CZ20013580A3 - Substituované 1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazoly jako inhibitory tyrosin kinázy - Google Patents

Substituované 1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazoly jako inhibitory tyrosin kinázy Download PDF

Info

Publication number
CZ20013580A3
CZ20013580A3 CZ20013580A CZ20013580A CZ20013580A3 CZ 20013580 A3 CZ20013580 A3 CZ 20013580A3 CZ 20013580 A CZ20013580 A CZ 20013580A CZ 20013580 A CZ20013580 A CZ 20013580A CZ 20013580 A3 CZ20013580 A3 CZ 20013580A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
optionally substituted
alkoxy
formula
compounds
dihydroindeno
Prior art date
Application number
CZ20013580A
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin J. Doyle
Paul Rafferty
Robert W. Steele
Allyson Turner
David J. Wilkins
Lee D. Arnold
Original Assignee
Knoll Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Knoll Gmbh filed Critical Knoll Gmbh
Publication of CZ20013580A3 publication Critical patent/CZ20013580A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/54—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

Substituované 1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazoly jako inhibitory tyrosin kinázy
Oblast techniky
Tato přihláška vychází z prozatímní přihlášky USA č. 60/127.963, jejíž veškeré informace jsou zde zahrnuty ve formě odkazu.
Tento vynález se týká 3-arylpyrazolů se dvěma kondenzovanými kruhy 4,5(3,4), jež jsou inhibitory proteinkináz, zvláště tyrosinkináz a serin/threoninkináz, přičemž některé z nich jsou nové sloučeniny, farmaceutických kompozic obsahujících tyto pyrazoly a způsobů přípravy těchto pyrazolů.
Dosavadní stav techniky
Existuje nejméně 400 enzymů identifikovaných jako proteinkinázy. Tyto enzymy katalyzuji.fosforylaci cílových proteinových substrátů. Fosforylace je obvykle přenosová reakce týkající se přenosu fosfátové skupiny z ATP na proteinový substrát. Specifická struktura v cílovém substrátu, na kterou se fosfát přenáší je tyrosinový, serinový nebo threoninový zbytek. Protože tyto zbytky aminokyselin jsou cílové struktury pro fosforylový transfer, jsou tyto proteinkinázové enzymy obvykle označovány jako tyrosinkinázy nebo serin/threoninkinázy.
K fosforylačním reakcím a opačně působícím fosfatázovým reakcím na tyrosinových, serinových a threoninových zbytcích dochází v nesčetných buněčných procesech obsažených v odezvách na různé nitrobuněčné signály (typicky zprostředkované buněčnými receptory), při regulaci buněčných funkcí a aktivaci a deaktivaci buněčných procesů. Kaskáda proteinkináz se často zúčastňuje nitrobuněčné transdukce signálu (signální dráhy) a je nezbytná pro uskutečnění těchto buněčných procesů. Vzhledem k jejich všudypřítomnosti
I ♦ « lze v těchto procesech proteinkinázy nalézt jako integrální část plazmatické membrány buď jako cytoplazmové enzymy nebo enzymy umístěné v jádře, často jako složky enzymových komplexů. V mnoha případech jsou tyto proteinkinázy podstatným prvkem enzymových a strukturálních proteinových komplexů, které určují, kde a kdy v buňce dojde k buněčnému procesu.
Tyrosínproteinkinázy
Tyrosinproteinkinázy (PTK) jsou enzymy katalyzující fosforylaci specifických tyrosinových zbytků v buněčných * proteinech. Tato posttranslační úprava uvedených substrátových proteinů, jež jsou často samy enzymy, účinkuje jako molekulární přesmyk (switch) regulující buněčné bujení, aktivaci a diferenciaci (přehledně viz Schlessinger a Ulrich, 1992, Neuron, 9, ss. 383-391. Při četných chorobných stavech se pozorovala nestandardní nebo nadměrná aktivita PTK včetně benigních a maligních poruch typu bujení a v podobě chorob vznikajících nevhodnou aktivací imunitního systému (například autoimunitních poruch), odmítnutí aloštěpů a onemocnění typu štěp versus hostitel. Navíc receptorové tyrosinproteinkinázy specifické pro endotelové buňky jako je KDR nebo Tie-2 zprostředkují angiogenní proces a tím se účastní podpory vývoje karcinomů a jiných chorob zahrnujících nežádoucí vaskularizaci (například diabetické retinopatie, neovaskularizace cévnatky v důsledku věkem podmíněné makulární degenerace, lupénky, artritidy, dětské hemangiomy).
Tyrosinkinázy mohou být receptorového typu (s ’ mimobuněčnými, transmembránovými a nitrobuněčnými doménami) nebo nereceptorového typu (zcela nitrobuněčné).
Receptorové tyrosinkinázy (RTK) Receptorové tyrosinkinázy zahrnují velkou rodinu transmembránových receptorů s různými biologickými • · * · ’ • · · .···· • · · · · ♦ ··· ··· ·····«· ·· ··· aktivitami. Do současné doby bylo identifikováno nejméně devatenáct (19) rozdílných podrodin RTK. Rodina receptorových tyrosinkináz zahrnuje receptory, jež jsou rozhodující pro růst a diferenciaci různých buněčných typů (Yarden a Ullrich, Ann. Rev. Biochem, 57, ss. 433-478, 1988; Ullrich a Schlessinger, Cell, 61, ss. 243-254, 1990). Vlastní funkce tyrosinkinázových receptorů se aktivuje vazbou ligandu, jejímž následkem je fosforylace receptorů a četných buněčných substrátů a následně i různé buněčné odezvy (Ullrich a Schlessinger, 1990, Cell, 61, ss. 203212). Takto je signální dráha zprostředkovaná receptorovou tyrosinkinázou iniciována mimobuněčnou interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligand), po níž typicky následuje dimerizace receptorů, stimulace vlastní tyrosinproteinkinázové aktivity a transfosforylace receptorů. Tím jsou vytvořena vazebná místa pro nitrobuněčné molekuly signální dráhy, což vede k vytvoření komplexů se spektrem cytoplazmových signálních molekul usnadňujících vhodnou buněčnou odezvu (například buněčné dělení, diferenciaci, metabolické účinky, změny v mimobuněčném mikroprostředí (viz Schlessinger a Ullrich, 1992, Neuron, 9, ss. 1-20) .
Proteiny s doménou SH2 (src homology-2) nebo doménou vážící fosfotyrosin (PTB) vytvářejí s vysokou afinitou vazby s aktivovanými receptory tyrosinkinázy a jejich substráty a přenášejí signály do buněk. Obě domény rozpoznávají fosfotyrosin (Fantl a další, 1992, Cell, 69, ss. 413-423); Songyang a další, 1994, Mol. Cell. Biol., 14, ss. 2777-2785; Songyang a další, 1993, Cell, 72, ss. 767-778; Koch a další, 1991, Science, 252, ss. 668-678; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol., 1997, 1 (2), ss. 227-234 a Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol., 1997, 7(6), ss. 835-838. Bylo identifikováno několik proteinových substrátů, jež se spojují s receptorovými tyrosinkinázami (RTK). Lze je rozdělit do dvou • · hlavních skupin: 1. substráty s katalytickou doménou; a 2. substráty, jež takovou doménu nemají, ale slouží jako adaptory a spojují se s katalyticky aktivními molekulami (Songyang a další, 1993, Cell, 72, ss. 767-778). Specifičnost interakcí mezi receptory nebo proteiny a doménami SH2 nebo PTB jejich substrátů závisí na zbytcích aminokyselin obklopujících bezprostředně fosforylovaný tyrosinový zbytek. Například rozdíly ve vazebných afinitách mezi doménami SH2 a aminokyselinovými sekvencemi obklopujícími fosfotyrosinové zbytky na individuálních * receptorech korelují s pozorovanými rozdíly ve fosforylačních profilech jejich substrátů (Songyang a další, 1993, Cell, 72, ss. 767-778.) Z pozorování vyplývá, že funkce každé receptorové tyrosinkinázy je určena nejen typem exprese a dosažitelností ligandů, ale i uspořádáním signálních drah po směru signálu, aktivovaných specifickým receptorem i časovým sledem a trváním těchto stimulů. Fosforylace tedy představuje důležitý regulační stupeň určující selektivitu signálních drah iniciovaných specifickými receptory růstových faktorů stejně jako diferenciaci faktorových receptorů.
Několik receptorových tyrosinkináz a na ně vázaných růstových faktorů se v angiogenezi považuje za významný činitel, ačkoliv některé ji mohou podporovat nepřímo (Mustonen a Alitalo, J. Cell. Biol., 129, ss. 895-898, 1995). Jedna taková receptorová tyrosinkináza známá jako kináza 1 plodových jater (FLK-1) je členem podskupiny III RTK. Jiným označením lidské FLK-l/KDR je receptor kinázy * obsahující vloženou doménu (KDR) (Terman a další, Oncogene 6, ss. 1677-1683, 1991). Dalším alternativním označením pro FLK-l/KDR je receptor 2 růstového faktoru buněk cévní výstelky (VEGFR-2), protože se s velkou afinitou váže na VEGF. Myší typ FLK-l/VEGFR-2 byl rovněž označován NYK (Oelrichs a další, Oncogene 8 (1), ss. 11-15, 1993). Byly izolovány DNA kódující myší, krysí a lidskou FLK-1 a publikován příslušný nukleotid a kódované sekvence aminokyselin (Matthews a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, ss. 9026-9030, 1991; Terman a další, 1991, viz výše; Terman a další, Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, ss 15791586, 1992; Sarzani a další, viz výše; a Millauer a další, Cell, 72, ss. 835-846, 1993). Z četných studií jako je například studie publikovaná Millauerem a dalšími (viz výše) vyplývá, že VEGF a FLK-l/KDR/VEGFR-2 jsou dvojice ligandreceptor, jež hraje významnou roli v proliferaci buněk cévní výstelky a při vytváření a obnově krevních řečišť, označovaných jako vaskulogeneze a angiogeneze.
Jiný typ RTK podskupiny III označovaný jako tyrosinkináza-1 typu fms (Flt-1) je v blízkém vztahu k FLK1/KDR (DeVries a další, Science, 255, ss. 989-991, 1992; Shibuya a další, Oncogene, 5, ss. 519-524, 1990). Jiným označením pro Flt-1 je receptor 1 růstového faktoru buněk cévní výstelky (VEGFR-1). V současné době bylo zjištěno, že se členové podrodin FLK-l/KDR/VEGFR-2 a Flt-l/VEGFR-1 nalézají primárně exprimovány na buňkách výstelky. Členové této podskupiny jsou specificky stimulovány členy rodiny ligandů typu růstových faktorů buněk cévní výstelky (VEGF) (Klagsburn a D'Amore, Cytokine and Growth Factor Reviews, 7, ss 259-270, 1996) . Růstový faktor buněk cévní výstelky (VEGF) se na Flt-1 váže s větší afinitou než FLK-l/KDR a je mitogenní vůči buňkám cévní výstelky (Terman a další, 1992, viz výše; Mustonen a další, viz výše; DeVries a další, viz výše). Soudí se, že Flt-1 je rozhodujícím činitelem organizace výstelky při vývoji cév. Exprese Flt-1 je spojena s ranným vývojem cév v myších embryích a s neovaskularizací při hojení ran (Mustonen a Alitalo, viz výše). Exprese Flt-1 v dospělých orgánech jako jsou ledvinná klubíčka naznačují, že tento receptor má vedle vlivu na buněčný růst další funkci, která nesouvisí s buněčným růstem. (Mustonen a «· * • < · · < · · · ·
». · · • « · · • ·
Alitalo, viz výše).
Jak již bylo uvedeno, nové důkazy naznačuji, že VEGF má význam při stimulaci normální i patologické angiogeneze. (Jakeman a další, Endocrinology, 133, ss. 848-859, 1993; Kolch a další, Breast Cancer Research and Treatment, 36, ss. 139-155, 1995; Ferrara a další, Endocrine Reviews, 18 (1), ss. 4-25, 1997; Ferrara a další, Regulation of Angíogenesis (vyd. L. D. Goldberg a E. M. Rosen), ss. 209-232, 1997). Kromě toho se VEGF zúčastňuje regulace a podpory propustnosti cév (Conolly a další, J. Biol. Chem., 264, ss. 20017-20024, 1989; Brown a další, Regulation of Angíogenesis (vyd. L. D. Goldberg a E. M. Rosen), SS. 233-269, 1997).
Byly popsány různé formy VEGF vzniklé alternativním sestřihem mRNA včetně čtyř druhů, které popsal Ferrara a další (J. Cell. Biochem., 47, ss. 211-218, 1991) . Tyto secernované a převážně s buňkami spojené druhy VEGF identifikoval Ferrara a další, viz výše, a je známo, že. příslušný protein existuje ve formě disulfidicky spojených dimerů.
V poslední době bylo identifikováno několik příbuzných homologů VEGF. Jejich role v normálních fyziologických procesech a v chorobných procesech ještě nebyla objasněna. Kromě toho jsou členové rodiny VEGF často koexprimovány s VEGF v četných tkáních a všeobecně jsou schopny vytvářet s VEGF dimery. Tato vlastnost pravděpodobně mění receptorovou specificitu a biologické účinky heterodimerů a dále komplikuje objasnění jejich specifických funkcí, jak bude vysvětleno níže (Korpelainen a Alitalo, Curr. Opin. Cell. Biol., ss. 159-164, 1998 a v nich citované odkazy).
Růstový faktor placenty (PIGF) má sekvenci aminokyselin vykazující výraznou homologii se sekvenci VEGF (Park a další, J. Biol. Chem., 269, ss. 25646-25654, 1994; Maglione a další, Oncogene, 8, ss. 925-931, 1993). Stejně jako u VEGF, sestřihem mRNA vznikají různé druhy PIGF a protein
existuje v dimerní formě (Park a další, viz výše). PIGF-1 a PIGF-2 se s vysokou afinitou váže na Flt-1 a PIGF-2 se též intenzivně váže na neuropilin-1 (Migdal a další, J. Biol. Chem., 273 (35), ss. 22272-22278), ale ani jeden z nich se neváže na FLK-l/KDR (Park a další, viz výše). Bylo zjištěno, že PIGF posiluje jak cévní permeablitu tak mitogenní účinek VEGF na buňky výstelky, když je VEGF přítomen při nízkých koncentracích (údajně vlivem tvorby heterodimeru) (Park a další, viz výše).
VEGF-B se připravuje ve dvou isoformách (167 a 185 zbytků), jež se zřejmě též váží na Flt-l/VEGFR-1. Patrně se uplatňuje při regulaci degradace mimobuněčné matrice, buněčné adhezi a migraci prostřednictvím modulace exprese a aktivity aktivátoru plasminogenu urokinázového typu a inhibitoru 1 aktivátoru plasminogenu. (Pepper a další, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1998), 95(20), ss. 11709-11714).
VEGF-C byl původně klonován jako ligand pro VEGFR3/Flt-4 primárně exprimovaný buňkami lymfatické výstelky. V plně upravené formě VEGF-C může též vázat KDR/VEGFR-2 a stimulovat bujení a migraci výstelkových buněk in vitro a angiogenezi v modelech in vivo (Lymboussaki a další, Am. J. Pathol. (1998), 153(2), ss. 395-403; Witzenbichler a další, Am. J. Pathol. (1998), 153(2), ss. 381-394). Transgenní nadměrná exprese VEGF-C má za následek bujení a zvětšení pouze mízních cév, zatímco krevní cévy zůstávají nedotčeny. Na rozdíl od VEGF se VEGF-C neindukuje hypoxií (Ristimaki a další, J. Biol. Chem., (1998), 273,(14), ss. 8413-8418).
Nejnověji objevený VEGF-D je strukturně velice podobný VEGF-C. Uvádí se, že VEGF-D se váže nejméně na dva receptory VEGFR, a to VEGFR-3/Flt-4 a KDR/VEGFR-2. Původně byl klonován jako c-fos indukovatelný mitogen pro fibroblast a je nej výrazněji exprimován v mezenchymálních buňkách plic a kůže (Achen a další, Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. (1998), 95(2), ss. 548-553 a tam obsažené odkazy).
tit · · ·
Uvádí se, že VEGF-C a VEGF-D indukují vzrůst vaskulární permeability in vivo při Milesově testu injektováním do kožní tkáně. (PCT/US97/14696; WO98/07832, Witzenbach a další, viz výše). Fyziologická role a význam těchto ligandu při modulaci vaskulární hyperpermeability a endotelových odpovědí ve tkáních v nichž jsou exprimovány zůstává nej istá.
Na základě nových objevů dalších homologů VEGF a VEGFR a precedentů pro heterodimerizaci ligandu a receptoru se objevuje možnost, že působeni takových homologů VEGF zahrnuji tvorbu heterodimerů ligandů VEGF a/nebo heterodimerizaci receptorů nebo vazbu na ještě neobjevené VEGFR (Witzenbichler a další, viz výše). Nová sdělení též uvádějí, že neuropilin-1 (Migdal a další, viz výše) nebo VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler a další, viz výše) nebo receptory*jiné než KDR/VEGFR-2 mohou být odpovědné za indukci vaskulární permeability . (Stacker S. A., Vítali A., Domagala T., Nice E. a Wilks A.F. Angiogenesis and Cancer Conference, Amer. Assoc. Cancer Res., Jan. 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetelogia, 40, ss. 118-120 (1997)). Až dosud nebyl podán žádný přímý důkaz významné role KDR ve vaskulární hyperpermeabilitě zprostředkované VEGF.
Nereceptorové tyrosinkinázy
Nereceptorové tyrosinkinázy představují soubor buněčných enzymů bez mimobuněčných a transmembránových sekvencí. Dodnes bylo identifikováno více než dvacetčtyři jednotlivých nereceptorových tyrosinkináz zahrnujících jedenáct podrodin (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack a LIMK). Dnes je podrodina Src nereceptorových tyrosinkináz tvořena největším počtem tyrosinproteinkináz a zahrnuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk. Podrodina enzymů Src byla spojována s onkogenezí.
Podrobnější pojednání o nereceptorových tyrosinkinázách se najde v článku: Bolen, 1993, Oncogen, 8, ss. 2025-2031, zde zahrnutém ve formě odkazu.
Bylo zjištěno, že mnoho tyrosinkináz, jak RTK tak nereceptorových tyrosinkináz, je zúčastněno v buněčných signálních drahách uplatňujících se v četných patogenních stavech jako je karcinom, lupénka a dalších hyperproliferačních poruchách nebo hyperimunních odezvách.
Vývoj sloučenin pro modulaci tyrosinproteinkináz (PTK).
Vzhledem k předpokládanému významu tyrosinproteinkináz pro kontrolu, řízení a modulaci buněčného bujení, chorob a poruch spojených s abnormálním buněčným bujením bylo vykonáno mnoho pokusů ve snaze nalézt inhibitory receptorů tyrosin kináz a nereceptorových tyrosinkináz s využitím různých přístupů včetně využití mutantních ligandů (Patent USA č; 4,966.849), rozpustných receptorů a protilátek (Přihláška č. WO 94/10202; Kendall a Thomas, 1994, Proč. Nati. Acad. Sci., 90, ss. 10705-10709; Kim a další, 1993, Nátuře, 362, SS. 841-844), RNA ligandů (Jellinek a další, Biochemistry, 33, ss. 10450-10456; Takano a další, 1993, Mol. Bio. Cell, 4, s. 358A; Kinsella a další, 1992, Exp. Cell. Res. 199, ss. 56-62; Wright a další, 1992, J. Cellular Phys., 152, ss. 448-457) a inhibitorů tyrosinkinázy (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patent USA č. 5,330.992; Mariani a další, 1994, Proč. Am. Assoc. Cancer Res., 35, s. 2268).
Nověji se činily pokusy identifikovat malé molekuly působící jako inhibitory tyrosinkinázy. Jako inhibitory tyrosinkinázy se obecně popisovaly například bismonocyklické, bicyklické nebo heterocyklické arylové sloučeniny (PCT WO 92/20642) a deriváty vinylenazaindolu (PCT WO 94/14808). Styrylsloučeniny (Patent USA č. 5,217.999), styrylem substituované pyridylové sloučeniny (Patent USA 5,302.606), některé chinazolinové sloučeniny ’ζ·» · · · · · ίο ;
— ... ... ··· ···· ·· ··· (Přihláška ΕΡ č. 0 566 266 Al; Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8(4), ss. 475-478), selenindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxysloučeniny (PCT WO 92/21660) a sloučeniny benzenfosfonové kyseliny PCT WO 91/15495) byly popsány jako sloučeniny použitelné jako inhibitory tyrosinkinázy pro užití při léčbě karcinomu. Anilincinnoliny (PCT WO 97/34876) a sloučeniny na bázi derivátů chinazolinu (PCT WO 97/22596; PCT WO 97/42187) byly popsány jako inhibitory angiogeneze a vaskulární permeability.
