CZ13994A3

CZ13994A3 - DNA-kódující callasu a její použití k navození samčí sterility u rostlin

Info

Publication number: CZ13994A3
Application number: CZ94139A
Authority: CZ
Inventors: Roderick John Scott; John Draper; Wyatt Paul
Original assignee: Biogemma Uk Limited
Priority date: 1991-07-23
Filing date: 1992-07-23
Publication date: 1998-03-18
Also published as: EP0595981A1; US5955653A; HU9400183D0; GB9115909D0; SK7494A3; JPH06509231A; WO1993002197A1; CA2114008A1; AU686092B2; AU2361492A; HUT69640A

Description

Oblast techniky

							—
K “σ	ι—			θ'
	>	C33
	ω		G
	—Η	-<	;0	-	Ο	ςο	Ο<
		60 \|· -	>	«<	Ο C/X		ύ_.
	Ο	Ο	σ		Ι-
	Ή	< ΓΠ*		60	Ο
	<	zc
	”3	ο				Η-

Tento vynález se týká rekombinantní, izolované a jiné syntetické DNA využitelné v systémech samčí sterility pro rostliny. Rostliny se samčí sterilitou jsou využitelné pro produkci hybridních rostlin sexuální hybridizací.

Dosavadní stav techniky

Hybridní rostliny mají výhody větší výtěžnosti a lepší odolnosti proti chorobám než jejich rodiče z důvodů heterosy nebo hybridové bujnosti. Uniformita plodin je další výhodou hybridních rostlin, jestliže rodiče jsou extenzivně homozygotní; to vede ke zlepšení manažmentu plodin. Hybridní semena gsou proto obchodně důležitá a prodávají se za výjimečnou cenu;.

Produkce hybridních rostlin znamená,že je zajištěno, že se samičí rodič sám neoplodní. <le zde množství dřívějších návrhů, mechanických, chemických a genetických, pro zabránění opylení. Mezi genetickými metodami je použití anther-specifických genů nebo jejich promotorů k narušení normální produkce pylových zrn známo. Anther-specifický promotor může být, například, použit k řízení samčí-sterilní DNA** ve vhodném čase a na správném místě. Samčí sterilní DNA zahrnuje tu, která kóduje lytické enzymy včetně těch, které lyžují proteiny nukleové kyseliny a karbohydráty. Glukananjt jsou enzymy, které ničí karbohydráty .

-2V EP-A-0344029 (Plant Genetic Systems (PGS)) a WO-A9211379 (Nickerson International Seed Company Limited) se glukanasu kódující DNA jeví mezi možnými DNA samčí sterility. Ačkoliv bylo charakterizováno mnoho rostlinných glukanás a v některých případech byly geny klonovány (tj. (např. *'RR glukanásy, týkající se odolnosti), dosud nebyla popsána žádná glukanása s vlastnostmi, spočívajícími v úloze uvolnění mikrospory. Uvolnění mikrospory je proces, kterým jsou nezralé mikrospory uvolňovány z ochranného pláště (1,3) poly-glukanu(callosy), vytvořeného {

mikrosporogenními buňkami před meiosou ( Rowley, Grana Palynol., 2, 3—31 (1959) a Heslop-Harrison, Can.J.Bot.46, 1185-1191 (1968) aNewPhytol., 67, 779-786 (1968)). Anther-exprimovaná glukanása odpovědná za rozpuštění tohoto sallosového obalu je známa jako calasa. Calasa je syntetizovaná buňkami tapeta a secernována do loculu. Objevení enzymové aktivity je vývojově regulováno tak, aby koincidovalo se specifickým stavem vývoje mikrospor.

Základ použití glukanasy jako sterilitní DNA spočívá ve faktu, že nesprávně načasované objevení calasové aktivity je spojeno s jistými typy samčí sterility (Warmke a Overman, J.Hered. 63 103-108 (1972)). Dva typy jsou rozpoznávány v závislosti na tom, zdali objevení glukanasové aktivity je nezralé nebo pozdní. Protože jsou oba typy nacházeny v přírodě je jedna důležitá vlastnost glukanasy jako potenciální sterilitní ta, že se už vyskytuje v přírodních systémech. Ačkoliv rostliny, které postrádají produkci aktivní calasy nebyly v přírodě popsány, téměř jistě se vyskytují mutanty těchto typů. Ztráta produkce calasy bude zabraňovat uvolnění mikrospor- a způsobovat tak ztrá tu pylu a samčí sterilitu. Bude tak zabráněním expresi calasy bude tvořit základ systému samčí sterility.

