KDR kinasy, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
  23. 23. Použití podle nároku 16, sloučeniny, která je selektivní pro uvedenou KDR tyrosinkinasu, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
    -57 • · · · * · · · ···· · · · · • · ·· · · · • · · ··· · · • · · · ··· · ·· ·· ·« ····
  24. 24. Použiti podle nároku 16, sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability, kde uvedená buněčná signální funkce KDR je stimulována vazbou aktivačního ligandu na receptorovou část KDR.
  25. 25. Použití podle nároku 24, sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability, kde uvedená sloučenina je selektivní pro uvedenou KDR tyrosinkinasu.
  26. 26. Použití podle nároku 16, sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability, kde uvedená sloučenina je vybrána ze skupiny sestávající z protilátek s jednoduchým řetězcem, KDR-specifických ribozymů a protisměrných polynukleotidů, přičemž léčivo inhibuje řádné působení funkční KDR tyrosinkinasy.
  27. 27. Použití sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibici buněčné signální funkce KDR jako procesu vybraného ze souboru sestávajícího z blokování produkce aktivačního ligandu, modulace vazby aktivačního ligandu na receptor KDR tyrosinkinasy, narušení dimerizace receptoru, blokování transfosforylace KDR, inhibice aktivity KDR tyrosinkinasy, rušení doplnění intracelulárních substrátu KDR a narušení dalšího přenosu signálu iniciovaného fosforylační aktivitou KDR tyrosinkinasy.
    • ·
    -58 ·· ·· ·ν • · · · · · · · · · · · • · ·♦ · · ··· 4 ······· ·«·· · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ···· ·· ····
  28. 28. Použiti podle nároku 16, sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR pro výrobu léčiva pro inhibici nežádoucího účinku spojeného se změnou v buněčné signální funkci tyrosinkinasy jiného než KDR.
  29. 29. Použití podle nároku 16, sloučeniny inhibující buněčné signální funkce KDR v kombinaci s farmaceutickým činidlem vybraným ze skupiny sestávající z antiendemických steroidů, inhibitorů Ras, anti-TNF činidel, anti-ILl činidel, antihistaminu, antagonistů PAF, inhibitoru COX-1, inhibitoru COX-2 inhibitoru NO synthasy, nesteroidního protizánětlivého činidla (NSAID), inhibitoru PKC a PI3 kinasového inhibitoru, pro výrobu léčiva pro inhibici vaskulární hyperpermeability.
CZ20011564A 1998-11-06 1999-11-03 Léčivo pro inhibici vaskulární hyperpermeability CZ20011564A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10746298P 1998-11-06 1998-11-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20011564A3 true CZ20011564A3 (cs) 2002-04-17

Family

ID=22316735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011564A CZ20011564A3 (cs) 1998-11-06 1999-11-03 Léčivo pro inhibici vaskulární hyperpermeability