Kromě toho se činily pokusy s identifikací malých molekul působících jako inhibitory serin/threoninkinázy. Zejména byly popsány sloučeniny na bázi bis(indolylmaleinimidu) jako inhibitory zvláštních isoforem PKC serin/threoninkinázy, jejichž dysfunkce je spojována se změněnou cévní permeabilitou při onemocněních, na nichž se podílí VEGF (PCT WO 97/40830; PCT WO 97/40831)
Nalezení účinných malých sloučenin specificky inhibujících signální dráhu modulací aktivity receptorových a nereceptorových tyrosinkináz a serin/threoninkináz za účelem řízeni a modulace nenormálního a nežádoucího buněčného bujení, diferenciace nebo metabolismu je proto potřebné. Zvláště by bylo prospěšné identifikování způsobů a sloučenin pro specifickou inhibici funkcí tyrosinkinázy, jež je rozhodující pro angiogenní procesy nebo vznik cévní hyperpermeability, jež vede k edémům, břišní vodnatelnosti, výpotkům, exsudátům, makromolekulárním extravazátům (výronům) a depozicím v matrici, stejně jako k poruchám s nimi spojeným.
Podstata vynálezu
Tento vynález nabízí sloučeninu vzorce I
r6 a její farmaceuticky přijatelné soli, přičemž ve vzorci Li přestavuje skupinu vzorce (E)s(CH2)q, v niž E je NR24, O nebo S, s je 0 nebo 1 a q je celé číslo od 0 do 6, s podmínkou, že jestliže s je 1, q je nejméně 1, přičemž je alkylenový řetězec případně substituován jednou nebo více skupinami ze skupiny, kterou tvoří: Cl-6-alkylová skupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; Cl-6alkoxyskupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; hydroxyskupina; halogen nebo případně substituovaná aminoskupina;
A představuje CONH, NHCO, SO2NH, NHSO2 nebo NR25;
L2 představuje skupinu vzorce (CH2) r, v níž r je celé číslo od 0 do 6, v níž je alkylenový řetězec případně substituován jednou nebo více skupinami z následujících: Cl-6-alkylová skupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; Cl-6-alkoxyskupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; hydroxyskupina; halogen nebo případně substituovaná aminoskupina;
R2 představuje Cl-6-alkylovou skupinu případně substituovanou jedním nebo více z následujících substituentů: halogen, hydroxyskupina, Cl-6-alkoxy nebo případně substituovaná aminoskupina; Cl-6-alkoxyskupina případně substituovaná jedním nebo více z následujících
substituentů: halogen, hydroxyskupina, Cl-6-alkoxyskupina nebo případně substituovaná aminoskupina; nebo R2 j e halo, hydroxy, kyano, nitro, karbamoyl, alkanoylskupina Cl-6, (Cl— 6-alkoxy)karbonylskupina nebo případně substituovaná aminoskupina;
n představuje 0, 1, 2 nebo 3
X představuje a) substituovaný methylen, b) karbonyl, c) kyslík, d) skupinu -C=NOR7, v niž R7 představuje H nebo Cl-4-alkyl e) skupinu NR8, v níž R8 představuje H, případně substituovanou Cl-4-alkylovou skupinu nebo případně substituovaný fenyl, f) skupinu vzorce (CH2)n, v níž n je 1, 2 nebo 3, nebo g) skupinu vzorce S(O)p, v níž p je 0, 1 nebo 2;
R3, R4, R5 a R6 nezávisle představují a) H, b) halogen, c) Cl-6-alkylskupinu případně substituovanou jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyskupina, Cl-6alkoxyskupina, halogen n-ebo případně substituovaná aminoskupina d) Cl-6-alkoxyskupina případně substituovaná jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyskupina, Cl-6-alkoxyskupina, halogen nebo případně substituovaná aminoskupina, za předpokladu že tyto skupiny nejsou vázány na uhlík vázaný na kyslík alkoxyskupiny; e) případně substituovaná fenoxyskupina, f) hydroxyskupina, g) skupina CORa v níž Ra představuje hydroxyskupinu, Cl-6alkoxyskupinu nebo Ra představuje případně substituovanou aminoskupinu, h) případně substituovaná aminoskupina, i) Cl6-alkanoylskupina, j) nitroskupina, k) případně substituovaná fenyl-Cl-6-alkylskupina, 1) případně substituovaná fenyl-Cl-6-alkoxyskupina, m) kyanoskupina nebo o) C2-4-alkenylskupína nebo C2-4-alkynylskupina, které jsou obě případně substituovány fenylem, který je případně substituován jedním nebo více následujícími substitueňty: Cl-6-alkylcvá skupina, Cl-6-alkoxylová skupina nebo halogen;
a
1) když A je SO2NH nebo NHSO2
Ri představuje a) případně substituovaný fenyl, b) případně substituovaný heteroaryl, c) pěti, šesti nebo sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh obsahující dusíkový atom, který případně obsahuje další heteroatom vybraný ze skupiny 0, S nebo N a je případně substituován Cl-6alkylovou skupinou, přičemž uvedený nasycený kruh může být připojen přes uhlík nebo heteroatom, d) případně substituovanou aminoskupinu nebo e) Cl-6-alkoxyskupinu.
2) když A představuje CONH nebo NHCO
Ri představuje a) fenyl substituovaný nitroskupinou nebo jednou nebo více Cl-6-alkoxyskupinami případně substituovanými jedním nebo více substituenty ze skupiny: halogen, hydroxyl, Cl-6-alkoxyskupina nebo případně substituovaná aminoskupina, b) případně substituovaný heteroaryl nebo c) pěti, šesti nebo sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh obsahující dusíkový atom, který případně obsahuje další heteroatom vybraný z 0, S nebo N a je případně substituován Cl-6-alkylovou skupinou, přičemž je uvedený nasycený kruh vázán přes uhlíkový atom nebo d) Cl-6alkoxyskupinu;
3) když A představuje skupinu NR25 a q je nejméně 1, potom
Ri představuje a) případně substituovaný fenyl, b) případně substituovaný heteroaryl nebo c) případně substituovanou aminoskupinu; a
4) když A představuje skupinu NR25 aqjeOasjeO, potom Ri představuje případně substituovaný heteroaryl;
R24 a R25 nezávisle představují H; Cl-6-alkylovou skupinu případně substituovanou jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyl, Cl-6-alkoxyskupina, ·· • ·
halogen nebo případně substituovaná aminoskupina; Cl-6alkanoylskupinu nebo Cl-6-alkylsulfonylskupinu, za předpokladu, že žádné dva heteroatomy nejsou vázány na tentýž hybridizovaný uhlíkový atom sp3 .
Odborníkům je zřejmé, že když n je jiné než 0 nebo 1, skupiny R2 mohou být tytéž nebo rozdílné.
Výraz případně substituovaná aminoskupina znamená skupinu NRkRi, v níž Rk a Ri nezávisle představují vodík, C1-12-alkylovou skupinu, 1-12-alkoxylovou skupinu, C3-12cykloalkylovou skupinu, fenylovou skupinu, fenyl-Cl-6alkylovou skupinu, heteroarylovou skupinu nebo heteroarylCl-6-alkylovou skupinu, přičemž každá z těchto skupin je případně substituována jedním nebo více následujícími substituenty: Cl-6-alkylová skupina, Cl-6-alkoxylová skupina, hydroxyl, halogen; nebo Rk a Ri společně s dusíkovým atomem, k němuž jsou vázány, představují pěti, šesti nebo sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh, který případně obsahuje další heteroatom vybraný mezi 0, S nebo N a je případně substituován-Cl-6-alkylovou skupinou.
Výraz případně substituovaný zde používaný ve vztahu k fenylové a heteroarylové skupině znamená substituovaný jedním nebo více z následujících substituentů: a) halogen,
b) Cl-6-alkylskupina případně substituovaná jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyl, halogen, případně substituovaná aminoskupina nebo pěti-, šesti- nebo sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh obsahující dusíkový atom, který případně obsahuje další heteroatom vybraný z 0, S nebo N a je případně substituován Cl-6-alkylovou skupinou, přičemž je uvedený nasycený kruh vázán přes uhlíkový atom,
c) Cl-6-alkoxyskupina případně substituovaná jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyl, Cl-6alkoxyskupina, halogen, nebo případně substituovaná aminoskupina za předpokladu, že tyto skupiny nejsou vázány na uhlík, který je vázán na kyslík alkoxyskupiny, nebo pěti- šesti- nebe sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh obsahující dusíkový atom, který případně obsahuje další heteroatom vybraný z 0, S nebo N a je případně substituován Cl-β-alkylovou skupinou, přičemž uvedený nasycený kruh je vázán přes uhlíkový atom, d) případně substituovaná fenoxyskupina, e) hydroxyl, f) skupina C0Ra, v níž Ra představuje hydroxyskupinu, Cl-6-alkoxyskupinu, nebo Ra představuje skupinu NRbRc, v níž Rb a Rc nezávisle představují vodík, Cl-12-alkylskupinu, C3-12cykloalkylskupinu nebo fenyl, přičemž alkylová skupina, cykloalkylová skupina a fenyl jsou případně substituovány jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyl, halogen, C3-12-cykloalkylová skupina nebo aminoskupina vzorce NRhR3, v němž Rh a Rj nezávisle představují vodík nebo Cl-6-alkylovou skupinu, nebo v němž Rh a Rj společně s dusíkem, na který jsou vázány, představují pěti-, šestinebo sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh, který případně obsahuje další heteroatom vybraný z 0, S, nebo N a je případně substituován Cl-6-alkylovou skupinou, g) skupina vzorce NRdRa, - v němž Rd a Re jsou nezávisle zvoleny z vodíku, Cl-12-alkylové skupiny, C3-12-cykloalkylové skupiny nebo fenylu nebo skupiny CORf ke Rf představuje vodík, Cl-12alkylovou skupinu, C3-12-cykloalkylovou skupinu, fenyl-Cl-6alkylovou skupinu nebo fenyl, přičemž ve všech případech alkylová skupina, cykloalkylová skupina a fenyl jsou případně substituovány jedním nebo více z následujících substituentů: halogen, hydroxy-, nitro- nebo aminoskupina vzorce NRhRj, kde Rh a Rj jsou definovány výše, h) skupina vzorce O(CH2)mRg< v němž m je 2, 3, 4 nebo 5 a Rg představuje hydroxyskupinu nebo skupinu vzirce NRdRe, v němž Rd a Re jsou definovány výše; nebo Rg představuje skupinu C0Ra, v níž Ra je definováno výše a m je 1, 2, 3, 4, nebo 5, i) nitroskupina, j) případně substituovaný fenyl-Cl-6-alkyl, k) případně substituovaný fenyl-Cl-6-alkoxylová skupina, 1) kyanoskupina, m) C3-6-alkenyloxyskupina, n) pyridyloxy- nebo pyridylthioskupina, v niž je pyridinový kruh případně substituován jedním nebo více z následujících substituentů: trifluormethyl- nebo nitro-, o) hydroxyamidino-, p) aminomethyl-, q) formamidomethyl-, r) Cl-6-alkylthioskupina, s) fenyl- nebo t) C2-4-alkenylskupina nebo C2-4alkynylskupina, jež jsou obě případně substituovány fenylem, který je případně substituován jedním nebo více z následujících substituentů: Cl-6-alkylová skupina,Cl-6alkoxylová skupina nebo halogen.
Termín heteroaryl znamená případně substituovaný mononebo bicyklický aromatický heterocyklus, kde heterocyklus obsahuje 1, 2, 3 nebo 4 heteroatomy vybrané z dusíku, síry nebo kyslíku. Heteroarylová skupina může být vázána přes uhlík, nebo heteroatom. Vhodné heteroarylové skupiny zahrnují imidazolyl, furyl, pyrrolyl, thienyl, oxazolyl, thiazolyl, isoxazolyl, thiadiaz-olyl, oxadiazolyl, pyridinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, pyridazinyl, chinolyl, isochinolyl, indazolyl, benzoxazolyl, benzofuryl,. benzothiazolyl, indolizinyl, imidazopyridinyl nebo benzo(b)thienylskupinu, jež jsou případně všechny substituovány jak popsáno výše.
Když případně substituovanou aminoskupinu představuje saturovaný heterocyklický kruh, je tento kruh výhodně morfolino, perhydrothiazin-4-yl, piperidino, pyrrolidin-1yl, piperazin-l-yl, 4-methylpiperazin-4-yl, thiamorfolinyl, perhydro-1,4-diazepin-l-yl nebo perhydroazepinyl.
Výraz substituovaný methylen znamená například methylen substituovaný jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyl nebo Cl-4-alkylskupinu, v níž je případně alkylová skupina dále substituována skupinou NRrRs, kde Rr a Rs nezávisle představují H nebo Cl-6-alkylskupinu.
Je samozřejmé, že kterákoliv zde zmíněná skupina obsahující tři nebo více atomů znamená skupinu, která může mít přímý nebo rozvětvený řetězec. Například alkylová skupina může zahrnovat propyl, který zahrnuje n-propyl a isopropyl, a butyl, který zahrnuje n-butyl, sec.butyl, isobutyl a terč.butyl. Termín C3-12-cykloalkyl zahrnuje skupiny s můstky, například adamantyl. Zde užívaný termín halogen (halo) znamená fluor, chlor, brom nebo jod.
Je výhodné, když X je CH2 nebo S.
V první skupině výhodných sloučenin vzorce I je X CH2 a A j e NR25 .
Ve druhé skupině výhodných sloučenin vzorce I je X S a A je NR25.
Ve třetí skupině výhodných sloučenin vzorce I je X CH2 a A je HNSO2.
Ve čtvrté skupině výhodných sloučenin vzorce I je X CH2 a A je SO2NH.
V páté skupině výhodných sloučenin vzorce I je X CH2 a A je CONH.
V šesté skupině výhodných sloučenin vzorce-· I je X CH2 a A je NHCO.
V nejvýhodnějšleh sloučeninách vzorce I je X CH2, A je NR25, Li je (CH2)q, přičemž g je celé číslo od 1 do 6 a alkylenový řetězec je případně substituován jedním nebo více ze substituentů: Cl-6-alkylová skupina případně substituovaná jedním nebo dvěma hydroxyly, halogeny nebo případně substituovanou aminoskupinou; Cl-6-alkoxylová skupina případně substituovaná jedním nebo dvěma hydroxyly, halogeny nebo případně substituovanou aminoskupinou; hydroxyl; halogen; nebo případně substituovaná aminoskupina; L2 je vazba a Ri je případně substituovaný pyridyl.
Sloučeniny vzorce 1 mohou existovat jako soli s farmaceuticky přijatelnými kyselinami. Tento vynález takové soli zahrnuje. Příklady takových kyselin zahrnují hydrochloridy, hydrobromidy, sírany, methansulfonáty, dusičnany, maleáty, octany, citráty, fumaráty, vinany [například (+)vinany, (-)vinany nebo jejich směsi včetně
·· ·· • · • · · • · • · · · · racemických směsí], jantarany, benzoáty a soli s aminokyselinami jako je glutamová kyselina. Tyto soli se mohou připravit způsoby známými zkušeným odborníkům.
Určité sloučeniny vzorce I nesoucí kyselé substituenty mohou existovat jako soli s farmaceuticky přijatelnými bázemi. Ter.to vynález takové soli zahrnuje. Příklady takových solí jsou sodné soli, draselné soli, soli lysinu a argininu. Tyto soli lze připravit způsoby známými odborníkům.
Určité sloučeniny vzorce I a jejich soli mohou existovat ve více než jedné krystalové formě a tento vynález zahrnuje všechny krystalové formy a jejich směsi.
Určité sloučeniny vzorce I a jejich soli mohou existovat ve formě solvátů, například hydrátů, a tento vynález zahrnuje všechny solváty a jejich směsi.
Ur-čité sloučeniny vzorce I mohou obsahovat jeden nebo více center chirality a existovat v různých opticky aktivních formách. Když sloučeniny podle vzorce I obsahují jedno centrum chirality, sloučeniny existují ve dvou enantiomerních formách a tento vynález zahrnuje oba enantiomerv a směsi enantiomerů. Enantiomery se mohou štěpit způsoby známými odborníkům, například tvorbou diastereoisomerních solí, jež lze oddělit například krystalizací, vytvořením diastereoisomerních derivátů nebo komplexů, jež lze separovat například krystalizací, rozdělovači plynovou chromatografii nebo kapalinovou chromatografii; selektivní reakcí jednoho enantiomerů s reagentem pro něj specifickým, například enzymatickou esterifikací; nebo plynovou rozdělovači chromatografii nebo kapalinovou chromatografii v chirálním prostředí, například na chirální stacionární fázi jako je oxid křemičitý s vázaným chirálním ligandem nebo v přítomnosti chirálního rozpouštědla. Je pochopitelné, že při konverzi požadovaného enantiomerů na jinou chemickou entitu jedním z výše popsaných separačních způsobů je nutný další krok pro uvolnění požadované enantiomerní formy. Alternativně lze syntetizovat specifické enantiomery asymetrickou syntézou za použití opzicky aktivních reagentů, substrátů, katalyzátorů nebo rozpouštědel, nebo konverzí jednoho enantiomeru na jiný asymetrickou transformací.
Pokud sloučenina podle vzorce I obsahuje více než jedno centrum chrrality, může existovat v diastereoisomerních formách. Daastereoisomerní dvojice se mohou oddělit způsoby známými odborníkům, například chromatografíčky nebo krystalizací a jednotlivé enantiomery v každé dvojici lze oddělit jak je popsáno výše. Tento vynález zahrnuje všechny diastereoisomery sloučeniny vzorce I a jejich.směsi.
Určité sloučeniny vzorce I mohou existovat v různých tautomerních formách nebo jako různé geometrické isomery a tento vynález zahrnuje všechny tautomery a/nebo geometrické isomery sloučeniny vzorce I a jejich směsi.
Určité sloučeniny vzorce I mohou existovat v různých stabilních konformačních formách, jež mohou být separovatelné. Torzní asymetrie způsobená omezenou rotací kolem asymetrické jednoduché vazby, například sférickou zábranou kruhového napětí, může dovolit oddělení různých konformerů. Tento vynález zahrnuje všechny konformační isomery sloučenin vzorce I a jejich směsi.
Určité sloučeniny vzorce I mohou existovat v zwitterionrové formě sloučenin vzorce I a jejich směsí.
Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné jako inhibitory serin/threoninkináz a tyrosinkináz. Zejména jsou sloučeniny podle vynálezu použitelné jako inhibitory tyrosinkináz významně se uplatňující v hyperproliferačních chorobách, zvláště v procesu angiogeneze. Protože tyto sloučeniny jsou antiangiogenní, jsou důležitými látkami pro inhibici progrese chorobných stavů, v nichž je angiogeneze významnou složkou.
• Φ ·*♦ • φ φ · φ • » φ· • « · · · • * · · «φφ ·· <··
V dalším jsou definovány výhodné substituenty.
Je výhodné, když Ri představuje případně substituovaný fenyl, případně substituovaný thienyl, případně substituovaný pyridyl, případně substituovaný furyl nebo případně substituovaný pyrrolyl.
Výhodněji Ri představuje 2-thienyl, 3-thienyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl nebo 4-pyridyl, jež jsou všechny případně substituovány, a případně mono-, di- a trisubstituovaný fenyl, přičemž se substituenty vyberou z případně substituovaných alkoxysubstituentů (zvláště methoxy, 3-morfolinopropoxy, 2-morfolinethoxy, 3karboxypropoxy, karboxymethoxy, 2-karboxyethoxy, 2karbamoylethoxy, karbamoylmethoxy, 3-karbamoylpropoxy, 2piperidinoethoxy, 2-(piperazin-l-yl)ethoxy, 2-(pyrrolidin-1yl)ethoxy, 2-dimetylaminoethoxy, 2-perhydrothiazin-4yl)ethoxy, 3-piperidinopropoxy, 3-(piperazin-l-yl)propoxy, 3-(pyrrolidin-l-yl)propoxy, 3-dimethylaminopropoxy, 3(perhydrothiazin-4-yl)propoxy, nižší alkyl (zvláště methyl), halo (zvláště fluor a chlor), aryl (zvláště fenyl), hydroxy, aryloxy (zvláště fenoxy), arylalkoxy (zvláště benzyloxy), di-(nižší)alkylamino (zvláště dimethylamino), polyhalo(nižší)alkyl, polyhalo-(nižší)alkoxy (zvláště difluormethoxy), nitro, kyano, (nižší)alkylthio (zvláště methylthio, karboxy, (nižší)alkoxykarbonyl (zvláště methoxykarbonyl), amido (zvláště acetamido a benzamido) a případně substituovaný karbamoyl (zvláště karbamoyl, Nmethylkarbamoyl, N-fenylkarbamoyl) a pyridyloxy nebo pyridylthioskupina, v níž je pyridinový kruh případně substituován jedním nebo více ze substituentů: trifluormethyl nebo nitro.
