KR100686917B1 - 새로운 티올에스테르 및 그것의 이용 - Google Patents

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짐 에이. 터핀
용성 송
존 케이. 인만
밍준 후앙
안데르스 왈크비스트
앤드류 메이나드
데이비드 지. 코벨
월리암 지. 라이스
에토르 아펠라
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더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 레프리젠티드 바이 더 세크러터리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈
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Abstract

본 발명은 티올에스테르의 새로운 과의 발견 및 그것의 이용에 속한다. 또한, 이 새로운 티올에스테르를 함유하는 바이러스 사멸 화합물 및 약제학적 제형을 제공한다. 본 발명은 또한, 티올에스테르-불활성화 바이러스 및 티올에스테르-복합 바이러스 단백질을 제공한다.

Description

새로운 티올에스테르 및 그것의 이용{NOVEL THIOLESTERS AND USES THEREOF}
본 발명은 바이러스학과 항-바이러스 치료학의 분야에 속한다. 특히, 본 발명은 티올에스테르의 새로운 과(family)의 발견 및 그것의 이용에 속한다.
바이러스, 특히 HIV 같은 레트로바이러스(retroviruses)는 감염 치료에 사용된 약제에 급속히 저항성이 될 수 있다. 레트로바이러스의 이러한 극도의 적응성은 그것의 RNA 유전자를 전사하는 역전사 효소(reverse transcriptase enzyme)의 높은 오류 비율 때문이다. HIV는 그러한 과-돌연변이성 바이러스의 예이다. 이는 HIV-1와 HIV-2의 두 개의 주요한 종으로 나뉘고, 각각은 많은 클레이드(clade), 아종(subtype) 및 약물저항성(drug resistant) 변종을 갖는다.
약물저항성 균주의 출현에 대처하기 위한 전략은 조합 약제 치료를 포함한다(Lange(1996) AIDS 10 Suppl 1:S27-S30). 상이한 바이러스 단백질에 대한 약제와 동일한 단백질의 다중 사이트에 대한 약제가 일반적으로 바이러스의 적응성을 극복하기 위한 전략으로 사용된다. 예컨대, AZT, ddI, ddC 및 d4T 같은 프로테아제 억제제 및 뉴클레오시드 유사물을 사용하는 레트로바이러스에 대한 조합 치료는 효과가 없고, 바이러스는 비교적 단기간에 완전한 저항성을 발달시킨다(Birch(1998) AIDS 12:680-681; Roberts(1998) AIDS 12:453-460; Yang(1997) Leukemia 11 Suppl 3:89-92; Demeter(1997) J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 14(2):136-144; Kuritzkes(1996) AIDS 10 Suppl 5:S27-S31). 게다가, 항-레트로바이러스 백신도 현재 효과가 없다(Bolognesi(1998) Nature 391:638-639; Bangham(1997) Lancet 350:1617-1612).
HIV-1으로 야기된 AIDS 전염병은 약 18년 전 발생하였다. 그 이후로, 그 수가 계속 증가하고 있다. 1993년, 12월 이후로 20%씩 증가하여 1994년 말까지, 1,025,073 AIDS가 WHO에 보고되었다(Galli(1995) Q. J. Nucl. Med. 39:147-155). WHO는 2000년까지 세계적으로 3 내지 4천만의 누적 HIV-1 감염이 될 것으로 예상한다(Stoneburner(1994) Acta Paediatr. Suppl. 400:1-4). 이렇게 해서, HIV-1 같은 레트로바이러스에 대해 효과적인 화합물의 요구가 있다. 본 발명은 이들 및 다른 요구들을 만족시킨다.
본 발명은 하기 (1) 내지 (5)로 구성된 군으로부터 선택된 화학 구조를 갖는 티올에스테르이다:
(1) 하기 구조를 갖는 주형Ⅰ과 주형 Ⅱ로 구성된 군으로부터 선택된 식을 갖는 티올에스테르,
Figure 112000027203682-pct00001
여기서, X는 알킬기, 치환된 알킬기, 아릴기 및 치환된 아릴기로 구성된 군으로부터 선택되고,
R1은 -Y-Z (여기서, Y는 -(CH2)m- (m은 1 내지 6인 정수이다),
삭제
Figure 112006049146981-pct00043

으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
Z는 디알킬 또는 아릴 또는 알킬아릴술포늄(Z1), 트리알킬 또는 아릴 또는 알킬아릴암모늄(Z2), 트리알킬 또는 아릴 또는 알킬아릴포스포늄(Z3), 또는 하기 일반식을 갖는 피리디니오(Z4)로 구성된 군으로부터 선택된다.
Figure 112000027203682-pct00044
(여기서, R12, R13, R14, R15 및 R16은 H-, -C(=O)NH2와 치환된 카르복스아미도기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.)
R1은 알킬, 치환된 알킬기, 아릴기, 치환된 아릴기, 아릴알킬기, -Ph-CH3, 아릴알콕시기, Ph-OCH3, 니트로아릴기, Ph-NO2 및 -(CH2)n-X기 (여기서, X는 할로겐이고, n은 1 내지 6의 정수이다)로 구성된 군으로부터 선택되고,
삭제
R2는 -H, -CH3, -C(=O)NH2 및 -C(=O)OCH3기로 구성된 군으로부터 선택되고,
R3, R4 및 R5는 H, 할로겐, -NO2, -C(=O)ONH2 및 -C(=O)OCH3기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R6은 H, 알킬기, -CH3기, 치환된 알킬기, 아릴기, 치환된 아릴기 및 아릴알킬기로 구성된 군으로부터 선택되고,
R10 및 R11은 H이고, R7, R8, 및 R9 는 H 또는 (O=S=O)-G' 이다 (여기서, G'는 -NH2기, -NH-알킬기, -NH-아릴기, -NH-아실기, 아릴-NH2기, 니트로아릴기, 아릴-NH-아실기 및 아릴-NH-알킬기로 구성된 군으로부터 선택된다).
(2) 하기 구조를 갖는 주형Ⅲ과 주형Ⅳ로 구성된 군으로부터 선택된 식을 갖는 티올에스테르,
Figure 112000027203682-pct00045
[여기서, G는 알킬기, 치환된 알킬기, 아릴기, 치환된 아릴기 및 알킬아릴기로 구성된 군으로부터 선택되고,
R6은 -H기, 알킬기, -CH3기, 치환된 알킬기, 아릴기, 치환된 아릴기 및 아릴알킬기로 구성된 군으로부터 선택되고,
R7, R8, R9, R10 및 R11은 R7, R8 또는 R9가 (O=S=O)-G'(여기서, G'는 -NH2기, -NH-알킬기, -NH-아릴기, -NH-아실기, 아릴-NH2기, 니트로아릴기, 아릴-NH-아실기 및 아릴-NH-알킬기로 구성된 군으로부터 선택된다.)인 것을 제외하고, H이다.]
(3) 하기 구조를 갖는 주형Ⅴ과 주형Ⅵ로 구성된 군으로부터 선택된 식을 갖는 티올에스테르,
Figure 112000027203682-pct00046
[여기서, n은 정수, R2 내지 R5, R6 및 R12 내지 R16 은 상기와 동일하고,
Y는 상술한 바와 같고,
R17은 -H 또는 -CH3이고,
R18은 -H, -CH3, 알킬기, 아릴기, 아릴알킬기 또는 아미노산 측쇄(여기서, R18이 부착된 탄소 원자에 대한 입체화학 배열은 R 또는 S이다.)이고,
R19는 -OH, -NH2, N-치환형 아미드니트로젠 또는 에스테르기(-OR)이다.]
(4) 하기 구조의 주형Ⅶ의 식을 갖는 티올에스테르, 및
Figure 112000027203682-pct00047
(여기서, R0는 치환된 또는 비치환형 아릴 또는 황 원자에 직접 부착된 헤테로아릴환계이고,
Y 및 R12 내지 R16은 상술한 바와 같다.)
(5) 하기 식을 갖는 피리디니오알카노일티올에스테르
Figure 112000027203682-pct00048
(여기서, m은 1 내지 6의 정수이고, n은 0 또는 1 내지 6의 정수 및 R은 알킬기, 치환된 알킬기, 아릴기, 치환된 아릴기, 알킬아릴기, 카르복스아미도기, 카복사미도기, 치환된 카르복스아미도기, 치환된 카복사미도기, -NH2기 및 치환된 -NH2기로 구성된 군으로부터 선택된다.)
다른 실시형태로, 티올에스테르에서, X는 -(CH2)m-로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, m은 1 내지 6의 정수, -CH2(C=O)NH-이고, R1은 -CH3, -(CH 2)n-CH3, -CH(CH3)2-, -C(CH3)3-, -(CH2)n-Cl, -C(CH2 )n-Br 및 -(CH2)n-I로 구성된 군으로부터 선택되고, G는 CH(CH3)2, -C(CH3)3 및, 2,6-디메틸페닐기로 구성된 군으로부터 선택되고 피리디니오알카노일티올에스테르 R은 -NHC(=O)CH3, -C6H4NO2 ,
-C6H4NHSO2CH2C6H4NO2 및 -C6H4NHCOCH3로 구성된 군으로부터 선택된다. 피리디니오알카노일티올에스테르는 m이 정수 4 및 n=0 또는 정수 1 또는 2인 구조를 갖는다.
한 실시형태에서, 본 발명의 티올에스테르는 시험관내에서 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 티올에스테르는 항바이러스 활성을 갖는다.
본 발명은 아연 핑거 함유 단백질로부터 금속 이온을 해리하는 방법을 제공하고, 그 방법은 본 발명의 티올에스테르를 상기 아연 핑거와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 금속 이온은 아연 이온이고, 아연 핑거는 바이러스 단백질을 포함하고, 바이러스 단백질은 뉴클레오캡시드 단백질, Gag 단백질 또는 Gag-Pol 단백질이고, 아연 핑거-함유 단백질은 손상되지 않은(intact) 바이러스에 혼입된다.
한 실시형태에서, 아연 핑거 함유 단백질로부터 금속 이온을 해리하는 방법에서, 상기 바이러스와 상기 단백질의 접촉은 시험관내에서 실시된다. 상기 바이러스와 상기 화합물의 접촉은 또한, 생체내에서 실시될 수 있다. 아연 핑거는 조류육아종(avian sarcoma) 및 백혈증(leukosis) 레트로바이러스(lentivirus) 그룹, 포유류 B-형 레트로바이러스 그룹, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스 그룹, D-형 레트로바이러스 그룹, 뮤린 백혈병-관련 그룹 또는 렌티바이러스 그룹으로부터 기원한 레트로바이러스 단백질을 포함한다. 레트로바이러스 단백질은 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스로부터 기원될 수 있다. 이 방법은, 또한, 상기 바이러스 단백질의 아연 핑거로부터의 상기 금속 이온의 해리를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 아연 핑거로부터의 상기 금속 이온 해리의 검출은 모세관 전기 영동(capillary electrophoresis), 면역블로팅(immunoblotting), 핵자기 공명(Nuclear Magnetic Resonnance: NMR), 고압 액체크로마토그라피(HPLC)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 방사성 아연-65의 방출, 형광 및 겔 이동 시프트를 검출하여 실시될 수 있다.
본 발명은 또한, 바이러스를 불활성시키는 방법을 제공하는데, 이는 상기 바이러스와 본 발명의 화합물을 접촉시키는 것을 포함하는데, 여기서, 상기 바이러스와 화합물의 접촉이 바이러스를 불활성시킨다. 이 방법에서, 화합물은 아연 핑거로부터 아연 이온을 해리할 수 있다. 바이러스는 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스 그룹, 포유류 B-형 레트로바이러스 그룹, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스 그룹, D-형 레트로바이러스 그룹, 뮤린 백혈병-관련 그룹 또는 렌티 바이러스 그룹으로부터 기원된 레트로바이러스이다. 레트로바이러스는 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스로부터 기원될 수 있다.
바이러스를 불활성시키는 방법에서, 바이러스와 화합물의 접촉은 생체내에서 실시될 수 있다. 본 실시형태에서, 화합물은 바이러스의 전이를 억제하기 위해 투여될 수 있다. 본 화합물은 바이러스의 전이를 억제하기 위해, 질내(intra-vaginally) 또는 직장내(intra-rectally)에 투여될 수 있다. 화합물은 약제학적 제형으로 사람에게 투여될 수 있다. 화합물은 수의(veterinary) 약제학적 제형으로 동물에게 투여될 수 있다. 본 방법은, 또한, 바이러스와 비-티올에스테르 항-레트로바이러스 제제의 접촉을 포함한다. 항-레트로바이러스제는 뉴클레오티드 유사물(nucleotide analogue) 또는 프로테아제 억제제(protease inhibitor)일 수 있다. 뉴클레오티드 유사물은 AZT, ddCTP 또는 DDI일 수 있다.
바이러스를 불활성화하는 방법에서, 바이러스와 화합물의 접촉이 시험관내에서 실시될 수 있다. 본 방법의 실시형태에서, 레트로바이러스와 화합물의 접촉은 혈액 산물, 혈장(blood plasma), 영양 배지, 단백질, 약제, 화장료, 정자 또는 난자 제제, 세포, 세포 배양액, 박테리아, 바이러스, 식품 또는 음료에서 실시될 수 있다.
본 발명은, 또한, 분리되고 불활성화된 바이러스를 제공하고, 여기서 바이러스는 상기 바이러스를 본 발명의 티올에스테르와 접촉시키는 방법에 의해 불활성화되고, 상기 바이러스와 티올에스테르의 접촉이 바이러스를 불활성화시킨다. 분리되 고, 불활성화된 바이러스는, 또한, 백신 제형을 함유할 수 있다. 분리되고, 불활성돠된 바이러스는 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스 그룹, 포율류 B-형 레트로바이러스 그룹, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스 그룹, D-형 레트로바이러스 그룹, 뮤린 백혈병-관련 그룹 또는 렌티바이러스 그룹으로부터 기원된 레트로바이러스이다. 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스 일 수 있다.
본 발명은, 또한, 바이러스 단백질의 아연 핑거와 킬레이트된 금속 이온을 해리할 수 있는 화합물을 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 아연 핑거와 티올에스테르를 접촉시키고, 상기 바이러스 단백질 아연 핑거로부터 상기 금속 이온의 해리를 검출하는 것을 포함한다. 본 방법에서, 금속 이온은 아연 이온이다. 이 방법에서, 아연 핑거로부터 상기 금속 이온 해리의 검출은 모세관 전기 영동, 면역블로팅, 핵자기 공명(NMR), 고압력 액체크로마토그라피(HPLC)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 방사성 아연-65의 방출, 형광 및 겔 이동 시프트를 검출하여 실시될 수 있다.
본 발명은 또한, 바이러스 단백질의 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있는 화합물을 선택하기 위한 키트를 제공하고, 키트는 레트로바이러스 단백질과 바이러스 단백질로부터 상기 금속 이온의 해리를 검출하는 지시(instruction)를 포함하고, 지시는 본 발명의 티올에스테르의 선택 방법을 포함한다. 이 키트에서, 바이러스 단백질은 상기 바이러스 단백질의 아연 핑거로 킬레이트된 아연 이온이 제공될 수 있다. 바이러스 단백질은 손상되지 않은 레트로바이러스에 혼입될 수 있다. 아연 핑거는 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스 그룹, 포유류 B-형 레트로바이러스 그룹, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스 그룹, D-형 레트로바이러스 그룹, 뮤린 백혈병-관련 그룹 또는 렌티바이러스 그룹으로부터 기원될 수 있다. 아연 핑거는 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스로부터 기원될 수 있다. 키트에서, 지시는 상기 단백질로부터 상기 금속 이온의 해리를 모세관 전기 영동, 면역블로팅, 핵자기 공명(NMR), 고압력 액체크로마토그라피(HPLC)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 방사성 아연-65의 방출, 형광 및 겔 이동 시프트(shift)의 검출로 실시될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 티올에스테르를 함유하는 바이러스 사멸(virucidal) 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 바이러스 사멸 조성물은 또한, 혈장, 영양 배지, 단백질, 약제, 화장료, 정자 또는 난자 제제, 세포, 세포 배양액, 박테리아, 바이러스, 식품 또는 음료를 포함한다.
본 발명은, 또한, 본 발명의 티올에스테르를 함유하는 약제학적 제형을 제공한다. 약제학적 제형은, 또한, 약제학적 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 본질 및 이점의 이해는 명세서의 남은 부분 및 청구항을 참고하여 이루어질 수 있다.
여기서 명시된 모든 간행물, 전자 데이터베이스, 특허 및 특허 출원은 참고문헌으로 포함된다.
대부분의 항바이러스제의 효능은 선택 압력 하에서, 바이러스가 약물저항성 균주로 변이되는 것이 일반적이기 때문에 한정된다. 약물저항성의 발달은 급속하게 변이할 수 있는 능력 때문에 특히, 레트로바이러스 중에서, 잘 알려진 생존 전략이다. 생존 및 성장을 위해 필요한 바이러스 구조는, 그들의 불활성이 변이에 의해 쉽게 압도될 수 없기 때문에 적당한 약제 표적이다.
복제 및 생존을 위한 필수적인 바이러스 구조는 약제 발달을 위한 적당한 표적이다. 이 표적들의 이용은 또한, 그 구조가 변이상 용납하지 않는 것이 포함될 수 있다. 게다가. 이 구조들은 바이러스 과, 군 또는 속 사이에서 보존 및/또는 유지될 것이다.
본 발명은 티올에스테르 조성물의 새로운 속을 제공한다. 이들 티올에스테르는 다양한 메커니즘, 특히, 금속 이온-복합 아연 핑거(zinc finger)와 복합체를 이루어서 바이러스를 불활성화 할 수 있다. 더 바람직한 실시형태로, 본 발명의 티올에스테르 조성물이 레트로바이러스를 불활성화한다. 실질적으로 이 불활성은 티올에스테르가 바이러스의 뉴클레오캡시드 또는 다른 아연 핑거 함유 단백질과 접촉시 효과적이다. 이 새로운 조성물의 중요한 면은 그들이 생물학적 용액의 환원 환경에 의해 영향을 받지 않는 것이다(즉, 생체내 그들의 활성이 크게 감소되지 않는). 이렇게 해서, 바이러스, 특히, 레트로바이러스 치료의 중요한 치료 시약이다. 본 발명의 조성물의 바이러스 사멸 활성은, 또한, 예컨대, 시약 또는 백신 및 멸균제 처럼 바이러스를 죽이는데 사용된는 것과 같은 시험관내 적용에 유용하다.
