CZ160391A3 - Rekombinantní protein vázající komplexní virální antigen HIV-1 - Google Patents

Abstract

Rekombinantní protein, vázající komplexní virální antigen HTV-1, způsobjeho výroby, produkce, čištění ajeho použití. Protein obsahuje variabilní regiony humánní anti-HIVprotilátky, spojené linkerem Produkce se provádí v různých prokaryotických, popřípadě euraryotických systémech. Pro čištění se používají biochemické chromatorgaíické metody. Rekombinantní protein se může používat pro detekci, kvantifikaci a čištění antigenu HIV-1.

Description

Oblast techniky !

I

Vynález se týká rekorabinantníhd..pr^t^inďívázajíc?li.o i virální antigen FíIV-1.

Dosavadní, stav techniky

Humánní monoklonální protilátky /mAK/ se dají vyro biti,když se získají B-lymfocyty lidí,kteří vykazují imunitní reakci proti antigenu, získanou například nemocí, a tyto B-lymfocyty se immortalizují fúzí s vhodnými liniemi buněk, zejména liniemi myelorou. Tímto způsobem získané hybridy buněčných linií, hybridomy ,slouží jako produkční vehikulum pro mAK 's. Mohou se používat in vitro ve formě buněčných kultur a kultivovat v potřebném měřítku /Grunow, R.S.,Jahn T., Porstmann S.T.,Kiessig , H. Steinkeller ,P. Steindl, D. Mattanovich, I. Gurtler, P. Deinhardt, H. Katinger , a. R. von Baehr,1989. The high efficiency,human B cell immortalizing heteromyeloma GB-P7 , J. Immunol. Methods 106 : 257/.

Při tom vyrobená látka představuje zpravidla kompletní mAK ,charakterizovanou 2 těžkými řetězci a 2 lehkými řetězci, které jsou navzájem spojeny disulfidovými můstky a nekovalentními vazbami, a dohromady tvoří specificky vázající protilátku /Watson J.D. ,N.H. Ho pkins,J.W.Roberts, J.A. Steitz a A.M.Werner, 1987 , Molecular Biology of the Gene, Vol. 1 and 2, The Benjamin / Cumminge publishing Company,Inc./.

Struktusa takovéto protilátky se dá. rozděliti na konstantní region / oblast /, který je zodpovědný za tak. zvané funkce efektoru , jako například aktivaci komplementu a na variabilní region, který vyvolává specifickou vazbu toho kterého antigenu.

Protilátky lze štěpit enzymaticky biochemickými me-

-2thodami. Například se může část konstatního regionu, odštěpit papainem popřípadě pepsinem. Tímto způsobem vyrobené fragmenty Fab'popřípadě /FabVg jsou schopny vázat dotyčný angigen analogicky jako u původní protilátky / Watson,J.D. N.H. Hopkins, J.W. Roberts,J.A. Steitz and A.M. Weiner,l987 Molecular Biology of the Gene,Vol. 1 and 2 ,The Benjamin /Cumnings Bublishing Company,Inc./. Rovněž proteolytické odštěpena' kompletních konstantních regionů,které vede k tak zvanému Fv fragmentu, bylo již popsáno.Avšak toto se nedá ani zdaleka provádět tak reprodukovatelně jako je tomu u shora zmíněného štěpení protilátek pomocí papainu popřípadě pepsinu . / Inbar , D.J. Hochmann and D, Givol, 1972 Bocalisation of antibody combining sites within the variable portions of heavy and light chains, Broe. Nati. Acad. Sci. USA 69 : 2659-2662 , Hochmann,J.D. Inbar and D. Givol. I973 . An activa antibody fragment /Fv/ composed of the vartable portions of heavy and light chains,Biochemistry 12 : 1130-1135/. Bomocí method genové techniky se ale podaří vyrábět Fv fragmenty reprodukovatelně . K tomuto nutné před poklady jakož i použité methody jsou popsány dále.

Bomocí rutinních method se vyrobí cDNA henka buněčné linie hybridomu produkující mAK. Z hybridomu produkujícího mAk se izoluje veškerá RNA.Tato RNA obsahuje vedle ribosomální RNA celkové množství transkriptů buňky. Jsou přítomny jak neúplně procesované nukleární transkripty,jakož i zralé cytoplasmatické transkripty, tak zvané messengr RNA. Tyto se vyznačují polyadenosinovým chvostem na konci 3*. Tato poly-A-region se může používat k tomu, aby se afinitní chromatografií s oligo-DT-celulózou izolovaly zralé mRNA. Bomocí enzymu reverzní transkřiptázy ” se může RNA přepsat na tak zvanou cDNA. Za použití vhodných vektorů se získaná směs cDNA může klonovat, což vede k tak zvané cDNA bance.

3·

or crC/s i*hi m.ijjui f

I £? I ” I <

..........i

Maniatis T. E.E. Eritsch and J. Sambrook, 1982, Moleoular Cloning, A. Laboratory Manual,Gold Spring Harbor New YorkíCold Spring Harbor laboratory /. Hybridizaění sondy, specifické pro immunoglobulin dovolí identifikací a izolaci klonů, které obsahují požadované sekvence. Sekvencováním DBA těchto klonů a porovnáním sekvencí se známými imunoglobulinovými geny / EMB1 Nuoleotide sequence Data library, Heidelberg, NSR/, lze získat jistotu o identitě klonů. Tímto způsobem lze například izolovat klony, které nesou sekvence lehkého popřípadě těžkého řetězce mAK.

Analýzou sekvencí imunoglobulin-cDNA^ záskan^ tímto způsobem se dají ±y±a identifikovat srovnáním se známými imunoglabulinovými sekvencemi jednotlivé domény těž kého a lehkého řetězce; je možné identifikovat variabilní a konstantní region, a například uvnitř variabilního, regionu tak zvané hypervariabilní ” regiony nebo ®e giony určující komplementaritu ^M, které jsou vlastně zodpovědné za specifické vázání antigenu ./ Kabát Ε.Α.,Τ.Τ. Wu. M. Reid-Miller,H.M. Perry and K.S. Gottesmann, 1987. Sequenee od proteinsof immunological interest, U.S. Depertment of Health and Huraan Services , Public Health Service/.

Tímto způsobem klonované geny ^protilátek se dají v různých systémech přivést k expresi. Používat se mohou jednak zvířecí buněčné kultury, jako například buňky my-, elomu, jestliže se použijí vhodné expresní vektory. /Neuberger,M.S. 1983, Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lyphoid cells , EMBO J.2í 1373-1378 /. Použití kvasinek / Wood C.R. M.A. Boss J.H.Kenten,J.E. Galvert and W.A. Roberts, 1985. The synthesisand in vitro assembly of fuhktional antibodies in yeast, Nátuře /London/ 314: 446-449 /, popřípadě buněk bakterií /Boss.M.A.J.A. Kenten, C.R.Wood and^J.S. Emtage,

-41984. Assembly of functional antibodies from immunoglobulin heavy and light ohains synthesised in E. coli , Bucl. Acids Res, 12 ; 3791 - 3806 / jako expresní vehikulum pro komplexní protilátku je problematické , neboi takovéto buňky nejsou zřejmě schopné přesně synthetizovat pro ně velmi veliké molekuly , jaké představují protilátky . Úspěch v tomto směru se rýsoval teprve tehdy , když se zkoušelo vyvolat ex presi subfragmentů protilátky v malých eurokaryontech po případě prokaryontech. Dále jsou popsány čtyři různé methody , které dovolí expresi Ev popřípadě Rab fragmentů v Esche richia coli.

Skerra a Pluckthun /188, Assembly of a functional immunoglobulin Fv Fragment of Escherichia coli, Science 240 ý 1038 - 1041 / zavádějí geny pro variabilní regiony myší antífosforylcholinové protilátky / McPC603/ v návazností na Bac-promotor/operátor region,sledovanou bakteriální leadrsekvencí , která slouží pro zavední produktů do periplasmatického prostoru bakterií. Při tom se jedná o leadr protein A vnější membrány /cpmA / jakož i alkalickou fos fatázu /phoA/. Po transfekci tohoto plasmidu do Escheri chia coli byla prokázána exprese funkčního , to znamená antigen vázajícího proteinu v periplasmatickém prostoru bakterií.

Better et al. / Better K. P. Chang R.R. Robinson and A.H. Horwitz 1988 . Escherichla coli secretion of an ac tivechiraeric antibody fragment, Science 240 : 1041 - 1043 /> vyrábějí Pab-fragment chimérní myši humánní protilátky , který identifikuje ganglíosid antigenu , který se často nachází na povrchu lidských rakovinnových buněk. Při tom používaná konstrukce plasmidu sestává z promotoru Sal monely typhimurium araB , jakož i pelB leader sekvence vždy před sekvencí kódující právě přítokný řetězec .

Z převrstvení kultury transformovaných bakteriá byly zí skány Fab fragmenty vázající antigen.

-5Pro zajímavost používají jak Skerra a Pltiokthun/L988 Assembly of a functional immunoglobulin Fv Fragment in Escherichia coli,Science 240 : 1038-1041/ a Better et al.

/ Better,M.P. Chang., R.R. Robinson and A.H. Horwitz,l988 Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody Fragment,Science 240 ϊ 1041-1043 / tak zvané dicistronické konstrukce,to znamená takové, u kterých na jedné jediné molekule messenger RNA jsou informace pro oba odděleně exprimující řetězce. Autoři uvádí, že tím je zajištěna prostorová blízkost vznikajících polypeptidovýoh řetězců,které vytváří předpfeklad pro přesné souvislé uložení variabilního regionu těžkého řetězce /V_H/ s regionem lehkého řetězce /V-j-/.

Právě tento problém, totiž vytvoření Fv peptidového heterodiméru / v přírodě není kovalentně vázán/ se pokoušel řešit Huston et al./ Huston J.S. D. levinson, M. Mudgett -Hunter,M.S.Tai, J. Novotný, M.N. Margolius,H,J. . Ridge, R.E.Bruccoleri, E. Haber, R. Crea and H. Opper aann, I988 Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specifio activity in an anti-dioxin single Chain Fv analogue in Escherichia coli,Proč. Nati. Acad.

