CZ182498A3

CZ182498A3 - Způsob výroby kyseliny[S-(R,R)]- 3methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové a kyseliny [S-(R,R)], L-2-{2-[2-(1-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]-benzoylamino}-3-methylpentanové

Info

Publication number: CZ182498A3
Application number: CZ981824A
Authority: CZ
Inventors: Phillip Fiore; Timothy P. Puls; Jonathan Walker
Original assignee: Warner-Lambert Company
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 1998-09-16
Also published as: NZ323803A; HUP9902043A3; HUP9902043A2; WO1997022598A1; SK81798A3; EP0874835A1; AU1083597A; NO982709L; KR20000064403A; NO982709D0; CN1208407A; BG102470A; BR9612020A; IL123903A0; JP2000505067A; ZA9610479B; CA2233553A1; PL327135A1

Description

Způsob, výroby kyseliny [S-(R*,R*) ]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-’ benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové a kyseliny [S-(R*,R*)],L2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]benzoylamino}-3-methylpentanové

Oblast techniky

Vynález se týká syntézy kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl2-(3-oxo-3H-benzo[djisothiazol-2-yl)pentanové a kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]benzoylamino}-3-methylpentanové .

Dosavadní stav techniky

Kyselina [S- (R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové je použitelná jako protivirové činidlo a lze ji použít k léčení pacientů, infikovaných virem HIV. Kyselina [S- (R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl)benzoylamino)-3methylpentanová je meziproduktem při syntéze kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]iso-thiazol-2-yl) pentanové a může být rovněž použita při ošetření bakteriálních a virových infekcí včetně ošetření pacientů infikovaných virem’HIV. - Viz například patent US 5, 4 63,122. Bylo by tedy užitečné mít jednoduchý, vysoce výtěžkový způsob syntézy kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3Hbenzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové a kyseliny [S-(R*,R*)],L2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)-fenyldisulfonyl )benzoylamino)-3-methylpentanové.

• · • ·

Podstata vynálezu . . ......

Vynález poskytuje způsob přípravy kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl) pentanové, který zahrnuje uvedení kyseliny

2,2' -dithiosalicylové do reakce s halogenačním činidlem za vzniku 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidu; uvedení

2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidu do reakce s L-isoleucinem v tetrahydrofuranu nebo tetrahydrofuranu a báze za vzniku kyseliny [S- (R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfo-nyl)benzoylamino)-3-methylpentanové; a uvedení kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2methylbutylkarbamoyl)fenyl-disulfonyl)benzoylamino)-3methylpentanové do reakce s halogenovým oxidačním činidlem za vzniku kyseliny [S-(R*, R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3Hbenzo[d]isothiazol-2-yl)-pentanové.

U výhodného provedení je halogenačním činidlem thionylchlorid.

U dalšího výhodného provedení je 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidem 2,2'-dithiobisbenzoylchlorid.

U dalšího výhodného provedení je bází hydrogenuhličitan sodný.

U dalšího výhodného provedení je halogenovým oxidačním činidlem chlor, brom nebo jod.

U výhodnějšího provedení je halogenovým oxidačním činidlem brom.

1‘ • ·

Vynález rovněž poskytuje způsob- přípravy kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové, který zahrnuje uvedení kyseliny

2,2'-dithiosalicylové do reakce s thionylchloridem za vzniku 2,2'-dithiobisbenzoylchloridu; uvedení

2,2'-dithiobisbenzoylchloridu do reakce s alespoň dvěma ekvivalenty L-isoleucinu v tetrahydrofuranu nebo tetrahydrofuranu a hydrogenuhličitanu sodném za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]-benzoylamino}-3-methylpentanové; a uvedení kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2methylbutylkarbamoyl)fenyl-disulfonyl)-benzoylamino)-3methylpentanové do reakce s bromem a kyselinou octovou za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové.