Nejvýhodněji Ri představuje 4-pyridyl, 2formamidomethyl-4-pyridyl, 2-aminomethyl-4-pyridyl, 2(hydroxyamidino)-4-pyridyl, 2-karbamoyl-4-pyridyl, 4pyridyl-N-oxid, 2-chlor-4-pyridyl, 2-kyano-4-pyridyl, 521
--- ··· ··· »·· ·♦·· ·* ř·· methyl-2-furyl, 5-(2-nitro-4-trifluormethylfenyl)fur-2-yl, fenyl, 4-methoxyfenyl, 3-methoxyfenyl, 2-methoxyfenyl, 3,4dimethoxyfenyl, 3,4,5-trimethoxyfenyl, 4—(3— morfolinopropoxy)fenyl, 4-(2-morfolinoethoxy)fenyl, 4—(3— karboxypropoxy)fenyl, 4-karboxymethoxyfenyl, 4—(3— karbamoylpropoxy)fenyl, 4-(karbamoylmethoxy)fenyl, 3—(3— morfolinopropoxy)fenyl, 3-(2-morfolinoethoxy)fenyl, 3—(3— karboxypropoxy)fenyl, 4-karboxymethoxyfenyl, 3—(3— karbamoylpropoxy)fenyl, 3-karbamoymethoxyfenyl, 2hydroxyfenyl, 3-hydroxyfenyl, 4-hydroxyfenyl, 3-hydroxy-4methoxyfenyl, 4-hydroxy-3-methoxyfenyl, 4difluormethoxyfenyl, 3-nitrofenyl, 4-nitrofenyl, 3,5-diterc.butyl-4-hydroxyfenyl, 4-methylfenyl, 4-fluorfenyl, 2chlorfenyl, 3-chlorfenyl, 4-chlorfenyl, 2,4-dichlorfenyl, 2chlor-5-nitrofenyl, 4-fluor-5-chlorfenyl, 4-methylthiofenyl, 4-bifenylyl, 3-fenoxyfenyl, 4-fenoxyfenyl, 4-benzyloxyfenyl, 4-dimethylaminofenyl, 4-diethylaminofenyl, 4methoxykarbonylfenyl, 4-karbamoylfenyl, 4-kyanofenyl, 4-Nmethylkarbamoylfenyl, 4-N-fenylkarbamoylfenyl, 4acetamidofenyl., 4-benzamidofenyl, 4-karboxyfenyl, 4-[N- (2diethylaminoethyl)karbamoyl]fenyl, 4-(prop-l-enyloxy)fenyl, 3-(2-hydroxyethoxy)fenyl, 3-[N-(2diethylaminoethyl)karbamoylmethoxy]fenyl, 3-[3-(N-(2diethylaminoethyl)karbamoyl)propoxy]fenyl, (4-(N-(2diethylaminoethyl)karbamoyl)methoxy)fenyl, 4-[3-(N-(2diethylamir.oethyl) karbamoyl) propoxy] fenyl, 2-furyl, 5-(3,5bis(trifluormethyl)fenyl]-2-furyl, 3-brom-2-thienyl, 5methoxy-2-furyl, 5-(2-nitro-4-trifluormethylfenyl)-2-furyl, 3-N-(2-morfolinoethyl)karbamoylmethoxy)fenyl, 3-[3-(N-(2morfolinoethyl)karbamoyl)propoxyfenyl] , 4-(N-(2morfolinoethyl)karbamoylmethoxy)fenyl) , 4(morfolinoacetamido)fenyl a 4—[3—(N—(2— morfolinoethyl)karbamoyl)propoxy]fenyl.
Je výhodné, když R3, R4, R5 a R6 nezávisle představuji vodík, hale (zvláště fluor), případně substituované nižší alkoxy (zvláště methoxy, 3-morfolinopropoxy, 2morfolinoethoxy, 3-karboxypropoxy, karboxymethoxy, 2karboxyethexy, 2-karbamoylethoxy, 3-karbamoylpropoxy, 2piperidinethoxy, 2-(piperazin-l-yl)ethoxy, 2-(pyrrolidin-1yl)ethoxy, 2-dimethylaminoethoxy, 2-(perhydrothiazin-1yl)ethoxy, 3-piperidinopropoxy, 3-(piperazin-l-yl)propoxy,
3- (pyrrolidin-l-yl)propoxy, 3-dimethylaminopropoxy, 3(perhydrothiazin-4-yl)propoxy, karbamoylmethoxy, hydroxypropyloxy, hydroxyethoxy, 3-(morfolino)propoxy a 2(morfolino)ethoxy, amido (zvláště acetamido a benzamido), případně substituovaný karbamoyl (zvláště karbamoyl, Nmethylkarbamoyl a N-fenylkarbamoyl), karboxy, nitro a amino.
Ještě výhodněji R3, R4, R5 a R6 představují následující substituenty: 6,7-dimethoxy, 6,7,8-trimethoxy, 6-fluor, 6acetamido, 7-methoxy, 6-karbamoyl, 6-(N-methylkarbamoyl), 6(N-fenylkarbamoyl), 3-morfolinopropoxy a 2-morfolinoethoxy.
Zde používaný termín nižší znamená skupinu s 1 až 6 uhlíkovými atomy.
Specifické sloučeniny podle tohoto vynálezu zahrnují:
4- (1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-N-(4-pyridyl) benzylamin
N-[4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3yl)fenyl]benzensulfonamid
4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2methoxyethyl)benzamid
4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl) -N-(4nitrofenyl)benzamid
4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)imidazol-1ylacetanilid
4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-[2-imidazol-lyl)ethyl]anilin
4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2morfolinoethyl)benzensulfonamid
4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2methoxyethyl)benzensulfonamid
N-[2-(N,N-diethylamino)ethyl]-4-(1,4-dihydroindeno [1,2 — c]pyrazol-3-yl)benzylamin
N-[2-(N,N-diethylamino)ethyl]-4-(1, 4-dihydroindeno[1,2 —
c]pyrazo1-3-yl)benzensulfonamid
4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2morfolinoethyl)benzylamin
N-(4-ethoxyfenyl)-4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3yl)benzylamin (S)-4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(pyrrolidin2-methyl)benzamid
4-(1H-[1]benzothieno[3,2-c]pyrazol-3-yl)-N-[3-(imidazol-1yl)propyl]benzylamin
4-(1H-[1]benzothieno[3,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2morfolinoethyl)benzylamin a jejich farmaceuticky přijatelné soli včetně jednotlivých enantiomerů a směsí enantiomerů.
Tento vynález nabízí způsob inhibice kinázové aktivity tyrosinkináz a serin/threoninkináz zahrnující podávání při nemoci způsobené uvedenou kinázou sloučeniny představované
4
vzorcem I v koncentraci postačující pro inhibici enzymové aktivity uvedené kinázy.
Tento vynález dále zahrnuje použití těchto sloučenin ve farmaceutických kompozicích s farmaceuticky účinným množstvím výše uvedených sloučenin a farmaceuticky přijatelným nosičem nebo vehikulem. Tyto farmaceutické kompozice se mohou podávat jednotlivcům pro zpomalení nebo zastavení procesu angiogeneze a chorob vyvolaných angiogenezí, nebo pro léčbu edémů, výpotků, exsudátů nebo vodnatelnosti a dalších chorobných stavů spojených s vaskulární hyperpermeabilitou.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají antiangiogenní vlastnosti. Tyto antiangiogenní vlastnosti jsou přinejmenším zčásti způsobeny inhibici tyrosinproteinkináz podstatných pro angiogenní pochody. Z tohoto důvodu se tyto sloučeniny mohou používat jako aktivní činidla při chorobných stavech jako je artritida, ateroskleróza, lupénka, hemangiomy, angiogeneze myokardu, koronární a mozkové kolaterály, ischemická angiogeneze končetin, hojení ran, vředové choroby způsobené Helikobakterií, zlomeniny, horečka z kočičího škrábnutí, rubeosis iridis, neovaskulární zelený zákal a retinopatie jako například diabetická retinopatie a makulární degenerace související s věkem. Kromě toho se některé z těchto sloučenin mohou použít jako aktivní činidla proti solidním tumorům, zhoubné vodnatelnosti, rakovině krvetvorby a hyperproliferativním poruchám jako je zbytnění štítné žlázy (zvláště Graveova choroba) a cystám (jako hypervaskularita vaječníkového stromatu typická pro polycystický ovariální syndrom (syndrom Stein-Lever.thal) ) , protože tyto choroby potřebují bujení buněk krevních cév pro růst a/nebo metastázu.
Kromě toho se některé z těchto sloučenin mohou použít jako aktivní činidla proti popáleninám, chronickým plicním nemocem, mrtvici, polypům, anafylaxii, chronickým a alergickým zánětům, syndromu ovariální hyperstimulace, mozkovému edému spojenému s mozkovým nádorem, vysokohorské nemoci, traumatu a hypoxii indukovaným cerebrálnim nebo pulmonálnir. edémem, očnímu a makulárnímu edému, vodnatelnosti a dalším chorobám, jež se manifestují vaskulární hyperpermeabilitou, výpotky, exsudáty, výrony proteinu nebo edémem. Tyto sloučeniny budou též použitelné při léčbě poruch, při nichž výron proteinu vede k depozici fibrinu a mimobuněčné matrice, podporující bujení stromatu (trámčiny) jako například při fibróze, cirhóze a syndromu karpálního tunelu.
VEGF jsou výjimečné v tom, že jsou jedinými známými angiogenními růstovými faktory, jež přispívají k vaskulární hyperpermeabilitě a tvorbě edému. Vskutku se zdá, že vaskulární hyperpermeabilita a edém spojené s expresí nebo podáváním mnoha dalších růstových faktorů jsou zprostředkovány vznikem VEGF. Cytokiny zánětlivého původu stimulují vznik VEGF. Hypoxie má za následek zvýšení VEGF v mnoha tkáních a proto stavy zahrnující infarkt, okluze, ischemii, anemii nebo oběhové potíže typicky vyvolávají odezvy zprostředkované VEGF/VPF. Vaskulární hyperpermeabilita s připojeným edémem, pozměněnou transendotelovou výměnou a makromolekulární extravazací, jež je často provázeny diapedézou, může mít za následek nadměrnou depozici matrice, nežádoucí bujení trámčiny, fibrózu a podobně. Proto může hyperpermeabilita zprostředkovaná VEGF značně přispět k poruchám s uvedenými etiologickými znaky.
Je zřejmé, že výše uvedené poruchy jsou do značné míry zprostředkovány aktivitou tyrosinproteinkinázy včetně tyrosinkináz KDR/VEGFR-2 a/nebo Flt-l/VEGFR-1. Inhibici aktivity těchto tyrosinkináz se inhibuje rozvoj uvedených poruch, protože angiogenní nebo vaskulární hyperpermeabilita jako složka tohoto chorobného stavu je výrazně omezena.
Působeni sloučenin podle vynálezu podle jejich selektivity pro specifické tyrosinkinázy má za následek minimalizaci vedlejších účinků, jež by se projevily, kdyby se použilo méně selektivní tyrosinkinázy.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají inhibiční aktivitu vůči proteinkinázám. Znamená to, že tyto sloučeniny modulují signální dráhu proteinkináz. Sloučeniny podle tohoto vynálezu inhibuji proteinkinázy tříd serin/threoninkinázy a tyrosinkinázy. Tyto sloučeniny zvláště selektivně inhibuji aktivitu tyrosinkináz KDR/FLKl/VEGFR-2. Určité sloučeniny podle tohoto vynálezu též inhibují aktivitu dalších tyrosinkináz jako jsou Flt1/VEGFR-l, kináz podrodiny Src jako jsou Lek, Src, fyn, yes a jiných. Navíc některé sloučeniny podle tohoto vynálezu významně inhibují kinázy serin/threonin jako jsou kinázy CDK, jež mají významnou roli při vývoji buněčného cyklu. Účinnost a specifičnost generických sloučenin podle tohoto vynálezu vůči určité proteinkináze se často může změnit a optimalizovat změnami v povaze, počtu a uspořádání substituentů (to jest Rr, R2, R3, R4, R5 a Rě) a konformačními omezeními. Kromě toho mohou metabolity určitých sloučenin též vykazovat významnou proteinkinázovou inhibiční aktivitu.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu při podání osobám, jež takové sloučeniny potřebují, inhibují vaskulární hyperpermeabilitu a vznik edému v těchto osobách. Soudí se, že tyto sloučeniny působí inhibici aktivity KDR tyrosinkinázy zúčastněné v procesu vaskulární hyperpermeability a tvorby edému. KDR tyrosinkináza se rovněž může označovat jako FLK-1 tyrosinkináza, NYK tyrosinkináza nebo VEGFR-1 tyrosinkináza. KDR tyrosinkináza se aktivuje, když se růstový faktor buněk cévní výstelky (VEGFR) nebo jiný aktivační ligand (jako VEGF-C, VEGF-D nebo protein HIV Tat) váže na receptor KDR tyrosinkinázy nalézající se na povrchu vaskulárních endotelových buněk. Po a «* ♦ · · • · · Ί « *··· • · · · ·· ·« · ···«· * « · · 4· • · · ··· ······· · · · · <
této aktivaci KDR tyrosinkinázy se projeví hyperpermeabilita krevních cév a tekutina protéká z krevního řečiště stěnami krevních cév do intersticiálního prostoru a vytváří oblast otoku. Tuto odezvu může často provázet diapedéza (pronikání krvinek). Podobně může nadměrná vaskulární hyperpermeabilita přerušit normální molekulární výměnu přes výstelku v kriticky ohrožených tkáních a orgánech (například plíce, ledvina) a tím způsobit makromolekulární výron a depozici.
Po této akutní odpovědi na stimulaci KDR, jež se považuje za faktor usnadňující následný angiogenní proces, je výsledkem dlouhodobé stimulace KDR tyrosinkinázy bujení a chemotaxe vaskulárních endotelových buněk a vznik nových cév. Inhibici aktivity KDR tyrosinkinázy ať už blokováním vzniku aktivačních ligandů, blokováním navázání aktivujícího ligandu na receptor KDR tyrosinkinázy, prevencí dimerizace receptorů a transfosforylace, inhibici enzymové aktivity KDR tyrosinkinázy (inhibici fosforylační funkce.enzymu), nebo jiným mechanismem, který by přerušil signální dráhu po směru signálu (D. Mukhopedhyay a další, Cancer. Res., 58, ss. 1278-1284, 1998, a zde obsažené odkazy), je možno inhibovat a minimalizovat hyperpermeabilitu stejně jako připojený výron, následný vznik edému a depozici matrice i angiogenní odpovědi.
Jedna skupina výhodných sloučenin podle vynálezu má tu vlastnost, že inhibuje aktivitu KDR tyrosinkinázy, aniž by významně inhibovala aktivitu Flt-1 tyrosinkinázovou aktivitu (Flt-1 tyrosinkináza se též označuje jako VEGFR-1 tyrosinkináza). KDR tyrosinkináza i Flt-1 tyrosinkináza se aktivují vazbou VEGF na receptory KDR tyrosinkinázy a receptory Flt-1 tyrosinkinázy. Protože aktivita Flt-1 tyrosinkinázy může zprostředkovat významné události v údržbě endotelu a vaskulární funkci, může inhibice této enzymové aktivity vést k toxickým nebo nežádoucím účinkům. Přinejmenším je tato inhibice zbytečná pro blokování
---- · · · ··· ·♦····· · · · · · angiogenních odpovědi, indukci vaskulární hyperpermeability a tvorbu edému, takže je nadbytečná a bez významu pro pacienta. Určité výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou ojedinělé, protože inhibují aktivitu jedné receptorové VEGF-tyrosinkinázy (KDR), která se aktivuje aktivačním ligandem, ale neinhibují jiné receptorové tyrosinkinázy jako Flt-1, která se rovněž aktivuje určitými aktivačními ligandy. Výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou proto selektivní ve své tyrosinkinázové inhibiční aktivitě.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou použitelné při léčbě bakteriálních a plísňových vředových chorob, Moorenových vředů a vředovité kolitidy.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou též použitelné při léčbě stavů, při nichž dochází k nežádoucí angiogenezi, edému nebo depozici trámčiny v důsledku virové infekce jako je opar prostý, pásový opar, AIDS, sarkom Kaposiho, protozoální infekce a toxoplasmóza, dále trauma, ozáření, mrtvice, er.dometrióza, syndrom ovariální hyperstimulace, systémový sžíravý vřed, sarkoidóza, synovitida, Crohnova nemoc, srpková anemie, lymská borelióza, pemfigoid, Pagetova nemoc, hyperviskozitní syndrom, Osler-Weber-Renduova nemoc, chronický zánět, chronická okluzní pulmonální nemoc, astma, revmatická artritida a osteoartritida.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou též použitelné při léčbě očních a makulárních edémů, oční neovaskulární choroby, skleritidy, radiálního keratomu, uveitidy, vitritidy, krátkozrakosti, exkavace oční papily, chronického odchlipování sítnice, komplikací po ozáření laserem, zánětu spojivek, Stargardtovy nemoci a Ealesovy nemoci spolu s retinopatii a makulární degenerací.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou též použitelné při léčbě kardiovaskulárních stavů jako je ateroskleróza, restenóza, vaskulární okluze a ucpání krční tepny.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou též použitelné • · ·< · · ♦ · · · · · ··· · » ··· t · · · · · 9 • ·· · ····· • · · · · · » ··· ··· ···«·«· · · · · · při léčbě příznaků karcinomu jako jsou solidní tumory, sarkomy (zvláště Ewingův sarkom a osteosarkom), retinoblastom, rhabdomyosarkomy, neuroblastom, zhoubné bujení buněk krvetvorby včetně leukémie a lymfomu, tumorem vyvolaných pleurálních a perikardiálních výpotků a zhoubné vodnatelnosti.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou též použitelné při léčbě diabetických stavů jako je glaukom, diabetická retinopatie a mikroangiopatie.
Je zřejmé, že výše uvedené poruchy jsou do značné míry zprostředkovány aktivitou tyrosinproteinkinázy včetně receptorů VEGF (například KDR a Flt-1). Inhibici aktivity těchto receptorových tyrosinkináz se inhibuje rozvoj uvedených poruch, protože angiogenní nebo vaskulární hyperpermeabilita jako složka tohoto chorobného stavu je podstatně omezena. Působení sloučenin podle tohoto vynálezu má podle jejich selektivity pro specifické tyrosinkinázy .za následek minimalizaci vedlejších účinků, jež by se projevily, kdyby se použilo méně selektivní tyrosinkinázy.
V jiném ohledu tento vynález nabízí sloučeniny podle vzorce I definované výše (včetně výhrad) pro použití jako léky, zvláště jako inhibitory proteinkinázové aktivity a zejména tyrosinkinázové aktivity, serinkinázové aktivity a threoninkinázové aktivity. V ještě dalším ohledu tento vynález nabízí použití sloučenin podle vzorce I definované výše (včetně výhrad) při výrobě léků pro použití pro inhibici proteinkinázové aktivity.
V tomto vynálezu jsou použitelné následující definice: Farmaceuticky přijatelné soli se týkají soli, jež si zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti volných bází a které se získávají reakcí s anorganickými kyselinami jako jsou chlorovodíková kyselin, bromovodíková kyselina, kyselina sírová, kyselina dusičná, fosforečná kyselina, nebo organické kyseliny jako sulfonová kyselina, karboxylová kyselina, crganická fosforečná kyselina, methansulfonová kyselina, ethansulfonová kyselina, p-toluensulfonová kyselina, salicylová kyselina, mléčná kyselina, vinná kyselina a podobně.
Alkyl se týká nasycených alifatických uhlovodíků včetně skupin o 1 až 4 uhlících s přímým a rozvětveným řetězcem.
Alkoxy se týká O-alkylové skupiny, kde je alkyl definován stejně jako výše.
Farmaceutické kompozice
Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou podávat nemocné osobě samy o sobě ve farmaceutických kompozicích, v nichž jsou smíšeny s vhodnými nosiči a vehikuly v dávkách potřebných pro léčbu nebo zlepšení vaskulární hyperpermeability, edému a s nimi spojených poruch. Směsi těchto sloučenin se též mohou pacientovi podávat jako jednoduché směsi nebo ve vhodně formulované farmaceutické kompozici. Terapeuticky účinná dávka znamená množství sloučeniny nebo sloučenin, jež postačuje pro prevenci nebo zmírnění nežádoucí neovaskularizace, rozvoje hyperproliferativních poruch, edému, hyperpermeability stimulované VEGF a/nebo hypotenze způsobené VEGF. Techniky formulace a podávání sloučenin pro okamžitou aplikaci lze nalézt v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, poslední vydání.
Způsoby podáni
Vhodné způsoby podání mohou zahrnovat například orální, oční kapky, rektální, transmukózní, zevní nebo intestinální administraci; parenterálni dodávku včetně intramuskulárních, subkutánních a intramedulárních injekcí stejně jako injekcí intratekálr.ích, přímých intraventrikulárních, intravenózr.ích, intraperitoneálních, intranazálních nebo
intraokulárnich.
Alternativně se sloučenina může podávat lokálně raději než systémcvě, například injikováním sloučeniny přímo do edématóznír.o místa, často v depotní nebo kontinuálně se uvolňující formulaci.
Dále ;e může lék podávat v systému cílené dodávky léku, například ;ako liposom povlečený protilátkou specifickou pro endotelovou buňku.
Kompozice/formulace
Farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu se může připravován známým způsobem, například konvenčním mícháním, rozpouštěním, granulací, ve formě dražé, ve formě prášku, emulgací, v kapsli, uzavřením v pevném obalu nebo lyofilizací.
Farmaceutické kompozice pro užití v souladu s tímto vynálezem tedy mohou být formulovány běžným způsobem za pomoci jednoho nebo více fyziologicky přijatelného nosiče včetně excipientů a pomocných přípravků, jež usnadňují zpracování aktivních sloučenin do přípravků, jichž lze farmaceuticky použít. Vlastní formulace závisí na zvoleném způsobu podání.