Sci USA 85: 5879-5883 a Bird et al. / Bird,B.E.K.L. Hardman J.W. Jacobson, S. Johnson, B.M. Kaufman, S.M. Lee ,

I. lee,S.H. Pope,G.S. Riordan and M. Whitlow, 1988 , Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242 : 423426/ jiným způsobem, totiž kovalentním spojením řetězců pomocí spojovací sekvence aminokyseliny,která se v přírodě nevyskytuje. Tato spojovací sekvence vyznačuje tím,že sestává z určitéh8°É^Bekvencí aminokyselin, takže může

by se do konformace zavedl zbytečný stres.

Huston et al., 1988 Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-6τψο digoxin single-chain Ev analogue in Esoherichia coli, Proč,

Nati. Acad. Skí USA 85 : 5879-5883/ spojovali variabilní regiony myší anti-digoxin-protilátky pomocí linlsaru spssjast xs&xfea řetězce 15 aminokyselin sekvence GGGGSGGGGSGGGGS /. Zvolené uspořádání bylo : Vg-linker-V^ . Tento tak zvaný single-chain-Pv fragment / Ev fragment s jednoduchým řetězcem byl expřimován ve spojení s KLE leader sekvencí za kontroly syntetického trp-promotor /operátoru ve formě nerozpustných inkluzních tělísek. Po jejich rozpuštění v 6M HG1, obsahující guanidin a odstranění leader sekvencí kyselou hydrolýzou mezi aminokyselinami Asp a Pro, jakož i po několika chromatografických krocích byl získán aktivní, jednoduchý řetězec / single - chein / Ev fragmentu , který váže antigen .

Jeden ze způsobů, v principu analogický , byl zvolen Birdem et al. / 1988 , Single·» Chain Antigen-Binding Pro teins, Science 242 : 423 - 426 / pro konstrukci myšího proteinu vázajícího antigen,přičemž tento protein váže spéci ficky fluorescein.Tato skupina používala ale linker 18 amino kyselin se sekvencí KESGSVSSEQ1AQEBS1D. Tento linker jg? částí sekvence humánní ” carbonic annydrase ” a byl vybrán z Brockenhavenské databanky struktur proteinů jako smyč ková struktura,která se prostorově přesně hodí pro polohu aminokyselin Ev fragmentu,které se mají spolu vázat. Uspořádání jednotlivých regionů zde bylo jiné než u Hustona et al./ 1988 Protein engineering of antibody binding si tes/ recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Ev analogue in Esoherichia coli , Proč. Nati.

Acad. Sci. USA 05. : 5879-5883/, totiž V^-linker-V-j. .

Výše popsané konstrukce genů pro výrobu fragmentů protilátek v Esoherichia coli se vztahují na myší sekvence popřípadě v jednom případě na myší/lidské chiméry . Dosud nebily publikovány žádné odpovídající pokusy s lidskými sekvencemi.

-7Eab^z, /Eab '/a Ev fragmenty poskytují ve srovnání s kompletními protilátkami různé výhody. V důsledku toho, že jsou ve srovnání s kompletními protilátkami malé,mohou snadněji a rychleji difundovat jak in vitro , tak i při eventuálních aplikacích in vivo. Ze stejného důvodu jsou všeobecně snadhěji ovladatelné, a v největším počtu pří pádů, při kterých funkce konstatních regionů / například funkce efektoru, vazba na buněčné receptory, vatba na jiné molekuly / nejsou nezbytné popřípadě přináší dokonce nevýhody, jsou tyto fragmenty stejně hodnotné, popřípadě je možné jim dávat přednost.Například při použití kompletních. protilátek při podezření na nádory dochází častcjk problémům v důsledku nespecifických signálů pozadí, které jsou podmíněny nespecifickou vazbou protilátek, Je známé, že se tyto problémy mohou redukovat při použití Eab fragmentů . Podle toho se dá očekávat, že použití Ev fragmentů. popřípadě Ev fragmentů s jednoduchým řetězcem přinese v tomto směru, další zlepšení / Bird et al,, 1988 SingleChain Antigen-Binding Proteine, Science 242 : 423- 426 ; Huston et al., 1988 Protein engineerírg of antibody bin ding sites: recovery of speoific activity in an anti-digoxin single-chain Ev analogue in Escherichia coli,Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8£ : 5879-5883.

Až doposud se pracovalo s protilátkami myšího pů vodu, které- se vážou na malé , dobře popsané antigeny, jako fluorescein popřípadě digoxin. Celková konstrukce genu je vybudována na tom, že se jako antigen váže nízkomolekulární látka / molekulová hmotnost menší než 1000 /.

V případě nejvíce se vyskytující antigenní látky jsou peptidy, peptidoglykany, proteiny a polysacharidy , a ja» k o t ak o v é vy s ok o mo leku ’ ár ní.

Podstata vynálezu

Podle vynálezu obsahuje protein výše uvedeného druhu regiony protilátek , pocházející od buněčné linie

-8SD6 / Accesion č. 87110301, IBIS, Porto» Down , UK/ Grunov et al.,3 988 The higheffioiency,human B cell imrnortalising heteromyeloma CB/H7. J. Immunol. Methods 106; 257; Dbpel S.H.T. lortman,E. Grunov, A. Junghauer and R.v.

Baehr, 1989, Application of a human monoclonal antibody in a rapid competetive anit-HIV E1I8A, J. Imnunol. Methods 116; 229-233 i Wpel ,S.H.H. Horstmanu, P. Benklein and R. von Baehr,1989 .Fine mapping of an immunodomonant region, of the transmembrane protein of the Human Immunodeficiency Virus /EIV11/ by dífferant peptides and their use in antiHIV Elisa.J. Virol. Meth. 25 : 167-178; Junghauer A.O.

Tauer E. ^!A^Taniscb,E. £teinill,Mv Burtscher,M.Reiter,P. Unterluggauer ,A. Duchacher,K. Uhl and H. Ketinger,3.989,Pilot Saale Produkction of a Human Antibody Against Human Immunodeficiency Virus HIV-1 ,J. Biochem,Biophys. Meth. 19 /2-3/, 1223-240,které vážou antigen. Tím se poprvé zí skal. protein lidského původu,který vyhovuje požadované vlastnosti vazby a který se může exprimovat i v jedno buněčných organismech, jako kvasinkách a bakteriích .

Dále je podle předloženého vynálezu popsána výroba konstrukce jednoduchého řetězce,která je odvozena od lidských protilátek.Tato konstrukce jednoduchého řetězce váže na vysoko molekulární komplexní, virální antigen na rozdíl od malých, dobře definovaných antigenů.

Nedalo se předpokládat , že odpovídající methody pro konstrukci fragmentů s jednoduchým řetězcem by mohly vést i u jiných než publikovaných protilátek, zejména u humánních protilátek , k funkčním , to znamená antigen v á z a jí c ím mo1ekulám.

Obdobně není nasnadě, že komplexní antigeny , jako například antigeny na povrchu virů , u kterých je podle skutečnosti zúčastněn větší počet aminokyselin na vazbě antigenů na protilátku, než u malých antigenů,budou stejně

-0_ tolerovat manipulace v oblasti variabilních regionů odpovídej í ca' ob protilátek.

Vycházeje od buněčné linie 31)6, která produkuje hu mánní. wonoklonální protilátku typu IgGl/kappa,která reaguje specificky s EIV-l-gp41 a vykazuje slabou křížovou reakci s HIV-l-gpl20 /3D6 /; /Brunov E.S.,Jahn T. Porstmann,

S.T. Kiessirg,B. Steinkeller,B.Steirdl,D. Mattanovieh ,

1. GUrtel,P. Deinhardt, B. Katingeř and E. von Baehr, 1988 The high efficiency ,human B cell immortaiizing heteromy eloraa CB-B7, J. Inmunol. Methods 106 : 257 » Dbpel et a.l, 1989, Application of a human monoclonal antibody in a ra. pid competitive anti-HIV E1ISA , J. Immunol. Methods 116 : 229-233 ; Ddpel et al., 1989 kině mapping of an immunodo minant region of the transmembrane protein of the Human Immunodeficiency Virus /HIV-1 / by differant peptides and their use in anti-HIV'· . E1ISA, J. Virol. Metb, 25 ; 167 178 ; Jungbauer et al., 1989 . Pilot Scale Production of a Human Monoclonal Antibody Against Human Immunodeficiency Virus HIV-1 , J. Bioehem. Biophys. Meth, 19 /2.3/: 223-240 , byla izolována vešketou EMA. Při,tom byla použita methoda guanidin-isothiokyanátové extrakce a ultraodstředění přes polštář 5,7 M ©sCl /Maniatis et al, 1982 MonoňuclearCloning ,A. laboratory Manual,Gold Spráng Harbor, Hew Pork , ' Gold Bpring Harbor laboratory.

Z veškeré IfflA byla izolováda adsorpcí na oligo- dT celulóze póly A⁺ - frakce , tedy mRNA / mRKA purification Kit,,fa. Pharmacia, Švédsko/.

mRMA sloužila jako substrát pro syntézu cDHA / sDHA synthesis Kit, fa, Pharmacia, Švédsko /,

Klonovaní banky cDBA se provádělo v plasmidovém vektoru pUC!9 . Rekombinantní plasoidy byly transformová ny do Escherichia coli , kmene HB101 a kultivovány v 1B mediu / Maniatis et al. 1982 , Molecular Cloning a la-10boratory Manual ,Gold Spring Harbor,New York ; Gold Spring Harbor labonátory /.

dami specifickými pro oligonukleotid.Sekven.ee pro sondy byly odebrány v databance EMB1 DNA-sekvencí z konstatních regionů.

byly dále charakterizovány restrikční analýzou a byly identifikovány ty klony, které nesou plasmídy s nejdelšími inserty.