"아연 핑거" 모티프는 많은 바이러스, 특히 레트로바이러스에서 발견되는 고도로 보존되고 필수적인 구조이다. 스푸마바이러스를 제외하고, 레트로비리데에서 Gag 및 Gag-Pol 단백질은 폴리프로테인의 뉴클레오캡시드 p7(NCp7) 내에 높게 보존된 아연 핑거 모티프(CCHC)를 포함한다(하기에 정의됨). 초기 및 후기 바이러스 복제 시 단백질의 다른 잔기를 따라 금속 킬레이팅 시스테인 및 히스티딘의 절대적인 보존 및 그것의 필수적인 기능은 항바이러스 표적으로서의 특징을 확인한다. 아연 핑거에서 킬레이팅 잔기의 돌연변이는 비-감염성 바이러스를 생산한다. 아연 핑거가 대부분의 레트로바이러스에서 동일하기 때문에, 그것을 억제할 수 있는 시약은 넓은 범위의 항바이러스 치료제의 효과를 갖는다.
HIV-1의 뉴클레오캡시드(NC) 단백질, NCp7은 단지 7개의 아미노산으로 구분된 두 개의 아연 핑거를 포함한다(Henderson(1992) J. Virol. 66:1856). 두 개의 핑거는 감염에 필수적이다(Aldovini(1990) J. Virol. 64:1920; Gorelick(1990) J. Virol. 64:3207). 이렇게 해서, HIV-1 뉴클레오캡시드는, 특히, 아연 핑거 불활성제에 대해 공격받기 쉬운 표적이다. 모든 증거는 킬레이팅의 잔기 및 핑거 내의 다른 주요 잔기의 완전한 보존을 지시한다. 이들 잔기들 중 어는 것의 돌연변이는 바이러스 감염성의 손실 또는 심각한 손상을 일으킨다. 핑거의 금속 이온 킬레이팅 성질을 유지하는 변이(CCHC에서 CCHH 또는 CCCC로)도 감염성의 손실을 일으킨다. 이렇게 해서, 단백질 활성의 회복을 유도하는 단일 또는 다중 변이의 변이성 경로에 대한 알려진 증거가 없다.
다양한 C-니트로소 화합물 및 시스타민, 티아민디설파이드 및 디설프람 같은 디설파이드 함유 화합물은 아연 핑거 시스테인 티올레이트를 산화 및 분자내 및 분자간 디설파이드 교차결합을 유도할 수 있다(McDonnell(1997) J. Med. Chem. 40:1969-1976; Rice(1997) Nature Medicine 3:341-345; Rice(1997) Antimicrob. Agents and Chemotherapy 41:419-426; Rice(1996) J. Med. Chem. 39:3606-3616; Rice(1996) Science 270:1194-1197; Rice(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9721-9724; Rice(1993) Nature 361:473-475; Henderson, et al., WO 96/09406). 두 개의 아연 핑거 각각의 시스테인티올은 천연 단백질 구조의 자연발생적 손실과 Cu+2, Fe+3, C-니트로소 화합물, 디설파이드, 말레이미드, 알파-할로게네이티드케톤 및 니트릭 산화 유도체 같은 시약에 의해 급속하게 공격받는다. 예컨대, 3-니트로벤자미드, C-니트로소 화합물 같은 산화제로 손상되지 않은 HIV-1의 치료는 뉴클레오캡시드 단백질의 디설파이드 결합을 유도하고, 아연 핑거의 산화를 통해 바이러스 감염을 불활성화한다(Rice(1993) Nature 361:473; Rice(1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:9721-9724). C-니트로소 화합물은 또한 폴리(ADP-리보스)폴리머라제를 함유하는 진핵성 CCHC 아연 핑거를 불활성화한다(Buki(1991) FEBS Letters 290:181). 그러나, 이 화합물들은 독성이고, 낮은 용해성 및 생물학적유용성(bioavilability)을 갖고, 생물학적 용액에서 불활성된다.
본 발명의 새로운 티올에스테르는 전기성의 S-S 모이어티 보다는 그들의 티올에스테르 모이어티를 통하여 아연 핑거와 상호작용한다. 결과로서 생기는 티올에스테르는 S-S 전기성 모이어티가 결핍되어 있다. 낮은 친핵성 그룹은 아연 핑거 모티프의 표적화에 사용된다. 결과로, 그들은 많은 디설파이드 제와 비교하여 상당히 증가된 성질을 갖는다. 그들은 세포 독성을 감소시킨다. 그들은 항바이러스 활성 및 아연 핑거 모이어티, 특히, HIV-1의 NCp7 뉴클레오캡시드 단백질의 아연 핑거와의 반응성을 증가시킨다. 본 발명의 티올에스테르는 증가된 수용성을 갖는다. 그들은 환원제에서 아연 핑거 반응성을 유지한다. 개선된 특징, 특히, 본 발명의 티올에스테르에서 생물학적 용액의 환원에 대한 저항성의 조합은 시험관내, 생체내에서의 용도 및 치료 적응을 확대한다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 용어들을 하기에 정의한다.
본 발명에서 사용된 "알킬"이라는 용어는 분지 또는 비분지, 포화 또는 불포화, 1 내지 30개, 바람직하게는 4 내지 20, 더욱 바람직하게는 6 내지 18개의 탄소를 갖는 1가 탄화수소기를 의미한다. 알킬기가 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 있을 때, 이는 "저급 알킬"이라고 한다. 적당한 알킬 라디칼은, 예컨대, 한 개 이상의 메틸렌, 메틴 및/또는 메틴기를 함유하는 구조를 포함한다. 분지된 구조는 i-프로필, t-부틸, i-부틸, 2-에틸프로필 등과 유사한 분지 모티프를 갖는다. 본 발명에서 사용된 "치환형 알킬"은 저급 알킬, 아릴, 아실, 할로겐(즉, 알킬할로스, 예컨대, CF3), 히드록시 아미노, 알콕시, 알킬아미노, 아실아미노, 티오아미도, 아실록시, 아릴록시, 아릴록시알킬, 머캅토, 티아, 아자, 옥소, 포화 및 불포화된 시클릭탄화수소, 헤테로사이클 등과 같은 한 개 이상의 관능기를 포함하는 것으로 기술된 알킬을 의미한다. 이 군들은 알킬 모이어티의 어느 탄소에도 부착될 수 있다. 추가로, 이 그룹들은 알킬 체인에 부착되거나, 구성요소로 존재한다.
"알콕시"는 COR 기를 의미하고, 여기서, R은 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬 또는 치환된 아릴알킬이고, 여기서, 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬 및 치환된 아릴알킬 기는 여기서 기술된 바와 같다. 적당한 알콕시기는, 예컨대, 메톡시, 에톡시, 페녹시, 치환된 페녹시, 벤질록시, 펜에틸록시, t-부톡시 등을 포함한다.
"알킬아미노"는 2차 및 3차 아민을 의미하고, 여기서 알킬기는 동일하거나 다르고, "알킬기"에 대해 기술된 바와 같다.
"아릴"은 방향족 치환형분으로, 단일 방향족환 또는 메틸렌 또는 에틸렌 모이어티 같은 통상의 기에 결합, 공유결합, 연결된 다중 방향족환일 수 있다. 통상의 결합기는 벤조페논에서와 같은 카보닐일 수 있다. 방향족환은 페닐, 나프틸, 비페닐, 디페닐메틸 및 벤조페논 등을 포함한다. "아릴"은 "아릴알킬"을 포함한다. "치환형 아릴"은 저급 알킬, 아실, 할로겐, 알킬할로스(예컨대, CF3), 히드록시, 아미노, 알콕시, 알킬아미노, 아실아미노, 아실록시, 페녹시, 머캅토 및 메틸에틸렌 또는 에틸렌 모이어티 같은 통상의 기에 공유결합 또는 결합된 방향족환에 접합된 포화 및 불포화 시클릭탄화수소 같은 한 개 이상의 관능기를 포함하는 것으로 기술된 아릴을 의미한다. 통상의 결합기는 시클로헥실페닐케톤에서와 같은 카보닐기일 수 있다. "치환형 아릴"은 "치환형 아릴알킬"을 포함한다.
여기서 사용된 "아릴알킬"은 기술된 바와 같이 아릴기가 또한 알킬기에 부착된 "아릴"의 부분을 의미한다.
"접촉"은 반응이 일어날 수 있는 적합한 위치로 반응의 성분들을 가지고 오 는 작용을 의미한다. 더욱 상세히는, "접촉"은 다음의 결합하는, 추가하는, 혼합하는, 넘겨주는, 통하는 등과 교환하여 사용할 수 있다.
여기서 사용된, "Gag-Pol 단백질"은 HIV-1 또는 다른 레트로바이러스의 폴리프로테인 해독 산물을 의미한다(Fehrmann(1997) Virology 235:352359; Jacks(1988) Nature 331:280-283). "Gag 단백질"이 바이러스 프로테아제로 처리되어 성숙한 바이러스 단백질이 생성된다(Humphrey(1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41:1017-1023; Karacostas(1993) Virology 193:661-671).
"할로겐"은 플루오린, 브로마인, 클로린 및 아이오다인 원자를 의미한다.
"분리된"은 분자 또는 조성물, 예컨대, 본 발명의 티올에스테르, 티올에스테르-복합체 폴리펩티드 또는 바이러스 또는 티올에스테르-불활성화 바이러스 같은 것을 언급할 때 분자 또는 조성물이 적어도 하나의 단백질 같은 다른 화합물, 다른 핵산(예컨대, RNAs) 또는 생체내에서 또는 자연적으로 발생하는 상태와 관련된 다른 오염물 같은 것으로부터 분리되는 것을 의미한다. 이렇게 해서, 화합물, 폴리펩티드 또는 비리온은 그것이 자연적으로 , 예컨대, 세포막, 세포 추출액, 혈청 등과 연결되어 있을때, 분리되는 것으로 여겨진다. 그러나, 분리된 조성물은 또한 실질적으로 순수하다. 분리된 조성물은 균질화 상태이고, 건조 또는 수용액으로 존재할 수 있다. 순도와 동질성은 예컨대, 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE) 또는 고작위 액체크로마토그래피(HPLC) 같은 분석 화학 기술을 이용하여 측정될 수 있다.
"뉴클레오캡시드 단백질" 또는 "NC 단백질"은 레트로바이러스 뉴클레오캡시 드 단백질을 의미하고, 이는 비리온 뉴클레오캡시드의 주요한 부분이고, 그것은 다이머릭(dimeric) RNA 유전자를 코팅한다(Huang(1997) J. Virol. 71:4378-4384; Lapadat-Tapolsky(1997) J. Mol. Biol. 268:250-260). HIV-1의 뉴클레오캡시드 단백질은 NCp7로 명명된다(Demene(1994) Biochemistry 33:11707-11716).
"레트로바이러스"는 레트로비리데 과의 바이러스로, 이는 일반적으로,역전사 효소에 의해 전사된 ssRNA를 갖는다(P. K. Vogt, "Historical introduction to the general properties of retroviruses", in Retroviruses, eds. J. M. Coffin, S. H. Hughes and H. E. Varmus, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997, pp 1-26; Murphy et al.(eds.) Archives of Virology/Supplement 10, 586 pp(1995) Springer Verlag, Wien, NY; and the web site for the Committee on International Taxonomy of Viruses, Virology Division of the International Union of Microbiology Society at http://www.ncbi.nlm.nih.gov./ICTV/for viral classification and taxonomy). 아연 핑거 모티프-함유 폴리펩티드를 함유하고, 그들의 복제가 본 발명의 티올에스테르에 의해 억제될 수 있는 레트로비리데 과 구성원은 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스(알파레트로바이러스), 포유류 B-형 레트로바이러스(베타레트로바이러스)(예컨대, 마우스 포유류 종양 바이러스), 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스(델타레트로바이러스)(예컨대, 사람 T-림프영양성 바이러스 1), 뮤린 백혈병-관련 그룹(감마레트로바이러스), D-형 레트로바이러스(입실론레트로바이러스)(예컨대, 메이슨-프피저 원숭이 바이러스) 및 렌티바이러스를 포함한다. 렌티바이러스는 사람 면역결핍성 바이러스 1(HIV-1) 같은 소, 말, 고양이, 양/염소 및 영장류 렌티바이러스 그룹을 포함한다. 그들의 복제 능력이 본 발명의 티올에스테르에 의해 영향을 받는 특정 바이러스는 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스를 포함한다.
여기서, "티올에스테르" 및 티오에스테르"는 함께 사용될 수 있고, 그들은 화학 구조, G-S-(C=O)-G'이고, 여기서 G 및 G'는 두 개 군의 원자를 나타내고, 어떤 화학 구조는 -2 산화 상태에서 황 원자에 직접적으로 결합된 산화-계 카보닐기로 구성된다. 탄소 및 황 원자는 차례로, 두 개 그룹의 원자에 결합되어 G-S-(C=O)-G'이다.
여기서, "아연 핑거"는 단백질/핵산 및/또는 단백질/단백질 상호작용과 관련된 구조를 생성하기 위해 금속 이온과 결합하는 시스테인 및/또는 히스티딘으로 구성된 폴리펩티드 모티프를 의미한다. 본 발명의 티올에스테르는 시험관내에서 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있다. 일반적으로, 금속 이온은 아연 또는 카드뮴과 같은 2가 양이온이다. 아연 핑거 모티프-함유 단백질은 일반적으로 바이러스에서 높게 보존되며 필수적인 구조이다. 아연 핑거 모티프는 사람 파필로마 바이러스(HPV), 특히, HPV E6 및 E7 단백질(Ulman(1996) Biochem. J. 319:229-239), 인플루엔자 바이러스(Nasser(1996) J. Virol. 70:8639-8644)에서 발견된다. 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스, 포유류 B-형 레트로바이러스, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스, D-형 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하는 레트로비리데의 대부분 아과(subfamily)에서, 일정한 아연 핑거 모티프는 대게 높게 보존된 구조이다. 레트로바이러스의 뉴클레오캡시드, Gag 및 Gag-Pol 단백질은 아연 핑거 모티프를 갖는다. 레트로바이러스에서, 아연 핑거 모티프는 일반적으로 (일정한, 4개의 잔기 Cys(X)2Cys(X)4His(X)4Cys)를 갖는 14개의 아미노산으로 구성되어가 일정하여 "CCHC 아연 핑거"로 불린다(Henderson(1981) J. Biol. Chem. 256:8400). 이는 그것의 히스티딘이미다졸 및 시스테인티올레이트를 통하여 아연을 킬레이트 한다(Berg(1986) Science 232:485; Bess(1992) J. Virol. 66:840; Chance(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10041; South(1990) Adv. Inorg. Biochem. 8:199; South(1990) Biochem. Pharmacol. 40:123-129). CCHC 아연 핑거는 레트로바이러스 감염에서 유전자 RNA를 패키징하는 것과 같은 필수적인 기능을 수행한다. 그들은, 또한, 바이러스 감염의 초기 사건에 필수적이다.
여기서, "시험관내에서 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있거나 또는 항바이러스 활성을 갖는"은 티올에스테르가 여기서 기술된 몇 종류의 시험관내 분석을 사용하여 아연 핑거로부터 금속 이온을 어느 정도 해리할 수 있다는 것으로 본 발명의 범위 내에 있음을 의미한다. 아연 핑거로부터 금속 이온 해리의 검출은, 예컨대, 모세관 전기영동, 면역블로팅, 핵자기 공명(NMR), 고압 액체크로마토그라피(HPLC)를 사용하여, 방사성 아연-65, 형광 및 겔 이동 시프트를 검출하여 실시될 수 있다. 이는 티올에스테르가 분석, 예컨대, 기술된 XTT 세포보호 분석에서 항바이러스 활성을 나타내는 것이 본 발명의 범위 내인 것을 의미한다. 예컨대, 어느 정도의 측정 가능한 항바이러스 활성을 갖는 티올에스테르는 금속 이온의 해리가 검출되지 않을 지라도 본 발명의 범위에 속한다.
여기서, "바이러스의 전이를 억제" 및 "항바이러스 활성"은 티올에스테르의 효과가 어떤 경우에서, 바이러스 복제 능력에 음성적 영향을 미치는 것을 의미한다. 그러한 전이의 억제, 예컨대, 복제 능력 손실은 종래 공지된 수단을 사용하여 측정될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 티올에스테르는 후손을 생산, 비리온의 형태일 때, 세포에 융합, 세포로 들어가서 세포로부터 발아, 세포내 또는 세포외적으로 살아남아 그것의 RNA 유전자를 역전사, 바이러스 단백질을 해독, 프로테아제로 폴리프로테인을 프로세싱, 바이러스 성분의 세포내 어셈블리에 영향을 미쳐 캡시드화 하는 등의 바이러스의 활성을 감소시키는 바이러스의 전이를 억제(항바이러스 활성을 갖는)한다. 바이러스의 전이를 억제하는 본 발명의 티올에스테르의 활성은 화학적 또는 생물학적 매커니즘 또는 경로에 의해 제한되는 것은 아니다. 티올에스테르는, 예컨대, NCp7 같은 뉴클레오캡시드 단백질에 결합하여 NCp7의 바이러스 RNA 또는 다른 핵산에 결합을 막고, 안정한 부가물 형성을 일으키는 특이적 화학적 공격과 관련되고, 불안정한 NCp7 화합물 부가물의 붕괴 결과로 세포내 디설파이드 결합을 형성하고, 기능이 손실된 NCp7 단백질 내의 다른 보존적 또는 비-보존적 잔기의 상호작용으로 바이러스의 전이를 억제할 수 있다(복제 활성을 감소).