V případě injekcí se činidla podle vynálezu mohou formulovat ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech jako je Hanksův roztok, Ringerův roztok nebe fyziologický solankový pufr. Při transmukózní administraci se ve formulaci používají penetrační činidla schopná pronikat bariérou. Odborníkům jsou taková činidla známa.
V případě orálního podání se sloučeniny mohou vhodně formulovat kombinováním aktivních sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči dobře známými v oboru. Tyto nosiče umožňují, aby se sloučeniny podle vynálezu formulovaly pro orální příjem léčeným pacientem ve formě tablet, pilulek, dražé, kapsli, kapalných léků, gelů, syrupů, řídkých kaší, suspenzí a podobně. Farmaceutické preparáty pro orální použití se mohou získat kombinací aktivní sloučeniny s pevným excipientem, případně rozemletím vzniklé směsi a zpracováním směsi do granulí po případném přidání vhodných přísad pro přípravu tablet a náplní dražé.
Vhodným excipienty jsou zvláště plnidla jako cukry včetně laktózy, sacharózy, mannitu nebo sorbitu; celulózové preparáty jako kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragant, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy, anebo polyvinylpyrrolidon (PVP). Podle přání lze přidat dezintegrační činidlo jako je zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar nebo alginová kyselina nebo její soli, například sodná sůl.
Náplně dražé se opatřují různými povlaky. Pro tento účel se mohou užít koncentrované roztoky cukrů, jež případně mohou obsahovat arabskou gumu, mastek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Do tablet nebo povlaků dražé lze přidat barviva nebo pigmenty za účelem identifikace nebo charakterizace různých kombinací dávkovaných aktivních sloučenin.
Farmaceutické preparáty pro orální administraci zahrnují tobolky ze dvou do sebe zasouvaných (push-fit) dílů z želatiny, stejně jako měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako je glycerin a sorbit. Uvedené dvoudílné tobolky mohou obsahovat aktivní složky s příměsí plnidel jako je laktóza, pojidel jako jsou škroby, a/nebo maziv jako je mastek nebo stearát hořečnatý a případně stabilizátory. V měkkých tobolkách se aktivní sloučeniny mohou rozpustit nebo suspendovat ve vhodných kapalinách jako jsou mastné oleje, kapalný parafin nebo kapalné polyethylenglykoly. Rovněž lze přidat stabilizátory. Všechny formulace pro ústní podání musí být v dávkách vhodných pro takovou aplikaci.
V případě bukálního podání mohou kompozice mít formu tablet nebo pastilek formulovaných běžným způsobem.
Při podání inhalací se sloučeniny užité podle vynálezu obvykle dodávají ve formě aerosolového spreje z přetlakových obalů nebo atomizérů za použití vhodného hnacího plynu, například dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého nebo jiných vhodných plynů. V případě aerosolu z přetlakového obalu se dávkovači jednotka může zajistit ventilem dodávajícím odměřené množství. Tobolky a patrony například ze želatiny pro použiti v inhalátoru nebo insuflátoru se mohou formulovat s obsahem práškové směsi aktivní sloučeniny a vhodného práškového základu jako je laktóza nebo škrob.
Pro parenterální podání se mohou sloučeniny podávat injekcí, velkou injekční dávkou (bolus) nebo kontinuální infúzí. Formulace pro injekce mohou být ve formě dávkovači jednotky, například v ampulích nebo vícedávkového nosiče s přídavkem ochranného prostředku. Kompozice mohou mít formy suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejových nebo vodných vehikulech a mohou obsahovat formulační činidla jako suspenzní, stabilizační a/nebo dispergační činidla.
Farmaceutické formulace pro parenterální administraci zahrnují vodné roztoky aktivních sloučenin ve formě rozpustné ve vodě. Dále lze připravit suspenze aktivních sloučenin jako vhodné injikovatelné suspenze v oleji. Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula zahrnují mastné kyseliny jako je sezamový olej nebo syntetické estery mastných kyselin jako je methyloleát nebo triglyceridy nebo liposomy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky které zvyšují viskozitu suspenze jako je sodná sůl karboxymethylcelulózy, sorbit nebo dextran. Případně může suspenze též obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvyšují rozpustnost a tím umožňují přípravu vysoce koncentrovaných roztoků.
Alternativně může být aktivní složka před užitím ve formě prášku pro kombinaci s vhodným vehikulem, například s vodou bez pyrogenních látek.
Sloučeniny lze též formulovat v rektálních kompozicích jako jsou čípky a zadržené střevní nálevy, které například obsahují běžné báze čípků jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.
Vedle výše popsaných formulací mohou být tyto sloučeniny též formulovány jako depotní preparáty. Tyto dlouhodobě působící formulace se mohou podávat implantací (například subkutánně nebo intramuskulárně nebo intramuskulární injekcí). Takto mohou být sloučeniny formulovány například s vhodnými polymerními nebo hydrofobními materiály (ku příkladu jako emulze v přijatelném oleji) nebo ionexy nebo jako částečně rozpustné deriváty, například částečně rozpustná sůl.
Jako příklad farmaceutického nosiče pro hydrofobní sloučeniny podle vynálezu lze uvést systém s pomocným rozpouštědlem (kosolventní systém) obsahující benzylalkohol, nepolární povrchově aktivní prostředek, organický polymer mísitelný s vodou a vodnou fázi. Systém s pomocným rozpouštědlem (kosolventem) může být kosolventní systém VDP. VDP je roztok 3% hmot./obj. benzylalkoholu, 8% hmot./obj. nepolárního povrchově aktivního prostředku polysorbátu 80 a 65% hmot./obj. polyethylenglykolu 300, doplněný na 100 % absolutním ethylalkoholem. Systém VDP s pomocným rozpouštědlem (VDP:5W) sestává z VDP zředěného v poměru 1:1 5% roztokem dextrózy ve vodném roztoku. Tento kosolventní systém rozpouští dobře hydrofobní sloučeniny a sám je při systémovém podávání slabě toxický. Je samozřejmé, že poměry v systému s pomocným rozpouštědlem mohou být značně pozměněny aniž by se zrušila jeho solubilita a toxicita.
Dále je možno měnit komponenty kosolventního systému: například lze místo polysorbátu 80 užít jiných slabě toxických nepolárních rozpouštědel; je možno měnit podíl polyethylenglykolu; polyethylenglykol mohou nahradit jiné biokompatibilní polymery, například polyvinylpyrrolidon; a dextrózu mohou nahradit jiné cukry nebo polysacharidy.
Alternativně lze použít jiných dodávkových systémů pro hydrofobní farmaceutické sloučeniny. Dobře známými příklady dodávkových vehikulí nebo nosičů hydrofobních léků jsou liposomy a emulze. Lze použít určitých organických rozpouštědel jako dimethylsulfoxidu i když obvykle za cenu vyšší toxicity. Kromě toho lze dodávat sloučeniny pomocí systémů s kontinuálním uvolňováním, jako jsou semipermeabilni matrice z pevných hydrofobních polymerů obsahující terapeutické činidlo. Byly vyvinuty různé materiály pro kontinuální uvolňování a odborníkům jsou dobře známy. Kapsle pro kontinuální uvolňování mohou, v závislosti na jejich chemické povaze, uvolňovat sloučeniny několik týdnů až 100 dní. Podle chemické povahy a biologické stability terapeutického činidla lze použít dalších strategií stabilizace proteinů.
Farmaceutické kompozice též mohou obsahovat vhodné nosiče nebo excipienty v pevné fázi nebo jako gely. Příklady takových nosičů nebo excipientů zahrnují (aniž by se na ně omezovaly) uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery jako je polyethylenglykol.
Mnoho sloučenin podle vynálezu s organickou molekulou se může realizovat ve formě solí s farmaceuticky kompatibilními protiionty. Farmaceuticky kompatibilní soli se mohou vytvářet s mnoha kyselinami včetně chlorovodíkové, aniž by se na ni omezovaly; s kyselinami sírovou, octovou, mléčnou, vinnou, jablečnou, jantarovou a podobně. Soli jsou všeobecně rozpustnější ve vodných nebo v jiných protonických
rozpouštědlech než odpovídající volné báze.
«
Účinné dávkování
Farmaceutické kompozice vhodné pro použití podle tohoto vynálezu se týkají kompozic, v nichž jsou aktivní složky obsaženy v množství účinném pro dosažení zamýšleného cíle. Přesněji, terapeuticky účinné množství znamená množství účinné pro prevenci rozvoje nebo zmírnění existujících symptomů léčeného subjektu. Stanovení účinného množství je v dosahu schopností odborníků.
V kterémkoliv z použitých způsobů podle vynálezu se může terapeuticky účinná dávka primárně stanovit na základě buněčných testů. V buněčných nebo živočišných modelech lze například formulovat dávku pro dosažení koncentračního rozmezí v cirkulujících systémech zahrnujícího IC50 určeného v buněčných testech (to znamená koncentrací testované sloučeniny dosahující poloviny maximální inhibice dané < proteinkinázové aktivity). V některých případech je vhodné určit IC50 v přítomnosti 3%-5% sérového albuminu, protože tento způsob přibližuje vazebné účinky plazmového proteinu na sloučeninu. Taková informace se může užít pro přesnější stanovení použitelných dávek u lidí. Kromě toho nejvýhodnější sloučeniny pro systémovou administraci účinně inhibuji signální dráhu proteinkinázy v intaktních buňkách při hladinách, jichž lze bezpečně dosáhnout v plazmě.
Terapeuticky účinná dávka znamená množství sloučeniny, jež vede ke zlepšení symptomů nemoci u pacienta. Toxicitu a terapeutickou účinnost takových sloučenin lze stanovit standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech, například pro stanovení maximální tolerované dávky (MTD) a ED50 (účinné dávky pro 50 % maximální odezvy). Poměr dávek mezi toxickými a terapeutickými účinky je terapeutický index a může se vyjádřit jako poměr mezi MTD a ED50. Dává se přednost
φφ φφ φ ·· φ ··
ΦΦ· φφφ sloučeninám s vysokým terapeutickým indexem. Údaje získané při těchto experimentech s buněčnými kulturami a testech na zvířatech se mohou použít při formulování rozmezí dávkování při užití u lidí. Dávkování takových sloučenin se většinou nalézá uvnitř rozmezí cirkulujících koncentrací zahrnujících ED50 při nízké nebo žádné toxicitě. Dávkování může kolísat v rozmezí, které závisí na použité dávkovači formě a použitém způsobu administrace. Přesná formulace, způsob administrace a dávkováni může individuální lékař zvolit s ohledem na pacientův stav. (Viz například Fingl a další, 1975, Farmacological Basis of Therapeutics, kap. 1, s. 1.) Při léčbě krizového stavu může být nutné podání akutní velké dávky v pevném stavu nebo infúze blížící se MTD.
Dávkované množství a interval se může individuálně vyladit s cílem dosáhnout plazmových hladin účinné složky dostatečných pro udržení modulačních účinků na kinázu nebo minimální účinné koncentrace (MEC).. MEC je pro každou sloučeninu jiná, ale může se stanovit z údajů získaných in vitro, například koncentrace potřebné pro dosažení 50-90% inhibice proteinkinázy za pomoci zde popsaných experimentů. Dávkování potřebné pro dosažení MEC závisí na individuálních charakteristikách a způsobu podání. Pro stanovení plazmové koncentrace lze však užít i testů pomocí HPLC nebo biotestů.
Hodnoty MEC lze použít i při stanovení dávkovačích intervalů. Sloučeniny se musí podávat v režimu, který udržuje plazmové hladiny nad MEC během 10-90 % celkové doby, výhodně mezi 30 a 90 % a nej výhodněji mezi 50 a 90 %, dokud se nedosáhne zlepšení symptomů. Při lokálním podání nebo selektivní absorpci nemůže účinná místní koncentrace léku vycházet z těchto hodnot plazmové koncentrace.
Množství podávané kompozice bude ovšem záviset na léčeném subjektu, na jeho hmotnosti, závažnosti jeho onemocnění, způsobu podání a úsudku lékaře který lék předepisuj e.
• ··* ·· · ·· ·· ··« · · · ·· • * · · · · · « · » · ····· • · · · » · · ··· ··« ··· ·*·« ·« ··«
Balení
Kompozice se mohou v případě potřeby prezentovat v obalu nebo aplikačním zařízení, jež může obsahovat jednu nebo více jednotkových dávkovačích forem obsahujících aktivní složku. Obal může například představovat kovová nebo platová fólie jako je blistrové balení. Obal nebo aplikační zařízení by měly provázet instrukce pro provádění podání. Rovněž lze připravovat kompozice obsahující sloučeninu podle vynálezu, formulované v kompatibilním farmaceutickém nosiči, umístěné ve vhodném zásobníku a označené pro léčbu uvedených onemocnění.
V některých formulacích může být příhodné použít sloučenin podle tohoto vynálezu ve formě částic velmi malého rozměru, jaké se získávají například při fluidním mletí (fluid energy milling).
V kompozicích podle tohoto vynálezu se aktivní sloučeniny mohou podle potřeby spojovat s dalšími kompatibilními farmakologicky aktivními komponentami. Sloučeniny podle tohoto vynálezu se například mohou podávat v kombinaci s jedním nebo více dalšími farmaceutickými činidly, jež inhibují nebo brání tvorbě VEGF, zmírňují nitrobuněčné odpovědi na VEGF, blokují nitrobuněčné signální dráhy, inhibují vaskulární hyperpermeabilitu, zmenšují záněty, nebo inhibují nebo brání vzniku edému nebo neovaskularižací. Sloučeniny podle vynálezu se mohou podávat před, následně nebo souběžně s podáním dalšího farmaceutického činidla, podle toho, který způsob podání je vhodný. Tato přídavná farmaceutická činidla zahrnují (aniž by se na ně omezovala) antiedemické steroidy, NSAIDS, inhibitory ras, anti-TNF činidla, anti-ILl činidla, antihistaminíka, antagonisty PAF, inhibitory COX-1, inhibitory COX-2, inhibitory NO syntázy, inhibitory PKC a inhibitory P13 kinázy. Sloučeniny podle vynálezu a přídavná
• · • 0« ·· ·
« • • · • •
• • 0 • · • ·
• • ♦ « Λ •
> * · ··· • 9» 9··· ·· 9»
farmaceutická činidla působí bud aditivně nebo synergicky. Proto může podání takové kombinace látek inhibujících vaskulární hyperpermeabilitu a/nebo tvorbu edému poskytnout větší zmírnění zhoubných důsledků poruch z nadměrného bujení, anciogeneze, vaskulární hyperpermeability nebo edému, než podání jedné z obou látek samotné. Při léčbě maligních poruch se kombinace s antiproliferativními nebo cytotoxickými chemoterapiemi nebo radiací předpokládá.
Tento vynález zahrnuje i užití sloučeniny podle vzorce I jako léku.
Rodiny kináz Src i Syk hrají při regulaci imunitních funkcí rozhodující roli. Rodina Src dnes zahrnuje Fyn, Lek, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yes, Hek a Blk. Rodina Syk jak se dnes chápe, obsahuje jen Zap a Syk. Rodina kináz Janus je zúčastněna na transdukci signálů růstového faktoru a prozánětlivého cytokinu přes řadu receptorů. I když v imunobiologii hrají BTK a ITK, členové rodiny kináz Tec, dobře známou roli, jejich modulace inhibitorem by se mohla ukázat terapeuticky prospěšnou. Kinázy RIP, IRAK-1, IRAK-2, NIK, IKK-1 a IKK-2 jsou zahrnuty v signálních drahách klíčových prozánětlivých cytokinu TNF a IL-1. Díky své schopnosti inhibovat jednu nebo více těchto kináz se uplatňují sloučeniny vzorce I jako imunomodulační činidla použitelná pro udržování aloštěpů a léčbu autoimunitnich chorob. Transplantáty jsou vlivem fenoménu odhojování, ať už typu hostitel versus štěp u pevných orgánů nebo typu štěp versus hostitel u kostní dřeně, omezovány toxicitou dnes dosažitelných imunosupresivních činidel a potřebují účinný lék se zlepšeným terapeutickým indexem. Pokusy s cílenými geny prokázaly zásadní roli Src v biologii osteoklastů, buněk odpovědných za resorpci kostní dřeně. Sloučeniny podle vzorce I mohou být díky schopnosti regulovat Src též užitečné při léčbě osteoporózy, osteopetrózy, Pagetovy choroby, tumorem indukované hyperkalcinémie a při léčbě kostních metastáz.
Prokázalo se, že mnohé proteinkinázy jsou protoonkogenní. Zlom chromozomu (ltk kináza ve zlomovém bodu na chromozomu 5), translokace jako v případě genu Abl filadelfským chromozomem BCR, zkrácení sekvence v případech jako c-Kit nebo EGFR nebo mutace (například Met) mají za následek vznik neřízených proteinů tím, že je konvertuje z protoonkogenů na onkogenní produkty. V jiných tumorech jsou motorem onkogeneze interakce mezi autokrinním nebo parakrinním ligandem a receptorem růstového faktoru. Členové kináz rodiny Src jsou typicky zúčastněny na signální dráze po směru signálu, čímž posilují onkogenezi a samy se stávají onkogennimi nadměrnou expresi nebo mutaci. Inhibici proteinkinázové aktivity těchto proteinů by se mohl tento chorobný proces přerušit. Vaskulární restenóza může zahrnovat proces bujení endotelových buněk a buněk hladkého svalstva podporovaný FGF a/nebo PDGF. Při inhibici tohoto jevu by inhibice aktivity FGFr- nebo PDGFr kinázy mohla být účinnou strategii. Sloučeniny podle vzorce I, které inhibují kinázovou aktivitu normálních nebo aberujících členů rodin c-kit, c-met, c-fms a src, EGFr, erbB2, erbB4, BCR-Abl, PDGFr, FGFr a jiných receptorových nebo cytosolových tyrosinkináz mohou mít svou hodnotu při léčbě benigních a neoplastických proliferačních chorob.
Při mnoha patologických stavech (například primární solidní tumory, Kaposiho sarkom, revmatická artritida, slepota zaviněná nesprávnou neovaskularizací oka, lupénka a ateroskleroza) je rozvoj choroby závislý na přetrvávající angiogenezi. Polypeptidové růstové faktory často produkované chorobnou tkání nebo připojenými zánětlivými buňkami a jim odpovídající receptorové tyrosinkinázy specifické pro endotelové buňky (například KDR/VEGFR-2, Flt-l/VEGFR-1, Tie2/Tek a Tie) jsou důležité pro stimulaci růstu, migrace, ϊ
organizace a diferenciace endotelových buněk a vytvořeni nového funkčního cévního systému.
V důsledku aktivity VEGF jako faktoru vaskulární permeability při zprostředkování vaskulární hyperpermeability se soudí, že stimulace VEGVR kinázy faktorem VEGF též hrají významnou roli při vzniku břišní vodnatelnosti tumorového původu, cerebrálního a pulmonálního edému, pleurálních a perikardiálních efúzí, pozdní přecitlivělosti, tkáňových edémů a dysfunkcí orgánů v důsledku traumatu, popálenin, ischémií, komplikací s diabetem, endometriózou, syndromu respirační tísně dospělých (ARDS), postkardiopulmonální hypotenze a hyperpermeability po bypassu, a očního edému vedoucího ke glaukomu nebo slepotě v důsledku nesprávné neovaskularizace. Vedle VEGF mohou odezvu v podobě vaskulární hyperpermeability stimulací VEGFR kinázy způsobit i nedávno identifikované proteiny VEGF-C, VEGF-D a HIV-Tat.
Tie-2 se exprimuje i ve vybrané populaci kmenových buněk krvetvorby, ve kterých se uplatňují při selekci, adhezi, regulaci a diferenciaci (Blood, 89, ss. 4317-4326, 1997); tato populace exprimující Tie-2 může sloužit jako cirkulující angiogenní endoteloví progenitoři. Určité působky odpovídající vzorci I schopné blokovat kinázovou aktivitu kináz specifických pro endotelové buňky by proto mohly inhibovat rozvoj chorob zahrnujících tyto situace.
Sloučeniny podle vzorce I nebo jejich sůl, nebo farmaceutická kompozice obsahující jejich terapeuticky efektivní množství se může použít při léčbě benigních a neoplastických proliferačních chorob a poruch imunitního systému. Tyto choroby zahrnují autoimunitní choroby jako je revmatická artritida, thyroiditida, diabetes typu 1, roztroušená skleróza, sarkoidóza, nemoc střevních zánětů, těžká myasténie a systémový lupus erythematodes; iupénka, odhojování, (například odmítání transplantovaných ledvin,
I nemoc štěp versus hostitel), benigní a neoplastické proliferační choroby, humánní karcinomy jako je rakovina plic, prsu, žaludku, močového měchýře, tlustého střeva, pankreatu, vaječníků, prostaty a konečníku a buněk krvetvorby (leukémie a lymfomu) a choroby zahrnující nevhodnou vaskularizaci, například retinopatie při diabetů, neovaskularizace cévnatky v důsledku stařecké makulární degenerace a infantilní humánní hemangiom. Kromě toho mohou být takové inhibitory použitelné při léčbě poruch jako jsou edémy zprostředkované VEGF, břišní vodnatelnost, efúze a exsudáty včetně například makulárního edému, cerebrálního edému a syndromu respirační tísně dospělých (ARDS).