ID NO; 2/.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude blíže vysvětlen pomocí výkresů a jejich obr

Obr. 1 : Mutace na přechodu mezi leadrovým regionem a variabilním regionem těžkého řetězce protilátky 3D6 /SEQ ID HO : 1 / . Mutované báze jsou označeny x . kódované aminokyseliny jsou uvedeny v divokém typu DNA , a'kromě toho restrikční místa EC0R1 a Ecol vzniklá mutací, jakož i startovací kodon ATG.

Obr. 2.: Mutace na přechodu mezi variabilním regionem a konstantním regionem těžkého řetězce protilátky 3D6 /SBQ ID NO : 1 / . Mutované báze jsou označeny ” x ” . kódované // aminokyseliny jsou uvedeny v divokém typu DNA,'a kromě toho jsou uvedena místa restrikce Bamlíl vzniklá mutací.

Obr. 3: Mutace na přechodu mezi zaváděcím /leadr— regionem a variabilním, regionem lehkého řetězce protilátky 3D6 /SEQ ID NO : 2 /. Mutované báze jsou označeny x ”,kódované aminokyseliny jsou uvedeny v divokém typu DNA,kromě ^oho jsou uvedena restrikční místa Sáli vzniklá mutací.

Obr. 4: Mutace na přechodu mezi variabilním regionem a konstantním regionem lehkého řetězce eyrtltelrfetea 3D6 /SEQ IL NO : 2 / .Mutovaná báze jsou označeny x ·’ . Kódované aminokyseliny jsou uvedeny v divokém typu DNA. Kromě toho jsou uvedena restrikční místa HindlII, vzniklá mutací, jakož i stopkodon TAA.

Obr, 5 í DNA sekvence spojovacího místa VH-linker před a po vratné mutaci pro reprodukci přirozené sekvence aminokyseliny v oblasti VH regionu /SEQ ID NO : 3 /. Mutované . báze jsou označeny ϊ .Je uvedena konečná sekvence aminokyseliny.

Obr. 6: DNA sekvence spojovacího místa linker -VI před a po vratné mutaci pro reprodukci přirozené sekvence aminokseliny v oblasti VI regionu /SEQ I2D NO : 3 / . Mutované báze jsou označeny se *. Je uvedena konečná sekvence aminokyseliny.

obr. 7 í SDS gel čištěného so3D6. Molekulové hmotnosti použitého standardu jsou uvedeny·

Obr. 8 : HIV-1 proužky získané při methodě Western/ÉLotj£protein vázající antigen : 1, sc3D6 protein

2. APsc3D6 fúzní protein

3. protilátka, 3D6

4. veškerý protein z E. coli

Obr. S s znázorňuje přímý důkaz HIV-1-antigenu formou standardní křivky a to v jeho spojení s sc3D6 proteinem.

Obr. 10: Kompetitivní EIISA test s APsc3D6 proteinem.

U vzorků vpravo od šipky se jedná o sérum negativní na HIV-1

Příklady provedení

Příklad 1

V sekvenci insertu klonu pUC3D6HC /SEQ ID NO : 1 / poV

-12případě pUC3D61C /SBQ ID NO : 2/ byla identifikována pře chodová místa mezí regionen ledr peptidu a variabilním regionem, jakož i mezi variabilním regionem a konstatním regionem . loraocí oligonukleotidy řízených mutagenů / in vítro mutagenosis system,Amersham UK / byly na těchto přechodových místech provedeny následující mutace / viz obr. 1 - 4/.

1. Mutací byly zavedeny dovnitř rozpoznávací / identifikační / sekvence pro určité restrikční enzymy . Pomocí těchto restrikčních míst byly vyříznuty variabilní regiony těžkého popřípadě lehkého řetězce protilátky 3D6 z právě pří tomného plasmidu.

2. Dále byly vmutovány startovací a stopovací kodony, nezbytné pro pozdější expresi.

Aby se variabilní regiony 3D6 mohly spojit s linkrem / spojovacím článkem. / byly vyrobeny dva oligonukleótidy , které tvoří oba řetězce DNA linkeru. Oba oligonukleotidy byly vybrány tak, že když se spolu hybridizují / kříží / , vznikne dvojitý řetězec DNA , na jehož koncích jsou pře čnívající jednořetězcové DNA regiony,které přesně odpovídají těm přečnívajícím koncům,které vznikají při řetání odpovídajícími restrikčními enzymy na výše zmíněných valutovaných restrikčních. místech . To dovoluje ligaci variabilních regionů se syntetickými oligonukleotidy linkeru , izolovanými pomocí těchto restrikčních enzymů.

Vzájemnou ligaoí 3 vhodně předem zpracovaných, fragmentů /Vg , linker , Vj/ byl získán gen,který na přechodových, místech mezi variabilními regiony a linkerem nesl ještě vmutovaná restrikční místa, která obsahují nukleotidy, které neodpovídají nukleotidům vyskytujícím se přirozeně na těchto místech . Tím vznikla i současná sekvence aminokyseliny /obr. 5 a 6 /.

Aby se mohla rekonstruovat původní sekvence aminokyseliny, byla na uvedených přechodových místech vyrobena pomocí no

-13vého mutačního pochodu požadovaná sekvence DMA / obr. 5 a 6./

Domoci těchto method byl tedy zkonstruován gen,který má strukturu V^-linker-V^. Tento zkonstruovaný gen se označuje jako sc3D6 / single-chain-3D6/, a byl insertován do klonevacího vektarru pUCl9 /SEQ ID NO:3/· Eezultující vektor je označen pUCsc3D6.

so3D6 gen byl vyříznut z plasmidu pUCsc3D6 pomocí restrikčníoh enzymů a insertován do bakteriálního expresního vektoru pKK223-3 / Pharmacia, Švédsko /, který obsahuje tacpomotor, indukovatelný isopropyl- /^-thiogalaktosidem /IPTG/. Eezultující vektarr je označen pKKSC3D6 a byl transformován do Esterichia coli kmen JM105.

Kultivace bakterií

Transformované bakterie byly kultivovány v laboratorním fermentoru až do OBgQQ 2,0 v 1 ' JLB . JL· živném pretředí. /M^niatis et al: 1982 , Moleculas cloning ,A. laboratory Manual,¥old Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor la-. boratory/. Potom se provedla indukce exprese přídavkem isopropylthiogalaktosidu /IPTG/. Bakterie se kultivovaly další 3 hodiny v přítomnosti IPTG, potom še sklidily odstředěním a uložily se při -80 °G. Potom byl extrahován protein a vy čištěn.

Extrakce a čištění

Pro každou pokusnou várku bylo použito 10 g biomasy / hmotnost mokrého produktu /. Buňky byly $ožloženy lysozymem. Zmražená pasta E. coli se rozláme na kousky a upraní pomocí STE pufru / 10 mM Tris, 100 mM NaCl, lmM EDTA, pH 8,0/ na 10$ suspsnsi. K této suspensi se přidá směsný roztok,který obsahujenukleázy, lysozym a inhibitory / viz tabulka 1/. Tato suspense E. coli se inkubuje 15 minut při 42 °C. Přídavkem Triton - X -100 /konečná koncentrace 0,5 % / a novou pětiminutovou inkubaví při 42 °C se lyžují buňky.

-14Sklízení inkluzních tělísek

Sediment se resuspenduje v STE pufru a míchá se 8 h při 4 °C. Inkluzní. tělíska se obohatí, odstředěním.Za tím účelem se do odstředivkových zkumavek vnese glycerinový polštář /50$ glycerin / ve fosforečnanovém pufrn /Phosphate Buffered Salině /BBS//, převrství stejným objemem sus pense a. odstřeluje /30 minut , 6000 ot/min , 4 °C ,JA-20 rotor ,J2-21 -odstředivka,fy Beckmann /,

Rozpouštění inkluzních tělísek

Obohacená inkluzní tělíska se rozpustí v 6M GuHCl / guanidinhydrochloridu / v BBS , pH 8,3 , za míchání při 4 °C / 12 hodin /. Potom se fotometricky určí obsah pro teinu.

fíefolding

Protein rozpuštěný v GuHCl se v přítomnosti cizích proteinů rozmotá .Nejdříve se stahovil protein.Rozpuštěná inkluzní tělíska se zředí tak pro refolding pufrem /GuHCl llí, glutathion redukovaný 30 mM , glutathion. oxidovaný 3 mM, EDTA 100 uM , v BBS, pH 8,3 /, že konečný koncentrace činí 20 mg proteinu /1.

Zředění rozpuštěných inkluzních tělísek se provádí v laboratorním měřítku za použití byrety pomalým překapáváním roztoku proteinu v pufru pro refolding . Nejvýhodněji se pracuje při 37 °C.

Zpětné poskládání se sledovalo pomocí BP1C / vysokoúčinné kapalinové chromatografie / reverzní fází. Za tím účelem byly odebrány vzorky, hodnota pH byla nastavena na 9,5, aby se zabránilo dalšímu refoldingu,vzorky byly oše třeny /Millipore stolní' odstředivka, 4700 ot/min, teplota místnosti /, sterilně se zfiltrovalo / velikst pórů 0,22 um, low protein binding /, v případě potřeby se provedlo zkon centrování / millipore,stolní odstředivka, 4700 ot /min , °C / a nyní se analyzovalo 250 pl. pomocí chromatografie BP1C s reverzní fází, Nucleosil 300,5 um, 4 x 125 mm, fa

Macherey a Vogel ,N8R//, Lineární gradient 0,1 % TPA /aee tonitril. 10 - 60 1 se na^sloupoi ustavil během 40 minut /♦

Rozvinutý sc3U6 se ultradialyzuje . Používá se 1000 dalton cutoff polysulfonová membrána . Liafiltrovaný pro teinový roztok se nanese na aniontoměnič a potom se elu uje 100 mM NaCl , sc3'L6 se deionizuje gelovou filtrací se Sephadexem G-25 / fa Pharmacia , Švédsko / a methodou Na kane et sl, / Nakane P.K. a A. Kawaci , 1974 Peroxidase labeled antibody : a new method of conjigation , J. Histochem. Cytochem., 22 : 1084 - 1091 / konjuguje s alkalickou fosfatázou.