일반적 방법
본 발명은 시험관내에서 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있는 티올에스테르 화합물의 새로운 속(genus)을 제공한다. 전문가는 본 발명의 티올에스테르가 다양한 과정 및 방법을 사용하여 합성될 수 있고, 이는 과학 및 특허 문헌에 자세히 기술되어 있다(Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al.(Eds) John Willey & Sons, Inc., NY; Venuti(1989) Pharm Res. 6:867-873). 본 발명은 종래 공지된 방법 또는 프로토콜을 결합하여 실시될 수 있고, 이는 과학 및 특허 문헌에 자세히 기술되어 있다. 그러므로, 단지 몇몇의 일반적인 기술이 본 발명의 새로운 티올에스테르 및 방법과 관련하여 특이적 방법론 및 예시를 논의하기 위해 이전에 기술될 것이다.
모든 유기 시약 및 중간체는 Sigma/Aldrich(St. Louis, MO) 및 Lancaster Synthesis, Inc.(Windham, NH)의 것을 사용하였다. 용매 및 다른 화학품은 시약 등급이다. 모든 화합물의 구조 및 조성물은 1H NMR 및 EI MS에 의해 명시되었고, 실리카층 TLC에 의해 분석되어 티올에스테르에 대해 메탄올/아세트산(6:4)로 일루션하고, 피리디니오알카노일티올에스테르(PATE) 화학형 및 다른 것에 대한 클로로포름/메탄올(9:1)을 포함한다.
본 발명의 티올에스테르는 아연 핑거를 공격하고, 아연을 방출하여서 HIV-1 같은 아연 핑거 함유레트로바이러스를 불활성화하는데 사용된다. 일단 불활성화된 레트로바이러스는, 예컨대, 백신, 예방약 또는 레트로바이러스 감염의 진단을 위한 표준 ELISA 분석에서 성분으로서 사용될 수 있다는 것이 종래 기술에서 명확하다. 이들 새로운 조성물 및 방법들을 만들고 사용하는 것은 다양한 기본 과정 및 시약의 결합을 포함할 수 있다. HIV-1 CCHC 아연 핑거와 반응할 수 있는 화합물을 확인하기 위한 키트가, 또한, 제공된다. 본 발명의 새로운 조성물에 더하여, 이 키트들은 다양한 기본적인 과정 및 시약들을 포함한다.
본 발명과 함께 사용될 수 있는 일반적인 방법들의 다음의 논의는 단지 기술 적인 의도이다. 다른 방법 및 형태가 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위내에서 실시가능하다.
디설파이드벤자미드 화학형, 화합물 2D의 합성
표1에 기술된 화합물 2D("D"는 다이머 형을 의미하고, 표1에 "D 형"으로 명시됨) 또는 N,N'-(2,2'-디티오디벤조일)-비스-술프아세트아미드를 합성하기 위한 예시적 수단이 다음에 기술된다. 개시 물질, 2,2'-디티오디벤조일클로라이드는 Katz(1953) J. Org. Chem 18:1380-1402; Baggaley(1985) J. Med. Chem. 28:1661-1667에 기술된 바와 같이 합성되었다. 피리딘(300 ml) 중의 술프아세트아미드(13 g, 60 mmol)의 용액에 실온(RT)에서, 1,4-디옥산(100 ml) 중의 2,2-디티오디벤조일클로라이드(85%로, 0.1 g, 20 mmol)의 용액을 적하하였다. 투명한 붉은 갈색 용액을 실온에서 밤새 강하게 교반하고, 교반된 에틸에테르(1 L)로 부어 넣는다. 점성 액체 침전물이 에테르 상으로부터 분리되고, N,N-디메틸포름아미드(DMF, 대략 50 ml) 중에 용해되고, 강하게 교반된 수용성 3 M HCl 800 ml에 적한된다. 백색 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 진공에서 건조하여 11 g(78%)를 얻는다. 정제하지 않은 산물(1 g)을 고온의 에탄올(20 ml)서 용해한다. 고온의 여과액이 교반된 물(200 ml)에 추가된다. 백색 침전물은 여과되고 건조된다. 순수한 2D 0.85 g(85%)를 얻는다.
Figure 112000027203682-pct00008
벤조이소티아졸론 화학형, 화합물 2B, 22, 31, 34의 합성
표1에 기술된 화합물 2B("B"는 BITA 또는 벤조이소티아졸론 형을 나타낸다) 또는 N-[4-(3-옥소-3H-벤즈[d]이소티아졸-2-일)페닐술포닐]아세트아미드를 포함하는 벤조이소티아졸론 화학형을 합성하는 예시적 수단이 다음에 기술된다. 두 가지 방법이 사용된다. 한 방법에서, 피리딘(2 ml) 중의 화합물 2D(0.2 g, 0.28 mmol)의 용액에 1,4-디옥산(1 ml) 중의 N-브로모석시니미드(0.18 g, 1 mmol)의 용액이 추가된다. 그 용액은 3시간 동안 실온에서 교반되고, 물(30 ml)에 추가된다. 백색 침전물이 수집되고, 고온의 에탄올 및 물로부터 침전에 의해 정제하여 0.17 g(87%)를 얻는다.
Figure 112000027203682-pct00009
두 번째 방법은 화합물 2B, 화합물 22 BITA, 화합물 31 BITA 및 화합물 BITA를 합성하기 위해 사용된다(표1). CCl4(10 ml) 중의 2,2'-디티오디벤조일클로라이드(0.32 g, 0.93 mmol)의 혼합물에 CCl4(10 ml) 중의 2.5% w/v Cl2의 용액이 추가된다. 그 혼합물이 투명해질 때까지 교반된다(1시간). 여과 후, 여과액은 1시간 동안 N2로 거품이 일고, N,N-디메틸아세트아미드(DMA, 4 ml) 중의 술프아세트아미드(0.2 g, 0.93 mmol)의 용액이 추가된다. 그 혼합물은 2시간 동안 교반되고, 에틸에테르(20 ml)가 추가되고, 침전물은 수집되고, 고온의 에탄올 및 물로 정제되어 화합물 2B 0.3 g(92%)를 얻는다.
Figure 112000027203682-pct00010
스페이스드 디설파이드벤자미드/벤조이소티아졸론 화학형, 예로 화합물 23D, 24D 및 25D의 합성
화합물 23D(표1) 또는 N,N'-(2,2'-디티오디벤조일)-비스-4-(아미노메틸)벤젠-술폰아미드, 24D 또는 N,N'-(2,2'-디티오디벤조일)-비스-4-(2-아미노에틸)벤젠-술폰아미드 및 25D 또는 N,N'-(2,2'-디티오디벤조일)-비스-4(글리신아미도)벤젠-술폰아미드(표1)을 합성하기 위한 예시적 수단이 다음에 기술된다. 이 화합물들은 각각 4-(아미노메틸)벤젠술폰아미드(Aldrich), 4-(2-아미노에틸)벤젠술폰아미드(Aldrich) 및 N-글리실술프아닐아미드로부터 제조된다. 후자 화합물은 먼저 술프아닐아미드를 DNA 중의 브로모아세틸브로마이드 및 피리딘을 동량 처리하고, 반응 혼합물을 0.5 M 이상의 HBr에 추가한 후 브로모아세틸화 유도체를 회복하여 제조된다. 건조된, 정제되지 않은 산물은 에탄올로부터 재결정화되고, 표준 Gabriel 반응(프탈이미도 유도체를 준비하고, 히드라진히드레이트로 쪼개는)을 통하여 N-글리실술프아닐아미드로 전환된다. 상기 화합물 2D에 대한 처리는 다음과 같다.
Figure 112000027203682-pct00011
Figure 112000027203682-pct00012
N-말단 변형된 아미노페닐술폰 화학형, 예로 화합물 34D 합성.
화합물 34D(표1) 또는 N,N'-(2,2'-디티오디벤조일)-비스-4-술프아닐릴-N-[(2-니트로벤질)술포닐)]아닐린을 합성하기 위한 예시적 수단이 다음에 기술된다. 화합물 26은 3-아미노페닐술폰 및 2,2'-디티오디벤조일클로라이드를 시작으로 화합물 2D와 유사한 방식으로 합성된다. DMA(30 ml) 중의 화합물 26(1.5 g, 1.9 mmol)의 용액에 1,4-디옥산(10 ml) 중의 2-니트로톨루엔술포닐클로라이드(1.4 g, 5.9 mmol)의 용액이 적하된다. 그 용액은 밤새 실온에서 교반되고, 강하게 교반된 에틸에테르(300 ml)에 옮겨진다. 에테르 상 제거 후, 점성 액체가 DMF(15 ml)로 희석된다. 희석된 용액은 교반하면서 물(200 ml)에 추가된다. 백색 침전물이 수집되고, 고온의 에탄올 및 에틸에테르로부터 두 번의 침전으로 정제되어 화합물 34D 1.92 g(84%)를 얻는다.
Figure 112000027203682-pct00013
2,3-할로알카노아미도벤즈아미도 화학형, 예로 화합물 37 합성
화합물 37(표1) 또는 N-[2-(3-클로로-프로피온아미도)벤조일]술프아세트아미드를 합성하기 위한 예시적 수단이 다음에 기술된다. N-(2-니트로벤조일)술프아세트아미드는 2-니트로벤조일클로라이드를 개시물질로 하는 외에는 2D와 유사한 방식으로 합성된다. 이 산물의 1 g(2.7 mmol)이 45℃에서 메탄올(100 ml) 중에 용해된다. 그 용액은 실온에서 냉각되고, N2로 거품을 일어 공기를 제거한다. 그 용액에 팔라디늄, 활성화 탄소 위의 10 중량%(0.22 g)이 N2 하에서 추가된다. 그 혼합물은 H2로 1.5시간 동안, N2로 0.5시간 동안 거품을 인다. 여과 후, 여과액은 증발되고, 건조되어 백-황색의 산물 0.84 g(93%)을 얻는다. 이 2-아미노벤즈아미도 유도체는 화합물 34D와 유사한 조건 하에서 3-클로로프로피오닐클로라이드와 반응하여 화합물 37을 얻는다.
Figure 112000027203682-pct00014
할로알카노일티올에스테르 화학형, 예로 화합물 44 합성
화합물 44(표1) 또는 N-[2-(5-브로모발레로일티오)벤조일]술프아세트아미드를 합성하기 위한 예시적 수단이 다음에 기술된다. N-(2-머캅토벤조일술프아세트아미드가 먼저 90% DMF(20 ml) 중의 2D(2.2 g, 3.1 mmol), 트리스(2-카복시에틸포스핀히드로크로라이드(1 g, 3.5 mmol) 및 트리에틸아민(0.5 ml)에 추가하여 준비된다. 그 용액은 1시간 동안 교반되고, 0.5 M HCl(200 ml)에 추가된다. 그 침전물이 수집되고, 건조되어 2.3 g(95%)을 얻는다. DMA(5 ml) 중의 이 산물(0.5 g, 1.4 mmol)의 용액에 N2 하에서 5-브로모발레릴클로라이드(0.6 ml, ~4.5 mmol)이 추가된다. 그 용액은 1시간 동안 N2 하에서 교반되고, 에틸에테르(50 ml)에 추가된다. 에테르 상을 제거 후, 남아있는 점성 액체를 DMF(10 ml) 중에 용해한다. 그 용액은 강하게 교반된 물(100 ml)에 추가된다. 백색 침전물이 여과되고, 고온의 에탄올 및 물로부터 정제되어 화합물 44 0.47 g(65%)를 얻는다.
Figure 112000027203682-pct00015
피리디니오알카노일티올에스테르 화학형, 예로 화합물 45의 합성
화합물 45(표1) 또는 N-[2-(5-피리디니오-발레로일티오)벤조일]술프아세트아미드브로마이드를 합성하기 위한 예시적 수단이 다음에 기술된다. 피리딘(7 ml) 중의 화합물 44(0.25 g, 0.49 mmol)의 용액이 N2 하에서 밤새 교반된다. 에틸에테르(80 ml)가 추가되고, 백색 침전물이 수집되어 고온의 에탄올 및 에테르로부터 정제되고, 그 침전물은 진공에서 즉시 건조되어 화합물 45 0.21 g(72%)를 얻는다.
Figure 112000027203682-pct00016
Figure 112000027203682-pct00017
주형Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ에 의해 표현된 티올에스테르의 합성.
주형Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ에 의해 표현된 티올에스테르 화합물을 합성하기 위한 예시적 수단이 다음에 기술된다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 티올에스테르를 얻기 위해 합성 도식 또는 예시적 포로토콜에 변화를 준 것을 사용할 수 있다.
주형Ⅱ 및 Ⅲb에서, X는 -CH2-, -CH2CH2- 및 -CH2C(=O)NH-이고, 티올에스테르는 상기 기술된 바와 같이 화합물 23D, 24D 및 25D를 각각 합성하기 위한 방법을 사용하여 얻을 수 있다(표1).
티올에스테르는 N-[2-α-피리디니오-4-톨루오일티오)벤조일]술프아세트아미드클로라이드이고, N-(2-머캅토벤조일술프아세트아미드(합성 화합물 44)(0.4 g) 및 디메틸아세트아미드(2 ml) 중의 4-(클로로메틸)벤조일클로라이드(0.6 ml)이 1시간 동안 질소 분위기 하에서 교반되고, 교반하면서 에틸에티르(40 ml)에 추가된다. 점성 액체 침전물은 디메틸포름아미드(1 ml)로 희석되고, 에테르(40 ml) 및 헵탄(40 ml)의 용액에 추가된다. 점성 액체 침전물은 수집되고, 피리딘(3 ml)에 추가된다. 그 용액은 실온에서 3일 동안 Ar 하에서 교반되고, 에테르(50 ml)에 추가된다. 침전물은 수집되고, 건조된다. 정제하지 않은 산물은 MeOH 중의 10% AcOH로 등용매원리(isocratic elution)을 이용하여 실리카겔 컬럼 위에 정제된다.
티올에스테르가 N-[2-(2-(피리디니오아세트아미도)벤조일티오)벤조일]술프아 세트아미드클로라이드일 때, 화합물 37의 유사물은 클로로아세틸클로라이드가 클로로프로피오닐클로라이드에 치환하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 준비된다. 이 산물은 피리딘에 용해되고, 실온에서 두고, 상기 기술된 바와 같이, N-[2-(α-피리디니오-4-톨루오일티오)벤조일]술프아세트아미드클로라이드에 대해 얻어진다.
티올에스테르가 N-[2-(α-피리디니오아세트아미도아세틸티오)벤조일]술프아세트아미드클로라이드일 때, N-(2-머캅토벤조일)술프아세트아아미드가 화합물 44에 대해 기술된 바와 같이 준비된다. 클로로아세틸글리신은 이 산물의 티올기에 결합되고, 다음에 (a) p-니트로페닐에스테르 유도체 또는 (b) 옥살릴클로라이드를 사용하여 준비된 산 클로라이드를 통하여 글리신카보닐기의 활성이 따른다. 검사 및 피리딘과의 연이은 반응이 상기 기술된 바와 같이 N-[2-(α-피리디니오-4-톨루오일티오)벤조일]술프아세트아미드클로라이드에 대해 기술된 바와 같이 실시된다.
티올에스테르가 N-[2-(2-(피리디니오아세트아미도)이소부티릴티오)벤조일]술프아세트아미드클로라이드일 때, 화합물은 N-클로로아세틸-2-아미노이소부틸산 (Brinbaum(1952) J. Biol. Chem. 194:455 and Ronwin(1953) J. Org. Chem. 18:127에 따라 제조된)이 클로로-아세틸글리신에 대해 치환형되는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 N-[2-(피리디니오아세트아미도아세틸티오)벤조일]술프아세트아미드클로라이드와 동일한 방식으로 준비될 수 있다.
티올에스테르가 N-[2-(5-디메틸술포니오발레로일티오)벤조일]술프아세트아미드아이오다이드일때(여기서, Z=-S+(CH3)2 및 Y=-(CH2)4 -), 화합물 44(1.10 g)과 아세 톤(99%, 25 ml) 중의 NaI(5 g)의 혼합물은 실온에서 밤새 질소하에서 교반되고, 교반하면서 물(250 ml)에 추가된다. 백색 침전물이 수집되고 건조되어 1.2 g을 얻는다. 아세토니트릴(3 ml) 및 메틸설파이드(4 ml) 중의 이 산물(0.3 g)의 투명한 용액은 실온에서 밤새 교반된다. 투명한 용액은 강하게 교반하면서 에틸에테르(250 ml)에 추가된다. 백색 침전물이 수집되고, 에테르로 세척되고 건조되어 0.15 g을 얻는다.
티올에스테르가 N-[2-(5-트리에틸암모니오발레로일티오)벤조일]술프아세트아미드아이오다이드(여기서, Z=-N+(C2H5)3 및 Y=-(CH2) 4-)일 때, N-[2-(5-디메틸술포니오발레로일티오)벤조일]술프아세트아미드아이오다이드에 평행 합성이 실시될 수 있고, 여기서, 트리에틸아민은 메틸설파이드에 대해 치환된다. 환류가 트리에틸아민과의 반응을 완성하기 위해 요구될 수 있다.
티올에스테르가 N-[2-(5-트리-n-부틸포스포니오발레로일티오)벤조일]술프아세트아미드아이오다이드(여기서, Z=-P+(C4H9)3 및 Y=-(CH2) 4-)일 때, N-[-(5-디메틸술포니오발레로일티오)벤조일]술프아세트아미드아이오다이드에 평행합성이 실시될 수 있고, 여기서, 트리-n-부틸포스파인은 메틸설파이드에 대해 치환형된다.