Vynález rovněž poskytuje způsob přípravy kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutyl-karbamoyl)fenyldisulfonyl)benzoylamino)-3-methylpentanové, který zahrnuje uvedení kyseliny 2,2'-dithiosalicylové do reakce s halogenačním činidlem benzoylhalogenidu; a halogenidu do reakce s nebo tetrahydrofuranu za vzniku 2,2'-dithiobisuvedení 2,2'-dithiobisbenzoylL-isoleucinem v tetrahydrofuranu a bázi za vzniku kyseliny [S-(R*, R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutyl-karbamoyl)fenyldisulfonyl)benzoylamino)-3-methylpentanové .

U dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu je halogenačním činidlem thionylchlorid.

U dalšího výhodného provedení způsobu podle Vynálezu je 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidem 2,2'-dithiobisbenzoylchlorid.

, U dalšího výhodného, provedení způsobu podle vynálezu je bází hydrogenuhličitan sodný.

Vynález rovněž poskytuje způsob přípravy kyseliny [S-(R*, R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyl-disulfonyl)benzoylamino)-3-methylpentanové, který zahrnuje uvedení kyseliny 2,2'-dithiosalicylové do reakce s thionylchloridem za vzniku 2,2'-dithiobisbenzoylchloridu; a uvedení 2,2'-dithiobisbenzoylchloridu do reakce s L-isoleucinem v tetrahydrofuranu nebo tetrahydrofuranu a bází za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]-benzoylamino]-3methylpentanové.

Vynález poskytuje způsob přípravy kyseliny [S—(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2yl)pentanové a kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2methylbutyl-karbamoyl)fenyldisulfonyl]-benzoylamino}-3methylpentanové, který se provádí podle následujícího reakčního schéma I.

• ·

Reakční schéma I

co₂h co₂h so₂ci

V

THF nebo THF/NaHCO₃ *

kyselina octová ,_r co₂h

V prvním kroku syntézy se kyselina 2,2'dithiosalicilová od společnosti Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, převedla na odpovídající halogenid, 2,2'dithiobisbenzoylhalogenid uvedením kyseliny 2,2'dithiosalicilové do reakce s halogenačním činidlem. Odborníkům v daném oboru je způsob převádění kyseliny na halogenid dobře znám. Příkladem vhodných halogenačních činidel jsou například thionylchlorid,. fosgen, chlorid fosforitý, chlorid fosforečný a bromid fosforitý.

U výhodného provedení je halogenačním činidlem thionylchlorid a halogenidem kyseliny je chlorid kyseliny. Výraz „halogen, jak je zde použit, zahrnuje chlor, brom, fluor a jod.

Reakce se zpravidla provádí v inertní atmosféře a aprotickém rozpouštědle. Příklady vhodných aprotických rozpouštědel zahrnují neomezujícím způsobem toluen, heptan, hexan a acetonitril. U výhodného provedení je rozpouštědlem toluen. 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenid může být použit v následujícím kroku bez předcházejícího čištění, tj. v surové formě nebo může být čištěn způsoby, které jsou odborníkům v daném oboru dobře známy.

V druhém kroku syntézy se 2,2'-dithiobisbenzoylhalogeni-d— uvede do reakce s L-iso.l eucinem v tetrahydrofuranu nebo směsi tetrahydrofuranu a báze za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]-benzoylamino}-3-methylpentanové. Použitím tetrahydrofuranu (THF) nebo roztoku THF a báze se získají vyšší výtěžky a dosáhne se vyšší čistoty produktu. Další výhodou tetrahydrofuranu je jeho to, že je méně toxický a karcinogenní než další rozpouštědla, používaná při přípravě amidů zchloridů a-a-aminokyselin. Použití tetrahydrofuranu jako rozpouštědla přesto není zřejmé, protože L-isoleucin má v THF pouze omezenou rozpustnost a THF se zpravidla rozkládá pomocí chlorovodíku, který vzniká v průběhu reakce. Syntéza podle vynálezu navíc nevyžaduje žádné kroky poskytující ochranu a zbavující ochrany α-aminokyselinu, a je méně příznivá pro racemizaci, takže poskytuje produkty, mající vynikající optickou aktivitu. Kyselinu [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(1karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]-benzoylamino}-3-methylpentanovou lze použít v následujícím kroku jako takovou nebo vyčištěnou pomocí způsobů, které jsou odborníkům v daném oboru dobře známy. Příklady vhodných bází zahrnují neomezujícím způsobem hydrogenuhličitan sodný, uhličitan sodný, uhličitan draselný a hydrogenuhličitan draselný. Výhodně je bází hydrogenuhličitan sodný.