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být užitečné i v profylaxi uvedených chorob.
Další aspekt tohoto vynálezu představuje použití sloučeniny podle vzorce I nebo její soli při výrobě léku pro léčbu vaskulární hyperpermeability, poruch závislých na angiogenezi, proliferačních onemocnění a/nebo poruch imunitního systému savců, zvláště lidí.
Tento vynález též nabízí způsob léčby vaskulární hyperpermeability, nežádoucí neovaskularizace, proliferačních chorob a/nebo poruch imunitního systému zahrnující podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny vzorce I savcům, zejména lidským bytostem, jež ji potřebuj i.
Účinnost sloučenin při inhibici těchto proteinkináz in vitro se může určit níže popsanými postupy.
Účinnost daných sloučenin se může stanovit rozsahem inhibice fosforylace exogenního substrátu (například syntetického peptidu (Z.Songyang a další, Nátuře, 373, ss. 536-539) když je zkoušená sloučenina příbuzná se srovnávací sloučeninou.
Výroba KDR tyrosinkinázy za použití bakulovirového systému
Kódující sekvence pro lidskou nitrobuněčnou doménu KDR (aa789-1354) se vytvořila pomocí PCR (reakce katalyzované polymerázou) užitím cDNA izolovaných z buněk HUVEC. Na Nzakončení “ohoto proteinu se též lokalizovala sekvence polyHis6. Tento fragment se klonoval do transfekčního vektoru pVL1393 v místech Xba 1 a Not 1. Rekombinantní bakulovirus (BV) se generoval kotransfekcí za pomoci transfekční reagencie BaculoGold(PharMingen). Rekombinantní BV se přečistil plakami a ověřil Westernovou analýzou. Pro přípravu proteinu se buňky SF-9 kultivovaly na půdě SF-900II při 2xl06/ml a infikovaly se 0,5 plakformujičími jednotkami (MOI 0,5). Buňky se sbíraly 48 hodin po infekci.
Čištěni KDR
Buňky SF-9 exprimující (His) 6KDR (aa7-89-1354) se podrobily lýze přidáním 50 ml lytického pufru Triton X-100 (20- mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% glycerolu, 1% Tritonu X-100, lmM PMSF, 10 μg/ml aprotininu, 1 gg/ml leupeptinu) k buněčným peletkám z 1 1 buněčné kultury. Lyzát se odstřeďoval odstředivkou Sorval SS-34 30 minut při teplotě 4 °C a 19.000 otáčkách za minutu. Buněčný lyzát se podrobil imunosorpci v koloně s chelatačním sefarózovým sorbentem a NiCl2 (5 ml', ekvilibrace se dosáhlo 50 mM HEPES při pH 7,5 a 0,3 M NaCl. Eluce KDR se prováděla tímtéž pufrem obsahujícím 0,25 M imidazolu. Získané frakce se analyzovaly programem SDS-PAGE a testem ELISA (viz níže) měřícím aktivitu kinázy. Přečištěný KDR se převedl do 25 mM HEPES (pH 7,5; 25 mM NaCl, 5 mM DTT) a skladoval při -80 °C.
Příprava a čištění lidské kinázy Tíe-2
Kódující sekvence pro lidskou nitrobuněčnou doménu Tie2 (aa775-1124) se vytvořila řetězovou reakcí katalyzovanou
polymerázou (PCR) za použití cDNA izolované z lidské placenty jako templátu. Sekvence poly-His6 se vázala na Nzakončení a vzniklý konstrukt se klonoval do transfekčního vektoru pVL 1939 v místech Xba 1 a Not 1. Rekombinantní BV se vytvořil kotransfekcí za použití transfekční reagencie BaculoGold (PharMingen). Rekombinantní BV se přečistil na plakách a ověřil Westernovým přenosem. Při přípravě proteinu se pěstovaly hmyzí buňky SF-9 na půdě SF-900-II při 2xl06/ml a infikovaly se při MOI 0,5. Čištění kinázy značené His použité při třídění se shodovalo s čištěním popsaným u KDR.
Příprava a čištěni lidské tyrosinkinázy Flt-1
Použil se bakulovirový klonovaci vektor pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA). Nukleotidová sekvence kódující poly-His6 se umístila v místě 5' nukleotidové oblasti kódující celou nitrobuněčnou kinázovou oblast lidské Flt-1 (aminokyseliny 786-1338). Nukleotidová sekvence kódující kinázovou doménu se vytvořila řetězovou reakcí katalyzovanou polymerázou (PCR) s použitím knihoven cDNA izolovaných z buněk HUVEC. Histidinové zbytky umožnily afinitní přečištění proteinu způsobem obdobným jako u KDR a ZAP70. Hmyzí buňky SF-9 se infikovaly při MOI 0,5 a sběr nastal 48 hodin po infekci.
Zdroj EGFR tyrosinkinázy
EGFR se koupil u firmy SIGMA (Cat č. E-3641; 500 jednotek/50 μΐ) a ligand EGF byl zakoupen u firmy Oncogene Research Products/Calbiochem (kat č. PF011-100).
Exprese ZaplO
Použitý bakulovirový expresivní klonovaci vektor byl pVL1393 (Pharmingen, Los Angeles, Ca.) Nukleotidová sekvence kódující aminokyseliny M(H)6 LVPR9S se lokalizovala v místě 5'oblasti kódující celou ZAP70 (aminokyseliny 1-619).
Nukleotidová sekvence kódující oblast kódující ZAP70 se připravila pomocí PCR s využitím knihoven cDNA izolovaných z imortalizovaných T-buněk rodiny Jurkat. Histidinové zbytky umožnily afinitní čištění proteinu (viz níže). Přemostění LVPRgS tvoří rozpoznávací sekvenci pro proteolytické štěpení thrombinem, přičemž umožňuje odstranění afinitního značení z enzymu. Hmyzí buňky SF-9 se infikovaly při MOI 0,5 a sběr nastal 48 hodin po infekci.
Extrakce a čištění ZAP70
Buňky SF-9 se podrobily lýze v pufru složeném z 20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% glycerolu, 1% Tritonu X-100, lmM PMSF, 1 μg/ml leupeptinu, 10 μg/ml aprotininu a 1 mM ortovanadičnanu sodného. Rozpustný lyzát se podrobil imunosorpci v koloně HiTrap (Pharmacia) s chelatačním sefarózovým sorbentem, ekvilibrace se dosáhlo 50 mM HEPES při pH 7,5 a 0,3 M NaCl. Spojené proteiny se podrobily eluci s 250 mM imidazolu. Enzym se skladoval v pufru obsahujícím 50 mM HEPES při pH 7,5, 50 mM NaCl a 5 mM DTT.
Zdroj Lek
Lek nebo jeho zkrácené formy se mohou získat komerčně (například z Upstate Biotechnology lne. (Saranac Lake, N.Y.) a Santa Cruz Biotechnology lne. (Santa Cruz, Ca.), nebo přečištěný ze známých přírodních nebo rekombinantních zdrojů pomocí konvenčních způsobů.
Zdroj Cdc2
Lidský rekombinantní enzym a pufr pro tento experiment se mohou komerčně získat od (New England Biolabs, Beverly, MA. USA) nebo přečištěný ze známých přírodních nebo rekombinantních zdrojů pomocí konvenčních způsobů.
Stanovení Cdc2
Použitý protokol byl tentýž jaký předepisují použité reagencie s malými modifikacemi. Reakce se tedy prováděla v pufru složeném z 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 2 mM DTT) , 0,01% Brij, 5% DMSO a 10 mM MgCl2 (komerční pufr), doplněném ve finálních koncentracích čerstvými 300 μΜ ATP (31 μθί/ιη1) a 30 gg/ml histonu typu IIIss. Reakce probíhala v objemu 80 ul obsahujícím jednotky enzymu při 25 °C v přítomnosti nebo absenci inhibitoru po dobu 20 minut. Reakce se ukončila přidáním 120 μΐ 10% kyseliny octové. Substrát se oddělil od chemicky nenavázané značící látky nanesením směsi na fosfocelulózový papír, po němž následovala 3 pětiminutová promývání 75mM fosforečnou kyselinou. Počty se zjišťovaly pomocí β-čítače v přítomnosti kapalného scintilačního činidla.
Určité sloučeniny podle vynálezu významně inhibuji cdc2 při koncentracích pod 50 μΜ.
Zdroj PKC kinázy
Katalytická podjednotka PKC se může komerčně získat u firmy Calbiochem.
Stanovení PKC kinázy
Stanoveni radioaktivní kinázy se provádělo podle zveřejněného postupu (Yasuda I., Kirshimoto A., Tanaka S., Tominaga M., Sakurai A., Nishizuka Y., Biochemical and Biophysical Research Communication 3, 166, ss. 1220-1227 (1990) ) . Všechny reakce se prováděly v kinázovém pufru, který sestával z 50mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2mM DTT, lmM EGTA, 100 μΜ ATP, 8 μΜ peptidů, 5% DMSO a 33P ATP (8 Ci/mM). Sloučenina a enzym se smísily v reakční nádobě a reakce se iniciovala přídavkem ATP a substrátové směsi. Po ukončení reakce přídavkem 10 μΐ terminačního pufru (5mM ATP • · · · · » ··· · · · ······· « · «·· v 75mM fosforečné kyselině) se část směsi nanesla na fosfocelulczové filtry. Nanesené vzorky se při teplotě místnosti praly 3x v 75mM fosforečné kyselině po dobu 5 až minut. Chemická vazba radioaktivního indikátoru se kvantifikovala čítáním pomocí kapalného scintilátoru.
Zdroj enzymu Erk2
Rekombinantní myší enzym a zkušební pufr lze komerčně získat (New England Biolabs, Beverly ΜΆ., USA) nebo přečištěný ze známých nebo rekombinantních zdrojů pomocí běžných způsobů.
Stanovení enzymu Erk2
Reakce se prováděla v pufru sestávajícím z 50mM Tris pH 7,5, lmM EGTA, lmM DTT, 0,01% Brij, 5% DMSO, a lOmM MgCl2 (komerční pufr), který se doplnil čerstvým 100 μΜ ATP (31 μΟί/ιη-Ι) a 30 μΜ bazického proteinu myelinu v podmínkách doporučených výrobcem. Reakční objemy a způsob zjišťováni chemicky vázaného radioaktivního indikátoru byly stejné jako při pokusu s PKC (viz výše).
Stanovení vazby ímunosorbent-enzym (ELISA) pro různé PTK Pokusy s vazbou imunosorbent-enzym (ELISA) se použily pro detekci a měřeni přítomnosti aktivity tyrosinkinázy. Pokus ELISA se prováděl podle známých protokolů popsaných například v: Voliér a další, 1980, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, v: Manual of Clinical Immunology, 2. vyd., vydal Rose a Friedman, ss. 359-371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.
Popsaný protokol se používal pro stanovení aktivity s ohledem na specifické PTK. Příklady specifických protokolů pro provedení experimentů ELISA jsou uvedeny níže. Přizpůsobení těchto protokolů pro stanovení aktivity sloučenin vůči dalším členům rodiny receptorových PTK stejně « · • ·
jako nereceptorových tyrosinkináz je plně v mezích schopností odborníků. Pro stanovení selektivity inhibitoru se při pokusu používal univerzální PTK substrát (například nahodilý kopolymer póly(Glu4Tyr) s molekulovou hmotností 20.000 až 50.000 spolu s ATP (typicky 5 μΜ) při koncentracích, jež byly přibližně dvojnásobkem zdánlivého Km.
Následující způsob se užíval za účelem testování inhibičního účinku sloučenin podle tohoto vynálezu na tyrosinkinázovou aktivitu KDR, Flt-1, Tie-2, EGFR a ZAP70.
Pufry a roztoky
PGT: Póly(Glu, Tyr), 4:1
Prášek se skladuje při -20 °C. Prášek se rozpustí v solance pufrované fosfátem (PBS) na roztok 50 mg/ml. Alikvotní 1 ml se skladuje při -20 °C. Při práci s plotnami se zředí na 250 μρ/ιηΐ v Gibco PBS.
Reakční pufr:
lOOmM Hepes, 20mM MgCl2, 4mM MnCl2, 5mM DTT, 0,02% BSA,
200μΜ NaV04, pH 7,10
ATP: Alikvoty koncentrace lOOmM se skladují při -20 °C.
Zředí se na 20μΜ vodou.
Promývací pufr: PBS s 0,1% Tween 20.
Pufr ředící protilátku:
0,1% albumin z bovinního séra (BSA) v PBS
Substrát TMB:
Těsně před užitím se smísí substrát TMB a peroxidovými roztoky v poměru 9:1, nebo se použije K-Blue Substráte firmy
Neogen
Terminační roztok: 1M kyselina fosforečná
Postup
1. Příprava ploten
Zmražený kopolymer PGT (50 mg/ml) se v PBS zředí na 250 gg/ml. Nanese se v množství 125 μΐ na jamku modifikovaných vysoce afinních ploten ELISA s plochým dnem firmy Corning (Corning č. 25805-96). Do jamek srovnávacího pokusu se vnese 125 μΐ PBS. Plotny se uzavřou těsnící páskou a inkubují se přes noc při 37 °C. Jednou se promyjí 250 μΐ promývacího pufru a suší se v suchém inkubátoru při 37 °C asi 2 hodiny. Přikryté plotny se až do použití skladují v uzavřených sáčcích při 4 °C.
2. Reakce tyrosinkinázy
Připraví se roztoky inhibitoru ve 20% DMSO ve vodě (4x koncentrace).
Připraví se reakční pufr.
Připraví se roztok enzymu tak, aby požadovaný počet jednotek bvl v 50 μΐ, například pro KDR aby se v reakcích uplatnil 1 ng/μΐ při úhrnu 50 ng na jamku. Skladovat na ledu.
Zásobní lOOmM roztok ATP ve vodě se rozdělí na 4x roztok ATP při 20 μΜ. Skladovat u ledu.
Přidá se 50 μΐ roztoku enzymu na jamku (typicky 5-50 ng enzymu na jamku podle specifické aktivity kinázy).
Čtyřikrát se přidá 25 μΐ inhibitoru.
Čtyřikrát se přidá 25 μΐ ATP pro test aktivity inhibitoru.
Následuje inkubace při pokojové teplotě po dobu 10 minut.
Reakce se zastaví přidáním 50 μΐ 0,05 HC1 na jamku.
Plotna se vymyje.
** Finální koncentrace pří reakcí: 5 μΜ ATP, 5% DMSO
3. Vazba protilátky
Zředí se 1 mg/ml alikvotu protilátky PY20-HRP (Pierce) (fosfotyrosinová protilátka) na 50 ng/ml v 0,1% BSA dvoustupňovým ředěním (lOOx, pak 200x). Přidá se 100 μΐ Ab na jamku. Inkubuje se při pokojové teplotě 1 hodinu. Pak se 1 hodinu inkubuje se při 4 °C. Plotna se 4x umyje.
4. Barevná reakce
Připraví se substrát TMB a dávkuje se 100 μΐ na jamku. Sleduje se optická hustota při vlnové délce 650 nm do dosažení hodnoty 0,6. Reakce se zastaví 1M fosforečnou kyselinou. Čtečka intenzity zbarvení jamek se podrobí vibracím. Při vlnové délce 450 nm se ihned odečte optická hustota.
Optimální inkubační doba a podmínky enzymové reakce se u různých enzymových přípravků poněkud liší a stanovují se empiricky pro každou šarži.
V případě Lek - byl za obdobných zkušebních podmínek použitý reakční pufr lOOmM MOPSO, pH 6,5, 4 mM MnCl2, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,2% BSA, 200 mM NaV04.
Sloučeniny podle vzorce I mohou mít terapeutickou užitečnost v léčbě chorob působených jak už identifikovanými kinázami včetně kináz zde dosud nejmenovaných, tak i dosud neidentifikovanými proteintyrosinovými kinázami, jež jsou inhibovány sloučeninami vzorce I. Všechny sloučeniny zde uvedené jako příklad výrazně inhibují KDR kinázu při koncentracích 50 mikromol a nižších. Některé sloučeniny podle tohoto vynálezu též významně inhibují další PTK jako například lek při koncentracích 50 mikromol a nižších.
Modely pro aktivaci T-buněk in vitro
Aktivací mitogenem nebo antigenem se T-buňky indukují k vylučování IL-2, růstového faktoru podporujícího jejich následnou proliferační fázi. Proto je možno měřit buď
produkci IL-2 z primárních T-buněk nebo buněčnou proliferaci T-buněk neto vhodných buněčných linii T-buněk jako obraz aktivace T-buněk. V literatuře jsou oba tyto přístupy dobře popsány a ejich parametry dobře zdokumentovány (Current Protocols in Immunology, sv. 2, 7.10.1-7.11.2).
Ve zkratce, T-buňky lze aktivovat společnou kultivací s buňkami alcgenního stimulátoru, což je způsob nazývaný jednosměrná reakce směsných lymfocytů (one way mixed lymphocyte reaction). Respondující i stimulující mononukleární buňky z periferní krve se přečistí gradientovou technikou roztokem Ficoll-Hypaque firmy Pharmacia podle instrukcí výrobce. Buňky stimulátoru se mitoticky inaktivují reakcí s mitomycinem C (Sigma) nebo gama-ozářer.ím. Reagující a stimulující buňky se společně kultivují v poměru dva ku jedné v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny. Typicky se smísí 105 respondujicích buněk s 5 x 104 buněk stimulátoru a očkují se v objemu 2C0 μΐ do mikrotitrační plotny firmy Costar Scientific s dnem tvaru U. Buňky se kultivuji v půdě RPMI 1640 doplněné buď plodovým bovinním sérem (Hyclone Laboratories) dezaktivovaným teplem, nebo spojeným lidským AB sérem mužských dárců, 5xlO‘5M 2-merkaptoethanolem a 0,5% DMSO. Kultury se pulzně zpracují s 0,5 μθί 3H thymidinem (firma Amersham) den před sběrem (typicky v den 3). Kultury se sklidí jBetaplate Harvester, Wallac) a chemická vazba radioaktivního indikátoru izotopu se měří kapalným scintilátorem (Betaplate, Wallac).
Tentýž způsob kultivace se může užít pro hodnocení aktivace T-buněk měřením produkce IL-2. Osmnáct až dvacetčtyři hodiny po zahájení kultivace se odstraní kalové vody a koncentrace IL-2 se měří pomocí ELISA (R and D Systems) pcdle instrukcí výrobce.
Modely aktivace T-buněk in vivo
Účinnost sloučenin in vivo se může zkoušet na živočišných modelech o nichž je známo, že přímo měří aktivaci T-buněk, nebo o nichž se prokázalo, že T-buňky jsou jejich efektory. T-buňky se mohou aktivovat in vivo ligací konstantní části receptoru T-buňky s monoklonální anti-CD3 protilátkou (Ab). V tomto modelu dostanou myši BALB/c intraperitoneální injekci 10 μg anti-CD3 Ab dvě hodiny před vykrvácením. Zvířata, jež jsou určena ke zkoušení testovaného léku dostanou jedinou dávku sloučeniny jednu hodinu před podáním anti-CD3 Ab. Hladiny protizánětlivých cytokinů interferon-γ (IFN-γ) a faktoru-α nekrotizujícího nádory (TNF-α) v séru, což jsou indikátory aktivace T-buněk, se měří pomocí ELISA. Podobný model užívá in vivo aktivace T-buněk specifickým antigenem jako je hemocyanin kuželnatky (KLH), po níž následuje sekundárně in vitro odezva na tentýž antigen drenáží buněk mízních uzlin. Jako v předchozím případě se užívá měření produkce cytokinů pro hodnocení stupně aktivace kultivovaných buněk. V praxi se myši C57BL/6 subkutánně imunizují pomocí emulze 100 μg KLH v kompletním Freundově adjuvans (CFA) v den 0. Zvířata předběžně dostanou dávku léku jeden den před imunizací a následně v den 1, 2a 3 po imunizaci. Drenážující mízní uzliny se sbírají v den 4 a jejich buňky se kultivují při 6xl06/ml v tkáňovém kultivačním médiu (RPMI 1640 doplněném teplem dezaktivovaným plodovým bovinním sérem (Hyclone Laboratories), 5xlO6M 2merkaptoethanolem a 0,5% DMSO) po dobu jednak 24, jednak 28 hodin. Supernatanty z kultivace jsou potom zkoušeny na hladinu autokrinního růstového faktoru T-buněk interleukinu2 (IL-2) a/nebo IFN-γ způsobem ELISA.
Špičkové sloučeniny se též mohou testovat na živočišných modelech lidských chorob. Jako příklady lze uvést experimentální autoimunitní encefalomyelitidu (EAE) a
kolagenem indukovanou artritidu (CIA). Modely EAE napodobující příznaky lidské roztroušené sklerózy se popisují u krys a myší (souhrnně FASEB J., 5, ss. 2560-2566, 1991; myší model: Lab. Invest., 4(3), s. 278, 1981; model hlodavců: J. Imunol., 146 (4), ss. 1163-1168, 1991). Stručně, myši a krysy se imunizují emulzí bazického proteinu myelinu (MBP), nebo jeho neurogenních peptidových derivátů a CFA. Akutní choroba se může indukovat přidáním bakteriálních toxinů jako je Bordetella pertussis. Recidivující a remitentní onemocnění se indukuje adoptivním přenosem T-buněk ze zvířat imunizovaných MBP/peptidem.