주형Ⅲ의 티올에스테르(여기서, G는 t-부틸, Y는 CH2-, X는 -CH2-이고, 피리딘환은 R8 및 R10에서 치환된 카복사미드를 갖고, R6은 H, R9는 -SO2-NH2이고, R7, R8, R10, R11은 H이다.)를 합성하기 위해, 4-[1-(t-부틸티오카보닐메틸)니코틴아미도메틸]-벤젠술폰아미드클로라이드트리에틸아민(36 mmol) 및 니코티노일클로라이드히드로클로라이드 (30 mmol)이 150 ml 아세토니트릴 중의 4-(아미노메틸)벤젠술폰아미드히드로클로라이드히드레이트(30 mmol)의 현탁액에 추가된다. 트리에틸아민 60 mmol이 조금씩 추가된다. 4-(니코틴아미도메틸)벤젠술폰아미드의 침전물이 180 ml 물 중의 12 ml 에탄올의 용액으로부터 재결정된다. 산물이 vacuo/CaCl2에서 건조된다. 다음에, S-크로로아세틸-t-부틸머캅탄이 Dawson(1947) J. Amer. Chem. Soc. 69:1211에 따른 클로로아세틸클로라이드 및 t-부틸머캅탄을 반응시켜 준비된다. 티올에스테르는 아세토니트릴 125 ml 중의 클로로아세틸티올에스테르의 20 mmol과 니코틴아미드 유도체 10 mmol을 밤새 환류에서 교반하여 얻어진다. 실온에서 방치하여 산물이 결정화된다. 이는 에탄올-물 혼합물로부터 결정화될 수 있다.
주형Ⅱ 및 Ⅲb(여기서, R1은 알킬, -CH3-, -(CH2)n-CH3, -CH(CH 3)2, -C(CH3)3, -아릴, 아릴알킬, -Ph-CH3, 아릴알콕시, -Ph-OCH3, 니트로아릴, Ph-NO2, -(CH2)n-X이고, 여기서 X는 할로겐, -(CH2)n-Cl, -(CH2)n-Br 또는 -(CH2)n-I이다.)에서, 식 R1-C(=O)의 아실기 및 다른 R1 구조로부터 취해진 R1's를 갖는 N-(2-아실티오벤조일)술프아세트아미드는 화합물 44에 기술된 바와 같이 준비될 수 있고, 5-브로모발레릴클로라이드에 대해 R1-C(=O)-Cl를 치환한다.
H 보다는 -CH3인 R2를 갖는 주형Ⅰ 및 Ⅱ에 기초로 한티올에스테르는 전구체, 화합물 2D의 준비에서, 2,2'-디티오디벤조일클로라이드에 대해 2,2'-디티오비 스(3-메틸벤조일클로라이드)를 치환하여 화합물 44 및 45와 동일한 방식으로 준비될 수 있다. 3-메틸 유도체는 Collman and Groh(1982) J. Amer. Chem. Soc. 104:1391-1400의 방법에 따라 제조될 수 있다.
CH3인 R6을 갖는 주형Ⅱ를 기초로 하는 티올에스테르는 술프아세트아미드 대신에, N-메틸-4-(4-니트로벤젠술포닐)아닐린이 Saxena(1989) Arzneim. Forsch. 39:1081-1084에 기술된 바와 같이 사용되고 제조되는 것을 제외하고는 화합물 44 및 45에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
CH3인 R6을 갖는 주형Ⅱ를 기초로 하는 티올에스테르는 2-메틸아미노-N-(4-술프아모일페닐)아세트아미드가 Horstmann(1977) Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 12:387-391에 따라 사용되고 조제된 티올에스테르인 것을 제외하고는 화합물 44 및 45에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
아릴 또는 페닐인 R6을 갖는 주형Ⅱ를 기초로 하는 티올에스테르는 술프아세트아미드 대신에, Gaind, Sehgal and Ray; J.(1941) Indian Chem. Soc. 18:209에 기술된 바와 같이 제조된 N-페닐글리실-술프아닐산아미드를 사용하는 것을 제외하고, 화합물 44 및 45에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있는 티올에스테르의 제조 및 합성.
바이러스 아연 핑거, 특히, HIV-1 NCp7의 뉴클레오캡시드 단백질에서 아연 핑거는 본 발명의 새로운 티올에스테르를 제조하기 위해 모델로 사용된다. NCp7은 보조 리간드와 바람직한 상호작용이 일어날 수 있는 그들의 용매 접근 표면에 영역을 갖는다. 각 아연 핑거는 두 개의 효과적인 고 친화성 결합 부위를 갖는다. 하나는 핑거1의 Phe17 및 핑거2의 Trp37 가까이에 추정의 mRNA 결합 부위를 포함한다. 다른 부위는 추정의 mRNA 부위에 상반하는 각 핑거의 금속 결합 히스티딘 근처이다. 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있는 새로운 티올에스테르의 제조를 위해, 추정의 mRNA 결합 부위에 상반하는 리간드 결합 부위가 두 개의 보조 결합 부위 중 더 견고한 것으로 고려된다. 이 결합 부위들은 가능한 소수성 및 친수성 원자형의 범위로 조사된다.
NCp7과 리간드(제)의 상호작용에 대한 모델링 연구는 디설파이드벤즈아미드(DIBAs) 및 벤조이소티아졸론 유도체(BITAs)가 각 핑거에서 친핵성 시스테인 황 원자와 근접한 위치로 이 작용제 들의 반응성 그룹이 향하도록 하는 방법으로, 두 개의 레트로바이러스 Zn 핑거의 표면에 소수성 부분과 상호작용 할 수 있다는 것을 제안한다. 반대로, DIBAs는 입체적 배제 때문에 전사 인자 GATA-1의 Zn 핑거에서 시스테인 황 원자와 상호작용할 수 없다(Huang(1998) J. Med. Chem. 41:1371-1381). 디설파이드 및 그들 각각의 BITA 유도체가 제조, 합성 및 정제되었고, 항바이러스 및 시험관내 NCp7 아연 방출 활성이 평가된다.
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디설파이드와 합성적으로 가능한 화합물 1 내지 36의 BITA 형이 합성되고(표1 내지 4), 그들의 항바이러스 활성이 XTT 세포보호 분석에서 평가되었다(하기 기술).
이 연구를 위해, 생성된 모든 화합물들은 본질적으로 어느 정도의 항바이러스 활성(XTT 세포보호 분석) 및 아연 핑거 반응성을 갖는다. 아연 핑거 반응성은 Zn 특정 형광색소, TSQ, N-(6-메톡시-8-퀴놀릴)-p-톨루엔술폰아미드, 분석 또는 Trp37 아연 핑거 형광 분석을 사용하여 측정된다. 재조합 HIV-1 NCp7 단백질의 C-말단 핑거의 Trp37 잔기의 형광 측정은 Rice(1995) Science 270:1194-1197; Rice(1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41:419-426에 기술된 바와 같이 실시된 다. 양쪽 핑거로부터의 Zn 방출의 측정은 Rice(1996) J. Med. Chem. 39:3606-3616에 의해 기술된 바와 같이 Zn-선별 형광색소 탐침 TSQ(Molecular Probes, Eugene OR)을 사용하여 측정된다. HIV-1 RNA 패키징 부위와 유사한 44 머:GGC GAC TGG TGA GTA CGC CAA AAA TTT TGA CTA GCG GAG GCT AG(서열 번호:1)의 DNA 올리고머에 결합하는 NCp7 결합력의 측정은 Huang(1998) J. Med. Chem. 41:1371-1381, Rossio(1998) HIV Pathogenesis and Treatment: Keystone Symposium on Molecular and Cellular Biology, Abstract#4082에 기술된 바와 같이 실시된다. 간단히, 50 nM NCp7은 10% 글리세롤 및 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5)를 함유하는 10 ml 완충액에서 1시간 동안 실온에서 시험 화합물로 처리된다. 라벨 올리고머(0.1 피코몰, 엔드 라벨[32P])가 10% 글리세롤, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 400 mM KCl 및 40 mM MgCl2를 함유하는 완충액의 동일한 양으로 추가된다. 그 반응은 실온에서 15분 동안 진행되고, 전체의 5 ml(또는 총 반응양의 1/4)이 0.5X 트리스-Borate 전기영동 완충액에dml 비변성 4.5% 폴리아크릴아미드겔에서 분리된다. NCp7-올리고머 복합체는 자기방사법(autoradiography)에 의해 시각화된다.
새로운 디설파이드-계 유사물 중에서, 화합물 26, 31 및 34는 316 μM의 높은 시험 투여에서 독성을 보이지 않았고, 각각 4.3, 12.2 및 12.3 μM의 EC50(바이러스 복제를 50% 억제하는 농도)을 나타내었다. 화합물 26을 생성하기 위해 사용된 아미노페닐 치환형은 DIBA의 리간드 부분을 비스(4-아미노페닐)술폰으로 전환했다. 화합물 26의 N-아세틸화는 더 낮은 EC50(1.5 μM)과 더 높은 독성(160 μM)을 갖는 화합물 26을 생성한다.
화합물 26의 비스(아미노페닐)술폰 브리지의 술폰아미도기로의 전환 및 말단 아민의 제1차 술폰아미드로의 변화는(화합물 22, 표1) 더 높은 세포 독성(43 μM)을 야기한다. 일반적으로, 디설파이드/BITA 쌍이 합성될 수 있는 위치에서, 주로, 항바이러스 효과의 손실, 즉, 증가된 EC50 값 때문에 시험관내 치료 지표(IC50/EC50 )에서 평균 4배(n=15, 1.5 내지 8배의 범위) 떨어진다. 증가된 세포 독성은 없다. 새로운 디설파이드 또는 BITAs 중 어느 것도 화합물 1에 비해 우수하지 않다.
분자적 모델링은 NCp7 Zn 핑거 원자 표면 결합 도메인 위의 더 적합한 약제가 화합물 1의 벤즈아미도 헤드 그룹 및 벤젠술폰아미드 리간드 그룹 사이의 백본에서 메틸렌(화합물 23) 또는 에틸렌(화합물 24)의 추가에 의해 이루어질 수 있다(표2). 항바이러스 활성 및 Zn 핑거 반응성은 유지되나 이들 변형은 페어렌탈 화합물 1과 비교시, IC50이 4 내지 10배 감소(더 독성)를 야기한다. 표2에 나타낸 바와 같이, 상응하는 BITAs는 정제된 NCp7에 대한 반응성이 유지될 지라도, 항바이러스 활성의 상당한 손실을 나타내었다(화합물 23: 42배 감소, 화합물 24: 5배 감소). 또한, 화합물 23에 카바밀기 추가에 의한 헤드 그룹 스페이서의 변형(화합물 25)은 아연 핑거 반응성(RFU/min 7.9 대 3.3)을 나타내나 항바이러스 효과는 감소하였다.
비스(아미노페닐)술폰-계 디설파이드벤자미드의 최적화
디설파이드 헤드 그룹 위에 4,4'-비스(아미노페닐)술폰의 결합은 다른 변형을 위한 합성 위치로서 말단 아민을 갖는 화합물 26을 생성한다. 몇 가지의 아실 변형이 화합물 27, 28 및 29를 생성하고, 이는 증가된 아연 핑거 반응성 및 개선된 EC50을 야기한다. 이런 이점은 IC50에서 감소에 의해 부분적(화합물 27, 29) 및 완전한(화합물 28) 상쇄이다. 이렇게 해서, 화합물 26의 리간드 부분의 말단 연장은 상당히 개선된 항바이러스제를 생성하지 않았다.
화합물 26의 BITA 유도체는 그 성질을 연구하기 위한 충분한 순도 또는 양으로 생산될 수 없었다. 그러나, 화합물 26의 말단 NH2의 NO2기로 교환하여 생산한 화합물 31은 이런 점을 극복하고, 디설파이드 및 그것의 상응하는 BITA의 생산이 가능했다(표3). 화합물 26처럼 화합물 31의 디설파이드형은 비독성이고, EC50이 2.6배 증가될 지라도(보다 덜 효과적임), 동일한 NCp7 아연 핑거 반응성을 갖는다. 화합물 31의 BITA 형은 항바이러스 활성이 없었다. 니트로방향족기를 갖는 리간드 연장의 촉진은 일반적으로 더 단순한 니트로기 보다 더 낮은 아연 핑거 반응성을 보이는 화합물 32 내지 34를 유도하였다. 화합물 34의 디설파이드 및 BITA형만이 상당한 항바이러스 활성을 보였다.
3,3'-비스(아미노페닐)술폰의 술포닐기의 위치 변화는 이성체, 화합물 35와 36을 생성했다(표4). 이 화합물들은 개선된 항바이러스 활성을 갖는다(화합물 26:화합물 35 - EC50 4.3:1 mM, 화합물 27:화합물 36 - EC50 1.5:0.62 mM). 그러나, 아연 핑거 반응성은 상당이 감소되었다(화합물 26:화합물 35 - 3.3:0.92 RFU/min, 화합물 27:화합물36 - 5.9:2 RFU/min). 게다가, 이 변화는 적어도 3배(더 높은 독성)의 IC50을 감소시켰다. 이렇게 해서, 3,3'-디페닐술폰 이성체는 주요한 이점을 제공 하지 않았다.
디설파이드의 새로운 티올에스테르로 전환
NCp7 아연 핑거에 대한 디설파이드의 작용은 작용제 및 CCHC 시스테인 황 원자 사이의 티올-디설파이드 교환과 관련된다. NCp7과 약의 1/2("단량체"부분) 사이에서 생기는 공유 디설파이드 결합은 NCp7 구조로부터 Zn2+ 이온의 수동적 손실로 아연 킬레이트의 파괴를 야기한다(상기 Rice(1995); 상기 Huang(1998)).
상기 기술된 화합물들 중 어느 것을 사용하는 것보다 더 안정한 결합을 통하여 아연 핑거 시스테인을 공유 변형하기 위해, 새로운 티오에테르가 고안되고 합성되었다. 티오에테르 결합을 만들기 위해, 벤자미드 헤드기의 오르소(ortho) 또는 메타 위치에서 적당한 활성의 SH-선별 알킬레이팅 관능기가 제안되었다. 단일-리간드형(단량체) 벤자미드는 아미드 또는 티오에스테르 결합을 통하여 효과적인 반응성 할로알카노일기에 결합된다(표5). 화합물 37 내지 39는 오르소 또는 메타벤자미드 위치에 아미드 결합을 나타낸다. 화합물 2의 리간드 형에서 오르소(화합물 37) 또는 메타(화합물 38)에서 Cl-(CH2)2-CO-NH의 치환형은 적당한 아연 핑거 반응성을 갖는 화합물을 생성했다. 그러나, 어느 것도 감지할 수 있을 정도의 항바이러스 활성을 갖지 않았다. 오르소 Cl-CH2-CO-NH-를 갖는 화합물 39는 완전히 불활성이었다. 오르소 아미드 치환된 탐침은 리간드 구조로서 몇 가지의 다른 백본을 사용하여 합성되었고, 동일한 결과를 나타내었다.
오르소 위치된 알카노일, 아로일 및 할로알카노일티오에스테르가 고안되고 합성되었다(화합물 40 내지 52, 표5 및 6). 아세틸(화합물 40), 벤조일(화합물 41), 4-메톡시벤조일(화합물 42) 및 부티로일(화합물 43) 티올에스테르의 합성은 낮은 μM의 EC50 값과 실질적으로 아연 핑거 반응성에 적당한 4개의 화합물을 생성했다. 그러나, 50 μM 범위에서 IC50 값 때문에, 그들의 항바이러스 활성은 BITA 유도체의 그것에 근접한다(표1).
새로운 티올에스테르는 ω-할로알카노일기를 사용하여 합성되었다. 화합물 2, 화합물 44의 오르소 5-브로모발레로일티올에스테르 유도체는 상당히 감소된 세포독성 및 적당한 아연 핑거 활성을 갖는다. 치료 지침은, 또한, 화합물 44를 피리디니오알카노일티올에스테르(PATE) 유도체, 화합물 45로 전환하는 것에 의해 증가된다. 생성 작용제는 효과적인 아연 핑거 반응성(3.6 RFU/min), 316 μM의 높은 시험 투여에서 비독성 및 10 μM 보다 작은 EC50을 증명했다.
표6은 PATEs가 그들의 페어렌탈 화합물 보다 더욱 바람직한 항바이러스 및 독성 프로파일의 화학형으로서 나타낸다. 피리디니오발레로일티올에스테르에 의해 나타난 독성의 결핍은 화합물 2, 31, 34, 27 및 36의 모노벤자미드 백본을 추가하여 각각 새로운 화합물 45, 47, 50, 51 및 52를 생성하는 것에 의해 기술되고, 여기서 페어런트 모노벤자미드의 세포 독성은 모든 경우에서 감소하였다. 화합물 48을 생성하는 화합물 23 백본의 PATE 화학형으로의 전환이 다른 피리디니오발레로일티올에스테르에서 발견되는 순서의 선별 지표(TI)를 생성하지 못하고, 모노벤자미드 독성(화합물 23 BITA 53.7 μM:화합물 48 μM)을 감소시키지 못할 지라도, 피리 디니오발레로일티올에스테르 전환은 부분적으로 디설파이드형과 관련된 독성을 감소시킨다(화합물 23D의 IC50은 19.4 μM: 화합물 48은 55 μM). 이렇게 해서, 티올에스테르 및 특히 PATEs는 바이러스 아연 핑거를 표적으로 하는 새로운 화학치료제로 사용될 수 있는 새로운 화학형을 나타낸다.
피리디니오알카노일티올에스테르(PATEs)의 항바이러스 활성
5-브로모발레로일티올에스테르(화합물 44) 및 두개의 5-피리디니오발레로일티올에스테르(화합물 45 및 47)가 기계적 및 표적-기초 어세이로 분석되었다. 이들 화합물은 HIV-1 인테그레이즈, 역전사 효소 또는 프로테아제 효소 활성을 억제하지 않았다(표7). 재조합 HIV-1 역전사 효소(S. Hughes, ABL Basix Research NCI-FCRDC, Frederick MD)를 사용하는 HIV-1 역전사 효소 rAdT(주형/프라이머)dhk rCdG(주형/프라이머)에 대한 활성 분석이 상기 기술된 Rice(1997)에 의해 기술된 바와 같이 실시되었다. 인공 기판 Ala-Ser-Glu-Asn-Try-Pro-Ile-Val-아미드 (Mutiple Peptide Systems, San Diego CA)을 갖는 HPLC-rlch 방법론을 사용하여 시험 화합물의 존재에서 재조합 HIV-1 프로테아제의 기판의 분해가 상기 Rcie(1997)에 의해 기술된 바와 같이 실시되었다. 시험 화합물의 존재하에서 3-프로세싱과 스트랜드 전이 활성을 수행하기 위한 재조합 HIV-1 인테그레이즈(S. Hughes, ABL Basic Research NCI-FCRDC, Frederick MD)의 활성이 Buckheit(1994) AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:1497-1506, and Turpin(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:487-494에 의해 기술된 바와 같이 실시되었다.