Ve třetím kroku syntézy se kyselina [S-(R*,R*)],L-2{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]benzoylamino}-3-methylpentanová uvede do reakce s halogenovým oxidačním činidlem za vzniku kyseliny [S—(R*, R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové. V tomto kroku se disulfidová vazba kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]benzoylamino}-3-methylpenťanové zoxidovala a sulfenylbromid, vznikající jako meziprodukt, se cyklizoval za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové. Vhodná halogenová oxidační činidla zahrnují neomezujícím způsobem brom, chlor a jod. U výhodného provedení je halogenovým oxidačním činidlem brom.

V tomto kroku syntézy se zpravidla do suspenze kyseliny [S-(R*,R*)],L—2—{2—[2—(l-karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl]-benzoylamino}-3-methylpentanové a kyseliny octové přidává za stálého míchání halogenové oxidační činidlo. Po ukončení míchání se vytvořená sraženina odfiltruje. Produkt se sráží přímo z reakční směsi ve vysokém stupni čistoty.

Potom se sraženina, kterou je surová kyselina [S-(R*, R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl) pentanová čistí extrakcí etherem, výhodně methyl-tbutyletherem a vodou. Etherové extrakty se sloučí a zahustí za vzniku oleje. Olej se rozpustí v etheru a do vzniklého roztoku se přidá heptan. Výsledná sraženina se přefiltruje a po promytí a vysušení ' poskytne kyselinu [S- (R*,R*) ] -3methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanovou.

Následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

2,2'-dithiobisbenzolylchlorid

Dvoulitrová tříhrdlá baňka s kulatým dnem opatřená mechanickým míchadlem, teploměrem a zpětným chladičem s přívodem dusíku se naplnila kyselinou 2,2'-dithio-

salycilovou (120 g) , toluenem (600 ml), dimethylformamidem (1 ml) a thionylchloridem (128 g). Směs se za stálého míchání ohřála na 75°C a při této teplotě se udržovala 21 hodin pod dusíkem, čímž se získal čirý, žlutý roztok. Získaný roztok se ohřál na 80°C a přefiltroval přes diatomitovou zeminu na Buchnerově nálevce. Filtrační koláč se promyl toluenem (100 ml) a sloučené filtráty se přemístily do dvoulitrové tříhrdlé baňky s kulatým dnem opatřené mechanickým míchadlem, teploměrem a destilační hlavou. Horký roztok se ve vakuu (666,6 Pa) zahustil na celkový objem 300 ml, přičemž konečná teplota vsádky byla 65°C. Do směsi, která se opět ohřála na 80°C, se přidal čerstvý toluen (500 mlj. Horký roztok se zahustil za vakua (666,6 Pa) na konečný objem 300 ml a do takto zahuštěného roztoku se přidala čerstvá dávka toluenu (500 ml). Směs se opět ohřála na 80°C a roztok se za vakua (666,6 Pa) zahustil na konečný objem 400 ml, přičemž teplota konečné vsádky byla 65°C. Tímto způsobem se získala hustá, žlutá suspenze, která se ochladila na 10°C, míchala 2 hodiny a přefiltrovala přes Buchnerovu nálevku. Filtrační koláč se promyl studeným toluenem (100 ml) a vysušil ve vakuové peci při 40°C až 45°C, čímž poskytl 120 g (89,3%) titulní sloučeniny ve formě bledě žlutých krystalů;

teplota tání 156,2 až 157,9°C;

^XH NMR (δ, CDC1₃, 200 MHz): 4,81 až 8,37 (m, 2H, aromatický vodík), 7,78 až 7,74 (m, 2H, aromatický vodík), 7,60 až

7,51 (m, 2H, aromatický vodík), 7,43 až 7,34 (m, 2H, aromatický vodík).