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP1126842A2 (cs)
JP (1) JP2002529421A (cs)
KR (1) KR20010080952A (cs)
CN (1) CN1342077A (cs)
AR (1) AR023912A1 (cs)
AU (1) AU1908000A (cs)
BG (1) BG105476A (cs)
BR (1) BR9915139A (cs)
CA (1) CA2347916A1 (cs)
CO (1) CO5150183A1 (cs)
CZ (1) CZ20011564A3 (cs)
HU (1) HUP0104302A3 (cs)
ID (1) ID29063A (cs)
IL (1) IL142583A0 (cs)
NO (1) NO20012218L (cs)
PL (1) PL348163A1 (cs)
SK (1) SK5052001A3 (cs)
TR (1) TR200102278T2 (cs)
WO (1) WO2000027414A2 (cs)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69926536T3 (de) 1998-12-22 2013-09-12 Genentech, Inc. Antagonisten von vaskular-endothelialen zellwachstumsfaktoren und ihre anwendung
US8124630B2 (en) 1999-01-13 2012-02-28 Bayer Healthcare Llc ω-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
JP2002534468A (ja) 1999-01-13 2002-10-15 バイエル コーポレイション ｐ３８キナーゼ阻害剤としてのω−カルボキシアリール置換ジフェニル尿素
EP1250155B1 (en) * 1999-12-22 2008-04-16 The Scripps Research Institute Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors
DE10021246A1 (de) * 2000-04-25 2001-10-31 Schering Ag Substituierte Benzoesäureamide und deren Verwendung als Arzneimittel
EP1417976A4 (en) * 2001-07-26 2004-09-15 Santen Pharmaceutical Co Ltd AGENT FOR TREATING GLAUKOM WITH A COMPOUND WITH PI3-KINASE INHIBITING EFFECT
EP2324825A1 (en) 2002-02-11 2011-05-25 Bayer Healthcare LLC Aryl ureas with angiogenesis inhibiting activity
US20050100963A1 (en) 2002-03-01 2005-05-12 Dyax Corporation KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
US8623822B2 (en) 2002-03-01 2014-01-07 Bracco Suisse Sa KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
US7794693B2 (en) 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
US7261876B2 (en) 2002-03-01 2007-08-28 Bracco International Bv Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
EP2314691A3 (en) * 2002-11-14 2012-01-18 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional siRNA
WO2004078778A2 (en) 2003-03-03 2004-09-16 Dyax Corp. PEPTIDES THAT SPECIFICALLY BIND HGF RECEPTOR (cMet) AND USES THEREOF
ATE366108T1 (de) 2003-05-20 2007-07-15 Bayer Pharmaceuticals Corp Diaryl-harnstoffe für durch pdgfr vermittelte krankheiten
NZ580384A (en) 2003-07-23 2011-03-31 Bayer Pharmaceuticals Corp 4{4-[3-(4-chloro-3-trifluoromethylphenyl)-ureido]-3-fluorophenoxy}-pyridine-2-carboxylic acid methylamide and metabolites for the treatment and prevention of diseases and conditions
CN101965193A (zh) 2006-11-15 2011-02-02 科达治疗公司 用于伤口愈合的改进方法和组合物
WO2012015775A2 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Dharmacon, Inc. Sirna targeting vegfa and methods for treatment in vivo
KR101565886B1 (ko) 2013-10-23 2015-11-05 전남대학교산학협력단 난소과자극증후군의 진단 방법 및 키트
CA2958879A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Auckland Uniservices Limited Channel modulators
CN106381330A (zh) * 2016-08-30 2017-02-08 张建华 一种检测交通性脑积水易感性的引物及试剂盒
KR102644938B1 (ko) * 2018-03-19 2024-03-07 주식회사 파멥신 항-vegfr-2 항체
CN109718253B (zh) * 2019-01-16 2021-09-24 中国人民解放军总医院 一种代谢产生组胺的菌在预防或治疗高原病中的用途

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE789948A (fr) * 1971-10-13 1973-04-11 Sandoz Sa Nouveaux derives du pyrazole, leur preparation et leur application comme medicaments
US3843664A (en) * 1973-02-20 1974-10-22 Sandoz Ag Substituted naphtho pyrazoles
US3843665A (en) * 1973-04-11 1974-10-22 Sandoz Ag Process for preparing substituted indeno,naphtho and cyclohepta pyrazoles
US3843666A (en) * 1973-05-29 1974-10-22 Sandoz Ag Process for preparing substituted indeno,naphtho and cyclohepta pyrazoles
US5712395A (en) * 1992-11-13 1998-01-27 Yissum Research Development Corp. Compounds for the treatment of disorders related to vasculogenesis and/or angiogenesis
WO1998033917A1 (en) * 1994-11-14 1998-08-06 The Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor c (vegf-c) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
US6346398B1 (en) * 1995-10-26 2002-02-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for the treatment of diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor
FR2742662B1 (fr) * 1995-12-21 1998-01-23 Centre Nat Rech Scient Anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance endotheliale vasculaire et leur utilisation comme medicaments
US6100071A (en) * 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
DE19638745C2 (de) * 1996-09-11 2001-05-10 Schering Ag Monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen VEGF - Rezeptorproteins (KDR)
WO1998058053A1 (en) * 1997-06-18 1998-12-23 Merck & Co., Inc. Human receptor tyrosine kinase, kdr
EP1021182A1 (en) * 1997-10-06 2000-07-26 Basf Aktiengesellschaft Indeno[1,2-c] pyrazole derivatives for inhibiting tyrosine kinase activity
CN1278725A (zh) * 1997-10-06 2001-01-03 巴斯福股份公司 茚并[1,2－c]－、萘并[1,2－c]－和苯并[6,7]芳庚并[1,2－c]吡唑类衍生物
WO1999055335A1 (en) * 1998-04-30 1999-11-04 Basf Aktiengesellschaft Substituted tricyclic pyrazole derivatives with protein kinase activity