CIA se může u DBA/1 myší indukovat imunizací kolagenem typu II (J.Immunol., 142(7), ss. 2237-2243). U myší se vyvinou příznaky artritidy už deset dní po expozici antigenu a lze je vyhodnocovat devatenáct dní po imunizaci. V případě modelů EAE i CIA se sloučenina může podávat buď profylakticky nebo při začátku nemoci- Účinné léky mají zmenšovat závažnost a/nebo výskyt nemoci.
Určité sloučeniny podle tohoto vynálezu, které inhibují jeden nebo více angiogenních receptorů PTK a/nebo proteinkináza jako je lek zúčastněná na zprostředkování odpovědí při zánětech, může snížit závažnost a výskyt artritidy v těchto modelech.
Sloučeniny lze též zkoušet v myších aloštěpových modelech buď kožních (přehledně Ann.Rev.Immunol., 10, ss.
333-358, 1992; Transplantation, 57(12), ss. 1701-1706, 1994), nebo srdečních (Am.J.Anat., 113, s.273, 1963). Stručně, kožní štěpy v plné tloušťce se transplantují z myší C57BL/6 na myš BALB/c. Štěpy se denně kontrolují počínaje dnem 6 pro získání důkazu odhojování. V případě myšího neonatálního modelu srdečního transplantátu se neonatální srdce ektopicky transplantovala z myši C57BL/6 na ušní boltce dospělé myši CBA/J. Srdce začínají bít čtyři až sedm dní po transplantaci a odhojování se může vizuálně kontrolovat za pomoci disekčniho mikroskopu pro registraci přerušeni srdečního tlukotu.
Stanovení buněčných receptorů PTK
Pro stanoveni stupně aktivity a účinku různých sloučenin podle tohoto vynálezu na KDR/VEGFR2 se použilo následujících buněčných testů. Podobné zkoušky receptorových PTK používající stimulů specifických ligandů se mohou při témže přístupu naplánovat i pro další tyrosinkinázy za pomocí odborníkům dobře známých technik.
Fosforylace KDR v epitelových buňkách lidské pupečníkové žíly (HUVEC) indukovaná VEGF měřená Westernovým přenosem.
1. Buňky HUVEC od smíšených dárců se získaly od firmy Clonetics, San Diego, CA, a kultivovaly podle směrnic výrobce. V tomto pokusu se použilo pouze 3 až 8 ranných pasáží. Buňky se kultivovaly v miskách o průměru 100 mm (Falcon pro tkáňové kultury; Beckton Dickinson; Plymouth, England) za pomoci úplné kultivační půdy EBM od firmy Clonetics.
2. Při zjišťování inhibiční aktivity sloučeniny byly buňky trypsinovány a očkovány při četnosti 0,5-1,0 χ 105 buněk na jamku v každé jamce šestijamkových klastrových ploten (destiček) (firma Costar, Cambridge, Ma).
3. 3-4 dny po očkování byly plotny slité z 90-100 %. Ze všech ploten se odstranila půda, buňky se opláchly 5 až 10 ml PBS a inkubovaly 18-24 hodin s 5 ml základní půdy EBM bez jakékoliv přísady (to znamená v podmínkách výživové nedostatečnosti séra).
4. Postupně ředěné inhibitory se přidávaly do 1 ml půdy EBM (25μΜ, 5μΜ nebo ΙμΜ finální koncentrace) k buňkám a následovala inkubace při 37 °C po dobu 1 hodiny. Lidský rekombinantní faktor VEGF165 (od R and D Systems) se pak při konečné koncentraci 50 ng/ml přidal do všech jamek ve 2 ml půdy EBM a inkuboval se 10 minut při 37 °C. Kontrolní buňky bez příměsí nebo s příměsí pouze VEGF se použily pro vyhodnocení standardní fosforylace (background fosforylation) nebo fosforylace indukcí faktorem VEGF.
Potom se jamky opláchly 5-10 ml studeného PBS obsahujícího 1 mM ortovanadičnanu sodného (od firmy Sigma) a buňky se podrobily lýze a seškrabaly se do 200 μΐ pufru RIPA (50 mM Tris-HCl) pH 7, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% deoxycholátu sodného, lmM EDTA) obsahujícího inhibitory proteázy (lmM PMSF, 1 μg/ml aprotininu 1 μg/ml pepstatinu 1 μg/ml leupeptinu lmM vanadičnanu sodného, lmM fluoridu sodného) a 1 μς/ιηΐ Dnázy (všechny chemikálie od firmy Sigma Chemical Ccmpany, St Louis, MO). Lyzát se odstřeďoval při 14.000 otáček za minutu po dobu 30 minut pro odstranění buněčných jader.
Shodná množství proteinů se potom vysrážela přidáním studeného (-20 °C) ethanolu (ve 2 objemech) na minimálně 1 hodinu nebo maximálně přes noc. Peletky se rekonstituovaly ve vzorkovém pufru Laemli (Laemli sample buffer) obsahujícím 5 % β-merkaptoethanolu (od: BioRad, Hercules, CA), potom se 5 minut vařily. Proteiny se frakcionovaly elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (6%, 1,5 mm Novex, San Diego, CA) a přenesly na nitrocelulózovou membránu pomocí systému Novex. Po blokaci albuminem z bovinního séra (3%) se proteiny sondovaly přes noc anti-KDR polyklonální protilátkou (C20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) nebo antifosfotyrosinovou monoklonální protilátkou (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) při 4 °C. Po promyt! a jednohodinové inkubaci s fragmentem F(ab)2 (konjugovaným s HRP) z kozího protikráličího nebo kozího protimyšího imunoglobulinu IgG se pásy vizualizovaly pomocí systému emisní chemiluminiscence (ECL) (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL).
Určité příklady těchto vynálezů významně inhibují
·· •· •· •· buněčnou KiR tyrosinkinázovou fosforylaci indukovanou VEGF při koncentracích nižších než 50 μΜ.
Model uterinního edému in vivo
Tento experiment měří schopnost sloučenin inhibovat prudký vzrůst hmotnosti myší dělohy, k němuž dojde v několika prvních hodinách po estrogenové stimulaci. Je známo, že tento časný nástup vzrůstu uterinní hmotnosti je důsledkem edému způsobeného zvýšenou permeabilitou uterinního cévního systému. Cullinan-Bove a Koss (Endocrinology, 1993, 133, ss. 829-837) ukázal těsnou časovou souvislost estrogenem stimulovaného děložního edému se zvýšenou expresí mRNA VEGF v děloze. Tyto výsledky se potvrdily užitím neutralizující monoklonální protilátky k VEGF, které výrazně omezilo prudký vzrůst děložní hmotnosti, k němuž dochází po stimulaci estrogenem (WO 97/42187). Proto může tento systém sloužit jako model pro inhibici signální dráhy VEGF in vivo, navazující hyperpermeability a edému. Materiály: Všechny hormony byly získány od firmy Sigma (St.Louis, MO) nebo Cal Biochem (La Jolla, Ca) jako lyofilizované prášky, a připraveny podle instrukcí dodavatele.
Složky vehikula (DMSO, Cremaphor EL) byly zakoupeny u firmy Sigma (St. Louis, MO).
Myši (Balb/c, staré 8-12 týdnů) byly získány od firmy Taconic (Germantown, NY) a chovány ve sterilizovaném zařízení podle oficiálních směrnic Animal Care and Use Committee Guidelines.
Metodika:
1. den: myši Balb/c dostaly intraperitoneální (i.p.) injekci 12,5 jednotek gonadotropinu (PMSG) ze séra březích klisen.
3. den: myši dostaly 15 jednotek lidského chorionického
--- «·· · ·· ······· · · ··· gonadotropinu (hCG) intraperitoneálně (i.p.).
4. den: myši byly randomizovány a rozděleny do skupin po 5-10. Testované sloučeniny se podávaly intraperitoneálně (i.p.), intravenózně (i.v.) nebo orálně (p.o.) v závislosti na rozpustnosti a použitém vehikulu v dávkách v rozmezí od 1 do 100 mg/kg. Kontrolní skupina dostala jen vehikulum a dvě skupiny byly zcela opomenuty.
Po 30 minutách dostaly pokusné skupiny, skupiny se samotným vehikulem a jedna z neléčených (opomenutých) skupin intraperitcneální injekci 17 β-estradiolu (500 μς/kg). Po 23 hodinách se zvířata utratila inhalací C02. Po provedení středového řezu se děloha izolovala a odstranila řezem těsně pod děložním hrdlem na spojení dělohy a vejcovodu. Opatrně se odstranila tuková a pojivová tkáň, aby se neporušila celistvost dělohy před zvážením. Střední hmotnost dělohy testovaných skupin se srovnala s její hmotností u skupin neléčených nebo injikovaných pouze vehikulem. Hodnota se určila Studentovým t-testem. Nestimulovaná kontrolní skupina se užila pro kontrolu odezvy estradiolu.
Výsledky ukazují, že určité sloučeniny podle vynálezu inhibují vznik edému při systematickém podávání různými způsoby.
Určité sloučeniny podle tohoto vynálezu jež jsou inhibitory angiogenních receptorových tyrosinkináz se též mohou projevit jako aktivní v modelu neovaskularizace implantátu (Matrigel). Model neovaskularizace Matrigel zahrnuje tvorbu nových krevních cév ve zřetelně mramorované struktuře mimobuněčné matrice implantované podkožně, která se indukuje přítomností proangiogenního faktoru produkujiciho tumorové buňky (například: Passaniti A. a další, Lab. Investig., 1992, 67(4), ss. 519-528; Anat. Rec., 1997, 249(1), ss. 63-73; Int. J. Cancer, 1995, 63(5), ss. 694-701; Vasc. Biol., 1995, 15(11), ss. 1857-6). Tento způsob výhodně probíhá 3-4 dny a závěrečné etapy sestávají z kvantitativního vyhodnocení neovaskularizace kombinací makroskopické vizuální cesty a zobrazovacích technik, mikroskopického stanovení hustoty mikrocévního sytému a kvantifikace hemoglobinu Drabkinovou metodou, načež se ze zvířat neléčených inhibitory vyjmul systém implantát versus kontrola. V modelu lze alternativně používat jako stimuly bFGF nebo HGF.
Určité sloučeniny podle tohoto vynálezu, které inhibují jednu nebo více onkogenních, protoonkogenních nebo proliferačně dependentních proteinkináz, nebo angiogenní receptorovou PTK, rovněž inhibují růst primárních myších, krysích nebo humánních xenoimplantátových tumorů v myších nebo inhibují metastázu v myších modelech.
Syntéza
Sloučeniny podle vzorce I se mohou připravit podle popisu uvedeného níže. V následujicim je
Sloučeniny podle vzorce I v nichž A představuje CONH se mohou připravit reakcí sloučeniny vzorce TLX CORt, v nichž je Rt odstupující skupina, například halo nebo alkoxyskupina s aminem vzorce H2N-L2-Ri, při teplotě v rozmezí 0 až 250 °C případně v přítomnosti rozpouštědla.
Sloučeniny vzorce I, v nichž LXA představuje CH2NH, se mohou připravit reakcí sloučeniny vzorce I, v níž A představuje CONH, s redukčním činidlem, například lithiumaluminiumhydridem při teplotě v rozmezí 0 až 250 °C, případně v přítomnosti rozpouštědla.
Alternativně se sloučeniny vzorce I, v nichž LjA představuje CH2NH, mohou připravit reakcí sloučeniny vzorce TLi CHO s aminem vzorce H2N-L2-Ri v přítomnosti redukčního činidla, například triacetoxyborohydridu sodného při teplotě v rozmezí 0 až 250 °C, případně v přítomnosti rozpouštědla.
Alternativně může být skupina Li-A-L2-Ri přítomna ve fenylovém kruhu a kruhový systém se může konstruovat jak popsáno níže, přičemž
Existují dva základní přístupy k syntéze kruhového systému sloučenin podle vzorce I, uváděné v patentu USA 3,843.665 a 3,843,666.
V patentu USA 3,843.665 se cyklizace pyrazolového kruhu provádí zahříváním sloučenin vzorce II s aromatickým sulfonylhydrazidem vzorce III v inertním rozpouštědle s katalytickým množstvím kyseliny. Reakce se provádí po dobu 5 až 30 hodin, výhodně při teplotě 75 °C až 100 °C a poskytuje sloučeniny vzorce I, ve kterých R2 je vodík,
přičemž:
p je 0, 1, 2; W je nižší alkyl; a symboly R, R3, Ro Rs,· Re a
X mají výše uvedený význam. Sloučeniny vzorce II se připravují reakcí vhodně funkcionalizované sloučeniny vzorce
9 • 9 ·· 99 9
» • • 9 9 9
« • 9 • • 9 9 ·
• » 9 • 9 9
• 9 · • 99 • <
IV s aldehydem vzorce V v přítomnosti kyselého nebo bazického katalyzátoru (Braun R.A., Mosher W.A.,
J. Amer . Cheir.. Soc ., 1958, 80, s. 2749).
R,
0
AH R H
k 0
IV V
Druhý způsob přípravy cykl ického systému sloučenin
vzorce I se popisuje v patentu USA 3,843.666, v němž se sloučeniny s obecným vzorcem VI zahřívají na 75 až 175 °C s katalytickým množstvím organické karboxylové kyseliny nebo organické sulfonové kyseliny v inertním rozpouštědle jako je aromatický uhlovodík po dobu 6 až 24 hodin,
kde symboly R, R3, R4, Rs, Rě a X mají výše uvedený význam. Sloučeniny vzorce VI se připravují reakcí sloučeniny obecného vzorce VII s hydrazinem v inertním rozpouštědle. Reakce se provádí při 15 °C až 20 °C po dobu 24 hodin.
Alternativně se mohou připravovat sloučeniny vzorce I • · · ·
přímo reakcí sloučeniny vzorce VII s hydrazinem bez izolace sloučeniny vzorce VI, například zahříváním sloučeniny vzorce VII s hydrazinem v inertním rozpouštědle, například methanolu, v přítomnosti kyselého katalyzátoru, například octové kyseliny, při teplotě v rozmezí od 60 °C k bodu varu použitého inertního rozpouštědla.
Sloučeniny vzorce I se též mohou připravovat reakcí sloučeniny vzorce XVI,
R, 1
XVI
R6 0
přičemž symboly R, R3, R4, R5, Rs a X mají výše uvedený
význam, s hydrazinem.v inertním rozpouštědle, například methanolu, při teplotě v rozmezí od 15 °C do bodu varu použitého inertního rozpouštědla.
Sloučeniny s obecným vzorcem VII se připravují reakcí sloučeniny vzorce VIII s aldehydem vzorce V v zásaditých podmínkách. Reakce se provádí v inertním rozpouštědle při teplotě mezi 5
přičemž Y je obvyklá odstupující skupina jako chlor, brom, jod, p-toluensulfonát nebo methansulfonát a symboly R3, R4, R5, R6 a X mají výše uvedený význam.
Sloučeniny vzorce VII se též mohou připravit reakcí • · • ·
sloučeniny vzorce II s epoxidačním činidlem, například peroxidem vodíku, v inertním rozpouštědle, například methanolu, dichlormethanu, vodě nebo jejich směsích, při teplotě v rozmezí 0 až 100 °C případně v přítomnosti báze, například hydroxidu sodného.
Cyklízace struktury VI se též může provést reakcí s minerální kyselinou jako je chlorovodíková kyselina, kyselina sírová a kyselina fosforečná. Reakce se provádí v nižším alkcholu při teplotě mezi 15 a 20 °C po dobu 12 až 48 hodin. Reakční produkt IX se potom může aromatizovat na I zahříváním na teplotu 50 až 150 °C s organickou karboxylovou kyselinou r.ebo organickou sulfonovou kyselinou v éteru s přímým řetězcem nebo v cyklickém éteru po dobu 8 až 30 hodin.
Sloučenina IX se může diacetylovat reakcí s anhydridem kyseliny vzorce (RXCO)2O (struktura X), v níž Rx je Cl-4alkylová skupina, v inertním rozpouštědle jako je aromatický uhlovodík, při teplotě mezi 35 °C až 200 °C po dobu 5 až 8 hodin za vzniku sloučeniny vzorce XI.
O
Sloučeniny XI se potom mohou aromatizovat na sloučeninu XII zahřátim na teplotu 35 °C až 200 °C s minerální kyselinou nebo organickou kyselinou v inertním rozpouštědle po dobu 4 až 8 hodin. Nakonec se sloučenina XII může konvertovat na I zahříváním na teplotu 50 °C až 150 °C v inertním rozpouštědle jako je voda nebo nižší alkohol v přítomnosti alkalického kovu nebo hydroxidu alkalického kovu po dobu 8 až 30 hodin.
Sloučeniny s obecným vzorcem II se mohou cyklizovat na sloučeniny vzorce XIII reakcí s hydrazinem v inertním rozpouštědle, například methanolu, při teplotě v rozmezí 35 až 150 °C.
Sloučeniny vzorce I se mohou připravovat reakcí sloučeniny vzorce XIII s dehydrogenačním činidlem, například sírou, kyslíkem, palladiem, oxidem manganičitým nebo oxidem olovičitým, případně v přítomnosti inertního rozpouštědla, například uhlovodíku, při teplotě v rozmezí od 15 do 250 °C.
Specifické příklady výše uvedených transformací se mohou nalézt v patentech USA 3,843.665 a 3,843.666.
Karbonyl v můstkové vazbě se může transformovat na methylenovou skupinu přes Wolf-Kižněrovu redukci odpovídajícího hydrazonu (Mosher W.A., Tawfik E.Z., Lipp D.W., J.Org.Chem., 1971, 36, s. 3890).
Další způsoby funkcionalizace karbonylu v můstkové vazbě a specifické případy lze nalézt v japonské patentové přihlášce JP 60 130521 A2, a B. Loev, Patent USA, 3,004.983 (1960) .
Sloučeniny vzorce I se mohou připravit reakcí sloučenin vzorce XIV
se silnou bází, například n-butyllithiem, při teplotě v rozmezí -78 °C až 25 °C, po níž následuje reakce se sloučeninou vzorce R2COG (struktura XV), v níž R2 již bylo definováno a G představuje Cl-6-alkoxylovou skupinu.
Sloučeniny vzorce IV, VIII, XIV, XV a XVI jsou komerčně dosažitelné a lze je připravit způsoby známými odborníkům.
Sloučeniny vzorce I, v nichž X představuje SO nebo SO2, se mohou připravit oxidací sloučeniny vzorce I, v níž X představuje S, způsoby známými odborníkům, například použitím vhodného počtu molárních ekvivalentů 3chlorperbenzoové kyseliny.
Sloučeniny vzorce I, v nichž X představuje skupinu vzorce -C=NOR7, se mohou připravit reakcí sloučeniny vzorce I, v níž x představuje karbonyl, se sloučeninou vzorce H2NOR7 způsoby známými odborníkům.
Sloučeniny vzorce I, v nichž Rj = 4-pyridyl, lze dále funkcionalizovat v poloze 2 pyridinového kruhu způsoby ··· ··· ··· · · ·· ·· ··· známými odborníkům, například přesmykem prostřednictvím pyridin-N-oxidu.
Určité substituenty sloučenin vzorce I se mohou vzájemně konvertovat způsoby známými odborníkům. Například alkoxysubstituenty mohou reagovat s vhodnými činidly štěpícími étery, například bromovodíkovou kyselinou, bromidem bcritým nebo pyridinhydrochloridem za vzniku sloučeniny vzorce I s hydroxysubstituentem. Alternativně lze připravit sloučeniny vzorce I s alkoxysubstituentem alkylací sloučeniny vzorce I s hydroxysubstituentem. Struktury substituované esterifikovaným karboxylem se mohou konvertovat na karboxylové nebo amidové substituenty a karboxylové skupiny lze konvertovat na esterové nebo amidové substituenty. Nitroskupiny lze redukovat na aminy a aminy lze acylovat způsoby známými odborníkům.
Odborníkům je jasné, že určité substituenty mohou reagovat s některými činidly popsanými ve výše uvedených procesech. V takových případech je třeba užít alternativního způsobu, nebo se musí reaktivní substituent před reakcí opatřit chránící skupinou, jež se po reakci sejme.
Tento vynález ilustrují následující příklady, jež nejsou ničím víc než příklady. Konečný produkt každého z těchto příkladů vznikl za použití jedné nebo více z následujících metodik: vysokoúčinná kapalná chromatografie, elementární analýza, nukleární magnetická rezonanční spektroskopie, infračervená spektroskopie a hmotová spektroskopie s vysokou rozlišovací schopností. Užívá se následujících zkratek:
IMS = průmyslový ethanol denaturovaný methanolem LCMS = kapalná chromatografie/hmotová spektroskopie.