• 9

• 9 99

9 9 999

Příklad 2

Kyselina [S- (R*,R*)3,L-2-{2-[2-(l-karboxy-2-methylbutylkarbamo.yl) fenyldisulfonyl]benzoylamino}-3-methylpentanová

Jednolitrová tříhrdlá baňka s kulatým dnem opatřená mechanickým míchadlem, teploměrem a zpětným chladičem s přívodem dusíku se naplnila 2,2'-dithiobisbenzoylchloridem (75,0 g) , L-isoleucinem (62,8 g), bikarbonátem sodným (55,3 g) a THF (750 ml) . Suspenze se za stálého míchání ohřála v průběhu dvaceti minut pod dusíkem na 54 °C až 58°C a posléze se ohřála na 60°C až 65°C a při této teplotě se udržovala 8 hodin. Reakční směs se ochladila na pokojovou teplotu a pozvolna nalila do třílitrové baňky s kulatým dnem opatřené mechanickým míchadlem, obsahujícím rychle míchanou směs koncentrované kyseliny chlorovodíkové (60 g) , vody (550 ml) a methyl-t-butyletheru (800 ml). Jednolitrová baňka se postupně propláchla THF (150 ml), methylt-butyletherem (150 ml) a vodou (150 ml) a průplachy se přidaly do třílitrové baňky. Dvoufázová směs se míchala 30 minut při pokojové teplotě a posléze se nechala usadit. Spodní vodná fáze se separovala a horní organická vrstva se promyla třemi díly vody (2 x 375 ml, 180 ml) . Do rychle míchané organické vrstvy se přidal hexan (1 060 ml), čímž se získala hustá, bílá suspenze, která se míchala při pokojové teplotě další 2 hodiny. Pevné látky' se přefiltrovaly na Buchnerově nálevce, promyly hexanem (150 ml) a po vysušení ve vakuové peci při 65°C poskytly 105,9 g (91,0%) surové titulní sloučeniny.

Dvoulitrová baňka s kulatým dnem opatřená mechanickým míchadlem, teploměrem a destilační hlavou se naplnila surovou titulní sloučeninou (95,2 g) a THF (1 620 ml).

•· ·· ·· ·· ► · 4 4 4 4 4 » 4 4 · 4 · 4 · 4

Bledě žlutý, roztok se ohříval pod zpětným chladičem a THF (1 140 ml) se oddestiloval z.baňky. THF roztok v baňce se ochladil na pokojovou teplotu a do takto ochlazeného roztoku se za intenzivního míchaní přidal hexan (760 ml), čímž se získala hustá bílá suspenze, která se míchala při pokojové teplotě další 2 hodiny. Pevné látky se přefiltrovaly na Buchnerově nálevce, promyly hexanem (375 ml) a po vysušení ve vakuové peci při 67°C poskytly 93,8 g (98,5%) titulní sloučeniny ve formě bílé pevné látky;

HPLC 99,1% (z plochy);

teplota tání 207 až 210°C;

^ΧΗ NMR (δ, DMSO, 200 MHz): 12,8 až 12,4 (široké s, 2H, CO₂H) , 8,72 (d, J = 8,3 Hz, 2H, NH) , 7,68 až 7,64 (m, 4H, aromatický vodík), 7,50 až 7,41 (m, 2H, aromatický vodík),

7,35 až 7,27 (m, 2H, aromatický vodík), 4,39 až 4,32 (m,

2H, NCH), 1,95 (m, 2H, CH₃CH), 1,53 (m, 2H, CH₂) , 1,31 (m, 2H, CH₂), 0,97 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH₃CH) , 0,89 (m, 6H, CH₃CH₂) .