Vyčištěný so3D6 protein byl kontrolován SDS -PAGB / obr. 7 / . Pro důkaz funkčnosti sc3D6 proteinu byl proveden Western- fclotftest s HIV-1 - testovacími proužky / fa. BioRad , USA /. Jako pozitivní kontrola byl proveden analogický test s přirozenou protilátkou , izolovanou ze zvířecích buněk .

Jako negativní kontrola sloužila preparace veškerého pro teinu s E. coli. Výsledek tohoto testu byl pozitivní a je znázorněn na obr. 8.

Čištění sc3D6 proteinu pomocí afinitní chromatogra fie

S vhodně vyčištěným. sc3D6 proteinem bylo vyrobeno za standardních podmínek s kompletním Preundovým adjuvans králičí sérum . Pomocí CM sefarose / fa. Pharmacia , Švédsko / byla -z IgG frakce. Specifita protilátky fast flow chromatografie králičího séra získána byla zjištěna pomocí Elisa- testu . Pomocí syntetizátoru peptidů byla vyroben/ linker peptidu o délce 15 aminokyselin / sekvence : GGGGsGGGGSGGGGS / a potom konjugován pomocí karhodiimidové konden z a © e s alb um i n e m 1 . S tímto konju Vzorek séra byl i deskách a vázaná, hovězího séra /BSÁ / v molárním poměru 6: .gátem byly povlečeny mikrotizaóní desky, nkubován v povlečených, mikrotitraóníeh , protilátka byla prokázána kozím-anti-krá>1β· líčím IgG , značeným peroxidázou. Takto vyrobený a přezkoušený anti-sc3D6 byl vázán na sefarožu 48 , aktivovanou BrCN / fa. Pharmacia , Švédsko /. Nevázáný materiál byl vymyt . Předčištěný extrakt sc3D6 proteinu , který byl , jak je popsáno výše , zpětně poskládán a neionizován pomocí Sephadexu G-25 / fa.. Pharmacia , Švédsko / byl nanesen na anti-Sc3D6 sloupec . Nevázaný materiál byl bymyt a specificky vázaný Sc3P6 protein byl eluován 0,1 M glycin-HCl pufrem , pH fi,5· Potom byl eluát neutralizován 1M Tria pufrem a scD36 pro tein byl identifikován jak je popsáno výše SDS elektrofořežou, a jeho funkčnost byla přezkoušena Western- ílot- testem»

Jiná methoda pro imunoafinitní chromatografické čištění sc3D6 proteinu je následující :

S výše popsaným linkerem peptidů kopulovaným na ESA bylo pomocí kompletního Preundova adjuvans vyrobeno králi čí sérum. IgG frakce byla získána GM sepharose Past Plow chromatografií / fa. Pharmacia , Švédkso / , aby se odtranila anti-BSA protilátka. Takto získaný anti-linker IgG byl kopulován sefarózou 4B aktivovanou BrCN / Pa. Phar macia, Švédsko /. Předčištěný extrakt sc3D6 proteinu, který byl, jak je výše popsáno , zpětně poskládán a deionizo ván Sephadexem- G-25 / fa Pharmacia , Švédsko / byl nane sen na anti-linkerový sloupec . Nevázaný materiál byl vymyt a specificky vázaný sc3D6 protein byl eluován 0,1 M glycinHCl pufrem, pH 3,0. Potom byl eluát neutralizován 1M Iris pufrem a sc3D6 protein byl identifikován, jak je //// po psáno,SDS- elektroforésou a pomocí Western-ňlot-iestu přezkoušena jeho funkčnost,

Imunoafinitní chromatografické čištění HIV-1 gpl60

Pro výrobu sc3D6 imunoafinitního sloupce byl vyčištěný protein vázán na 1 ml MS sloupec / fa. Pharmacia ,švédsko / / It, protokl. fa. Pharmacia/.

Předčištěný gpl60 / p obalový.’— protein . HIV-1,který se váže specificky pro-ti2á±fc©u·' 3D6, jakož i sc3D6 proteinem / bylo provedeno podle Barreta et al,/ Barret N.A. Mitterer,W. Mundt, J. Eibl, M. Eibl, R.C. Pallo, B. Moss a P. Dorner, 1989 large-scale produetion and purification of a Vaccinia reccombinact - derived HIV-1 gpl6O and analysis of its immunogenicity, Aids Res. and Human Retroviruses % /2/*. 159-171/.

Předčištěný materiál, který obsahuje rekombinantní gpl6O , byl zkoncentrován ultra/diafiltrací a kondioio nován pro imunoafinitní chřomatografii sc3D6. Tento kondicionovaný materiál byl nanesen na imunoafinitní slaupec sc3D6 . Jako ekvilibrační pufr byl použit Tris pufr pH 7,4 s 0,1 $ Tween 20. Rekombinantní antigen byl eluován 3 M rhodanidem. Výtěžky jednotlivých stupňů jsou shrnuty v- tabulce 2.

Příklad 2

Jiné klonování sc3D6, při kterém sc3D6 gen byl fúzován s genem pro alkalickou fosfatázu /EephoA/, izolovaný z Escherichia cůi, se provádělo následovně :

se3D6 gen byl vyříznut restrikčním enzymem z plasmidu pUCsC3D6 a insertován do vektoru pBcphoAMut'3 / Eohl,J.P. RUker, B. Himmler,D. Mattanovich, and H. Katinger,l990 , Engineered gene for Escherichia coli alkaline phosphatase for the construction of translational fusions,Nuel. Acids Res. 1.8 /4/: 1069 /. Rezultující vektor je označován pAPsc3D6 . Vektor pEcphoAMut3 obsahuje gen pro alkalickou fosfatázu izolovaný z Escherichia coli /Shuttlew»th II. J., Tylor and N. Minton, 1986,Sequenee of the gene for alka line phosphatase from Escherichia coli JM83, Hucl. Acids Res. 14 / 21 : 8689 /do něhož bylo mutageázou žízenou oligonukleotidem vmutováno restrikční místo, na konci 3* káujícího regionu, které dovolí fúzi EcphoA-genu s jinými geny. Tímto způsobem se mohou vyrobit expresí fúzního genu

-18fúzní proteiny, to znamená proteiny, u kterých jsou nyní. kódující regiony spojeny peptidovými vazbami přes amino kyseliny·

EcphoA - sc3P6 fúzní gen byl vyříznut s pAPsc3D6 restrinkčními enzymy a insertován do bakteriálního expres ního vektoru pKK223-3 / fa. Pharmacia, Švédsko/. Rezultující plasmid je označován pKKAPsc3D6.

Plasmid pKKAPsc3D6 byl transformován do Escherichia coli kmen JP 105 a transformované bakterie byly kultivovány v laboratorním živném prostředí /Maniatis et al. 1982, Moleoular clnning,A laboratory Manual,Cold Spring,Harbor New York : Cold Pring Harbor laboratory /, Po indukci s IPTG byl aktivní EoPhoA - sc3D6 fúzní protein z periplasmatického prostoru bakterii čištěn následovně:

Bakterie se sklízí odstředěním a promyjí se lOmM Tris pufru pH 7,5, doplněným 30 mři NaCl. Promyté bakterie se resuspendujív 33 mM Tris pufru, pH 7,5 a éoplní se stejným objemem 40$ roztoku sacharózy v 33 mM Tris pufru a přidá se tolik EDTA až konečná'koncentrace je 0,1 mM. Po . loti minové inkubaci při teplotě místnosti se bakterie odstředí a vyjmou se do 0,5 mM roztoku MgCl^. Po 10ti minu tové inkubace při 0 °C se přidá inhibiční směsný roztok proteázy,který sestává z PMSP a EGTA a bakterie se odstředí.Přebytek se upraví pomocí 1M roztoku Tris na konečnou koncentraci 25 mM Tris. Tímto postupem se periplasmatický prostor zbaví buněk.E. odlij

Odstředěním při 12000 g se proteinový roztok vyčiíi a potom se zkoncentruje ultrafiltrací.

EcPhoA - sc3D6 protein se dále čistí hydrofóbní interakční iontovou chromatografií.Penylsefaróza Past Plow / fa. Pharmacia, Švédsko / byla ekvilibróvána se 60$ nasyceným roztokem amoniumsulfátu ve 25 mM Tris pu fru pH 7,5. Proteinový roztok by^střídavě s ekvilibračúanášen

-19ním pufrem na sloupec . Sc3D6 se entem 60 ý amoniumsúlfátu na 0 / ré obsahují EcPhoa-sc3D6 protein eluuje s lineárním gradiamoniumsulfát . Reakce,kte se deionizují gelovou filtrací.

Pro důkaz fuhkčnosti EcPhoA- sc3D6 proteinu byl proveden Western- Blot- test s HIV-l - testovacími proužky /fa. BioRad, USA /. Pro kontrolu byl proveden analogický test s přihozenou protilátkou , izolovanou ze zvířecích buněk. Jako negativní kontrola sloužila preparace veškerého pro * teinu z E. coli. Výsledek tohoto testu byl pozitivní a je znázorněn na obr. 8.

Přímý důkasjmv-l antigenu pomocí testu EiISA gpl20 specifická monoklonální antilátka /klon 25 02, Accesion č, 89120601 , PB1S , Porton Down , UK / byla nanesena. na raikrotizační desky / stupeň I , fa. Punc,Dánsko /. Převrstvení kultury, obsahující EIV-1 / D$5psl .S.H.T. Porst mann, Ρ» Henklein and R. von Baehr $ 1989. Pine mapping of an imunmofominant region of the transmemhrane protein of the Human Immunodeficiency virus / EIV-1 / by differant peptides and their use in anti-HIV E1ISA , J. Virol. Meth., 25 í 167 - 178 / bylé naneseno na povlečené mikrotitrační desky. Jako standard byl použit rekombinant gpl60. /Barret U.A. Mitterer , W, Mundt , J. fíibl.,M.Eibl,R.C. Galle , B.Moss , and P. Dorner , I989. Parge-scale production and purification of a Vaccinia recombinant-derived. HIV-l gpl60 and ana^ysis of its immunogenicity ,Aids Res. and Human Retrovirusses 5 / 2 /: 159 - 171 /.