5-브로모발레로일티올에스테르 화합물 44와 두개의 5-피리디니오발레로일티 올에스테르 화합물 45 및 47은 또한 바이러스 부착(세포-기초 p24 부착 분석) 및 숙주 세포에 융합을 억제하지 않았다. 세포-기초 p24 부착 분석은 Rice(1995) Science 270:1194-1197에 기술된 바와 같이 실시되었다. 바이러스 불활성 분석은 Rice(1995) Science 270:1194-1197 및 상기 Turpin(1997)에 약간의 변형을 가하여 기술된 바와 같이 실시되었다. 간단히, MAGI-CCR-5 세포는 평평한 바닥의 2 cm 웰 플레이트에 24시간 동안 플레이트되고(4 × 104 세포/웰), 그 후, 배양 배지가 제거되고, 화합물-처리된 바이러스가 추가된다. 사용된 바이러스는 pNL4-3의 HeLa 세포로 일시적인 트랜스팩션(transfection)에 의해 생성되는 복제 가능한 NL4-3 바이러스에 의해 얻어진다. 바이러스 함유 상층액이 37℃에서 2시간 동안 처리되고, 그 후, 남은 화합물은 원심분리(18,000 ×g, 1시간, 4℃)에 의해 제거된다. 바이러스 펠렛은 재현탁되고, MAGI-CCR-5 단층에 놓이고, 48시간 동안 배양된다. 단층은 고정되고, X-gal 용액으로 염색되고, 파란색의 세포가 카운트된다.
바이러스 융합에 대한 시험 화합물의 효과 측정은 다음과 같이 실시되었다. 간단히, HIV-1 LTR의 제어 하에서 β-갈락토시다제 리포터 유전자를 함유하는 HIV-1 Tat 및 세포 표면 gp120을 안정하게 발현하는 HL2/3 세포와 그들의 세포 표면의 CD4와 CCR5를 안정하게 발현하는 MAGI-CCR-5 세포는 37℃에서 1시간 동안 시험 화합물로 전처리된다. 배양 후, 세포는 4:1 비율(2 × 105 MAGI-CCR-5:8 × 105 HL2/3 세포)로 혼합되고, 37℃에서 18시간 동안 함께 배양되고, 배양액은 고정되고, β-갈락토시다제 활성을 위해 X-gal 용액으로 염색된다. 파란색 세포는 CD4/CCR5 공- 수용체 gp120 상호작용을 통해 HL2/3와 MAGI-CCR-5 세포의 융합에 의존하는 HIV-1 LTR의 Tat 트랜스활성(transactivation)을 나타내었다.
세 개의 모든 티올에스테르 화합물 44, 45 및 47은 상기 기술된 Trp37 분석에 의해 평가된 바와 같이 NCp7 단백질로부터 금속 이온(아연) 방출을 촉진시켰다. 이들 화합물들은 간섭되었고, 이렇게 해서 TSQ 형광색소 분석에서 시험될 수 없었다(표9).
아연 핑거 억제제와 NCp7의 상호작용은 단백질 구조와 HIV-1ψ 패키징 부위를 나타내는 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 그들 능력의 손실을 야기할 수 있다(상기 Huang(1998); Tummino(1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41:394-400; South(1993) Protein Sci. 2:3-19; Dannull(1994) EMBO J. 13:1525-1533). 본 발명의 티올에스테르를 갖는 단백질의 처리 후 이 올리고뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 NCp7의 능력이 시험되었다. 예컨대, 화합물 44, 45 또는 47은 비변성 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동성 이동 시프트 분석(EMSA)를 사용하여 측정된 바와 같이 표적 올리코뉴클레오티드와 결합하는 NCp7의 능력을 억제하는데 매우 효과적이었다. 1 μM에서 화합물 45는 복합체 형성을 억제했다. 화합물 44와 47은 100 μM에서 복합체 형성을 억제했다(표9).
화합물 44, 45 또는 47 결합 활성이 CCHC 아연 핑거에 특이적인지를 확인하기 위해, 화합물로 K562 세포 핵 추출물을 처리한 후 슈퍼 겔 시프트 EMSA가 실시되었다. 이는 Sp1-특이적 항체를 갖는 슈퍼 시프팅이 따른다. Sp1은 그것의 DNA 표적에 결합하는 Sp1에 요구된 전형적인 형태의 CCHH 아연 핑거 모티프의 세 개 복사 체를 포함하는 세포 전사 인자이기 때문에 선택된다. 이 세 화합물 44, 45 또는 47은 그것의 DNA 표적에 결합된 Sp1의 슈퍼 시프팅의 양상을 바꾸지 못했고, 이는 티올에스테르가 CCHC 레트로바이러스 Zn 핑거에 특이적이라는 것을 지시한다. 아연 핑거 반응성 화합물의 특이성을 확인하기 위한 슈퍼겔 시프팅은 Sp1 일치 올리고머(Stratagene, La Jolla, CA), K562 세포 핵 추출물 및 Sp1에 대한 항체(Sp1[PEP2]-G)(추출물과 Sp1 Abs는 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA로부터)를 사용하여 실시되었다. 전기영동 조건 뿐만아니라 K562 핵 추출물과 올리코뉴클레의 결합 반응은 겔 시프트 완충 키트(Stratagene, La Jolla, CA)에 기술된 바와 같이 실시되었다.
본 발명의 티올에스테르 같은 아연 핑거 억제제와 세포가 없는 바이러스의 상호작용은 비리온내 NCp7 단백질의 변형 및 감염성의 손실을 일으킨다. 세포 없는 HIV-1MN으로부터의 비리온 연관 NCp7 단백질은 티올에스테르 화합물 44와 45로 처리되었다. 그들은 또한, HIV-1 NCp7 특이 항체를 사용하는 비-환원 웨스턴 블로팅에 의해 평가되었다. PATE 화합물 45는 NCp7의 연장된 교차결합을 일으키고, 반면, 그것의 할로알카노일티올에스테르 전구체(화합물 44)는 매우 불충분한 교차결합제였다. 화합물 45에 의해 비리온내 NCp7 교차결합은 DIBA-1, 화합물 1과 비교된다. 화합물 45에 의한 교차결합은 2-머캅토에탄올(β-ME)로의 환원이 완전히 겔 지연을 역전하기 때문에, 분자내 디설파이드 결합의 형성이다. 화합물 47은 효과적으로 NCp7 교차결합을 개시하지 않는다. 뉴클레오사이드 역전사 효소 억제제인 AZT는 NCp7을 교차결합하지 않는다(표9).
NCp7 교차결합은 바이러스 불활성과 관련한다. 뉴클레오캡시드 단백질을 교차결합하는 능력은, 웨스턴 블로팅에 의해 측정된 것처럼 세포사멸 분석에서 시험된 바이러스를 불활성화시키는 능력에 관한 것이다. HIV-1NL4-3의 바이러스 스톡(stock)은 다양한 티올에스테르 화합물로 배양된다. 그 바이러스는 복재 가능 pNL4-3 플라스미드를 HeLa 세포로 일시적인 트랜스팩션에 의해 얻어진다. 남은 티올에스테르는 원심분리에 의해 제거된다. 바이러스 펠렛은 배양 배지에서 재현탁되고, MAGI-CCR-5 세포를 감염하는데 사용된다. 48시간 후 감염에서, 세포는 세척되고, X-gal로 염색된다. 화합물 44와 45는 각각 12.3 μM과 13.2 μM의 I50(50% 바이러스 불활성을 유도하는 농도) 값에서 세포사멸된다. 화합물 47이 비리온 내 NCp7의 효과적이 표차결합제가 아닐지라도, 그것은 불활성 바이러스에서 화합물 44와 45 보다 6배(I50=2.1 μM) 효과적이다. 이들 데이터는 티올에스테르 특히, 화합물 47은 분자내 또는 분자간 디설파이드 교차결합의 발생에 작용하지 않는 아연 핑거 황 원자를 갖는 안정한 부가물을 형성한다.
모노벤자미드 백본에 결합하지 않는 5-피리디니오발레린산(화합물 53)의 분석은 항바이러스 활성이 없을지라도, Trp37 아연 방출 분석에서 높은 반응성(4 RFU/min)을 나타내었다(표6).
화합물 53은 또한 NCp7의 비리온 내 교차결합 및 바이러스 사멸 활성에 대해 평가되었다. NCp7의 비리온내 교차결합 또는 바이러스 사멸 활성 중 어느 것도 관찰되지 않았다. 이렇게 해서, 화합물 44, 45 및 47의 모노벤자미드 백본은 세포 없 는 비리온에 대한 활성에 필수적이다.
티올에스테르 화합물은 또한, TNFα 유도 U1과 ACH-2 세포에서 HIV-1 복제를 억제하는 능력에 대해 시험되었다. U1 세포는 티올에스테르 44, 45 또는 47의 다양한 농도에서 TNFα 5 ng/ml로 유도된다. 48시간 후, 배양액은 바이러스 p24 항원 생산 및 세포 생존에 대해 특징지어진다. 세 개의 모든 화합물들은 U1 세포로부터 HIV-1 비리온(p24)의 방출을 억제했다(화합물 44, 45 및 47에 대해 각각 EC50은 94, 42.2 10.7 μM)(표9). 어떤 세포 독성도 100 μM의 높은 시험 투여에서 명확하지 않았다. 세 개의 티올에스테르의 더 높은 투여 시험(300 μM)은 화합물 45와 47에 대해 독성을 나타내지 않았다. 화합물 44는 200 μM에서 세포의 60%를 살해했다. 전기 분리 및 면역블로팅(웨스턴 블로팅)에 의해 TNFα 유도 U1 세포로부터 바이러스 단백질의 가시화는 화합물 45와 47이 바이러스 전구체 폴리프로테인의 교차결합을 유도하고, 이 전구체들의 프로세싱을 억제한다는 것을 나타낸다. β-ME를 갖는 U1 단백질의 감소는 화합물 45(100 μM)과 화합물 47이 Pr55gag 전구체 프로세싱을 억제한다는 것을 나타낸다. 화합물 44는 또한, 화합물 45와 47 사이의 중간 수준에서 HIV-1 전구체 단백질를 함유하는 아연 핑거의 이동에서 β-ME 가역적 변화를 유도한다. 전구체 프로세싱 평가는 Turpin(1997) Antiviral Chem. Chemother. 8:60-69에 의해 기술된 바와 같이 실시된다. 이렇게 해서, 티올에스테르 PATEs는 후기 바이러스 어셈블리 동안 전구체 폴리프로테인의 세포내 디설파이드 교차결합을 개시하고, 세포 없는 바이러스에서 성숙한 NCp7 레트러바이러스 아연 핑거에 공격을 통한 직접적인 바이러스 사멸 효과를 중재한다.
비리온 교차결합은 Rice(1995) Science 270:1194-1197 and Turpin(1997) Antiviral Chem. Chemother. 8:60-67에 의해 기술된 바와 같이 실시되었다. 간단히, 고도로 정제된 HIV-1MN(11.8 ㎍ 총 단백질)이 화합물의 농도로 2시간 동안 배양되었다. 비리온은 농축되고, 나머지 화합물은 원심분리(18,000 × g, 1시간, 4℃)에 의해 제거된다. 바이러스 펠렛은 0.5 M 트리스-HCl(pH 6.8), 50% 글리세롤, 8% SDS 및 0.4% 브로모페놀블루에서 용해되고, 단백질은 웨스턴 블로팅에 의해 분석된다. 비리온 교차결합 실험을 위한 U1 세포 또는 바이러스 펠렛에서 HIV-1 단백질의 발현을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅은 Turpin(1996) J. Virol. 70:6180-6189에 의해 기술된 바와 같이 실시되었다. 간단하게, NCp7 교차 결합 연구를 위한 U1 실험 또는 총 비리온 펠렛(11.8 ㎍ 총 바이러스 단백질)에 대한 총 세포 단백질 50 ㎍이 트리스-글리신(Novex, San Diego CA)을 갖는 SDS 중의 4 내지 20% 폴리아크릴아미드겔에 용해된다. 환원겔을 위한 샘플은 로딩 전에 5% β-ME에서 5분 동안 가열된다. 용해된 단백질은 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 막에 전기 블롯되고, HIV-1 특이적 단백질은 비리온 단백질만을 위한 염소 항-HIV-1 NCp7과 p24 또는 항-NCp7의 혼합물을 사용하여 검출되었다(a kind of L. E. Henderson, AIDS Vaccine Program NCI-FCRDC, Frederick, MD). 웨스턴 블롯은 Dupont-NEN Wilmington DE에 의해 생산되고 기술된 표준 화학발광 방법을 사용하여 현상된다.
티올에스테르의 하나의 중요한 특징은 생체내 생물학적 용액의 환원 환경에서 아연 핑거 반응성을 유지하는 능력이다. 이 특징은 예컨대, 생리적 조건하에서 글루타치온에 의한 환원에 화합물의 저항을 시험하여 평가될 수 있다. 이 환원에 대한 저항성은 모든 디설파이드 함유 화합물에 상당한 개선이다. 예컨대, DIBAs의 디설파이드 본질은 그들을 환원 조건에서 타고나게 불안정하게 만든다. 이는 다이머에서 단량체 형으로의 해리 및 혼합된 디설파이드를 야기한다.
티올에스테르 PATE 화합물 44, 45 및 47은 글루타치온 2 몰라 이상에서 시스테인티올을 공격할 수 있는 효능을 유지한다. 이렇게 해서, 화합물 44 또는 5-피리디니오발레로일티올에스테르, 화합물 45와 47과 같이 낮은 친핵성 5-브로모발레로일티올에스테르로의 디설파이드의 전환은 환원제에 상당한 저항성을 제공하고, 이렇게 해서, 아연 핑거 반응성의 연이은 손실을 막는다(표8).
표10에 관하여, PATE 화학형의 활성 프로파일은 카보닐과 피리디니오 모이어티 사이의 알킬 스페이서의 길이에 의존한다(화합물 54, 45 및 55와 비교하여). n=4 스페이싱은 효과와 독성에 대해 최적인 것으로 보인다. 티올에스테르 황의 필수적 존재는 황이 -NH-에 의해 대치되는 불활성 화합물 56에 의해 확인되었다. 피리디니늄환에서 수소 메타에어 질소에 대해 클로린의 치환은 항바이러스 효과를 감소시키고, 이는 클로로기와 NCp7의 잔기 39와 49 사이의 정전기적 상호작용(반발) 때문이다.
아연 핑거 모티프로부터 금속 이온의 해리 검출
본 발명은 아연 핑거 모티프로 킬레이트된 2가 이온을 해리할 수 있는 화합물을 선택하는 방법 및 키트를 제공한다. 상기 모티프가 바이러스 단백질 또는 비리온의 구조로부터 분리될 수 있다. 상기 방법은 티올에스테르와 아연 핑거의 접촉과 아연 핑거 단백질로부터 금속 이온의 해리를 검출하는 것을 포함한다. 양이온은 주로 아연이다. 종래 공지된 방법이 금속 이온의 해리를 검출하는데 사용될 수 있다. 예시적 수단은, 예컨대, 모세관 전기영동, 면역블로팅, 핵자기 공명(NMR), 고압 액체크로마토그라피(HPLC)를 사용하여 방사성 아연-65의 방출 검출, 형광 검출 또는 겔 이동 시프트 검출 및 다른 기술을 포함한다. 이들 과정은 과학 문헌이나 특허 문헌에 개시된 종래 공지된 프로토콜로 실행될 수 잇다. 몇 가지 예가 하기에 기술된다.
본 발명은 또한, 시험관내에서 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있는 새로운 티올에스테르의 속을 제공하고, 금속 이온 해리의 검출은 본 발명의 범위 내의 티올에스테르 종을 확인한다. 아연 방출 분석은 본 발명의 범위 내의 티올에스테르를 확인하기 위해 제1 라인 스크린으로 사용된다. 그러한 스크리닝을 위한 한 가지 전략은 항바이러스 활성을 감지할 수 있는 XTT 세포보호 분석과 NCp7 단백질 또는 그것의 Gag 또는 Gag-Pol 전구체의 세포 수준에서 작용할 수 있는 티올에스테르를 확인하기 위한 Trp37 아연 방출 분석을 사용했다.
티올에스테르는 아연 핑거로부터 어느 정도의 양이온을 방출할 수 있는지가 본 발명의 범위 내이다. 사실, 낮은 비율, 즉 낮은 동력학에서 아연 방출할 수 잇는 티올에스테르는 어떤 경우, 특히, 생체내 적용에서 바람직하다. 본 발명의 예시적 "약한 양이온 방출기" 티올에스테르는 Trp37 아연 핑거 형광 분석에 의해 0.86 RFU/min의 아연 방출율을 갖는 화합물 50이다. 그러나, 낮은 방출율(<0.86 RFU/min)을 갖는 티올에스테르는 또한, 본 발명의 범위내이다. "높은" 방출율은 대략 8 RFU/min의 범위이다. <15 μM의 EC50 항바이러스 활성를 갖는 티올에스테르가 바람직한 실시형태로 선택되었다.
모세관대 전기영동(CZE)
레트로바이러스 아연 핑거 단백질은 각각 보통 +2의 전하를 갖는 두 개의 아연 이온과 복합체를 이룬다. 단백질과 반응하고, 아연 이온을 제거하는 시약은 단백질의 형태 및 전하의 변화를 일으킨다. 이렇게 해서, 반응된 단백질의 전기영동성 이동은 반응하지 않은 단백질의 이동과 다르다. 단백질의 전기영동성 이동에서 변화는 모세관대 전기영동(CZE)의 표준 기술에 의해 쉽게 검출될 수 있다. CZE에 대한 일반적인 기술은 Capillary Electrophoresis Theory and Practice(Academic Press, Inc, Grossman and Colburn(eds.)(1992)에 기술되어 있다.