Příklad 3

Kyselina [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3Hbenzo[d]isothiazol-2-yl)pentanová

Do pětisetmilitrové tříhrdlé .baňky s kulatým dnem opatřené mechanickým míchadlem, teploměrem a nálevkou s dusíkovým vstupem se zavedla kyselina [S-(R*,R*)],L-2-{2[2-(l-karboxy-2-methylbutyl-karbamoyl)-fenyldisulfonyl] benzoylamino}-3-methylpentanová (25 g) a kyselina octová (163 ml) . Do míchané suspenze se pod dusíkem přidal po kapkách v průběhu 15 minut roztok bromu (7,9 g) v kyselině • · « <·· ···

octové. (12 ml). Oranžová- suspenze se pod dusíkem- a -při pokojové teplotě míchala další 4 hodiny, přefiltrovala na Buchnerově nálevce a promyla heptanem (2 x 50 ml) , čímž se získalo 31,7 g surové, rozpouštědlem zvlhčené titulní sloučeniny.

Pětisetmililitrová separační nálevka se naplnila surovou titulní sloučeninou (31,7 g), methyl-t-butyletherem (69 ml) a vodou (66 ml). Po extrakci se spodní vodná vrstva separovala a extrahovala methyl-t-butyletherem (1 ml) . Methyl-t-butyletherové vrstvy se sloučily, promyly vodou (50 ml) a zahustily pomocí rotační odparky za vakua (666,6 Pa) na olej, přičemž teplota konečné vsádky byla 50°C. Olej se udržoval pod vakuem a při 50°C další 1 hodinu, rozpustil se v methyl-t-butyletheru (80 ml) a přefiltroval přes Buchnerovu nálevku. Filtráty se přemístily do dvěstěpadesátimililitrové baňky s kulatým dnem opatřené mechanickým míchadlem, teploměrem a nálevkou s dusíkovým vstupem. Do teplého (45°C) míchaného methyl-tbutyletherového roztoku se přidal heptan (40 ml) . Kalný roztok se udržoval při teplotě 45°C 1 hodinu a po uplynutí této doby se přidala další dávka heptanu (19 ml) . Suspenze se ochladila, na pokojovou teplotu, následně na 10°C a míchala se 1 hodinu. Pevné látky se přefiltrovaly na Buchnerově nálevce, promyly heptanem (40 ml) a po šestnáct.ihodinovém vysoušení ve vakuové peci při 45°C poskytly 19,3 g (77,5%) titulní sloučeniny ve formě bílých krystalů;

teplota tání 122 až 1 230°C;

^ΧΗ NMR (δ, CDC1₃, 200 MHz): 8,81 (široké s, 1H, CO₂H) , 8,07 (d, J = 7,8 Hz, 1H, aromatický vodík), 7,67 až 7,54 (m, 2H, aromatický vodík), 7,44 až 7,36 (m, 1H, aromatický vodík), 5,28 (d, J = 9,4 Hz, 1H, CHN), 2,28 až 2,23 (m, 1H, CHCH₃) , ·· ·

4·· 4 •4 44 ·4 · 4 4 4 4 4

4 444 4 4 44

44 .4 4 4444 «

4 4 4 4 4 4

44 44 44

1,42, až 1,38 (m, 1H, CH₂) , 1,29 až 1,20 (m, 1H, CH₂) , 1,11 (d, J = 6,8 Hz, 3H, CHCH₃), 0,91 (t, J = 7,3 Hz, 3H, CH₂CH₃) .

Přiklad 4

Antivirová aktivita kyseliny [S-(R*, R*)]-3-methyl-2-(3-oxo3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové

Kyselina [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanová (přiklad 3) způsobuje extruzi zinku z nukleokapsidového proteinu (NCp7) HIV-1. NC protein je vysoce konzervovaný mezi všemi retroviry (South T., Blake P. a kol., Biochemistry, 1990;29:7786) a je podstatný pro virovou infekci (Aldovini A. a Young R., J. Virology, 1990; 64:1920 a Gorelick R., Nigida S. a kol., J. Virology, 1990; 64:3207) . Zinek se zpravidla drži v NC proteinech pomoci jednoho nebo dvou zinkových prstů. V případě HIV-1 jsou přítomny dva zinkové prsty (Summers M., South T. a kol., Biochemistry, 1990;29:329) , které se specificky váží na PSI místo na virové RNA, které kontroluje sbalení virové RNA. Interference tohoto sbalení způsobí vznik neinfekčních virionů (Dannull J., Surovoy A. a kol., EMBO, 1994; 13:1525) . Jak se v minulosti ukázalo, sloučeniny, „které .způsobují extruzi. zinku, mají ...potenciální. anti-HIV aktivitu v množině buněčných linií proti všem retrovirům (Rice W., Schaeffer C. a kol., Nátuře, 1993;361:473).