Po vymytí nevázaného materiálu byl nanesen EcPHoA · sc3D6 protein a. inkubován . Heváza ý materiál byl znovu vymyt a. vázaný EcPhoA- sc3D6 protein byl prokázán fdfto metricky při 602 nm s p-nitrofenylfosfátem . Ha obr.

je křivka, standardu a růz tj pře vrstvení kultury.

ých vzorku

HIV-l positivních

-20Kompetitívní anti-HIV-l-EDISA

Mikrodesky / stupeň I, fa. Kunc, Dánsko / byly povlečeny roztokem 10 mg/ml rekombinantu gp!60./ Barret H.A. Mitteeer ,W.Mundt, . J.Eibl,, M. Eibl, R.C. Gallo,B. Moss,. and E, Dorner,1989. Barge-scal.e production and purification of a Vacoinia recombinant-derived HIV-1 gpl60 and analysis of its immunogenicity, Aids Res. and Human Re troviruses 5 /2/: 159-171/. Potom byly desky promyty BBS + 0,1 <$> Tween 20 + 1 / BSA.

Roztok 5 ug/ml EcPhoA-sc3D6 fúzního proteinu byl smíchán, v poměru 1:1 s HIV-1 pozitivními|popřípuáě negativními séry a nanesen na povlečené desky. Jako kontrola byl nanesen se zřeáovacím pufrem smíšený EcPhoA -sc3D6 fúzní protein a inkubovalo se 60 minut při 37 °C.Potom byl nevázaný materiál vymyt.

Přídavkem p-nitrofenylfosfátu byl prokázán podíl vézanéhoEcPhoA - sc3D6 proteinu. Vzniklé zbarvení bylo fotometricky ifentifikováno při 602 nm. Inhibice séra byla zjišťována v procentech extinkce EePhoA-sc3D6 proteinu bez séra. Jak je znázorněno na obr. 10 ,inhibují všechna na HIV-1 pozitivní séra vazbu EcPhoA - Sc3D6 fúzního proteinu na gpl60. Všechna na HIV-1- negativní séra vykazovala menší inhibici než séra pozitivní na HIV-1 .

Příklad 3

Jiný druh exprese pro sc3D6 protein, při které byla použity buňky myelomu myši jako hostitelské buňky, byl proveden následovně:

3*- část sc3D6 genu byla izolována z plasmidu pUCsc3D6 /SEQ ID K0 : 3 / parciálním strávením EcoRV jakož i strávením kompletního HindlII / délka fragmentu : 401 bp/ . Z plasmidu pUC3D6HC /SEQ ID K0 : 1 / by3a odstraněna část 3'genu pro těžký řetězec říznutím EcoRV a HindlII. Do zbývajícího vektoru byl insertován 401 fragment sc3D6 genu izolovaný přes agarózovou gelovou elektroforézu a vyčištěný. Takπη ·* j-** to rekombinovaný gen sestává tedy ze sekvence pro zaváděcí leadr peptid těžkého řetězce protilátky 3D4 , která je následována sekvencí sc3D6 genu, Plasmid nese označení plsc3D6. Tato konstrukce dovolí vymrštění sc3P6 proteinu do zvířecích buněk. Kódující, gen byl izolován z plsc3P6 enzymy Ncol a RindlII,přesahující. konce se naplní Klenowou půymerázou a klonuje se do místa Smál expresního vektoru pRcRSV In vitrogen,USA/ vhodného pro zvířecí buňky. Smál místo tohoto expresního vektoru leží mezí long Terminál fíepeat RSV,tedy silným virálním promotorem, a transkripčními terminačními sekvencemi,které původně pochází od hovězího růstového hormonu. Insercí do tohoto restrikčního místa je umožněno,přivést libovolné strukturní geny mo molekulárního okolí.které dovolí expresi genů do zvířecích buněk, Kromě toho má vektor pRcRSV ještě selekční markér resistenei k neomycinu ”,který dovolí úspěšně transformovat zvířecí buňky v kultuře.»

Takto konstruovaný plasmid se označuje pRcRSVsc3D6 ,

Tento byl přenesen do buněk myelomu myši /linie P3X63-AgS,653 / Kearney J.P.A. Radbruch,B, liesegang and Rejevvsky,1979»

A new house myeloma cell that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell. lineš,J. Immunol. 123 : 1548-1550/. Po selekci transformovaných buněk antibiotikem neomycinem bylo na zá » kladě7klonování a screeningu selektováno celkem 5 klonů, které exprimují sc3D6 gen. Expresní hladiny jednotlivých klonů byly testovány pomocí E1ISA testu specifického pro antigen a leží mezi 0,5 a 1/ug/ml»

Přebytek kultury přenesených buněk myelomu myši,obsahující sc3D6 protein byl vyčiřen odstředěním při 5000 g ve zkumavkové odstředivce.Vyčiřený přebytek byl zkoncentro ván lOkrát ultrafiltrací / minitan, PTGC , cut off 10000 Dalton, fa Milipore / a diafiltrován s 5tinásobným objemem 50 mM Tris pufru pH 7,2»

Diafíltrovaný proteinový roztok byl dále čištěn Q - Sepharose Past Plow /fa, Pharmacia, Švédsko / / ekvilibrační pufr 50 mM Tris pufru, pH 7,2/. Sluce sc3D6 proteinu se prováděla se 150 mM NaCl. Vyčištěný protein byl testován pomocí EIISA testu specifickéhopro antigen.Výtěžky jednotlivých čistících stupňů jsou uvedeny v tabulce 1,

Příklad 4

Plasmid pRcRSVlsc3D6 byl přenesen do buněk do buněk vaječníku ěínskéhojkřečka / Ghinese Hamster Ovary /CHO//. Analo gickým způsobem,jaký je popsán v příkladu 3,byly transformovaný buňky selektovány a skránovány a sc3D6 protein z přebytku kultury byl čištěn.Testování thladinX expresepomocí EIISA testu specifickéhc^i .antitál· /

Příklad 5 tu spécifickéhqprdantigen přineslo hodnoty mezi 1 až 5|ug/ml •it o lísek-?· /a _Λ sc3D6 gen byl vyříznut z plasmidu restrikčními enzymy a insertován do expresníhovektoru kvasinek pGl /Clontech laboratories lne., Palo Alto,USA/. V této konstrukci se sc3D6 gen postavil pod regulaci Gali promotoru , indukovatelného gala&tózou. Konstrukt byl přenesen do Sacharomyces eerevisie kmene SHK2 / trpí“/ a selektován v mediu bez tryptophanu na kompletaci tryptofán-auxotropii. Pozitivní transformanty byly izolovány a použity pro výrobu sc3D6 proteinu. Podmínky pro kultivací produkčníhokmene, jakož i pro izolaoi. Zpracování a čištění prdduktu se provádělo podle standardních protokolů. / Glover D.M. 1987. DNA oloning .A praotical approach, vol. 1,2 and 3»IHI Press Oxford, Washington DC/.

Příklad 6 sc3D6 gen byl vyříznut z plasmidu pUCsc3D6 pomocí b e strikčních enzymů a insertován do vektoru pAc373 / Smith G.

E. M.D. SummeBrs and M.J. Praser : l983.Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus exprešsion vektor , Mol. Cell. Biol. £·. 2156-2165/. Tento společně nuclear polyherekombinantní plasmid byl přenesen drosisi virem s DNA baculoviru Antographa californica /AcMNPV/ do buněčné linie pocházející ze Spodoptera frugiperda Sf9. Kultivace Sf9 buněk se prováděli-· standardní methodou,která je popsána v katalogu American Type Culture Collection. 3 až 5 dní po transfekci byly plaky rekombinantních. virů mikroskopicky identifikovány a izolovány. Pro získání jistoty,že izolované rekombir.antní viry nejsou kontaminovány divokými typy virů,byly připojeny tři další pochody čištění plaků. Infekce Sf9 buněk rekombinantním virem vedla po 3 až 5 dnech k lyži infikovaných buněk a v souvislosti stím,k produkcí sc3D6 proteinu v přebytku lysátu buněk. sc3D6 protein byl z tohoto přebytku čištěn a analyzován analogicky jak to bylo popsáno v nříkladu 3· Tímto způsobem bylo možné prokázat funkňnost tohoto rekombinantního proteinu.

Příklad 7

Sekvence kódující protein avidin /Gope M.l., E.A. KeinSnen,P.A, Kristo, O.M. Connealy, W.G. Beattis,T. ZaruckiSchulz, B.W. O*Malley and M.S. Kulomaa,1987.Molecular cloning od the chicken avidin cDNA,Nucl, Acids. Ses, 15 /8/ :135953606/ byla vyrobena pomocí syntetického oligonúkleotidu jako syntetického genu, a sice tak,že dodatečně na kanci 3*genu je sekvence leader / zaváděcího / peptidu pro E- coli alkalickou fosfatázou /Shuttleworth H.J, Taylor and N. Minton, 1986.Sequence of the gene for alkaline ph.osphata.se from Escherichia coli JM 83,Nucl. Adids fíes. 14/21/: 8689/ a na 3*- konci póly linkerová oblast pro ínserci do této polylinkerové oblasti se jiných genů.Geny insertaané za vhodných podmínek exprimují jako fúzní proteiny s avidinem jako fúzním partnerem.Pomocí leaderu; jaacháze jícího se na 3*konci se tyto fúzní proteinyvymrští v aktivní formě do periplasmatického prostoru Escherichia aoli.

Tato konstrukční jednotka, byla insertována do vhodného restrikeriálního expresního vektoru pET-3a /Studier F.W, ,1986.Use of baoteriophage T7 RNA polymerase to high-lovel expression of cloned genes,J.Mol.Biol.