• · • *
Příklady provedení vynálezu
PŘÍKLAD 1
a) Směs indan-l-onu (3,3 g), methyl-4-formylbenzoátu (5,0 g), piperidinu (0,6 ml) a ledové kyseliny octové (0,5 ml) se zahřívala na parní lázni po dobu 3 hodin. Získaná pevná hmota se pcvařila v IMS (200 ml) a pak se za horka zfiltrovala. Získaný pevný zbytek se promyl IMS a usušil za vzniku methyl-4-(l-oxoindan-2-ylidenmethyl)benzoátu s bodem tání 194-198 °C.
b) Produkt z a) (1,5 g) se suspendoval v methanolu (10 ml) a dichlormethanu (15 ml) a míchal se při 0-5 °C, přičemž se přidal 2M roztok hydroxidu sodného (2,7 ml), po kterých následoval 30% peroxid vodíku (100 vol. 1,1 ml). Směs se míchala při 0-5 °C 5 minut, pak 24 hodin při teplotě prostředí. Ke směsi se přidal dichlormethan (100 ml), potom se směs promyla solankou (2x50 ml), vysušila, zfiltrovala a odpařila za vzniku methyl-4-(1-oxospiro[indan-2,2'-oxiran]-
3'-yl)benzoátu, bod tání 160-163 °C. Vodná fáze se okyselila 5M chlorovodíkovou kyselinou a extrahovala dichlormethanem jako 4-(1-oxospiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-yl)benzoová, bod tání 220 °C za rozkladu.
c) 4-(1-Oxospiro(indan-2,2'-oxiran)-3'-yl)benzoová kyselina z odstavce b)(780 mg), methanol (50 ml), hydrazinhydrát (0,18 ml) a ledová kyselina octová (6 kapek) se pod zpětným chladičem vařily 24 hodin. Směs se chladila na ledu a zfiltrovala za vzniku 4-(1,4-dihydroindeno[1,2-
c]pyrazol-3-yl)benzoové kyseliny s bodem tání >320 °C.
d) Směs produktu z c)(5,3 g) a dichlormethanu (250 ml) se míchala při teplotě prostředí a pak se přidal oxalylchlorid (5 ml) a suchý N,N-dimethylformamid (6 kapek), směs se míchala při teplotě prostředí 10 minut a pak vařila pod zpětným chladičem 90 minut. Rozpouštědlo se vakuově odtáhlo a získal se surový chlorid kyseliny, který se přímo použil v _____ · · · · » · · ··· · ·· ······· · · · · · příštím pokusu.
e) Chlorid kyseliny z d) (3,73 g) se při teplotě prostředí míchal v dichlormethanu (150 ml, potom se přidal triethylamin (3 ml) a pak 4-aminopyridin (0,9 g) . Směs se při teplotě prostředí míchala 3 hodiny. Přidala se voda (150 ml) a 5M roztok hydroxidu sodného (50 ml) a pak se směs 90 minut míchala při teplotě prostředí. Směs se zfiltrovala a zbytek se promyl dichlormethanem a vodou. Filtrát a promývací kapaliny se spojily, oddělily a dichlormethanová vrstva se vysušila a odpařila za vzniku pevné fáze, která se spojila s původní pevnou fází získanou filtrací a separovala flešovou sloupcovou chromatografii na oxidu křemičitém a s eluentem dichlormethanem a ethylalkoholem (10:1) jako N-(4-pyridyl)-4-(1,4-dihydroindeno[1,2-
c]pyrazol-3-yl)-benzamid.
f) Lithiumaluminiumhydrid (830 mg) se při teplotě prostředí přidal v dávkách k míchané směsi produktu z e) (1,9 g) v suchém tetrahydrofuranu (50 ml). Směs se pod zpětným chladičem vařila 1 hodinu. Směs se ochladila na 0-5 °C a přidala k ethylacetátu (70 ml) a pak se přidalo 70 ml vody. Směs se míchala 10 minut a zfiltrovala za vzniku pevné fáze A. Vodná fáze se oddělila a extrahovala dalším ethylacetátem (100 ml). Pevná fáze A se míchala s ethanolem a zfiltrovala. Ethylacetátové extrakty a ethanolový filtrát se spojily a odpařily. Získaný zbytek se přečistil flešovou sloupcovou chromatografii za použití eluentu dichlormethan/ethanolu (10:1) a získal se 4-(1,4dihydroindeno[1,2-c]pyrazol)-N-(4-pyridyl)benzylamin s bodem tání 270-274 °C.
PŘÍKLAD 2
a) Směs indan-l-onu (20,0 g), 4-nitrobenzaldehydu (27,0
g) , ledové kyseliny octové (3,0 g) a piperidinu (3,06 g) se 3,5 hodin zahřívala při 95 °C pod dusíkem. Směs se ochladila na 20 °C a zfiltrovala, pevná fáze se rekrystalizovala z IMS na 2-(4-nitrobenzyliden)indan-l-on.
b) Produkt z operace a) (28,0 g) se míchal s dichlormethanem (100 ml) a methanolem (100 ml) při 20 °C, potom se přidal 2M roztok hydroxidu sodného (50 ml) pak peroxid vodíku (20 ml, 100 objemů). Směs se míchala 24 hodin při 20 °C. Přidal se další peroxid vodíku (20 ml, 100 objemů) a směs se míchala dalších 24 hodin. Přidal se další peroxid vodíku (10 ml, 100 objemů) a směs se míchala 64 hodin. Reakční směs se neutralizovala ledovou kyselinou octovou a vytvořená pevná fáze se shromáždila filtrací a sušila na 3'-(4-nitrofenyl)-1-oxospiro[indan-2,2'-oxiran].
c) Produkt z b) (10,0 g) se rozpustil v ethanolu (180 ml) a k získanému roztoku se přidal hydrazinhydrát (1,78 g), po němž následovala ledová octová kyselina (30 kapek). Směs se 5 hodin vařila pod zpětným chladičem, pak se ochladila na 20 °C a při této teplotě stála 18 hodin. Filtrací se oddělila pevná fáze a rekrystalizovala z acetonu na 3-(4-nitrofenyl)1,4-dihydroindeno[1,2-c] pyrazol s bodem tání 267-270 °C.
d) Produkt z c) (3,0 g) se suspendoval v IMS (200 ml) a přidalo se 5% palladium na aktivním uhlí (250 mg), po němž následoval mravenčan amonný (2,05 g). Směs se 3 hodiny zahřívala při 70 °C, pak se ochladila na okolní teplotu a pak zfiltrovala. Filtrát se zahustil za sníženého tlaku a třel s dichlormethanem a získal se 4-(1,4-dihydroindeno[1,2c]pyrazol-3-yl)anilin s bodem tání 253-254 °C.
e) Produkt z d) (1,0 g) se rozpustil v dichlormethanu (30 ml) a přidal se triethylamin (0,62 ml). Směs se ochladila na 0 °C a za míchání se přidal benzensulfonylchlorid (0,79 g). Směs se zahřála na 20 °C a při této teplotě 2 hodiny míchala. Přidal se další triethylamin (0,62 ml) a benzensulfonylchlorid (0,79 g) a směs se míchala 4 hodiny při teplotě prostředí a pak se nechala při této teplotě stát 16 hodin. Přidal se éter (80 ml) a po něm voda (40 ml).
Vysrážená pevná fáze se zfiltrovala, promyla roztokem hydrogenuhličitanu sodného a éterem a pak se pod vakuem sušila při 60 °C. Materiál se rekrystalizoval z acetonu a získaná pevná fáze se přečistila flešovou sloupcovou chromatografii na oxidu křemičitém za použití dichlormethanu a získaná pevná fáze byla identifikována jako 4'— Čiřeny 1 sul f or.yl (1,4-dihydroindeno [ 1,2-c] pyrazol-3-yl) Nf enylsulfor.ylanilin.
f) Produkt z e) (0,56 g) se suspendoval v methanolu (40 ml) a přidal se roztok 2M hydroxidu sodného (5,3 ml). Získal se čirý roztok, který se míchal 20 minut při 20 °C. Směs se nalila do 2M chlorovodíkové kyseliny (75 ml) a získaná pevná fáze se zfiltrovala a míchala 30 minut s nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 ml) a ethylacetátem (25 ml) a filtrací se získal N-[4-(1,4dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)fenyl]benzensulfonamid, bod tání 286-268 °C.
PŘÍKLAD 3
Směs chloridu kyseliny z příkladu 1 d) (100 mg), dichlormethanu (5 ml), 2-methoxyethanolu (26 μΐ) a triethylaminu (84 μΐ) se míchala 20 hodin při teplotě prostředí. Směs se míchala s nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 ml) a zfiltrovala. Filtrát se odpařil na pevnou fázi, která se přečistila flešovou sloupcovou chromatografií s užitím směsi dichlormethan/IMS v poměru 25:2 jako mobilní fáze a bezbarvá pevná fáze se identifikovala jako 4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3yl)-N-(2-methoxyethyl)benzamid.
PŘÍKLAD 4
Směs chloridu kyseliny z příkladu 1 d) (100 mg), dichlormethanu (5 ml), 4-nitroanilinu (41 mg) a triethylaminu (64 μΐ) se míchala 20 hodin při teplotě prostředí. Směs se 10 minut míchala s nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 ml) a pak zfiltrovala. Pevná fáze se promyla dichlormethanem, potom alkoholem a sušila na bezbarvou pevnou látku 4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3yl)-N-(4-nitrofeny1)benzamid.
Příklad 5
Anilin z příkladu 2 d) se rozpustil v dichlormethanu (200 ml) a potom se přidal triethylamin (7,4 ml) . Směs se ochladila na 0 °C a za míchání se přidal chloracetylchlorid (4,2 ml) a směs se zahřála na 20 °C. Směs se zfiltrovala a získe.ná pevná fáze se promyla vodou a pak éterem a sušila za vzniku meziproduktu, který se chloracetyloval na NI pyrazolu a NH2 skupině výchozího anilinu.
b) Produkt z a) (1,4 g), imidazol (0,95 g) a tetrahydrofuran (40 ml) se vařily pod zpětným chladičem při teplotě 90 °C a v atmosféře dusíku po dobu 6 hodin. Směs se zfiltrovala a filtrát se odpařil za sníženého tlaku na pevný zbytek, který se rozdělil mezi ethylacetát a 2M chlorovodíkovou kyselinu. Získaná pevná fáze se zfiltrovala a sušila na dihydrochlorid 4-(1,4-dihydroindeno[1,2-
c]pyrazol-3-yl)imidazol-l-ylaceanilidu s teplotou tání 264266 °C.
PŘÍKLAD 6
Produkt z příkladu 5 (0,27 g) se za míchání a v dusíkové atmosféře suspendoval v tetrahydrofuranu (30 ml) a přidal se lithiumaluminiumhydrid (87 mg). Směs se 18 hodin míchala při 20 °C. Reakce směsi se zastavila nasyceným roztokem síranu sodného (40 ml) a potom extrahovala ethylacetátem (2x30 ml) za vzniku pevné fáze, která se rozpustila v ethanolu (3 ml), k němuž se přidala koncentrovaná chlorovodíková kyselina (10 kapek). Ethanol se odstranil a vznikla žlutá pevná fáze, jež se třela s éterem
za vzniku dihydrochloridu 4-(l,4-dihydroindeno[l,2c]pyrazol3-yl)-N-[2-(imidazol-l-yl)ethyl]anilinu s bodem tání 205-209 °C.
PŘÍKLAD 7
Směs 4-kyanobenzensulfonylchloridu (5,15 g) se míchala v acetonu 70 ml) při teplotě prostředí a potom se po kapkách a za míchání přidal roztok 2-morfolinoethylaminu (6,7 ml) v acetonu (15 ml). Směs se 2 hodiny míchala při teplotě prostředí, pak se odpařil aceton a zbytek se promýval ethylacetátem přes vrstvu oxidu křemičitého a získal se 4-kyano-N-2-morfolinoethylbenzensulfonamid.
b) Produkt z a) (0,65 g) a bezvodý toluen (30 ml) se míchaly při 0 až 5 °C a přidal se diisobutylaluminiumhydrid (4,4 ml 1,CM roztoku v cyklohexanu). Po přidání se roztok po přes 30 minut zahříval na okolní teplotu a potom se přes 30 minut zahříval k varu pod zpětným chladičem a vařil se 3 hodiny. Směs se ochladila a při 10 až 15 °C se přidala 5M chlorovodíková kyselina (10 ml).Potom se směs 10 minut zahřívala na 90 °C a následně se ochladila a oddělila se toluenová vrstva. Vodná vrstva se promyla ethylacetátem a potom zneutralizovala na pH 7 až 8 pomocí 5M roztoku hydroxidu sodného. Směs se extrahovala ethylacetátem, vysušila, zfiltrovala a odpařila na gumovitou látku, jež se sušila pod vakuem při 40 °C a poskytla pevnou látku, jež byla určena jako 4-formyl-N-(2- morfolinoethyl)benzensulfonamid, b.t. 114-116 °C.
c) Produkt z b) (200 mg), 2-bromindanon (142 mg) a bezvodý methanol (3 ml) se míchaly při 0 °C a k této směsi se přidal roztok sodného methoxidu (44 mg) v methanolu (0,5 ml). Směs se míchala při 0 °C 2 hodiny za vzniku pevné fáze, která se zfiltrovala, promyla methanolem a vysušila pod vakuem na epoxid.
d) Produkt z c) (3,7 g), hydrazinhydrát (1 ml), ledová
kyselina octová (10 kapek) a ethanol (100 ml) se 26 hodin vařily pod zpětným chladičem a ethanol se sušil v Soxhletově extraktoru pomocí molekulárního síta. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku a zbytek se přečistil flešovou sloupcovou chromatografií a získal se 4-(1,4dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2morfolinoerhyl)benzensulfonamid s b.t. 218-220 °C.
PŘÍKLAD 8
Příprava byla stejná jako v příkladu 7 s tím rozdílem, že místo 2-morfolinoethylaminu se použilo 2methoxymethylaminu a získaný produkt byl 4-(1,4dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2methoxyethyl)benzensulfonamid.
PŘÍKLAD 9
a) Směs indan-l-onu (3,3 g), methyl-4-formylbenzoátu (5,0
g), piperidinu (0,6 ml) a ledové kyseliny octové (0,5 ml) se 3 hodiny zahřívala na vodní lázni. Získaná pevná hmota se povařila v IMS (200 ml) a pak se za horka zfiltrovala. Získaný pevný zbytek se promyl IMS a sušil jako methyl-4-(loxoindan-2-ylidenmethyl)benzoát s bodem tání 194-198 °C.
b) Produkt z a) (1,5 g) se suspendoval v methanolu (10 ml) a dichlormethanu (15 ml) a míchal při 0 až 5 °C, přičemž se přidal 2M roztok hydroxidu sodného a po něm 30% peroxid vodíku (100 objemů, 1,1 ml). Směs se 5 minut míchala při 0-5 °C, potom 24 hodin při teplotě místnosti. Ke směsi se přidal dichlormethan (100 ml), a směs se pak promyla solankou (2x50 ml), vysušila, zfiltrovala a odpařila, čímž se získal methyl-4-(1-oxospiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-yl)benzoát s teplotou tání 160-163 °C. Vodná fáze se okyselila 5M chlorovodíkovou kyselinou a extrahovala dichlormethanem a získala se 4-(1-oxospiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-yl)benzoová kyselina s teplotou tání 220 °C za rozkladu.
c) Směs methyl-4-(1-oxospiro[indan-2,2'-oxiran]-3'yl)benzoátu (750 mg), methanolu (30 ml) a hydrazinhydrátu (0,16 ml) se míchala při teplotě prostředí, přičemž se přidala ledová kyselina octová (6 kapek). Směs se 24 hodin vařila pod zpětným chladičem a pak se ponechala stát 24 hodin při teplotě místnosti, pak se ochladila na 0 °C a zfiltrovala, čímž se získal methyl-4-(1,4-dihydroindeno[1,2c]pyrazol-3-yl)benzoát, teplota tání 224-226 °C.
d) Ester z c) (2,20 g) a N,N-diethylethylendiamin (7 ml) se vařil 4,5 hodin pod zpětným chladičem. Směs se ochladila na teplotu prostředí a přidal se petroléter (50 ml) s teplotou varu 40 až 60 °C. Směs se zfiltrovala a získal se amid.
e) Amid ((2,75 g) se suspendoval v tetrahydrofuranu a míchal při okolní teplotě v atmosféře dusíku a přidal se lithiumaluminiumhydrid (1,14 g). Směs se míchala 3,5 hodin a pak se přidal další lithiumaluminiumhydrid (1,14 g) a tetrahydrofuran (40 ml). Po 22,5 hodinách se přidala třetí dávka lithiumaluminiumhydridu a pak se tato směs míchala 24 hodin. Směs se 2,5 hodin vařila pod zpětným chladičem a pak se nechala přes noc stát při okolní teplotě. Směs se míchala v dusíkové atmosféře za chlazení ledovou lázní, přičemž se přidával ethylacetát (100 ml), po něm voda (100 ml) , oddělila se organická vrstva, promyla, vysušila a odpařila, čímž vznikl olej, který se přečistil flešovou sloupcovou chromatografií na oxidu křemičitém s použitím ethylacetátu/ethanolu/triethylaminu (7:2:1). Příslušné frakce se spojily a odpařily, čímž vznikla gumovitá látka (0,85 g), jež se při zahřívání rozpustila v ethanolu (5 ml) a k roztoku se přidala koncentrovaná chlorovodíková kyselina (0,6 ml). Potom se směs odpařila za sníženého tlaku a výsledná gumovitá látka se vařila s ethanolem (10 ml), pak chladila ledovou lázní a získal se trihydrochlorid N-[2(N, N-diethylamino)ethyl)-4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol74
3-yl)benzylaminu s teplotou táni 225 °C.
PŘÍKLAD 10
Tento přiklad se připravil stejně jako příklad 7 s tím rozdílem, že místo 2-morfolinoethylaminu se použil N,Ndiethylaminoethylamin. Získaný produkt byl dihydrochlorid N[2-(N,N-diethylamino)ethyl]-4-(1,4-dihydroindeno[1,2c]pyrazol-3-yl)benzensulfonamidu s teplotou tání 192-196 °C.
PŘÍKLAD 11
Tento příklad se připravil podobně jako příklad 9 a místo N,N-diethylethylendiaminu se použil 2morfolinoethylamin. Získaný produkt byl dihydrochlorid 4(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2morfolinoethyl)benzylaminu s teplotou tání 266-269 °C za rozkladu.
PŘÍKLAD 12
Tento příklad se připravil podobně jako příklad 1 s tím rozdílem, že místo 2-methoxyethylaminu se použil 4ethoxyanilin. Získaný produkt byl N-(4-ethoxyfenyl)-4-(l,4dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)benzylamin s teplotou tání 180 °C za rozkladu.
Přiklad 13
Tento příklad se připravil podobně jako příklad 9 d) s tím rozdílem, že místo N,N-diethylethylendiaminu se použil (S-(+)-2-(aminomethyl)pyrrolidin. Získaný produkt byl dihydrochlorid (S)-4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)N-(pyrrolidin-2-ylmethyl)benzamid s teplotou tání 222-226 °C.
PŘÍKLAD 14
a) Methylthiosalicylát (9,89) se za míchání přidal k roztoku sodného methoxidu (11,6 g) v ethanolu (100 ml). Po 15 minutách se přidal roztok 4'-bromfenacylbromidu (20,0 g) v ethanolu (100 ml) a směs se 18 hodin míchala a vařila pod zpětným chladičem. Směse ochladila a okyselila 10% chlorovodíkovou kyselinou (150 ml). Pevná fáze se oddělila a přímo užila v příštím experimentu.
b) Produkt a) (18,0 g) se míchal a vařil pod zpětným chladičem v ethanolu (150 ml) v baňce opatřené Soxhletovým extraktorem naplněným molekulárním sítem zrnitosti 4 Á. Přidala se 1 kapka ledové kyseliny octové, pak hydrazinhydrát (3,9 ml) a směs se vařila a míchala 64 hodin pod zpětným chladičem. Směs se ochladila a sraženina se oddělila a přímo užila v příštím experimentu.
c) Produkt z b) (4,0 g) se rozpustil v tetrahydrofuranu (200 ml) a po kapkách přidával za míchání v dusíkové atmosféře a při 0 °C do míchané suspenze hydridu draslíku (1,53 g) v tetrahydrofuranu (100 ml). Potom se směs 15 minut míchala a pak ochladila na -78 °C. Po kapkách se přidalo terc.butyllithium (17,0 ml 1,5M roztoku v pentanu) a po 45 minutách míchání při této teplotě se přidal dimethylformamid (4,7 ml). Na -78 °C se teplota udržovala 1 hodinu a pak se směs nechala pomalu ohřát na teplotu prostředí. Reakce se zastavila opatrným přidáním 1M chlorovodíkové kyseliny (200 ml). Organická vrstva se oddělila, promyla vodou, nasyceným hydrogenuhličitanem a solankou, pak se vysušila, zfiltrovala a odpařila na červenou voskovou pevnou látku, která se přečistila flešovou sloupcovou chromatografii na oxidu křemičitém a s použitím 20% ethylacetátu v petroléteru (teplota varu 260-280 °C) jako mobilní fází a získal se 3- (4-formylfenyl)-1H-[1]benzothieno[3,2-c]pyrazol s teplotou tání 261-263 °C.
d) Roztok produktu z c) (100 mg), 3—(1— imidazolyl)propylamin (58 mg) v ledové kyselině octové obsahující 1,2-dichlorethan (0,03 ml) se jednu hodinu míchal
při teplotě okolí. Přidal se triacetoxyborohydrid (84 mg) a směs se 16 hodin míchala při teplotě okolí. Přidal se další triacetoxyhorohydrid (90 mg) a směs se míchala 24 hodin při teplotě okclí. Směs se nalila do míchaného nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 20 ml). Organická vrstva se oddělila a vodná vrstva se extrahovala dichlormethanem. Kombinace organické vrstvy a extraktů se promyla vodou, vysušila a odpařila za sníženého tlaku a získaná pevná látka se rozpustila v ethanolu (15 ml) a přidaly se 2 kapky koncentrované chlorovodíkové kyseliny. Roztok se zahustil za sníženého tlaku a vzniklá pevná fáze se třela s diethyléterem, zfiltrovala a vysušila a získal se trihydrochlorid 4-(1H-[1]benzothieno[3,2-c]pyrazol-3-yl)-N[3-(imidazcl-1-yl)propyl]benzylaminu s teplotou tání 206-208 za rozkladu.