일반적으로, 단백질의 전기영동성 이동(모세관 전기영동관에서 완충액에 의해 결정된 pH에서)은 고정된 개시 위치로부터 한 개의 전극을 향하는 레트로바이러스 단백질을 이동시켜 사용된다. 이동률은 UV 흡광도, 예컨대, 215 nm에서 감지될 수 있다. CCHC 아연 핑거 불활성에 대해 시험될 티올에스테르 화합물을 함유하거나 함유하지 않은 선택의 레트로바이러스 NC 단백질을 포함하는 적당한 양의 용액을 함유하는 샘플관이 자동 샘플 분사장치에 놓인다. 소정의 간격으로, 샘플은 모세관으로 들어가서 UV 흡광도가 감지된다. 변형되지 않은 레트로바이러스 NC 단백질은 감지기를 통과하여 이동하는 단백질의 날카로운 선을 나타낸다. 선택의 시험 화합물과 반응하여 야기된 단백질의 변형은 반응된 단백질의 전기영동성 이동에서의 변화에 의해 나타낸다.
모세관대 전기영동은 많은 다른 샘플이 로딩될 수 있고, 연속 작동하여 분석 할 수 있기 때문에 단순 자동의 이점을 갖는다. 각 작업은 약 10분을 요구하고, 각 샘플은 반복해서 분석될 수 있다. CCHC 아연 핑거 반응성에 대해 시험될 선택된 화합물의 분석을 위한 CZE를 사용하는 키트의 예는 물 1.0 ml 중의 아연과 복합체르 이룬 정제된 레트로바이러스 NC 단백질 약 100 ㎍을 포함하고, 대략 1000 시험 화합물의 시험을 위해 사용된다.
아연-65 라벨 NCp7로부터 방사능 아연의 방출
정제된 HIV-1 NCp7은 측정된 특이적 활성을 갖는 방사성 아연-65로 재구성될 수 있다. 레트로바이러스 NC 단백질을 갖는 시험 화합물의 반응에 의해 야기된 방사성 아연-65의 방출의 감지를 통해 시험 화합물의 반응성을 결정하는 것이 가능하다.
티올에스테르 시험 화합물은 방사성 아연-65로 복합체를 이룬 NC 단백질을 함유하는 용액에 추가될 수 있다. 반응에 이서, 단백질(반응된 및 반응되지 않은)이 예컨대, 종래의 공지된 항체를 사용하는 면역침전 또는 면역흡착 방법 또는 NC 단백질이 핵산 기질 위의 결합 부위를 포화시키는 정해진 양의 핵산 추가로 침전될 수 있다. 낮은 이온 강도 조건에서, 포화된 단백질-핵산 복합체는 원심분리에 의해 제거될 수 있는 침전물을 형성한다. 또한, 라벨 뉴클레오캡시드 단백질이 고체 기판에 부착될 수 있고, 시험 시약이 직접적으로 부착된 단백질에 추가될 수 있다. 단백질로부터 아연을 방출하는 반응은 방사성 아연-65의 용해성 상층액으로의 방출에 의해 검출될 수 있다. 이 일반적인 과정은 유용한 장치에 의해 자동화 될 수 있다.
레트로바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 및 적당한 침전제를 제공하는 키트가 단백질로부터 아연을 제거하는 시험 화합물의 효능을 검출하는데 사용될 수 있다.
아연-65 라벨된 전체 바이러스로 부터 방사성 아연의 방출
아연은 CCHC 아연 핑거 어레이와 거의 화학량론적인 양으로 바이러스에 존재한다(Bess(1992) J. Virol. 66:840). 거의 모든 아연은 CCHC 어레이에서 결합된다(Summers(1992) Protein Science 1:563). 그러므로, 바이러스로부터 방출된 아연은 관계없는 단백질 또는 비리온과의 다른 비-특이적 관계로부터 보다는 이전에 CCHC 어레이에 결합된 아연으로부터 기원된다.
정제된 바이러스는 추가된 아연-65의 하에서 배양된 세포로부터 생산될 수 있다. 라벨 바이러스는 결합되지 않은 아연을 제거하기 위해 추가된 EDTA의 존재에서 밀도차 원심분리에 의해 분리되고 정제될 수 있다. 정제된 바이러스는 HIV-1, HIV-2 또는 SIV를 포함하나 이에 제한되지 않고, 관심의 레트로바이러스일 수 있다.
시험된 화합물(본 발명의 티올에스테르)은 선택의 시험 화합물을 위한 적당한 조건에서 정제된 방사능 바이러스에 추가될 수 있다(Rice(1993) Nature 361:473-475). 시약의 제거 및/또는 불활성의 반응에 따라, 바이러스가 비이온성 시약(예컨대, 트리톤 X-100)의 추가에 의해 붕괴되고, 핵산에 복합체를 이루고 있는 NC 단백질을 함유하는 바이러스 중심은 원심분리에 의해 제거된다.
상층액으로 방출된 방사성 아연-65는 시험 화합물이 손상되지 않은 바이러스를 통과하고, NC 단백질-아연 복합체를 붕괴하는 것을 지시한다. 어느 시험 화합물이 레트로바이러스 NC-킬레이트 아연을 제거할 수 있는 지를 확인하는 키트는, 예컨대, 그들의 NC 단백질, 적당한 반응 완충액 및 비이온성제에 결합된 방사성 아연-65를 갖는 손상되지 않은 레트로바이러스 입자를 포함한다.
단백질로부터의 아연 해리의 형광을 기초로 한 검출
방향족 단백질 모이어티의 고유의 형광에서 변화는 일반적으로 단백질 형태에서 변화를 수반하는 반응을 감지하는데 사용된다. 본 발명에서, 형광은 본 발명의 티올에스테르와 접촉 후, 형광이 아연 핑거로부터의 금속 이온의 손실, 즉, CCHC 레트로바이러스 아연 핑거 단백질로부터의 아연 손실을 감지하는데 사용될 수 있다. HIV-1 NC 단백질의 제2 아연 핑거에서 Trp37의 고유 형광은 아연 핑거 복합체의 핵산 결합 및 형태를 감지하는데 사용된다(상기 Summers(1992)).
아연 방출은 단백질의 내부 위치에 노출된 것으로부터 트립토판 37 잔기의 이동 때문에 형광의 손실을 일으키는 정제된 NCp7 단백질에서 시스테인을 화학적으로 공격하는 화합물의 효능에 의해 측정된다. 아연 방출은 30 분 분석 동안 총 형광에서의 비율 감소 또는 분당 상대 형광 단위(RFU/min)에서 감소로 측정되고, 나타낸다. 티올에스테르가 어느 정도의 아연 방출이 검출되는 지가 본 발명의 범위내로 고려된다. 예컨대, 화합물 50은 0.86 RFU/min의 아연 방출율을 갖는다.
인공 형광 탐침은 또한, 형태에서 변화를 검출하기 위해 제공되는 단백질에 결합될 수 있다. 예컨대, 폴리에티노-아데닌이 티올에스테르-아연 핑거 상호작용의 범위를 측정하기 위한 형광성 뉴클레오타이드로 사용될 수 있다.
결국, 방출된 아연과 복합체를 형성하는 종래의 형광성 아연 킬레이터가 아 연 손실을 감지하는데 사용될 수 있다. CCHC 핑거 어레이로부터 아연의 방출을 감지함으로써, 주어진 시약의 효과가 측정될 수 있다(Rice(1996) J. Med. Chem. 39:3606-3616; Rice(1996) Science 270:1194-1197).
겔-이동 시프트 분석에 의해 디설파이드 교차결합된 NC 단백질의 검출
바이러스의 정제된 NC 단백질에 대한 정제 농축된 레트로바이러스 및 항혈청은 바이러스를 통과하는 특이적 화합물의 효능을 시험하고, 바이러스의 중심에 디설파이드 복합체를 형성하는 것에 의해 NC 단백질과 반응하는데 사용될 수 있다. 화합물은 화합물에 적당한 반응 조건에서 전체 레트로바이러스와 혼합된다. 바이러스는 원심분리에 의해 시약으로부터 제거되고, 예컨대, 2-머캅토에탄올을 갖거나(환원된) 또는 갖지 않는(비-환원된) 표준 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 분쇄된다. 그리고 바이러스 단백질은 표준 SDS-PAGE에 의해 분리되고, 샘플은 비환원된 샘플에서 단량체의 아연 핑거가 존재하는지 그렇지 않은지에 대해 조사되었다. 전기영동의 실험 및 조건에서 사용된 바이러스에 의존하여, 아연 핑거 단백질이 단백질 염색 방법 또는 면역블롯 방법에 의해 가시화될 수 있다. 아연 핑거 복합체를 공격하고, 디설파이드 교차결합된 산물을 형성하는 것에 의해 아연 핑거 단백질과 반응하는 화합물은 바이러스를 불활성시킨다. 이렇게 해서, 본 발명의 티올에스테르를 포함하는 관심의 화합물(즉, 교차결합을 일으키는 화합물)은 검출된 단량체의 아연 핑거 단백질의 양을 감소시킨다. 예컨대, 티올에스테르 화합물 45는 웨스턴 블로팅에 의해 검출된 바와 같이 단량체 NCp7의 완전한 손실을 일으키는 비리온내 NCp7의 강한 교차결합제이다.
티올에스테르 처리된 비리온은 또한 감염성에 대해 시험될 수 있다. 비리온은 배지에 현탁되고(용해되기 보다는), 표적 세포에 추가된다. 그 다음, 배양액은 비리온이 여전히 살아있는 지를 확인하기 위해 조사된다. 처리된 바이러스 입자가 살아있는 지를 확인하기 위해, 세포가 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 세포내-합성된 바이러스 RNA의 존재에 대해 감지되었다(Rice(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9721; Turpin(1996) J. Virol. 70:6180). 또한, 세포보호 분석이 사용될 수 있다(Weislow(1993) J. Natl. Cancer Inst. 81:577).
겔 이동 시프트 분석에서 대조군으로 사용될 수 있는 화합물의 예로, 아조디카본아미드(ADA)가 있고, 이는 Aldrich Chemical Company(Milwaukee, WI)의 것을 사용했다. ADA는 또한 상기 기술된 PCR 분석을 사용하여 측정된 것처럼 HIV-1 바이러스를 불활성시킨다.
겔 이동 시프트 개념을 도입한 키트는 손상되지 않은 바이러스를 통과하고, 바이러스 아연 핑거 단백질에서 디설파이드 교차결합을 유도할 수 있는 티올에스테르를 확인하고 연구하는데 사용될 수 있다. 그러한 키트는 예컨대, 정제 농축된 레트로바이러스와 디설파이드 교차결합 때문에 겔을 통하는 이동에서 변화를 감지하기 위한 적당한 크기 표준을 포함한다.
반응 산물의 구조적 특징을 위해 고압 액체크로마토그라피 정제된 NC 단백질
고도로 정제된 레트로바이러스 아연 핑거 단백질은 재조합 DNA 기술을 통하여 발생된 벡터로부터의 발현에 의해 생산될 수 있다. Summers(1992) Protein Science 1:563-567에 의해 기술된 바와 같이, 아연에 의해 재구성된 이들 단백질은 본 발명의 티올에스테르 화합물에 의한 공격에 대한 표적인 아연 핑거를 포함하는 NC 단백질의 근원을 제공한다. 아연 핑거 단백질이 확인된 화합물과 반응 시, 반응은 아연 핑거 단백질에서 공유 변화를 일으키고, 변형된 단백질은 예컨대, 역상 HPLC에 의해, 반응되지 않은 단백질로부터 분리될 수 있다.
정제된 단백질 및 이들 분리 방법은 화학 및 구조적 분석을 위해 충분히 변형 단백질을 얻는데 사용된다. 정제된 반응 산물은 분리되고, 표준 N-말단 에드만(Edman) 분해에 의해 그들의 구조가 결정된다. 그러나, 어떤 특정 시약에 대해, 농도 및 HPLC 조건은 NC 단백질 및 반응 산물에 의존할 것이다.
이 과정은 HIV-1 아연 핑거와 반응하는 티올에스테르 화합물을 확인하는데 사용된다. 제시된 데이터에 대한 반응 조건 및 HPLC 조건은 상기 기술된 것과 유사하다.
이 기술을 표준화하는 키트가 예컨대, 정제된 레트로바이러스 아연 핑거 단백질을 포함하는 형태로 제작될 수 있다.
아연 손실의 핵자기 공명을 기초로 한 검출
NMR은 레트로바이러스 아연 핑거 단백질로부터 아연의 손실을 감지하는데 사용될 수 있다(Rice(1993) nature 361:473-475; McDonnell(1997) J. Med. Chem. 40:1969; Rice(1997) Nature Medicine 3:341-345). 기술 중 어느 하나는 단백질 리간드 상호작용을 감지하기 위한 NMR의 일반적인 기술 및 그것의 많은 적용과 유사하다. 간단하게, 아연에 결합된 레트로바이러스 아연 핑거 단백지에서 원자는 아연 이 없는 아연 핑거 단백질 보다 다른 국부적인 환경을 공유한다. 국부적 환경에서 차이는 그렇지 않은 것에 대하여 아연과 결합하는 단백질 분자를 위한 독특한 NMR 스펙트라를 유도한다. 예컨대, 금속 이온-킬레이트된 아연 핑거 단백질 및 본 발명의 화합물을 포함하는 샘플의 양자(1H) 스펙트럼을 오랜 시간 조사하여, 화합물이 단백질이 그것의 아연 이온을 방출하도록 유도하는 지를 측정하는 것이 가능하다.
NMR이 오랜 시간 동안 아연에 결합된 단백질 분자의 비율을 제공하는데 사용될 수 있기 때문에, 주어진 반응의 반응 동력학을 한정하기 위해 이 기술을 사용하는 것이 가능하다. 유사하게, NMR은 핵산 복합체에 아연 핑거 단백질의 결합에 의존하여 시험 화합물의 효능을 감지하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 정제된 레트로바이러스 아연 핑거 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 키트가 이 방법의 실시를 표준화하는데 사용될 수 있다.
티올에스테르 항-바이러스 활성을 측정
티올에스테르가 항바이러스 활성을 나타내는 지(즉, 바이러스의 전이 또는 복제력을 감소시키거나 줄이는 능력)는 본 발명의 범위내이다. 항바이러스 활성은 임상적 관찰에 의해 경험적으로 또는 생체내 또는 시험관내 시험 또는 분석, 예컨대, XTT 세포보호 분석을 사용하여 Tat-유도 활성(HeLa-CD4-LTR-β-gal(MAGI 세포) 분석에서와 같이 예컨대, Tat-유도 β-갈락토시다제 활성을 검출하는 (Tokunaga(1998) J. Virol. 71:6257-6259) 등을 측정하여 확인될 수 있다. 측정 가능한 항바이러스 활성의 범위를 갖는 티올에스테르는 금속 이온 해리가 검출되지 않을지라도, 본 발명의 범위 내에 속한다.
항바이러스 활성을 측정하기 위한 예시적 수단은 Rice(1993) PNAS 90:9721-9724 및 Rice(1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41:419-426에 의해 기술된 바와 같이 (XTT(2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐]-5[(페닐아미노)카보닐]-2H-테트라졸리늄히드록사이드) 세포보호 분석을 사용하는 CEM-SS 세포 및 바이러스(예컨대, HIV-1RF)(MOI = 0.01)이다. 간단하게, 세포는 시험 화합물(티올에스테르 및 대조군)의 다양한 희석에서 HIV-1RF(또는 시험될 다른 바이러스)로 감염된다. 배양은 7일 동안 실시된다. 이 기간 동안 보호성 화합물(즉, 항바이러스 활성을 갖는 화합물)을 갖지 않는 대조 배양은 바이러스를 복제하고, 신시티아(syncytia)를 유도하du 약 90% 세포 사멸을 일으킨다. 세포 사멸은 XTT 염료 환원법에 의해 측정된다. XTT는 MTT와 유사한 미토콘드리아 에너지 산출을 측정하는 용해성 테트라졸리늄 염료이다. 덱스트란설페이트(부착 억제제) 또는 3'-아지도-2',3'-디데옥시티미딘, AZT(역전사 효소 억제제)를 사용하는 양성 대조군이 각 분석에 추가된다. 개별 분석은 시스터 플레이트(siste plate) 방법을 사용하는 듀플리케이트(duplicate)에서 실시된다.
50% 세포보호(EC50)의 효과적인 항바이러스 농도 및 50% 세포독성(IC50)을 야기하는 세포 성장 억제 농도가 계산된다.
또한, 바이러스가 항바이러스, 바이러스 전이-억제 활성 및 효능을 시험하기 위해 티올에스테르 또는 티올에스테르 함유 약제 제형을 포함하거나 포함하지 않는 경우에서, 배양액 또는 생체내(동물 모델)에서 성장될 수 있다. 이 개시의 개관에 근거한 기술에 명확한 분명한 분석 또는 동물 모델의 바이러스가 사용될 수 있다(Lu(1997) Crit. Rev. Oncog. 8:273-291; Neildez(1998) Virology 243:12-20; Geretti(1998) J. Gen. Virol. 79:415-421; Mohri(1998) Science 279:1223-1227; Lee(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:939-944; Schwiebert(1998) AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:269-274).
시험관내 분석에 대해, 양성 또는 음성 대조군 화합물에 비교하여 티올에스테르 시험 화합물에서 성장한 배양의 바이러스 로드에서 측정 가능한 감소는 항바이러스, 전이-억제 효과를 지시한다. 일반적으로, 바이러스 로드에서 적어도 30%, 일반적으로 10 내지 90% 사이로 관찰된다. 정의 단락에서 논의된 바와 같이 어떤 적절한 기준이 티올에스테르 조성물 또는 티올에스테르 함유 제형의 항바이러스 표과를 평가하는데 사용될 수 있다.