3Několik studií napovídá, že callasa je pravděpodobně odlišná od dalších typů glukanas, jako jsou PR glukanasy. Například calasová aktivita může být předmětem jak transkripční tak post-transkripční kontroly. To napovídá fakt, že zde jsou silné vztahy mezi pH loculu, callasovou aktivitou a načasováním uvolnění mikrospory (Izhar a i'rankel, '1'heor. and Appl. Genet., 41 , 104-108 (1971)). pH loculu a callasová aktivita se mění koordinovaně vývojově regulovaným způsobem. Ve fertilních Petunia hybrida prašnících je pH během meiosy 6,8 až 7,0 a callasová aktivita je nedetektovatelná. Po meiose, ve čtvrtém stadiu klesá pH loculu, postupně na 5,9 až b,2 a callasová aktivita se zvýší přesně tak, aby vyvolala uvolnění mikrospor.

V určitých samčích sterilních kmenech Petunia jsou pokles pH a objevení callasové aktivity časné a zjevně vedou k poškození mikrosporogenese. Obdobně v jiné třídě mutantů pokles pH a objevení callasové aktivity jsou pozdní a jasně vedou ke ztrátě mikrospor.

Podstata vynálezu

Tak bylo objeveno, že:

1) načasování objevení callasové aktivity je kritické pro normální vývoj spor (pravděpodobně potrat předčasně uvolněných spor inidikuje, že musí dosáhnout jistého vývojového stadia před tím, než se stanou schopnými přežití bez ochrany callasového obalu),

2) snížení pH loculu je paralelní k objevení callasové aktivity a

S

-43) dvě události (produkce callasové aktivity a pokles ptí) jsou koordinovaně nějakým způsobem regulovány.

Přesný charakter koordinované callasové aktivity a aktivity a pH není znám, Pokles pH může aktivovat jinak plně funkční enzym (pasivní aktivace). Alternativně může být enzym syntetizován v inaktivní formě, spíše jako zymogen proteásy a aktivován jako následek nějaké na pH závislé události jako je odstranění N-koncové nebo G-koncové adice (pozitivní aktivace). Skutečnost, že callasa a možná' všechny glukanasy, včetně PR-glukanas, nemá detegovatelnou aktivitu nad pH 6,3, což je pod hodnotou, která byla zjištěna v prašníku před uvolněním mikrospor, může podporovat teorii pasivní aktivace.

Nicméně, protože současné zkoušky na callasu jsou hrubé a jsou odkázána na měření aktivity, je nemožné říci, zda-li je enzym: i) produkován před uvolněním mikrospofcy, ale v nefunkční formě pro pozdější aktivaci; ii) syntetizován v aktivní formě ale pouze v přesnou dobu, kdy je to žádoucí, iii) nebo je syntetizován příležitostně v aktivní formě, uchováván v buňkách tapeta v určitém druhu vesikul a uvolňován do loculu při uvolňování mikrospor. Skutečnost, že pokles pH a callasová aktivita jsou tak pevně korelovány i v případech, kdy callasová aktivita je zjištěna před normální dobou uvolnění mikrospory, by mohla indikovat, že enzym je syntetizován, v inaktivní formě před jeho potřebou a že pokles pří je určitým způsobem odpovědný za jeho aktivaci. Alternativou je, že pokles pH spustí syntézu callasy v buňkách tapeta. Důležité je, že bez znalosti co je správné, nelze určit, zda exprese glukanas, které nejsou callasy, bude produkovat samčí sterilitu.

i

-5Skutečnost, že se callasa jeví v určitých ohledech odlišnou od dříve charakterizovaných glukanas má tři důležité důsledky:

1) glukanasy, jako jsou odolnosti se týkající glukanasy ’*RP^M nemohou^ účinně fungovat za podmínek v loculu a nemohou proto být dostatečně vhodné jako složky

DNA samčí sterility,

2) v případě, že takové glukanasy jsou aktivní v loteulu, maximálně přirozeně, ve smyslu napodobené existujících typů rostlin se samčí sterilitou·, by nicméně bylo požadováno použití autentického cailasového genu. V tomto ohledu samčí sterilitní systém, založený na použití cailasového genu by byl nadřazen jakémukoliv dříve popsanému systému a

3) systém založený na prevenci callasové exprese rozrušením callasové mRNA použitím anti-callasové mRNA, ribozymů nebo callasové anti-sense RNA vyžaduje detailní znalost nukleotidové sekvence callasové mRNA.

Předložený vynález je založen na objevu a identifikaci cailasového genu u členů rodiny tírassicaceae. cDNA odvozená od tohoto genu v Brassica napus a genomické verze genu z Arabidopsis thaliana byly klonovány. Tato a odvozené DNA (zahrnující promotor cailasového genu) mohou být použity v konstrukci artificiálních systémů samčí sterility. Fertilita může být navrácena v F1 generaci za použití anti-sense RNA, ribozymů a RNA-vázajících proteinů.

souladu s prvním aspektem předloženého vynálezu je poskytnuta rekombinantní nebo izolovaná DNA kódující enzym, který má aktivitu cailasového enzymu, zejména 53 kDa cailasového systému brassica napus neoo ekvivalentního proteinu u jiného člena rodiny brassicaceae.