PŘÍKLAD 15
Tento příklad se připravil podobně jako příklad 14 reakcí 3-(4-formylfenyl)-1H-[1]benzothieno[3,2-c]pyrazolu s 2-morfolincethylaminem za vzniku trihydrochloridu 4-(lH[1]benzothieno[3,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2morfolinoethyl)benzylaminu s teplotou tání 270-272 °C.
Příklad A
Použití sloučeniny podle tohoto vynálezu při výrobě farmaceutických kompozic je ilustrováno následujícími popisy. V tomto popisu termín aktivní sloučenina znamená jakoukoliv sloučeninu podle vynálezu, ale zejména jakoukoliv sloučeninu, jež je konečným produktem některého z předchozích příkladů.
a) Tobolky
Při přípravě tobolek se 10 dílů hmotnostních aktivní sloučeniny a 240 dílů hmotnostních laktózy zbaví shluků a
smísí. Směs se plní do tvrdých želatinových tobolek, z nichž každá obsahuje jednu jednotkovou dávku (nebo její část) aktivní látky.
b) Tablety
Tablety se připravují z následujících přísad:
Hmotnostní díly
Aktivní sloučenina10
Laktóza190
Kukuřičný škrob22
Polyvinylpyrrolidon10
Stearát horečnatý3
Aktivní sloučenina, laktóza a část škrobu se zbaví shluků, smísí a výsledná směs se granuluje s roztokem polyvinylpyrrolidonu v ethanolu. Suchý granulát se smísí se stearátem hořečnatým a zbytkem škrobu. Potom se směs lisuje na tabletovacím stroji za vzniku tablet, z nichž každá obsahuje jednotkovou dávku nebo část jednotkové dávky aktivní sloučeniny.
c) Enterosolventní tablety
Tablety se připravují způsobem popsaným v b) výše. Enterosolventní povlak vzniká běžným způsobem za použití roztoku 20 % acetátftalátu celulózy a 3 % diethylftalátu v ethanol:dichlormethanu (1:1).
d) Čípky
Při přípravě čípků se 100 hmotnostních dílů aktivní sloučeniny vnese do 1300 hmotnostních dílů triglyceridové čípkové báze a směs se tvaruje do čípků, z nichž každý obsahuje terapeuticky účinné množství aktivní složky.
Ekvivalenty
I když vynález byl částečně demonstrován a popsán s odkazy na jeho výhodná provedení, odborníkům musí být zřejmé, že v nich lze činit změny formy a podrobností, aniž by se opustil duch a rozsah vynálezu, jak jej definují připojené patentové nároky. Odborníci najdou nebo budou schopni zjistit za pomoci pouhého rutinního experimentování mnoho ekvivalentů specifických provedení tohoto vynálezu zde výslovně popsaných. Takové ekvivalenty zahrnujeme do rozsahu tohoto vynálezu definovaného patentovými nároky.

Claims (4)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sloučeniny vzorce I R6 kde
    Li přestavuje skupinu vzorce (E)s(CH2)q, v níž E je NR24, O nebo S, s je 0 nebo 1 a q je celé číslo od 0 do 6, za podmínky, že jestliže s je 1, q je nejméně 1, a v níž je alkylenový řetězec případně substituován jednou nebo více skupinami ze skupiny kterou tvoří: Cl-6-alkylová skupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; Cl-6alkoxyskupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; hydroxyskupina; halogen nebo případně substituovaná aminoskupina;
    A představuje CONH, NHCO, SO2NH, NHSO2 nebo NR25;
    L2 představuje skupinu vzorce (CH2)r, v níž r je celé číslo od 0 do 6, v níž je alkylenový řetězec případně substituován jednou nebo více skupinami z následujících: Cl jednou nebe více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; hydroxyskupina; halogen nebo případně substituovaná aminoskupina;
    R2 představuje Cl-6-alkylovou skupinu případně
    6-alkylová skupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; Cl-6-alkoxyskupina případně substituovaná — ..................
    substituovanou jedním nebo více z následujících substituentů: halogen, hydroxyskupina, Cl-6-alkoxy nebo případně substituovaná aminoskupina; Cl-6-alkoxyskupina případně substituovaná jedním nebo více z následujících substituentů: halogen, hydroxyskupina, Cl-6-alkoxyskupina nebo případně substituovaná aminoskupina; nebo R2 j e halogen, hydroxy, kyano nitro, karbamoyl, alkanoylskupina Cl-6, (Cl-6-alkoxy)karbonylová skupina nebo případně substituovaná aminoskupina;
    n představuje 0, 1, 2 nebo 3
    X představuje a) substituovaný methylen, b) karbonyl, c) kyslík, d) skupinu vzorce -C=NOR7, v níž R-? představuje H nebo Cl-4-alkyl, e) skupinu vzorce NR8, v níž R8 představuje H, případně substituovanou Cl-4-alkylovou skupinu nebo případně substituovaný fenyl, f) skupinu vzorce (CH2)nz v níž n je 1, 2 nebo 3, nebo g) skupinu vzorce S(O)p, v níž p je 0, 1 nebo 2;
    R3, R4, R5 a R6 nezávisle představují a) H, b) halogen, c) Cl-6-alkylskupinu případně substituovanou jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyskupina, Cl-6alkoxyskupina, halogen nebo případně substituovaná aminoskupina, d) Cl-6-alkoxyskupinu případně substituovanou jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyskupina, Cl-6-alkoxyskupina, halogen nebo případně substituovaná aminoskupina za předpokladu, že tyto skupiny nejsou vázány na uhlík vázaný na kyslík alkoxyskupiny; e) případně substituovanou fenoxyskupinu, f) hydroxyskupinu, g) skupinu vzorce CORa v níž Ra představuje hydroxyskupinu, Cl6-alkoxyskupinu nebo Ra představuje případně substituovanou aminoskupinu, h) případně substituovanou aminoskupinu, i) Cl-6-alkanoylskupinu, j) nitroskupinu, k) případně substituovanou fenyl-Cl-6-alkylskupinu, 1) případně substituovanou fenyl-Cl-6-alkoxyskupinu, m) kyanoskupinu nebo o) C2-4-alkenylskupinu nebo C2-4-alkynylskupinu, které jsou obě případně substituovány fenylem, který je případně substituován jedním nebo více následujícími substituenty:
    Cl-6-alkylcvá skupina, Cl-6-alkoxylová skupina nebo halogen;
    a
    1) když A je SO2NH nebo NHSO2,
    Ri představuje a) případně substituovaný fenyl, b) případně substituovaný heteroaryl, c) pěti, šesti nebo sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh obsahující dusíkový atom, který případně obsahuje další heteroatom vybraný ze skupiny 0, S nebo N a je případně substituován Cl-6alkylovou skupinou, přičemž uvedený nasycený kruh může být připojen přes uhlík nebo heteroatom, d) případně substituovanou aminoskupinu nebo e) Cl-6-alkoxyskupinu.
  2. 2) když A představuje CONH nebo NHCO,
    Ri představuje a) fenyl substituovaný nitroskupinou nebo jednou nebo více Cl-6-alkoxyskupinami případně substituovanými jednou nebo více následujícími substituenty: halogen, hydroxyl, Cl-6-alkoxyskupina nebo případně substituovaná aminoskupina, b) případně substituovaný heteroaryl nebo c) pěti, šesti nebo sedmičlenný nasycený heterocyklický kruh obsahující dusíkový atom, který případně obsahuje další heteroatom vybraný z 0, S nebo N a je případně substituován Cl-6-alkylovou skupinou, přičemž je uvedený nasycený kruh vázán přes uhlíkový atom, nebo d) Cl6-alkoxyskupinu;
  3. 3) když A představuje skupinu NR25 a q je nejméně 1, potom
    Ri představuje a) případně substituovaný fenyl, b) případně substituovaný heteroaryl nebo c) případně substituovanou aminoskupinu; a
  4. 4) když A představuje skupinu NR25 aqjeOasjeO, potom
    Ri představuje případně substituovaný heteroaryl;
    R24 a R25 nezávisle představují H; Cl-6-alkylovou skupinu případně substituovanou jedním nebo více z následujících substituentů: hydroxyl, Cl-6-alkoxyskupina, halogen nebo případně substituovaná aminoskupina; Cl-6alkanoylskupinu nebo Cl-6-alkylsulfonylskupinu, za předpokladu, že žádné dva heteroatomy nejsou vázány na tentýž sp3 hybridizovaný uhlíkový atom, a jejich farmaceuticky přijatelné soli.
    2.
    Sloučeniny podle nároku
    1, kde je ch2 nebo S.
    3.
    Sloučeniny podle nároku
    1/ kde je
    CH2 a A je NR25.
    4.
    Sloučeniny podle nároku
    1/ kde je je NR25.
    5.
    Sloučeniny podle nároku
    1, kde je ch2 je
    HNSO2.
    6.
    Sloučeniny podle nároku
    1, kde je ch2 je so2nh.
    Sloučeniny podle nároku
    1, kde je
    CH2 je
    CONH.
    8. Sloučeniny podle nároku
    1, kde je
    CH2 je
    HNCO.
    1,
    9. Sloučeniny
    Li je (CH2)q, přičemž q je celé číslo od 1 do 6 a alkylenový řetězec je případně substituován jedním nebo více ze substituentů této skupiny: Cl-6-alkylová skupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny podle nároku kde je
    CH2, A je NR25, nebo případně substituovanými aminoskupinami; Cl-6alkoxylová skupina případně substituovaná jednou nebo více hydroxyskupinami, halogeny nebo případně substituovanými aminoskupinami; hydroxyl; halogen; nebo případně substituovaná aminoskupina; L2 je vazba a R2 je případně substituovaný pyridyl.
    10. Sloučenina vybraná ze skupiny, kterou tvoří:
    4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-N-(4-pyridyl) benzylamin
    N-[4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3yl)fenyl]benzensulfonamid
    4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2methoxyethyl)benzamid
    4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(4nitrofenyl)benzamid
    4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)imidazolylacetanilid
    4-(1, 4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-[2-imidazol-lyl)ethyl]anilin
    4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2morfolinoethyl)benzensulfonamid
    4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(2methoxyethyl)benzensulfonamid
    N-[2-(N, N-diethylamino)ethyl]-4-(1,4-dihydroindeno[1,2 — c]pyrazol-3-yl)benzylamin
    N-[2-(N,N-diethylamino)ethyl]-4-(1,4-dihydroindeno[1,2c]pyrazol-3-yl)benzensulfonamid
    4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(284 morfolinoethyl)benzylamin
    N-(4-ethoxyfenyl)-4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazo1-3yl)benzylamin (S)-4-(1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol-3-yl)-N-(pyrrolidin2-ylmethyl)benzamid
    4-(1H-[1]benzothieno[3,2-c]pyrazol-3-yl)-N-[3-(imidazol-1yl)propyl]benzylamin
    4-(1H-[1]benzothieno[3,2-c]pyrazo1-3-yl)-N-(2morfolinoethyl)benzylamin a jejich farmaceuticky přijatelné soli včetně jednotlivých enantiomerů a směsí enantiomerů.
    11. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se t i m , že obsahuje sloučeninu vzorce I podle nároku
    1 ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.
    12. Sloučenina vzorce I podle nároku 1 pro použití jako lék.
    13. Sloučenina vzorce I podle nároku 1 pro použití jako lék pro inhibici aktivity proteinkinázy.
    14. Použití sloučeniny vzorce I podle nároku 1 při výrobě léku užívaného při inhibici aktivity proteinkinázy.
    15. Způsob inhibice aktivity proteinkinázy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání sloučeniny vzorce I proti uvedené kináze v koncentraci dostačující, aby inhibovala enzymovou aktivitu uvedené kinázy.
    16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená proteinkináza je tyrosinkináza.
    17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená tyrosinkináza je buď receptorová tyrosinkináza nebo nereceptorová tyrosinkináza.
    18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedená tyrosinkináza se vybere ze skupiny, kterou tvoří KDR, flt-1, TIE-2, Lek, Src, fyn a yes.
    19. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že aktivita uvedené tyrosinkinázy ovlivňuje angiogenezi.
    20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že inhibice uvedené tyrosinkinázy je antiangiogenní.
    21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že uvedená inhibice uvedené tyrosinkinázy inhibuje postup chorob vybraných ze skupiny, kterou tvoří rakovina, artritida, ateroskleróza, lupénka, hemangiom, myokardiální angiogeneze, koronární a cerebrální kolaterální vaskularizace, ischemická angiogeneze končetin, onemocnění rohovky, rubeosis, neovaskulární glaukom, makulární degenerace, hojení ran, peptické vředové choroby způsobené Helikobakterií, zlomeniny, diabetická retinopatie a horečka z kočičího škrábnutí.
    22. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že aktivita uvedené tyrosinkinázy ovlivňuje vaskulární hyperpermeabilitu nebo vznik edemů.
    23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že inhibice uvedené tyrosinkinázy je antiedematózní.
    24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že inhibice uvedené tyrosinkinázy inhibuje postup chorob vybraných ze skupiny, kterou tvoří popáleniny, chronická plicní onemocnění, mrtvice, polypy, lupénka, alergické záněty, makulární degenerace, diabetická retinopatie, syndrom ovariální hyperstimulace, mozkový edém spojený s nádorem na mozku.
    25. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že inhibice uvedené tyrosinkinázy má protinádorový účinek.
    26. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že inhibice uvedené tyrosinové aktivity je spojena s působením proti plodnosti nebo pro vyhnání plodu.
    27. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená proteinkináza je serinkináza.
    28. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená proteinkináza je threoninkináza.
    29. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená tyrosinkináza je KDR.
    30. Procesy jak jsou zde popsány.
CZ20013580A 1999-04-06 2000-03-28 Substituované 1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazoly jako inhibitory tyrosin kinázy CZ20013580A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12796399P 1999-04-06 1999-04-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20013580A3 true CZ20013580A3 (cs) 2002-03-13

Family

ID=22432894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013580A CZ20013580A3 (cs) 1999-04-06 2000-03-28 Substituované 1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazoly jako inhibitory tyrosin kinázy

Country Status (25)

Country Link
EP (1) EP1165544B1 (cs)
JP (1) JP2002541150A (cs)
KR (1) KR20020015034A (cs)
CN (1) CN1368970A (cs)
AT (1) ATE246684T1 (cs)
AU (1) AU4037800A (cs)
BG (1) BG106044A (cs)
BR (1) BR0009561A (cs)
CA (1) CA2368686A1 (cs)
CZ (1) CZ20013580A3 (cs)
DE (1) DE60004340T2 (cs)
DK (1) DK1165544T3 (cs)
ES (1) ES2207497T3 (cs)
HK (1) HK1045500A1 (cs)
HU (1) HUP0201514A3 (cs)
IL (1) IL145564A0 (cs)
MX (1) MXPA01010072A (cs)
NO (1) NO20014864L (cs)
NZ (1) NZ514269A (cs)
PL (1) PL350891A1 (cs)
PT (1) PT1165544E (cs)
SK (1) SK14112001A3 (cs)
TR (1) TR200103789T2 (cs)
WO (1) WO2000059901A1 (cs)
ZA (1) ZA200107838B (cs)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6462036B1 (en) * 1998-11-06 2002-10-08 Basf Aktiengesellschaft Tricyclic pyrazole derivatives
US6297238B1 (en) * 1999-04-06 2001-10-02 Basf Aktiengesellschaft Therapeutic agents
BR0212661A (pt) * 2001-09-19 2004-08-24 Pharmacia Corp Compostos de pirazolil benzenossulfamida substituìdos para o tratamento de inflamação
JP2005506983A (ja) 2001-09-19 2005-03-10 ファルマシア・コーポレーション 炎症の治療のための置換ピラゾリル化合物
US20040127492A1 (en) * 2002-02-19 2004-07-01 Pharmacia Corporation Cyclic pyrazoles for the inhibition of mitogen activated protein kinase-activated protein kinase-2
JP2006502097A (ja) * 2002-05-15 2006-01-19 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ Ｐｄｇｆ受容体阻害剤としてのｎ−置換三環状３−アミノピラゾール
WO2004071507A1 (en) * 2003-02-17 2004-08-26 Pharmacia Italia S.P.A. Tetracyclic pyrazole derivatives as kinase inhibitors, process for their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
MXPA05009151A (es) * 2003-02-27 2005-10-20 Abbott Lab Inhibidores de cinasa heterociclica.
MXPA05009576A (es) * 2003-03-07 2005-12-12 Abbott Lab Inhibidores de pirazol-quinasa triciclicos y tetraciclicos, fundidos.
US7320986B2 (en) 2003-03-07 2008-01-22 Abbott Labortories Fused tri and tetra-cyclic pyrazole kinase inhibitors
ES2551293T3 (es) 2004-03-24 2015-11-17 Abbvie Inc. Inhibidores de quinasas de pirazol tricíclicos
ES2554513T3 (es) * 2008-05-23 2015-12-21 Novartis Ag Derivados de quinolinas y quinoxalinas como inhibidores de la proteína tirosina quinasa
AT507953B1 (de) 2009-03-05 2011-02-15 Apeptico Forschung & Entwicklung Gmbh Verfahren zur vermeidung und zur behandlung einer hyperpermeabilität
US8853207B2 (en) 2012-04-12 2014-10-07 Development Center For Biotechnology Heterocyclic pyrazole compounds, method for preparing the same and use thereof
CN104610149B (zh) * 2015-02-10 2017-04-05 山东大学 一种茚并吡唑类小分子微管蛋白抑制剂及其制备方法与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9226855D0 (en) * 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
WO1999017770A1 (en) * 1997-10-06 1999-04-15 Basf Aktiengesellschaft Indeno[1,2-c]pyrazole derivatives for inhibiting tyrosine kinase activity
KR20010086005A (ko) * 1998-11-06 2001-09-07 스타르크, 카르크 트리사이클릭 피라졸 유도체

Also Published As

Publication number Publication date
EP1165544A1 (en) 2002-01-02
PT1165544E (pt) 2003-12-31
HUP0201514A2 (en) 2002-08-28
MXPA01010072A (es) 2004-03-26
ATE246684T1 (de) 2003-08-15
KR20020015034A (ko) 2002-02-27
NO20014864L (no) 2001-12-05
AU4037800A (en) 2000-10-23
WO2000059901A1 (en) 2000-10-12
CN1368970A (zh) 2002-09-11
ZA200107838B (en) 2003-03-24
DE60004340T2 (de) 2004-06-09
SK14112001A3 (sk) 2002-04-04
JP2002541150A (ja) 2002-12-03
TR200103789T2 (tr) 2002-04-22
HK1045500A1 (zh) 2002-11-29
IL145564A0 (en) 2002-06-30
CA2368686A1 (en) 2000-10-12
NZ514269A (en) 2003-10-31
PL350891A1 (en) 2003-02-10
BR0009561A (pt) 2002-04-16
ES2207497T3 (es) 2004-06-01
NO20014864D0 (no) 2001-10-05
DE60004340D1 (de) 2003-09-11
BG106044A (en) 2002-05-31
HUP0201514A3 (en) 2003-11-28
DK1165544T3 (da) 2003-12-01
EP1165544B1 (en) 2003-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6297238B1 (en) Therapeutic agents
ES2299434T3 (es) Inhibidores de kinasa utilizados como agentes terapeuticos.
JP4707167B2 (ja) キナーゼ阻害剤
US7829570B2 (en) Substituted 4-amino isoxazolo[5,4-d]pyrimidines as kinase inhibitors
US20030153568A1 (en) Benzothiazole derivatives
JP2003517447A (ja) 三環式ピラゾール誘導体
JP2003533514A (ja) プロテインキナーゼ阻害剤としての三環式ピラゾール誘導体
EP1218373A2 (en) 2-pyrazolin-5-ones as tyrosine kinase inhibitors
EP1073435B1 (en) Substituted tricyclic pyrazole derivatives with protein kinase activity
CZ20013580A3 (cs) Substituované 1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazoly jako inhibitory tyrosin kinázy