레트로바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 클로닝 및 발현
본 발명의 새로운 티올에스테르는 시험관내에서, 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리할 수 있다. 아연 핑거 함유 단백질은 본 발명의 방법 및 키트에서 아연 핑거 모티프로부터 금속 이온의 해리를 검출하는데 사용된다. 아연 핑거 모티프와 이 모티프를 함유하는 단백질의 클로닝 및 발현에 대한 일반적인 과정은 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, New York, 1989; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1987)에 기술되어 있다. 핵산, 단백질 및 바이러스 근원을 포함하는 아연 핑거의 서열 및 근원이 예컨대, 전자 데이터베이스를 통해 공개되어 있다(The National Center for Biothechnology Information at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ 또는 The National Library of Medicine at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/).
아연 핑거 함유 단백질을 발현하기 위해 사용된 핵산 조성물은 RNA , cDNA 유전자 DNA 또는 다양한 조합의 하이브리드가 천연 근원으로부터 분리될 수 있거나 시험관내에서 합성될 수 있다. 재조합 DNA 기술이 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 관심의 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 DNA는 발현 벡터로 결찰(ligation)을 위해 적합한 형태로 클론되거나 분리된다. 결찰 후, DNA 절편 또는 삽입물을 함유하는 벡터는 재조합 폴리펩티드의 발현을 위한 적당한 숙주 세포에 도입된다. 그 후, 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 분리된다. 핵산은 변형된 또는 감염된 세포 용해질(lysate) 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 변형된 또는 감염된 전체 세포에 존재될 수 있다. 핵산 서열을 발현 벡터에 서브클로닝, 라벨링 탐침, DNA 잡종(hybridization) 등과 같은 아연 핑거 함유 단백질을 코딩하는 유전자의 핵산 조작을 위한 기술은 상기 Sambrook and Ausubel에 기술되어 있다.
일단 DNAs가 분리되고, 클론되면, 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포 같은 재조합된 세포에서 소정의 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 다양한 발현 시스템에서 종래 공지된 기술이 재조합 생산된 단백질의 발현을 위해 유용하다. 원핵세포 또는 진핵세포에서 단백질의 발현을 위한 다양한 공지된 방법의 상세한 기술은 생 략한다. 요약해서, 폴리펩티드를 코딩하는 자연의 또는 합성 핵산의 발현은 일반적으로 DNA 또는 cDNA를 프로모터(연속성 또는 유도성)에 결합시킴으로서 이루어지고, 발현 벡터로의 결합이 따른다. 벡터는 진핵세포 또는 원핵세포에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 벡터는 전사 및 해독 종결 암호, 개시 서열 및 재조합 폴리펩티들를 코딩하는 DNA의 발현을 조절하는데 유용한 프로모터를 포함한다. 클론된 유전자의 높은 수준의 발현을 얻기 위해, 최소한 직접 전사를 위한 프로모터, 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사/해독 종료 암호를 포함하는 발현 플라스미드를 제작하는 것이 바람직하다.
바이러스 사멸성의 티올에스테르
본 발명은 물질을 오염시키거나 시킬 수 있는 바이러스를 불활성시키는데(티올에스테르에 의해 불활성되는) 효과적인 본 발명의 티올에스테르와 생물 유기화합물 또는 다른 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 이 물질은 혈장, 영양 배지, 단백질, 약품, 화장료, 정자 또는 난자 제제, 세포, 세포 배양액, 박테리아, 바이러스, 식품, 음료와 같은 생물 유기화합물일 수 있다. 그들은 이식 재료 또는 이식 장치(예컨대, 플라스틱, 인공 심장판 또는 관절, 콜라겐), 의학 재료(예컨대, 카테테르 삽입법(catheterization)을 위한 관, 삽관(intubation), IVs) 및 용기(예컨대, 혈액 주머니, 저장 용기) 등의 외과적 또는 다른 내과적 재료일 수 있다. 또한, 본 발명의 티올에스테르는 바이러스 사멸제로 상기 재료 중에 적용되고, 재료의 사용 전에 제거되는 조성물의 형태일 수 있다. 바이러스 사멸성 조성물은 다양한 양으로 본 발명의 다른 티올에스테르의 혼합물을 포함할 수 있다. 예컨대, 티올에스테르는 바이러스 오염의 가능성을 감소시켜 연구자들을 안전하게 해주는 세포 배양액에 추가될 수 있다.
약제학적 제형으로서의 티올에스테르
본 발명은 또한, 본 발명의 티올에스테르를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 이 티올에스테르는 포유류, 특히, 사람에서, 바이러스, 특히, 레트로바이러스 감염의 치료를 목적으로 투여하기 위해 사용된 약제학적 조성물로 사용된다.
본 발명의 티올에스테르는 다양한 방법으로 투여를 위한 약제로 제형화 될 수 있다. 투여의 전형적인 루트는 소화관내 및 비경구를 포함한다. 이들은, 예컨대, 제한 없이, 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 골수내, 심장내, 점액낭내, 경구, 설하낭, 눈, 코, 국부, 경피, 경점막(transmucosal) 또는 직장을 포함한다. 투여 방식은 예컨대, 삼킴, 흡입 또는 표면에 국부 적용(예컨대, 눈, 점막, 피부)을 통할 수 있다. 일반적으로 특정 제형은 특정 투여 방식에 적당하다. 다양한 숙고된 제형은 예컨대, 수용액, 고체, 에어로졸, 리포솜 및 경피 제형을 포함한다. 제형 및 투여의 기술에 대한 상세한 설명은, 예컨대, "Remington's Pharmaceutical Sciences"(Maack Publishing Co, Easton PA)의 최신판 같은 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있다.
1. 소화관내, 비경구 또는 경점막 투여용 수용액
소화관, 비경구 또는 경점막 약 전달을 위한 제형에 사용될 수 있는 수용액의 예로는 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 행크(Hank's) 용액, 링거(Ringer's) 용액, 덱스트로스/식염수, 글루코오스 용액 등을 포함한다.
제형은 완충제, 긴장성 적응제, 습윤제, 세정제 등과 같은 안정성, 전달성 또는 용해성을 증가시키는 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질을 포함할 수 있다. 첨가제는 또한, 살균제 또는 안정화제 같은 추가 유효 성분을 함유할 수 있다. 예컨대, 수용액은 소듐아세테이트, 소듐락테이트, 소듐클로라이드, 포타슘클로라이드, 칼슘클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트 또는 트리에탄올아민올레이트를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 종래의 공지된 멸균 기술로 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성 수용액은 이용을 위해 패키징되거나 동결건조되고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 혼합된다.
수용액은 주사, 특히, 정맥내 주사에 적합하다. 정맥내 용액은 세정제와 지질 같은 유화제를 포함할 수 있다. 수용액은 또한, 강장제로 소화관 투여 및 콧물 또는 눈물 같은 점액성 또는 다른 막에 투여시 유용하다. 조성물은 약 1 내지 100 mg/ml, 더 바람직하게는, 약 10 내지 50 mg/ml의 티올에스테르를 함유할 수 있다.
2. 소화관 또는 경피 전달을 위한 제형
고체 제형이 소화관 투여을 위해 사용될 수 있다. 그들은 알약, 정제, 분말 또는 캡슐 같은 것으로 제형화될 수 있다. 고체 조성물에 대해, 종래의 비독성 고체 운반체가 사용될 수 있고, 이는 예컨대, 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘스테아레이트, 소듐사카린, 탈쿰, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘카보네이트 등을 포함한다. 경구 투여를 위해, 약제학적으로 허용 가능한 비독성 조성물이 이전에 언급된 운반체 같은 일반적으로 사용된 부형제 들의 유효 성분 10 내지 95%로 포함되어 형성될 수 있다.
비-고체 제형은 또한, 소화관(경구) 투여로 사용될 수 있다. 운반체는 예컨대, 피너트 오일, 콩 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등의 석유, 동물, 식물성 또는 합성을 것을 포함하는 다양한 오일로부터 선택될 수 있다(Sanchez, et al., U.S. Patent No. 5,494,936). 적당한 약제학적 부형제는 전분, 셀룰로오스, 활석, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 마그네슘스테아레이트, 소듐스테아레이트, 글리세롤모노스테아레이트, 소듐클로라이드, 건조 분유, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드로부터 합성된 비이온성 방지 공중합체가 또한, 약제학적 부형제로 사용될 수 있고, 이 형태의 공중합체는 유화, 습윤, 점증, 안정화 및 분산제로 작용할 수 있다(예컨대, Newman(1998) Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 15:89-142).
정제 같은 단위 투여형은 약 50 mg/unit 내지 2 g/unit, 바람직하게는 약 100 mg/unit 내지 1 g/unit일 수 있다.
3. 국부적 투여: 경피/경점막 전달
조직 투여는 또한, 경점막 또는 경피적 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과되는 운반체에 적당한 침투제가 제형으로 사용될 수 있다. 그러한 침투제는 일반적으로 종래 공지되어 있고, 예컨대, 경점막 투여를 위해, 담즙 염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 게다가, 세정제는 투과를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 경점막 투여는 예컨대, 코 스프레이를 통하여, 또는, 좌약이 사용될 수 있다.
국부적 투여를 위해, 작용제가 연고, 크림, 살브(salves), 분말 및 겔로 제형화될 수 있다. 한 실시형태에서, 경피 전달제는 DMSO이다. 경피 전달 체계는 또한, 예컨대, 천을 포함할 수 있다.
티올에스테르는 또한, 지속 전달 또는 지속 방출 메커니즘으로 투여될 수 있고, 이는 내부로 제형을 전달할 수 있다. 예컨대, 조성물의 지속적 전달이 가능한 생물분해성 마이크로스피어 또는 캡슐 또는 다른 생물분해성 중합체 형태가 본 발명의 제형에 포함될 수 있다(Putney(1998) Nat. Biotechnol. 16:153-157).
4. 흡입에 의한 제형 전달
흡입을 위해, 티올에스테르 제형이 건조 분말 에어로졸, 액체 전달 체계, 공기 제트 연무기, 추진제 체계 등을 포함하는 종래 기술을 사용하여 전달될 수 있다(Patton(1998) Biotechniques 16:141-143; 예컨대, Dura Pharmaceuticals(San Diego, CA), Aradigm(Hayward, CA), Aerogen(Santa Clara, CA)에 의한 흡입 전달 체계, 흡입 치료 체계(San Carlos, CA)).
예컨대, 약제학적 제형은 에어로졸 또는 미스트의 형태로 투여될 수 있다. 에어로졸 투여를 위해, 제형이 계면활성제와 산화제를 갖는 미세 분리된 형태로 제공될 수 있다. 계면활성제는 바람직하게는 산화제에서 용해성이다. 그러한 작용제로 대표적인 것은 예컨대, 지방성 다가 알코올을 갖는 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테아린산, 올레산 같은 6 내지 22 탄소 원자를 함유하는 지방산의 에스테르 또는 부분적 에스테르 또는 에틸렌글리콜, 글리세롤, 에리스리톨, 아라비톨, 만니톨, 소르비톨, 소르비톨로부터의 헥시톨 무수물 및 폴리옥시에틸렌 및 이들 에스테르의 폴리옥시프로필렌 유도체 같은 그것의 사이클릭 무수물이다. 혼합된 또는 천연의 글리세리드 같은 혼합된 에스테르가 사용될 수 있다. 계면활성제는 조성물의 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.25 내지 5%를 구성할 수 있다. 제형의 균형은 보통 산화제이다. 액화 산화제는 일반적으로 분위기 조건에서 기체이고, 압력 하에서 압축된다. 적당한 액화 산화제 중에서 부탄과 프로판 같은 5 탄소 이하를 포함하는 저급 알칸이고, 바람직하게는 플루오르화 또는 플로오로염소화 알칸이다. 상기의 혼합물이 또한, 사용될 수 있다. 에어로졸을 제조하는데 있어서, 적당한 밸브가 장착된 용기는 적당한 산화제로 충전되고, 정제 분리된 화합물 및 계면활성제를 포함한다. 이렇게 해서, 이 성분들은 밸브의 작동에 의해 방출될 때까지 증가된 압력에서 존재한다 (Edwards(1997) Science 276:1868-1871).
본 발명의 티올에스테르의 투여를 위한 연무기 또는 에어로졸라이저 장치는 일반적으로 약 1 내지 50 mg/㎥의 흡입된 투여량을 전달한다.
흡입에 의한 전달은 특히, 염증성 성분을 포함하는 호흡기 환경의 치료를 위한 호흡기 조직에 전달하는데 효과적이다.
5. 다른 제형
본 발명의 약제의 제조에서, 다양한 제형 변형이 사용되고 약물동태학(pharmacokinetics)와 생물 분포(biodistribution)를 바꾸기 위해 조작될 수 있다. 약물동태학(pharmacokinetics)와 생물 분포를 바꾸는 다수의 방법이 종래 공지되어 있다. 약물동태학의 일반적인 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Chapters 37-39에 기술되어 있다.
6. 투여
본 발명의 티올에스테르는 바이러스 감염, 특히, 레트로바이러스 감염의 치료 및 억제에 사용된다. 이를 이룰 수 있는 적합한 티올에스테르의 양을 "치료적 유효선량"으로 정의한다. 투여 스케줄 및 효과적 량, 즉 "투여 요법"은 투여의 빈도, 질환의 단계, 질환의 심각한 정도, 환자 건강의 일반적 상태, 환자의 신체 상태 나이 등을 포함하는 다양한 요인에 종속한다. 환자를 위한 투여 요법을 결정하는데 있어서, 투여 방식을 또한 고려해야 한다.
투여 요법은 또한 약물동태학, 즉, 티올에스테르의 흡수 비율, 생물학적유용성, 대사, 제거율(clearance)을 고려해야한다(Remington's edition 최신판).
조성물의 일회 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택된 투여량과 방식으로 실시될 수 있다. 어떤 경우에도, 약제 제형은 환자를 효과적으로 치료할 수 있는 충분한 양으로 제공된다. 본 발명의 티올에스테르의 총 유효선량은 다소 단기간 동안 환약 또는 주입에 의해 일회 투여로 환자에 투여될 수 있거나, 다중 투여가 오랜 기간 동안 투여되는 분별된 치료 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있다. 종래 공지된 방법은 본 발명의 티올에스테르의 농도가 전구약물(prodrug) 및 그것의 가수분해 산물의 약물동태학, 환자의 나이 및 전반적 건강 상태, 투여 경로, 투여될 치료의 수 및 의사의 판단을 포함하는 다양한 요인을 근거로 환자에서 유효선량을 얻기 위해 요구된다. 이런 요인들의 관점에서, 전문가가 유효선량을 특정 이용을 위해 제공하기 위해 투여를 조절한다.
본 발명의 티올에스테르를 포함하는 백신 제형
본 발명은 또한, 분리되고, 불활성화된 바이러스를 제공하고, 여기서, 바이러스는 바이러스를 본 발명의 티올에스테르와의 접촉을 포함하는 방법에 의해 불활성화되고, 상기 바이러스와 상기 화합물의 접촉이 상기 바이러스를 불활성화시킨다. 한 실시형태에서, 분리되고, 불활성화된 바이러스가 또한 백신 제형을 포함한다. 본 발명의 백신 제형은 또한, 분리된 티올에스테르-복합 바이러스 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 티올에스테르-복합 불활성화된 바이러스는 포유류, 특히 사람에게 바이러스 질환, 특히, HIV-1 같은 레트로바이러스 감염을 치료하고, 면역성을 일으키기 위한 투여에 유용한 백신 제형으로 사용된다. 백신 제형은 일회 투여 또는 연속 투여가 가능하다. 연속일 겨우, 초기 투여에 이어 접종이 면역 반응을 증가시키기 위해 주어지고, 이를 부스터(booster) 접종이라고 한다.
본 발명의 백신은 티올에스테르-복합 불활성 바이러스의 면역원성의 유효선량을 유효 성분으로서 포함한다. 유용한 운반체는 종래 공지되어 있고, 예컨대, 사람 혈청 알부민 같은 티로글로불린, 알부민, 파상풍 독소(tetanus toxoid), 폴리(D-리신: D-글루탐산) 같은 폴리아미노산, 인플루엔자, B형 간염 핵심 단백질, B형 감염 바이러스 재조합 백신 등을 포함한다. 백신은 또한, 물, 인산 완충 식염수, 식염수 같은 생리학적으로 허용 가능한 희석액과 일반적인 면역 보강제(adjuvant)를 포함한다. 불완전한 프로인트 면역 보강제(Freund's adjuvant), 알루미늄포스페이트, 알루미늄히드록사이드 또는 백반(alum) 같은 보강 제는 또한 면역 반응을 증가시키는데 효과적으로 사용된다.
티올에스테르 불활성화된 바이러스 및 티올에스테르 복합 단백질의 사용
백신으로서의 사용에 더하여, 티올에스테르 불활성화된 바이러스 및 티올에스테르 복합 바이러스 단백질은 다양한 용도를 갖는다. 예컨대, 티올에스테르 복합 바이러스 단백질 또는 티올에스테르 불활성화 바이러스는 상응하는 항바이러스 항체를 검출하는 시약으로 사용될 수 있다. HIV 같은 바이러스에 감염되는 것을 측정하기 위해 사용된 일반적이 시험은 항바이러스 항체의 존재에 대한 스크린이다. 티올에스테르 불활성화 비리온 또는 티올에스테르 복합 바이러스 단백질이 트래핑(trapping) 항원 또는 대조 항원으로서 이 검출 시험에서 사용될 수 있다(Hashida(1997) J. Clin. Lab. Anal. 11:267-286;Flo(1995) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14:504-511).
티올에스테르 불활성화 비리온 또는 티올에스테르 복합 바이러스 단백질은 X-선 결정화 분석 또는 다른 초미세구조 연구를 위한 결정화 시약 로 사용될 수 있다(Yamashita(1998) J. Mol. Biol. 278:609-615; Wu(1998) Biochemistry 37:4518-4526). 또한, 다양한 생리화학적 실험 및 방법론에서 분자량, pI 또는 다른 대조군으로 사용될 수 있다.