ěního místa bakt an d B, A, Ho f f at t direct selective

189» 113/ ,který pro expresi klonovaných genů obsahuje bakteriofág T7-1Í1Q promotor jakož i / terminátor. Rezultující vektor se označuje pET-3a-Av,

E.coli s vektorem fágu,který nese genetickou informaci pro T7 polymerázu, infikuje , tpk vede takto produkovaná T7 polyme ráza k expresi genů,které existují klonované, jak je výše po psáno ve vektorech. Tato vlastnost je pro expresi avidinu a fózních proteinů avidinu v E. coli velmi důležitá,neboí avi din je pro rostoucí kultury E. coli toxický, sc3D6 gen byl vyříznut z vektoru pUCsc3D6 restrikčními enzymy a insertován do polylinkrové oblasti vektoru pBT -3aAV. Rezultující vektor se označuje pET-3š-Av-sc3D6. Vhodné hostitelské buňky E.coli / například HHS174 / byly trasformovány s tímto vektorem a kultivovány. Jakmile kultury dosáhla ^OD6oo θ’6»byla infikována bakteriofágem CE6 / lambda cIts857Sam7/ / Studier P.W. and B.A. Hoffatt,1986 . Use of bakteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes· J. Mol. Biol. 189 » 113/ ,který nese gen 1 ba$ teriofágu T7. Takto vzniklá polymeráza T7 vedla k expresi fúzního proteinu avidin sc3B6 v periplasmatickém prostoru E. coli. Jakmile exprese dosáhla svého maxima / vždy podle pod mínek kultury mezi 1 až 12 hodinami po infekci fágem/ , byl rekombinantní protein uvolněn analogickým způsobem jaký byl popsán v příkladu 2 a zkoncentrován ultrafiltraeí.

koncentrovaný roztok proteinu se dále čistí přes Sephaoryl ^θθ / fa, Pharmacia/ a zkoncentruje podruhé ultradiafiltrací.Tento roztok se nanese na sloupec biotinu.Odpoví dající fúzní protein avidinu se3D6 zůstane specificky vázán. Hečistoty se vymyjí. Takto vyrobený afinitní sloupec byl použit pro čištění rekombinantního gpl60 analogicky jako v příklau 1, to znamená, předčištěný roztok proteinu podle Barreta

et al./ 1989, Large-scale production a purification of a Vaccinia re conťbinanfi - derived HIV-1 gpll60 and analysis of its Immunoganicity, Aids Res. and Human Retroviruses 5, /2/: 159 171 / byl nanesen na afinithí sloupec a po vymytí nevázaného materiálu byl rekombinantní gplóO eluován 3 M rhodanidem. Při tom dosažené výtěžky jsou analogické výsledkům uvedeným v tabulce 2.

SEQ ID NO: 1 druh sekvence : nukleotidy délka sekvence : 1548 párů _ mÚXZ .' ,

Tvar ^provaze? : jednoduchý Tepologie : cirkulámí s odpovídajícím proteinem bází řetězec* druh molekuly í plasmid DNA s insertem humánní cDNA

původní původ
organismus	: člověk
bezprostřední pokusný původ:
název buněčné linie:	3D6
znaky : od	1	až	po 36 bp	plasmidu pU019 polylinker
w	37	n	1527 w	insert těžkého řetězce řprctlátky 3D6
w	37	M	98 w	5*netrasiatováná region
n	99	n	1526	kódovaná region
«	156	n	1526	zralý peptid
n	156	n	533 «	variabilní region
n	156	n	245	základní struktura 1
n	246	n	260	oblast 1 určující komplementaritu
n	261	«	302 **	základní struktura 2
«	302	n	352 ”	oblast 2 určující komplementaritu
»1	354	n	449	základní struktura 3
n	450	n	500 «	oblast 3 určující komplementáři tu
n	501	11	533	základní struktura 4
M	534	n	1526	konstantní region
«	1527	n	1547	plasmid pTJC 19 polylinker

-26Vlastnosti cDNA klonu těžkého řetězce ahtitělíska SD6 insertovaného do plasmidu PUC19

GTGAATTCGA GCTCGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCCCA GCCCTGAGAT TCCCAGGTGT 60 TTCCATTCAG TGATCAGCACT GAACACAGAG GACTCACC 98

ATG MET

GAG TTG

GGA Gly

CTG AGC Leu Ser -15

TGG ATT

TTC CTT TTG GCT ATT TTA AAA

143

Glu

Leu

Trp

Ile

Phe Leu -10

Leu

Ala

Ile

Leu

Lys - 5

GGT

□TC

GAG

TGT

GAA

GTG

CAG

CTG

GTG

GAG

TCT

GGG

GGA

GGC

TTG

188

Gly

Val

Gin

Gys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

1

5

10

GTA

CAG

CCT

GGC

AGG

TCO

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCG

TCT

GGA

233

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

15

20

25

TTC

ACC

TTT

AAT

GAT

TAT

GCC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGG

CAA

GCT

CCA

278

Phe

Thr

Phe

Asn

Asp

Tyr

Ala

MET

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

30

35

40

GGG

AAG

GGC

CTG

GAG

TGG

GTC

TCA

GGT

ATA

AGT

TGG

GAT

AGT

AGT

323

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ser

Gly

Ile

Ser

Trp

Asp

Ser

Ser

45

50

55

AGT

ATA

GGC

TAT

GCG

GAC

TCT

GTG

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

368

Ser

Ile

gly

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

60

65

70

AGA

GAC;

\AfiC

GCC

AAG

AAC

TCC

CTG

TAT

CTG

CAA

ATG

AAC

AGT

CTG

413

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

Leu

Gin

MET

Asn

Ser

Leu

75

80

85

AGA

GCT

GAG

GAC

ATG

GCC

TTA

TAT

TAC

TGT

GTA

AAA

GGC

AGA

GAT

458

Arg

Ala

Glu

Asp

MET

Ala

Leu

Tyr

Tyr

Cys

Val

Lys

Gly

Arg

Asp

90

95

100

TAC

TAT

GAT

AGT

GGT

GGT

TAT

TTC

ACG

GTT

GCT

TTT

GAT

ATC

TGG

503

Tyr

Tyr

Asp

Ser

Gly

Gly

Tyr

Phe

Thr

Val

Ala

Phe

Asp

Ile

Trp

110

115

120

GGC CAA GGG ACA

ATG MET 125

GTG Val

ACC Thr

GTC TCT TCA GCC TCC ACC AAG GGC

548

Gly

Gin Gly

Thr

Val

Ser 130

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 135

CCA

TCG

GTC

TTC

CCG

CTG

GCA

CCC

TCG

TCC

AAG

AGC

ACC

TCT

GGG

593

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

140

145

150

GGC

ACA

GCA

GCC

GTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

GAC

TAC

TTC

CCC

GAA

638

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

155

160

165

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCC

GTG

ACC

AGC

GGC

GTG

683

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

170

175

180

CAG

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

GTC

TAC

TGC

CTC

728

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

185

190

195

AGC

AGC

GTG

GTG

ACC

GTG

CCC

TCC

AGC

AGC

TTG

GGC

ACC

CAG

AGC

773

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

200

205

210

TAC

ATC

TGC

AAC

GTG

AAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

GTG

GAG

818

Tyr

Ile

Cys

Asn

Váli Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

215

220

225

AAG

AAA

GTT

GAG

CCC

AAA

TCT

TGT

GAC

AAA

AGT

CAC

ACA

TGC

CCA

863

Lys

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

230

235

240

CCG

TGC

CGA

GGA

CCT

GAA

CTC

CTG

GGG

GGA

CCG

TCA

GTC

TTC

CTC

908

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

245

250

255

TTC CCC CCA AAA

CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT

953

Phe

pro

Pro lys

Pro 260

lys

Asp

Thr

leu MET Ile 265

Ser

Arg Thr

Pro 270

GAG

GTC

ACA

TGC

CTG

GTG

GTG

GAC

GTG

AGC

CAC

GAA

GAC

CCT

GAG

998

Glu

Val

Thr

cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

275

280

285

GTC

AAG

TTC

AAC

TGG

TAC

GTG

GAC

GGC

GTG

GAG

GTG

CAI

AAT

GCC

1043

Vgl Bys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

290

295

300

AAG

ACA

AAG

CCG

CGG

GAG

GAG

CAG

TAC

AAC

TCC

ACG

TAC

CGT

GTG

1088

Bys

Thr

lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

305

310

315

GTC

AGO

GTC

CTC

ACC

GTC

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

CTG

AAT

GGC

AAG

1133

Val

Ser

Val

leu

Thr

Val

leu

His

Gin

Asp

Trpleu Asn

Gly lys

520

325

330

GAG

TAC

AAG

TGC

AAG

GTC

TCC

AAC

AAA

CCC

CTC

CCA

CCC

CCC

ATC

1178

Glu

Ty*

lys

Cys

lys

Val

Ser

Asn

lys

Ala

leu

Pro

Ala

Pro

Ile

353

340

345

GAG

AAA

ACC

ATC

TCC

AAA

VCC

AAA

GGG

CAG

CCC

CGA

GAA

CCA

CAG

1223

Glu

lys

Thr

Ile

Ser

lys

Ala

lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

350

355

360

GTG

TAC

ACC

CTG

CCC

CCA

TCC

CGG

GAT

GAG

CTG

ACC

AAG

AAC

CAG

1268

Vyl

Tyr

Thr

leu

Pro

Pro

Ser

Arg Asp

Glu

leu

Thr

lys

Asn

Gin

365

370

375

GTC

AGC

CTG

ACC

TGC

CTG

GTC

AAA

GGC

TTC

TAT

CCC

AAC

TAC

AAG

1313

Val

Ser

leu

Thr

Cys

leu

Val

lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

380

385

390

GCC

GTG

GAG

TGG

GAG

AGC

AAT

GGG

CAG

CCG

GAG

AAC

AAC

TAC

AAG

1358

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

lys

395

400

405

-29ACC ACG GCT CCC GIG CTG GAC TGC GAC. GGC TCO TTC TTC CTC TAC

Thr Thr Pro Pro Val Asp lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val 425 430 . 435