Pro monitorování ejekce zinku z vyčištěného HIV-1 NCp7 byl vyvinut fluorescenční test. Fluorofor, N-(6-methoxy-8chinolyl)-p-toluensulfonamid (TSQ), má po navázání zinkového iontu v roztoku zvýšený fluorescenční signál.

• ·

NCp7 protein, obsahující dva zinkové prsty a dva zinkové ionty se inkuboval účinnou látkou, způsobující extruzi zinkových iontů. Uvolnění zinku se následně sekvesterovalo pomocí TSQ a zvýšená fluorescence se monitorovala a porovnala s kontrolním fluorescenčním signálem. Popsaný test se prováděl následujícím způsobem 10 μΜ sloučenina se přidala do 2,8 μΜ NCp7 a 47 μΜ TSQ ve 20 μΐ pufru (pH 7,4) při 26°C v průběhu devadesáti minut. Fluorescence (excitace 355 nm emise 400 nm) se monitorovala v závislosti na čase. Kontrolní měření se provádělo za použití NCp7, za testovacích podmínek bez účinné látky a za použití apo NCp7 (bez Zn) s účinnou látkou. Procentická Zn extruze se vypočetla vydělením aktuálně naměřené fluorescence fluorescencí veškerého teoreticky extrudovaného zinku (5,6 μΜ) x 100.

Testovací systémy, které se použily ke .stanovení buněčné antivirové aktivity kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl2-(3-oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové jsou v oboru dobře známy a pro tyto účely běžně používány. Pro stanovení aktivity sloučeniny viru HIV se například použil systém, využívaný U.S. National Cancer Institute a popsaný Weislowem O.S. a kol., J. Nati. Cancer Inst., 1989;81:577 až 586.

·“ ’ Tento postup je navržen pro detekcičinidel, působících v kterémkoliv stádiu virového reprodukčního cyklu. Test zahrnuje v podstatě zahubení T4 lymfocytů virem HIV. Malá množství viru HIV se přidají do buněk, přičemž pro dosažení požadovaného zahubení buněk jsou nezbytné alespoň dva úplné virové reprodukční cykly. Činidla, která vzájemně reagují s viriony, buňkami nebo virovými genovými produkty s cílem narušit aktivitu virů, budou chránit buňky před cytolýzou. Systém je automatizován tak, aby mohl vyhovovat většímu počtu kandidátových činidel a zpravidla je navržen pro detekci anti-HIV aktivity. Avšak sloučeniny, které za použitých kultivačních podmínek degenerují nebo jsou rychle metabolizovány nebudou v tomto testu vykazovat aktivitu.

Další testovací systém, použitý pro testování sloučenin podle vynálezu je označen jako HIV H9 test. HIV H9 buněčný test měří inhibiční koncentraci, potřebnou pro potlačení HIV-1 virové replikace. U tohoto systému virový růst probíhá v průběhu několikrát se opakujícího životního cyklu. Jakékoliv potlačení replikační kinetiky vede ke geometrickému snížení produkce virů. Tento test je citlivým prostředkem pro měření schopnosti sloučeniny inhibovat HIV-1 virovou replikaci.

H9 T-buněčná linie představuje vsádku, infikovanou virem HIV při vícečetné infekci (MOI) 0,01. Po dvouhodinové absorpci se buňky promyly, resuspendovaly v RPMI-1640 (dobře dostupném médiu, které je odborníkům v daném obořu dobře známo)/10% sérem z embrya telete a naočkovaly se (5 x 10~³ buněk/jamka na devadesátišestijamkové plotně).

Pro test cytotoxicity se neinfikovanými H9 buňkami, naředily v poměru 1:3,16 připravila další plotna s Účinné látky se postupně v dimethylsulfoxidu (DMSO) , přemístily do média v 8x koncentraci do tří vzorků kultur. Konečná koncentrace DMSO byla 0,002 (0,2%).