키트 및 장치
추가되는 면으로서, 본 발명은 여기서의 방법 및 장치를 구체화할 수 잇는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 다음의 (1) 기술된 티올에스테르 또는 티올에 스테르 성분, (2) 기술된 방법을 실행 및/또는 티올에스테르 또는 티올에스테르 성분을 사용하기 위한 지시, (3) 하나 이상의 분석 성분, (4) 티올에스테르를 제작 또는 여기서 기술된 방법을 실행하는데 유용한 티올에스테르를 담기 위한 용기, 분석 성분 또는 장치 성분, 및 (5) 패킹징 재료 중의 하나 이상을 포함한다.
다른 면에서, 본 발명은 여기서의 방법 또는 분석의 실행을 위한 화합물, 장치, 장치 성분 또는 키트의 사용 및 또는 여기서 분석 또는 방법을 실행하기 위한 장치 또는 키트의 사용을 위해 제공한다.
티올에스테르의 사용
다른 면에서, 본 발명은 여기서의 방법 또는 분석을 실행하기 위한 티올에스테르 조성물, 바이러스, 불활성화된 바이러스 또는 바이러스 성분, 세포, 세포 배양액, 포유류, 장치, 장치 성분 또는 키트의 사용 및/또는 여기서의 분석 또는 방법을 실행하기 위한 장치 또는 키트의 사용 및/또는 여기서의, 약제로서 바이러스, 세포, 세포 배양액, 조성물 또는 다른 특성의 사용을 제공한다.
본 발명은 다음의 특이적 예를 통해 상세히 기술된다. 다음의 예는 기술적인 의도로 제공되며 어떤 방식으로도 본 발명을 한정 또는 제한하지 않는다.
실시예
예1: 모세관 전기영동
본 발명의 티올에스테르의 금속 이온 방출 효과를 측정하기 위한 예시적 수단으로 모세관 전기영동을 사용한다. NCp7 단백질은 보통 +2 전하를 갖는 두 개의 아연 이온과 복합체를 이룬다. 단백질과 반응하고, 아연 이온을 제거하는 시약은 단백질의 형태 및 전하에서 변화를 유도하는 아연 이온을 제거한다. 이렇게 해서, 반응된 단백질의 전기영동성 이동은 반응되지 않은 단백질의 이동과 다르다. 단백질의 전기영동성 이동에서 변화는 모세관대 전기영동(CZE)에 의해 용이하게 검출될 수 있다.
모세관 컬럼 완충액은 pH 3.0에서 0.001 M의 소듐포스페이트이고, 단백질은 UV 흡광도 215 nm에서 검출된다. 샘플관은 예컨대, 본 발명의 티올에스테르인 아연 핑거 반응성 조성물을 포함하거나 포함하지 않고, pH 7.0에서 물(ml) 당 NCp7 0.25 ㎍으로 구성된 용액의 약 10 ㎕ 이상을 포함할 수 있다. 샘플관은 자동 샘플 분사 장치에 놓인다. 정해진 간격에서, 샘플의 10 ㎕가 모세관 컬럼으로 들어가고, 데이터가 분당 UV 흡강도로 수집된다. 변형되지 않은 p7NC는 약 7.95분에서 감지기를 통과하여 이동하는 단백질의 날카로운 피크를 야기한다. 선택의 시험 화합물과의 반응에 의해 야기된 단백질의 변형은 이 양상에 변화가 생긴다.
모세관 전기영동은 많은 다른 샘플이 샘플 용기에 로딩될 수 있고, 연속해서 작동되기 때문에 단순 자동의 이점을 갖는다. 각 작업은 약 10분 걸리고, 각 샘플관은 여러번 분석될 수 있다.
예2: N-[2-(5-피리디니오발레로일티오)벤조일]-3-아미노프로피온아미드브로마이드(YS1332D- 주형 Ⅵ와 Ⅶ) 및 N-[2-(5-피리디니오발레로일티오)글리신아미드브로마이드(YS1333D- 주형 Ⅴ와 Ⅶ)의 제조
YS1332A, 디설파이드벤자미드 중간체의 합성:
2,2'-디티오디벤조일클로라이드(3.43 g, 10 mmol)이 실온에서 N,N'-디메틸아 세트아미드(DMA; 30 ml) 및 물(5 ml) 중의 β-알라닌아미드히드로클로라이드(NOVA Biochem)(3.1 g, 25 mmol)와 4-메틸모르폴린(NMM; 5 ml, 45 mmol)의 투명한 용액에 추가된다. 혼합물은 30분 내에 투명한 붉은 갈색의 용액으로 변한다. 용액은 3일 동안 실온에서 교반되고, 이때 침전물이 형성된다. 혼합물은 1 M HCl(500 ml)에 추가된다. 생성된 노란 오렌지색 침전물이 수집, 물로 세척되고, 진공에서 건조되어 2.93 g(65%)를 얻는다.
YS1333A는 YS1332A와 유사하게 합성되나 반응 시간은 3일 동안이 아니고, 1일 간이고, 4 g(95%)을 얻는다.
YS1332B의 합성, YS1332A의 티올 중간체로 환원:
DMF(18 ml)와 물(2 ml) 중의 YS1332A의 혼합물에 실온에서 트리스(2-카복시에틸)포스핀히드로클로라이드(1.5 g, 5.2 mmol) 및 트리에틸아민( 0.5 ml)을 추가한다. 혼합물은 5분 이내에 투명한 오렌지색 용액으로 변한다. 1시간 동안 교반하고, 에틸에테르(200 ml)에 추가된다. 침전물이 수집, 물(3 × 20 ml)로 세척되고, 진공에서 건조되어 백색 산물 1.56 g(77%)를 얻는다.
YS1333B는 YS1332B와 동일한 방식으로 제조되어 1.5 g(76%)를 얻는다.
YS1332C, 할로알카노일티올에스테르 중간체의 합성:
DMA(5 ml) 중의 YS1332B(0.8 g, 3.6 mmol)의 용액에 질소 분위기하의 실온에서, 5-브로모발레릴클로라이드(1.4 ml, 10.8 mmol)가 추가된다. 혼합물은 1시간 동안 교반되고, 에틸에테르(80 ml)에 추가된다. 침전물은 수집되어 DMF(5 ml) 중에 용해된다. 용액은 교반하면서 10% 소듐비카보네이트(40 ml; pH=8)에 추가된다. 백 색 침전물이 수집되어 물로 세척되고 건조되어 0.83 g(70%)를 얻는다.
YS1333C는 YS1332C와 동일한 방법으로 제조되어 1.27 g(74%) 얻는다.
YS1332D, 피리디니오알카노일티올에스테르(PATE)의 합성:
피리딘(4 ml) 중의 YS1332C(0.2 g, 0.52 mmol) 용액이 질소 분위기 하에서 밤새 실온에서 교반된다. 혼합물은 에틸에테르(40 ml)에 추가된다. 백색 침전물이 수집, 에테르로 세척되고, 건조되어 0.23 g(95%)를 얻는다.
YS1333D는 반응 혼합물이 하루가 아닌 2일 동안 교반되는 것을 제외하고는 YS1332D와 동일한 방식으로 제조되어 0.22 g(90%)를 얻는다.
예3: N-[2-(5-피리디니오발레로일티오)벤조일]-3-아미노프로피온산브로마이드 (YS1334D)- 주형Ⅵ와 Ⅶ 및 N-[2-(5-피리디니오발레로일티오)벤조일]-L-이소류신브로마이드 (YS1324D) - 주형Ⅴ와 Ⅶ의 제조
YS1334A, 디설파이드벤자미드 중간체의 합성:
2.2'-디티오디벤조일클로라이드(3.43 g, 10 mmol)이 실온에서 N,N'-디메틸아세트아미드(DMA; 10 ml) 중의 β-알라닌-t-부틸에스테르히드로클로라이드(NOVA Biochem)(4.8 g, 25 mmol)과 4-메틸모르폴린(NMM; 5 ml, 45 mmol)의 투명한 용액에 추가된다. 혼합물은 밤새 실온에서 교반된다. 여기에 헵탄(200 ml)이 추가된다. 생성 침전물은 DMF의 작은 양에 용해되고, 1 M HCl(500 ml)에 추가된다. 점성 고체 침전물이 수집, 물로 세척되고, 진공에서 건조되어 5.1 g(91%)를 얻는다.
YS1322A는 5.0 mmol의 개시 디클로라이드 및 그 이상의 L-이소류신-t-부틸에스테르히드로클로라이드로부터 동일한 방식으로 합성되어 디설파이드 3.10 g(65%) 을 얻는다.
YS1334B의 합성, YS1334A의 티올 중간체로의 환원:
DMF(9 ml)와 물(1 ml) 중의 YS1334A(1.8 g, 3.2 mmol)의 용액에 실온에서 트리스(2-카복시에틸)포스핀히드로클로라이드(1.3 g, 4.5 mmol)와 트리에틸아민(0.45 ml)이 추가된다. 혼합물이 1시간 동안 교반되고, 0.5 M HCl(200 ml)에 추가된다. 점성 잔여물이 수집, 물로 세척되고, 진공에서 건조되어 1.24 g(69%)를 얻는다.
YS1324A는 YS1334B와 동일한 방식으로 제조된다. 디설파이드 2.0 g이 티올 1.5 g을 생성한다(75%).
YS1334C, 할로알카노일티올에스테르 중간체인의 합성:
DMA(5 ml) 중의 YS1334B(1.24 g, 4.4 mmol)의 용액에 질소 분위기 하의 실온에서 5-브로모발레릴클로라이드(1.5 ml, 11 mmol)이 추가된다. 혼합물은 1시간 동안 교반되고, 에틸에테르(100 ml)에 추가된다. 용매는 5 ml로 증발되고, 생성 점성 잔여물은 분리, 10% 소듐비카보네이트(20 ml; pH=8)와 물(40 ml)로 세척되고 건조되어 1.6 g(82%)를 얻는다.
YS1324B는 티올 1.0 g으로부터 0.95 g(65%) 생성된다.
YS1334D, 피리디니오알카노일티올에스테르(PATE)의 합성:
피리딘(10 ml) 중의 YS1334C(1.6 g, 3.6 mmol)의 용액이 밤새 질소 분위기하 실온에서 교반된다. 이것이 에틸에테르(200 ml)과 헵탄(100 ml)의 용액에 추가된다. 침전된 상은 메탄올(5 ml)에 용해되고, 에테르(80 ml)와 헵탄(200 ml)의 용액에 추가된다. 침전물은 트리플루오로아세트산(10 ml)과 포름산(3 g)의 용액에 용해 된다. 용액은 밤새 실온에서 교반되고, 질소 증기로 5 ml로 환원된다. 잔여물에 에틸에테르(40 ml)가 추가된다. 침전물은 수집, 건조되어 0.9 g(53%)를 얻는다.
YS1324D는 상응하는 브로모발레로일티올에스테르 0.60 g으로부터 이소류신함유 PATE 0.58 g(58%)를 얻어 생성된다.
상기는 기술의 의도로 제공된다. 상기 기술된 물질, 방법의 단계와 다른 변인 및 키트가 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 변형 또는 대치될 수 있다.

Claims (86)

  1. 하기 식의 화합물:
    Figure 112006049146981-pct00067
    여기서:
    R1은 -Y-Z 이고;
    Y는 -(CH2)m-, 이때 m은 1 내지 6 의 정수이고;
    Z는 하기 구조의 피리디니오(pyridinio) 이고:
    Figure 112006049146981-pct00068
    또한 여기서:
    R12, R13, R14, R15 및 R16은 H, -C(=O)NH2기 및 치환된 카르복스아미도기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2는 H, -CH3기, -C(=O)NH2기 및 -C(=O)OCH3기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    R3, R4 및 R5는 H, 할로겐, -NO2기, -C(=O)ONH2기 및 -C(=O)OCH3기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R6 은 H, 알킬기, -CH3기, 치환된 알킬기, 아릴기, 치환된 아릴기 및 아릴알킬기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    R7, R8, R10 및 R11은 H 이고;
    R9 는 (O=S=O)-G', 이때, G'는 -NH2기, -NH-알킬기, -NH-아실기, 니트로아릴기 및 아릴-NH-아실기 로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
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  6. 제1항에 있어서, m이 정수 4 인 것인 화합물.
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  9. 금속 이온을 아연 핑거를 함유하는 단백질로부터 해리시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 아연 핑거를 제1항의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 아연 핑거를 상기 화합물에 접촉시키는 것이 시험관내(in vitro)에서 수행되는 것인 방법.
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  21. 바이러스의 불활성화 방법에 있어서, 바이러스의 아연 핑거를 함유하는 단백질의 아연 핑거를 제1항의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 바이러스는 상기 화합물과 접촉하고 상기 아연 핑거로부터 금속 이온을 해리시킴에 의해 불활성화되며, 상기 아연 핑거를 상기 화합물에 접촉시키는 것이 시험관내(in vitro)에서 수행되는 것인 방법.
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  55. 항-레트로바이러스 약제의 제조 방법에 있어서, 제1항의 화합물이 약제학적으로 허용가능한 아주반트(adjuvant)에 첨가되고, 상기 화합물은 아연 핑거를 함유하는 단백질의 아연 핑거와 접촉할 때 아연 핑거를 함유하는 단백질로부터 금속 이온을 해리시키도록 설계된 것인 방법.
  56. 제9항, 제21항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 이온은 아연인 것인 방법.
  57. 제9항, 제21항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아연 핑거는 바이러스 단백질을 포함하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 바이러스 단백질은 뉴클레오캡시드 단백질, Gag 단백질, 또는 Gag-Pol 단백질인 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 아연 핑거를 함유하는 단백질은 손상되지 않은(intact) 바이러스에 삽입되는 것인 방법.
  60. 제9항, 제21항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아연 핑거는 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스 그룹, 포유류 B-형 레트로바이러스 그룹, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스 그룹, D-형 레트로바이러스 그룹, 뮤린(murine) 백혈병-관련 그룹 또는 렌티바이러스 그룹으로부터 기원된 레트로바이러스 단백질을 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 레트로바이러스 단백질은 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스로부터 기원된 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 레트로바이러스 단백질은 HIV-1 단백질인 것인 방법.
  63. 제9항, 제21항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아연 핑거로부터의 상기 금속 이온 해리를 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 아연 핑거로부터의 상기 금속 이온 해리의 검출은 모세관 전기영동, 면역블로팅, 핵자기 공명(NMR), 고압 액체크로마토그라피(HPLC), 방사성 아연-65의 방출의 검출, 형광의 검출, 및 겔 이동 시프트(shift)의 검출로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  65. 제55항에 있어서, 상기 레트로바이러스는 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스 그룹, 포유류 B-형 레트로바이러스 그룹, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스 그룹, D-형 레트로바이러스 그룹, 뮤린 백혈병-관련 그룹 또는 렌티바이러스 그룹으로부터 기원인 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 레트로바이러스는 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스인 것인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 레트로 바이러스는 HIV-1 레트로바이러스인 것인 방법.
  68. 제55항에 있어서, 상기 방법은 바이러스를 비-티올에스테르 항-레트로바이러스 제제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 항-레트로바이러스 제제는 뉴클레오티드 유사물 또는 프로테아제 억제제인 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사물은 AZT, ddCTP 또는 DDI인 것인 방법.
  71. 제9항 또는 제21항에 있어서, 상기 레트로바이러스와 상기 화합물의 접촉이 혈액 생산물, 혈장, 영양 배지, 단백질, 약품, 화장료, 정자 또는 난자 제제, 세포, 세포 배양물, 박테리아, 바이러스, 식품 및 음료로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상에서 실시되는 것인 방법.
  72. 제1항에 기재된 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 아주반트(adjuvant)를 포함하는 약제학적 조성물로서 바이러스의 전이를 억제하는 데 효과적인 약제학적 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 혈장, 영양 배지, 단백질, 약품, 화장료, 정자 또는 난자 제제, 세포, 세포 배양액, 박테리아, 바이러스, 식품 및 음료로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 약제학적 조성물.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 항-레트로바이러스 약제인 것인 약제학적 조성물.
  75. 제72항에 있어서, 상기 화합물은 아연 핑거를 함유하는 단백질의 아연 핑거와 접촉할 때 아연 핑거를 함유하는 단백질로부터 금속 이온을 해리시킬 수 있는 것인 약제학적 조성물.
  76. 제75항에 있어서, 상기 금속 이온은 아연인 것인 약제학적 조성물.
  77. 제75항에 있어서, 상기 아연 핑거는 바이러스 단백질을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 상기 바이러스 단백질은 뉴클레오캡시드 단백질, Gag 단백질, 또는 Gag-Pol 단백질인 것인 약제학적 조성물.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아연 핑거는 조류육아종 및 백혈증 레트로바이러스 그룹, 포유류 B-형 레트로바이러스 그룹, 사람 T 세포 백혈병 및 소 백혈병 레트로바이러스 그룹, D-형 레트로바이러스 그룹, 뮤린 백혈병-관련 그룹 또는 렌티바이러스 그룹으로부터 기원된 레트로바이러스 단백질을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 레트로바이러스 단백질은 HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, EIAV, Visna, CaEV, HTLV-1, BLV, MPMV, MMTV, RSV, MuLV, FeLV, BaEV 또는 SSV 레트로바이러스로부터 기원된 것인 약제학적 조성물.
  81. 제79항에 있어서, 상기 레트로바이러스 단백질은 HIV-1 단백질인 것인 약제학적 조성물.
  82. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아연 핑거를 함유하는 단백질은 손상되지 않은 바이러스에 삽입되는 것인 약제학적 조성물.
  83. 제74항에 있어서, 상기 화합물은 바이러스와 접촉되고, 상기 화합물의 바이러스와의 접촉이 생체내에서 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
  84. 제74항에 있어서, 상기 화합물은 질내 또는 직장내로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  85. 제74항에 있어서, 상기 화합물은 약제학적 제형으로 사람에 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  86. 제74항에 있어서, 상기 화합물은 수의(veterinary) 약제학적 제형으로 동물에 투여되는 것인 약제학적 조성물.
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