Also Published As

Publication number Publication date
PL348163A1 (en) 2002-05-06
NO20012218L (no) 2001-06-18
HUP0104302A3 (en) 2002-11-28
WO2000027414A2 (en) 2000-05-18
BR9915139A (pt) 2001-08-07
IL142583A0 (en) 2002-03-10
AU1908000A (en) 2000-05-29
HUP0104302A2 (hu) 2002-03-28
SK5052001A3 (en) 2002-10-08
KR20010080952A (ko) 2001-08-25
WO2000027414A3 (en) 2000-09-08
CO5150183A1 (es) 2002-04-29
EP1126842A2 (en) 2001-08-29
AR023912A1 (es) 2002-09-04
ID29063A (id) 2001-07-26
CA2347916A1 (en) 2000-05-18
JP2002529421A (ja) 2002-09-10
NO20012218D0 (no) 2001-05-04
CN1342077A (zh) 2002-03-27
BG105476A (en) 2002-02-28
TR200102278T2 (tr) 2001-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20011564A3 (cs) Léčivo pro inhibici vaskulární hyperpermeability
ES2299434T3 (es) Inhibidores de kinasa utilizados como agentes terapeuticos.
Gammons et al. Topical antiangiogenic SRPK1 inhibitors reduce choroidal neovascularization in rodent models of exudative AMD
JP2004511470A (ja) 蛋白キナーゼ阻害薬
TW200304818A (en) Kinase inhibitors
JP2003517447A (ja) 三環式ピラゾール誘導体
JP2002538107A (ja) アレルギー障害治療用のｊａｋ−３阻害剤
EP1023063A1 (en) INDENO 1,2-c]-, NAPHTHO 1,2-c]- AND BENZO 6,7]CYCLOHEPTA 1,2-c]PYRAZOLE DERIVATIVES
ES2224650T3 (es) Derivados de pirazol triciclico sustituido con actividad de proteina quinasa.
KR20150037877A (ko) 암, 자가면역성 염증 및 중추신경계 장애를 치료하기 위한 비플루오로디옥살란-아미노-벤즈이미다졸 키나제 억제제
US6534655B1 (en) Indeno[1,2-C]pyrazole derivatives for inhibiting tyrosine kinase activity
AU2022202286A1 (en) Compounds, compositions, and methods for treating T-cell acute lymphoblastic leukemia
CZ20013580A3 (cs) Substituované 1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazoly jako inhibitory tyrosin kinázy
CN107151233B (zh) 含腙的嘧啶类衍生物及其用途
MXPA01004438A (en) Inhibition of the formation of vascular hyperpermeability
Huang et al. Protective Effects of PPARγ on Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Regulating miR-21
US20210380547A1 (en) Urea derivatives for treating and/or preventing cancer
CN114456143B (zh) 一种uPA的抑制剂及其制备方法和应用
CN109134431B (zh) 作为囊性纤维化跨膜传导调节因子抑制剂的氨基咪唑偶联吡啶酮衍生物
MXPA00003359A (en) Indeno[1,2-c]pyrazole derivatives for inhibiting tyrosine kinase activity
WO2020007273A1 (zh) 新型雄激素受体抑制剂及其合成方法和应用
MXPA00003360A (en) INDENO[1,2-c]-, NAPHTHO[1,2-c]- AND BENZO[6,7]CYCLOHEPTA[1,2-c]PYRAZOLE DERIVATIVES