Virová produkce se měřila pomocí testu pokojové teploty a cytotoxicita se měřila pomocí XTT testu 7 dnů po infikaci. XTT test je odborníkům v daném oboru znám. Viz • · ¹⁶ například J. Nati. iCancer Inst., 1989;81:577 až 586. Test pokojové teploty se prováděl jako modifikace metody Borroto-Esody a Boona, J. Virol., 1991;65:1952 až 1959 a kvalifikoval pomocí Molecular Dynamics Phosphoimager se software Imagequant. XTT test se prováděl jako modifikace metody Roehm a kol., J. Immuno. Methods., 1991;142:257 až 265 a kvantifikoval se · pomocí molekulárního plotnového čítače Devices Thermomax se software Softmax.

Data byla elektronicky přenášena do tabulkového procesoru Microsoft Excel, kde se analyzovala. Hodnoty testu pokojové teploty, odpovídající 50% a 90% inhibici virové produkce, se vypočetly z neošetřených kontrolních vzorků. Koncentrace inhibitoru, potřebné pro získání těchto hodnot (IC₅₀ a IC90) , se interpolovaly z dat, sousedících s těmito aktivitami při pokojové teplotě. Hodnoty XTT testu odpovídající 50% cytotoxicitě se vypočetly z neošetřených kontrolních vzorků. Koncentrace inhibitoru, potřebné pro získání této hodnoty, se interpolovaly z dat sousedících s těmito XTT hodnotami.

Dalším testovacím systémem, používaným pro určování protivirové aktivity, je systém označovaný jako CEM buněčný test.

T4 lymfocyty (CEM buněčná linie) se vystavily HIV viru, přibližně v poměru 0,05 viru na buňku, a umístily spolu s neinfikovanými kontrolními buňkami do devadesátišestijamkových mikrolitrových ploten.

Kandidátové činidlo se rozpustilo v dimethylsulfoxidu (není-li stanoveno jinak) a následně naředilo v poměru 1:200 v buněčném kultivačním médiu. Další naředění se • ·

provedla (polovina -logio) před přidáním stejného* objemu média, obsahujícího infikované nebo neinfikované buňky.

Kultury se inkubovaly při 37 °C v atmosféře 5% oxidu uhličitého 6 nebo 7 dnů. Potom se do všech jamek přidala tetrazoliová sůl XTT a kultury se inkubovaly, čímž se umožnilo přežívajícím buňkám vyvinout formazanovou barvu, J. National Cancer Institute, 1989;81:577 až 586. Jednotlivé jamky se analyzovaly spektrofotometricky, čímž se určilo množství produkce formazanu a prohlížely se mikroskopicky, čímž byly detekovány přežívající buňky. Tato detekce byla potvrzením ochranné aktivity.

Virem infikované buňky ošetřené účinnou látkou se porovnaly s neinfikovanými buňkami ošetřenými účinnou látkou a dalšími vhodnými kontrolními buňkami (neošetřenými infikovanými a neošetřenými neinfikovanými buňkami, jamkami obsahujícími účinnou látku bez buněk atd.) na stejné plotně. Získaná data se porovnala s daty získanými dalšími testy prováděnými současně a na základě těchto dat se určila přibližná aktivita.

Tabulka 1 uvádí výsledky testu zinkové extruze sloučeniny podle vynálezu. U této sloučeniny se hodnotila její schopnost způsobit extruzi zinku z nukleokapsidového proteinu NCp7 (tato schopnost je vyjádřena jako procentická a je vztažena ke kontrolnímu vzorku).

• ·

TABULKA 1

Extruze zinku ze zinkových prstů HIV-1 nukleokapsidového proteinu (NCp7)

Sloučenina z příkladu	% Zn extruze vzhledem ke kontrolnímu vzorku
3	30

Níže uvedená tabulka 2 obsahuje data pro sloučeninu z příkladu 3, získaná při provádění H9 a CEM buněčného testu.