1403

TTO Phe	TCA Ser	TGO Cys	TCO Ser	GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC	TAC ACA Tyr Thr 450
Val MET 440	His	Glu Ala Deu 445	His Asn His
OAG	AAG	AGO	CTC	TCO CTG	TCT	CCG GGI AAA	TGA
Sin	lys	Ser	leu	Ser leu	Ser	Pro Gly lys	Stop
				455		460
GACCT GCAGG	CATGCAAGCT *	Γ

1526

1526

SEQ ID NO : 2

Druh sekvence : nukleotidy s odpovídajícím proteinem délka sekvence s 945 párů hází rebhtL

Tvar p-rovazce : jednoduchý řetězec

Tppologie : oirkulánní druh molekuly : Plasmid-DNA s insertem lidské cDNA původní půvdd organismus : ělověk bězprostřední experimentální původ:

Název	buněčné linie :	3D6
Znaky	: od	1	až	21	bp	plasmid pUCl9 polylinker
	99	22	99	732	99	insert lehkého řetězce protilátk y3D6
	19	22	«	27	19	5*netranslatovaná region
	99	28		732 ’’	kódující region
	99	28	99	93	99	signální peptid
	It	94	99	732	99	zralý peptid
	tí	94	99	408	99	variabilní region
	91	94	91	162	99	základní struktura 1
	99	163	99	195	99	oblast 1 určující komplementaritu
	99	196	99	240	19	základní struktura 2
	99	241	99	261	99	oblast 2 určující komplementaritu

Znaky : od	262	aš	357	bp základní struktura 3
	358	w	378		oblas 3 určující komplementaritu
	379	«	408	n	základní struktura 4
	409		732	M	konstantní region
	733	w	905	M	3znetranslatovaxiá oblast
	906	1»	945		plasmid pUC 19 polylinker

/protilátky- 316 in Vlastnosti : cDKA klon lehkého řetězce sertovaný do ^lasmidu PUC19

GTGAATTCGA GCTCGGTACC GCACAGC

ATG MET

GAG ATG

AGG Arg

GTG CCC Val Pro -18

GCT GAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG CTC

72

Asp

MET

Ala Gin

leu

leu -13

Gly

leu

leu

leu

leu - 8

TGG

CTC

CCA

GGT

GCC

AAA

TGT

GAC

ATC

CAG

ATG

ACC

CAG

TGT

CCT

117

Trp

leu

Pro

Gly

Ala

lys

Cys

Asp

Ile

Gin

MET

Thr

Gin

Ser

Pro

- 3

3

8

TCC

ACC

CTG

TCT

GCA

TCT

GTA

GGA

GAC

AGA

GTC

ACG

ATC

ACT

TGC

162

Ser

Thr

leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

13

18

23

CGG

GCC

AGT

CAG

AGT

ATT

AGT

AGG

TGG

TTG

GCC

TGG

TAT

GAG

CAG

207

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Arg

Trp

leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

28

33

38

AAA

CCA

GGG

AAA

GTC

CCT

AAG

CTC

GTG

ATC

TAT

AAG

GCA

TCT

AGT

252

lys

Pro

Gly lys

Val

Pro

lys

leu

leu

Ile

Tyr lys

Ala

Ser

Ser

43

48

53

TTA

GAA

AGT

GGG

GTC

GCA

TCA

AGG

TTC

AGC

GGC

AGT

GGA

TCT

GGG

297

leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

58

63

68

ACA

GAA

TTC

ACT

CTC

ACG

ATC

AGG

AGC

GTG

CAG

CCT

GAT

GAT

TTT

342

Thr

Glu

Phe

Thr

leu

Thr

Ile

Ser

Ser

leu

Gin

Pro

Asp

Asp

Phe

73

78

83

GCA Ala

ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT

AAT AGT TAT TCT TTC

GGC Gly

CCT Pro 98

387

Thr Tyr Tyr Gys Gin 88

Gin Tyr

Asn

Ser 93

Tyr

Ser Phe

GGG

ACC

AAA

GTG

GAT

ATC

AAA

CGA

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

432

Gly

Thr

lys

Val

Asp

Ile

lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

103

108

113

TTC

ATC

TTC

CCG

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

477

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

leu

lys

Ser

Gly

Thr

Ala

118

123

128

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

ccc

AGA

GAG

GCC

AAA

522

Ser

Val

Val

Cys

leu

leu

ÁSUjí

Isn Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

lys

133

138

143

GTA

CAG

TGG

AAG

GTG

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

AAC

TCC

CAG

567

Val

Gin

Trp

lys

Val

Aap -Asn

Ala

leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

148

153

158

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

CTC

612

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

leu

163

168

173

AGG

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

AAA

657

Ser

Ser

Thr

leu

Thr

leu

Ser

lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

lys

His

lys

178

183

188

GTC

TAG

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

702

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

leu

Ser

Ser

Pro

Val

193

198

203

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

TAG

732

Thr

lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

Stop

CACCTGCTCC TCAGTTCCAG CCTGACCCCC TCCCATCCTT TGGCCTCTGA CCCBTTTCC 792 ACAGGGGACC TACCCCTATT GCGGTCCTCC AGCTCATCTT TCACCTCACC CCCCTCCTCC 852 TCCTTGGCTT TAATTATGCT AATGTTGGAG GAGAATGAAT AAATAAAGTG AATGGGGATC 912 CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGG 945

-32SEQ ID NO:3

Druh sekvence : nukleotidy s odpovídajícím proteinem délka sekvence : 776 párů bází

Tvar provazce : jednoduchý řetězec

Topáogie : cirkulámí druh molekuly : plasmid DNA s insertem s vestavěným lidskou sDNA původní původ organismus : člověk bezprostřední experimentální původ:

Náze^	τ buněčné	linie : 3D6
Znaky: od 1 bp až	13 bp plasmid pHCl9 polylinker
n	14	760 insert sc3D6
w	14	16 ” startovací kodon
	14 ”	394 variabilní region těžkého řetězce
11	17	106 ” základní struktura 1 těžkého řetěz
«	107	ce 121 w oblast 1 těžkého řetězce určující
n	122	komplementaritu 163 ” základní struktura 2 těžkého řetěz
	164	ce 214 oblast 2 těžkého řetězce určující
11	215	komplementaritu 310 ” základní struktura 3 těžkého řetěz
tt	311	ce 361 oblast 3 těžkého řetězce určující
• •	362 ”	komplementaritu 394 základní struktura 4 těžkého řetěz-
11	395 ”	ce 440 linker
«	441	760 ” variabilní region lehkého řetězce
11	441	508 ** základní struktura 1 lehkého řetěz-

ce

-331

od	509	bp až	542	bp	> oblast lehkého řetězce určující komplementaritu
ti	543	II	588	11	základní struktura 2 lehkého řetězce
II	589	11	607	11	oblast 2 lehkého řetězce určující komplementaritu
II	608	II	703	II	základní struktura 3 lehkého řetězce
II	704	tt	724	tt	oblast 3 lehkého řetězce určující komplementaritu
II	725	11	757	II	základní struktura 4 lehkého řetězce
II	758	II	760	11	stop^ kodon
tt	76!	11	776	II	plasmid pUC 19 polylinker

Vlastností : klon vestavěného jednoduchého řetězce Fv fragmentu ipro-t-ilátky' 316 insertovaného do plasmidu PUC19

AAAAGAATTC CCC

AEG	GAA	GTG	CAG	CTG	GTG	GAG	TCT
Met	Glu	Val	Gin	leu 5	Val	Glu	Ser
GGC	AGG	TCO	CTG	AGA	CTC	TGC	TGT
Gly	Arg	Ser	leu	Arg 20	leu	Ser	Cys
AAT	GAT	TAT	GCC	ATG	CAC	TGG	GTG
Asn	Asp	Tyr	Ala	MET 35	His	Trp	Val
CTG	GAG	TGG	GTC	TCA	GGT	ATA	AGT
leu	Glu	Trp	Val	Ser 50	Gly	Ile	Ser

						13
GGG	GGA	GGC	TTG	GTA	CAG	CCT	88
Gly	Gly	Gly	leu	Val	Gin	Pro
	10					15
GCA	GCC	TCT	GGA	TTC	ACC	TTT	103
Ala	Ala	Ser	Gly	Phe	Thr	Phe
	25					30
CGG	CAA	GGT	CCA	GGG	AAG	GGC	148
Arg	Gin	Ala	Pro	Gly lys	Gly
	40					45
TGG	GAT	AGT	AGT	AGT	ATA	GGC	193
Trp	Asp	Ser	Ser	Ser	Ile	Gly
	55					60

TAT Tyr

GCG GAC

TCT Ser

GTG AAG Val lys 65

GGC CGA

TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC

238

Ala

Asp

Gly

Arg

Phe Thr 70

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn 75

GCC

AAG

AAC

TCC

CTG

TAT

CTG

CAA

ATG

AAC

AGT

CTG

AGA

GCT

GAG

283

Ala

lys

Asn

Ser

leu

Tyr

leu

Gin

MET

Asn

Ser

leu

Arg

Ala

Glu

80

85

90

GAC

ATG

GCC

TTA

TAT

TAC

TGT

GTA

AAA

GGC

AGA

GAT

TAC

TAT

GAT

328

Asp

MET

Ala

leu

Tyr

Tyr

Cys

Val

lys

Gly

Arg

Asp

Tyr

Tyr

Asp

95

100

105

AGT

GGT

GGT

TAT

TTC

ACG

GTT

GCT

TTT

GAT

ATC

TGG

GGC

CAA

GGG

373

Ser

Gly

Gly

Tyr

Phe

Thr

Val

Ala

Phe

Asp

Ile

Trp

Gly

Gin

Gly

110

115

120

ACA

ATG

GTC

ACC

GTC

TCT

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

GGT

418

Thr

MET

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly

oiy

Gly

125

130

135

GGG

TCG

GGT

GGC

GGC

GGA

TCT

GAC

ATC

CAG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCT

463

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Asp

Ile

Gin

MET

Thr

Gin

Ser

Pro

140

145

150

TCC

ACC

CTG

TCT

GCA

TCT

GTA

GGA

GAC

AGA

GTG

ACC

ATC

ACT

TGG

508

Ser

Thr

leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

155

160

165

CGG

GCC

AGT

CAG

AGT

ATT

AGT

AGG

TGG

TTG

GCC

TGG

TAT

CAG

CAG

553

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Arg

Trp

leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

170

175

180

AAA

CCA

GGG

AAA

GTC

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

AAG

GCA

TCT

AGT

598

lys

Pro

Gly

lys

Val

Pro

lys

leu

leu

Ile

Tyr lys

Ala

Ser

Ser

185

190

200

TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG 643 leu Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Qly

205 210 215

ACA

GAA TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGO

AGO

GTG

CAG

CCT

GAT

GAT

TTT

Thr

Glu Phe

Thr

leu.