TABULKA 2

CEM buněčný test anti-HIV aktivity

Sloučenina z příkladu	EC₅₀ (μΜ)³	TC₅₀ (pM)^b
3	14	>100
^a účinná koncentrace,	která chrání	buňky před

cytopatologickými účinky viru ^b toxická koncentrace, .která inhibuje růst buněk 50% vzhledem ke kontrolnímu vzorku

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)pentanové, vyznačený tím, že zahrnuje:

a. uvedení kyseliny 2,2'-dithiosalicylové do reakce s halogenačním činidlem za vzniku 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidu;

b. uvedení 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidu do reakce s L-isoleucinem v tetrahydrofuranu nebo tetrahydrofuranu a báze za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(1karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl)benzoylamino) -3-methylpentanové; a

c. uvedení kyseliny [S- (R*,R*)],L-2-{2-[2-(l-karboxy-2methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl)benzoylamino)-3methylpentanové do reakce s halogenovým oxidačním činidlem za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)-pentanové.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím,

- že halogenačním činidlem je thionylchlorid. , .....
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidem je 2,2'-dithiobisbenzoylchlorid.¹
4. Způsob podle, nároku 1, vyznačený tím, že bází je hydrogenuhličitan sodný.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že halogenovým oxidačním činidlem je chlor, brom nebo jod.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že halogenovým oxidačním činidlem je brom.
7. Způsob přípravy kyseliny [S-(R*,R*)]-3-methyl-2-(3oxo-3H-benzo[d]isothiazol-2-yl)-pentanové, vyznačený tím, že zahrnuje:

a. uvedení kyseliny 2,2'-dithiosalicylové do reakce s thionylchloridem za vzniku 2,2'-dithiobisbenzoylchloridu;

b. uvedení 2,2'-dithiobisbenzoylchloridu do reakce s alespoň dvěma ekvivalenty L-isoleucinu v tetrahydrofuranu nebo tetrahydrofuranu a hydrogenuhličitanu sodném za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(lkarboxy-2-methylbutyl-karbamoyl)fenyldisulfonyl] benzoylamino}-3-methylpentanové; a c . - uvedení =- kyseliny , [S- (Rí, R*)] L-2- {2- [,2-,( 1-karboxy-2methylbutylkarbamoyl)fenyldisulfonyl)benzoylamino)-3methylpentanové do reakce s bromem a kyselinou octovou za vzniku kyseliny [S-(R*’, R*) ]-3-methyl-2-(3-oxo-3Hbenzo-[d]isothiazol-2-yl)pentanové.
8. Způsob přípravy kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(1karboxy-2-methylbutyl-karbamoyl)-fenyldisulfonyl)benzoylamino) -3-methylpentanové, vyznačený tím, že zahrnuje:

a. uvedení kyseliny 2,2'-dithiosalicylové do reakce s halogenačním činidlem za vzniku 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidu; a

b. uvedení 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidu do reakce s

L-isoleucinem v tetrahydrofuranu nebo tetrahydrofuranu a bázi za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(1karboxy-2-methylbutyl-karbamoyl)-fenyldisulfonyl)benzoylamino)-3-methylpentanové.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že halogenačním činidlem je thionylchlorid.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že 2,2'-dithiobisbenzoylhalogenidem je 2,2'dithiobisbenzoylchlorid.
11. Způsob podle nároku 8, vyznače ný t i m , že bází je hydrogenuhličitan sodný..
12. Způsob přípravy kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(1karboxy-2-methylbutylkarbamoyl)-fenyl-disulfonyl)benzoylamino) -3-methylpentanové, vyznačený tím, že zahrnuje:

a. uvedení kyseliny 2,2'-dithiosalicylové do reakce s thionylchloridem za vzniku 2,2'-dithiobisbenzoylchloridu; a

b. uvedení 2, 2'-dithiobisbenzoylchloridu do reakce s

L-isoleucinem v tetrahydrofuranu nebo tetrahydrofuranu a bází za vzniku kyseliny [S-(R*,R*)],L-2-{2-[2-(1karboxy-2-methylbutylkarbamoyl) fenyldisulfonyl] ⁴ benzoylamino}-3-methylpentanové.