Thr

Ile

Ser

Ser

leu

Gin

Pro

Asp

Asp

Phe

220

225

230

GCA

ACT TAT

TAC

TGC

CAA

CAG

TAT

AAT

AGT

TAT

TCT

TTC

GGC

CCT

Ala

Thr Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Asn

Ser

Tyr

Ser

Phe

Gly

Pro

235

240

245

GGG

ACC AAA

GIG

GAT

ATC

AAA

GGA

TAA

Gly

Thr lys

Val

Asp

Ile

lys

Arg

Stoj

>---

GCTTCTGCAC CATCTG

Tabulky látka lysozym RKase DNA se EDTA konečná koncentrace 0,2 mg/ml 15 U/ml 15 U/ml

100 mM

Tabulka 1 : konečná koncentrace rozkladných chemikálií v buněčné suspensi

stupeň	objem /ml/	protein /mg/	gpl60/mg/ výtěžek
extrakce	7000	33200	600	10 0
lentil-
safaróza	520	1000	372	62 <$>
sc3D6 afi	-
nitní
Qhromato-
grafie	130	148	144	24

Tabulka 2 : výtěžky jednotlivých stupňů čištění imunoafinitní ohromatogna^ií rekombinantních gpl60 s so3D6 jako afinitním ligandem

-36stupeň objem /ml / protein /mg / titr přebytek kultury 3500 7600 1:256 ultradiafiltrace 350 5300 1:2048

Q-sefaróza 50 72 1:10000

Tabulka 3 : Výtěžky jednotlivých stupňů čištění sc3D6 pro teinu z přebytku kultury transformovaných buněk myelomu myši.

JUDr. Miloš VŠETEČKA <KeQl-Pf\ advokát

1«0 Θ0 PRAHA 2, Hálkova 2

Claims (5)

PATENTOVÉ N A*R Q, K f

1. sc3D6 Protein >£6Fusionsprotein

1. X í i U 3 ·' 22 i b < ó i !ŮZ variable Region konstantě Region -V D I K R T V A A P 397 GTG GAT ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA 426

GTG GAT ATC AAA CGA TAA GCT TCT GCA CCA *** * * Λ

HindlII

Stop ajah i i rtu„ng, /A^-étetat-ion oni Uborctang—zw.igr-hgn der variablen Req i on und der konstanten Region- der leichten Kette des Antikór£ěrS=»3D6 (SEQ ID NO: 2). Mutierte Basen sind 'Rodierten Aminosáuren in der die durch die Mutatio sowie das Stooooderr^TAA m i t__Ji*JL---gek^lTzei ohnět. Die __ sind angefuhrt, au/Jerdera andenen Restriktionsstelle HindlII l, A,

Obu. T

- VH Linker -* k

38.0 GTC ACC GTC TCT TCA GGA TCC GGT GGC TCG GGC 412

GTC ACC GTC TCT TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC

-V T V S S G G G G S G *. > 'i· .4itAfabildung -5-ť-—DNA-.-Seťpa-eng—d^^s--Aierkniipfung_sstelle VH - Linker vor und nach der Ruckmutatíon zur. wiederherstelluhg~~3^T—natwhy.chn Aminosaureseuenz im Bereich der__V H Reg.Ion——3}, MuťTerte Basen sind πυΛ^____2Μ^—gekennzeichnet. Die endgultige

Am i η o ε a u r e s_ejgu^nr^istan ge g e b e n.

,νϊΧ ^fr

Linker VL 422 TCG GGT GGC GGC GGA GTC GAC ATC CAG ATG ý. tcg GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATC CAG ATG • 3 G G G G s D I Q M -

451

LNA Sequerrz—der Ve-rknupfungssteund nach der Ruckmutatíon zur Wiederherstellune Aminosaureseuenz · ira Bereich der

Mutierte Basen sind Aminosáureseque / v.ryr lichn< /3) · . gultíge _ík _ * $3

JUDr. Mil

Váetečke _s * _ř

X

X i- ' ř x_5i ‘t. j i. i £ j b j i i .> i»

O b p · ?

rHLiJrt h ? i u j '

MG(kO)g i

87 $

Atofeildung 7: SDS scJUb, MolekuTa?qwŤctrfe^dPQ verwendeten Standards sind ž,nap.nphft.a---—-*gp 180 120 R *«Λ tóg·®

Kw1 2 3 4 •AfebiXdung fi.......HIV-l Waaternblul Stře I. ---.

1.4 1

Leader Var.table Region -R Κ- V Q c E V Q L v - ΑΛΑ CGT ClC CAG TCT GAA GTG CAG CTG GTG 170 Wí idtyp A. A A GAA TTC CCC ATG GAA GTG CAG CTG GTG sut i ert A X X * * A ‘

kCORI NcOT

Start

M>b.iidungjL—Kutat Fen——uJkergeng zwischen der leaderreoi on und der variafclen Region der schweren Kette ,das—AwtiKorpéTs 3D6 (SEQ ID Ne; i). Kutlerte Basen—-&»wd “nit gekenzeichnet. Die k cd i e r t en Ader Ki Idtyp-DKA sind ·angefůhrt, au£erdetn dJ^-třrrFclTdíe Kutation entstardenen Restriktionaste i 1 e η EcoRi und N c o I z e v; r & de-s—Starte, o den--ATtc--ob^.2........................................................... ...........~......— —

'vard.jbie Region _; konstantě Region -» T V S S -A S T K G - 10 CTG ACC GTC TCT TCA GCC TCC ACC AAG GGC S4S WiIdtyp GIG ACC GTC TCT TCA GGA TCC A ACC AAG GGC ™ut i ert Ran;HI

Λ b b i 1 ii!i **»—*—A -i—Mf-Ή-Ί ř- ί mi—rfca ”i g -7 tj ' c ,-¹’ b í. η /1 ďuXT T.r.^ r i *g h ’ /-· n und der ker s t a n t e n Re g i o n .ulax—a mfctTSTén Ret ce de ň’ řijlc ikorpe (SEC ID NO —-HrrtcíelTt e Ba £ e n sind mit A t pv e ke n z alehne r_; od ninosáureri in der Wi T ,-U-r T-.Γ-Λ” Λ <7 ·: “· ».x L· J j.ž ÚU±* ; X -.· .1 n d a n g efuh v. i. , r š., d e .id-íi—,.-·. :r»»é—A- tm—id u CTTttnTT 'i—errt 11 a * íd te •p—- Reál rlk-fe- i-ons a j, us.l1 c

3D6

Die

-obK.J Leader P G A

CCA CGT GCC CCA GGC CCC

Region | variatole Region ->

K C‘D I Q Μ T AAA TGT GAC ATC CAG ATG ACC iHS ΑΆΑ GTC GAC ATC CAG ATG ACC * *4

Sa I T

-i.nn.

Ubergaus

Abtoildung, v ·.

i a b 1 e n

I.D NC ; 2'; .

kope: ten a.Region der .lei chtěn

Kat. berte Essen sin ciaijren in der Mrl “fen Res.tr A ten der Le ader reg ion und das AntiKctrper-s—5-mh__XSEQ ¹ ’ * *' g e k e n zel, r. hne i---utr? e

Aihrt, uu-erdero.

onssteile Salin rKLúrt H

1. Rekombinantní protein váianý na komplexní virální aatigea HIV-1, obsahující variabilní regiony protilátky, pocházející z buněčné linie 3D6.

2· Rekombinantní protein podle nároku 1, obsahující variabilní region těžkého řetězce podle SEQ δ·1.

3. Antíkórpei .4 .-^WÍamt-ProtnAji^i?s'~T?>^-ni i

33'«·; „i

JUDr, Mih š/Všefečfra , 'λ ’9Í Ď5/22 Íbí40

Qh ·40

Kompetitíver ELISA mít APsc3D6 Protein

Koeufigkeit

3. Rekombinantní protein podle nároku 1 nebo 2, obsahu*jící variabilní region lehkého řetězce podle SEQ δ·2·

4· Rekombinantní protein podle jednoho z nároků 1 až 3 podle SEQ č<3, kde variabilní region těžkého řetězce a variabilní region lehkého řetězce jsou spojeny linkerem·

5· Způsob výroby rekombinantaíh© proteinu podle jednoho z nároků 1 až 4, vyznačující se t í a, že se DNA inserce se3D6, popřípadě sekvence hybridizující s touto insercí nebo sekvence odvozená Regenerací z exprimováného proteinu, zavede do plasmidu, tímto plasmidem se transformuje hostitel a konstrukční jednotka se exprimuje»

6* Způsob výroby rekombinantního proteinu podle nároku 5, vyznačující se t í m, že se exprimuje jako fuzní protein nebo společně s avidinem»

7» Inserce pro použití při způsobu podle nároku 5, vyznačující se tím, že inserce sc3D6 vykazuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č»3.

MBDllrBLíNOgí* obv. /)

5» inhibierung von 35 — 0 %

Abbildurrq HAmpetitivor ELICA wií ÁF733TJo ťřotěTřr:

rechts vc ~Bej P-žre-b^n