-bV tomto popisu, gen kočující 53 kDa cailasový enzym 3. napus a ekvivalenty tonoto genu u jiných členů čeledi Brassicaceae oudou označovány jako AČ gen.

Výhodné provedení tohoto aspektu vynalezu zanrnuje gen, kódující 53 kúa cailasový enzym z tí.napus samotný a ekvivalenty enzymu? z Araoidopsis tnaliana a jejich cDNA.

Molekulové hmotnosti uvedené výše jsou domnělé a odvozeny od mnoha aminokyselin, jejich přítomnost se předpokládá, jak je odvozeno z i)NA sekvence. 53 kDa protein, kódující A6 gen B.napus má 474 aminokyselin. Gylo odhadnuto, že molekulové hmotnosti se vztahují k neglykosylovanému proteinu. Dále se nepočítá s vlivem jakéhokoliv? postraslačního upravení jako je parciální proteolýza.

i když se výše uvedený nástin týká pouze proteinů B. napus, bude pro odborníky v oboru snadné identifikovat ekvivalentní proteiny z jiných členů čeledi Brasicaceae?. ^apříklaď ekvivalent A6 genu v A.thaliana kóduje putativní protein 479 aminokyselin v délce, mající vypočtenou molekulovou hmotnost 53»7 kDa. Takové ekvivalentní geny mohou být identifikovány h.ydridizačními studiemi, polymorfismem délky restrikčního fragmentu (restriction fragment length pol.ymorpism (RFLP)) a jinými metodami známými v oboru. Geny nebo jiné DNA sekvence, at přirozené, vyrobené genetickým inženýrstvím nebo syntetické, kódující blízce ekvivalentní proteiny mohou například hybridizovat za přísných podmínek (jako je přibližně 35 °^c až 65 °C v solném roztoku přibližně 0,9 molárním) k B.napus A6 genu, nebo jeho fragmentům, například 10, 20, 50 nebo 100 nukleotidů.

až 20 nukleotidóvé sonda by měla být vhodné za mnoha podmínek.

DNA sekvence modifikované nebo lišící se od přirozených Brassicaceae A6 sekvencí jsou v rozsahu vynálezu, jestliže například zajišťují výše uvedená hybridizační kriteria, by je zajištovaly po degeneraci genetického kódu;.

Výhodná A6 kódující sekvence popsaná v tomto popise je z Brassica napus nebo Arabidopsis thaliana a může být izolována metodami známými v oboru, například a) syntetizováním cDNA z mRNA izolované z tyčinek B.napus nebo A. thaliana, b) izolací této cDNA, c) použitím této cDNA jako sondy k identifikaci regionů rostlinného genomu zvolených členů čeledi Brassicaceae, které kódují tyčinkovou specifiskou mRNA a d) identifikací upstream (5*) regulátorových, oblastí, které obsahají promotor této DNA. Tento postup také demonstruje, že sondy založené na, nebo odvozené od, kódujících regionů tyčinkové specifické DNA z jednohu druhu rostliny mohou být použity k izolaci DNA sekvencí, kódujících tyčinkově specifické mRNA z jiných druhů.

Zvláště Referované kódující sekvence jsou uvedeny na obr.1 (pro B.napus A6 gen) a obr.4 (pro A.thaliana A6 gen) jak budou následně popsány v příkladech. Odbornici v oboru budou, na základě zde uvedených informací schop ni. identifikovat s dostatečnou přesností kódující regiony a izolovat a/nebo rekombinovat DNA je obsahující.

DNA v souladu s prvním aspektem vynálezu je vhodná pro poskytnutí systémů samčí sterility. Operativním spojením DNA se vhodným promotorem může být exprimována v době, která by byla přirozeně nevhodná', například příliš časná. Vhodné promotory zahrnují tapetum-specifické promotory jiné než přirozený A6 promotor. Výhodnými promotory jsou mezi jinými ty, které jsou popsány a nárokovány

-8WO-A-9211379 a označeny A3 a A0. Ve WO-A-9211379, jsou gen, kódující 12,9 kDA protein v A.thaliana a ekvivalenty tohoto genu v jiných členech čeledi Brassicaceae. označovány jako A3 gen; gen kódující 11,6 kDA protein v A.thaliana a ekvivalenty tohoto genu v jiných členech čeledi Brassicaaeae, zahrnující gen, kódující 10,3 kDA protein v 3. napus, jsou označovány jako A9 gen* Obsahy WO-A-9211379 jsou zde zahrnuty jako reference.

Objew zahrnutý v tomto vynálezu může být využit mnoha jinými způsoby pro poskytnutí systému samčí sterility. A6 promotor může například být použit pro řízení DNA samčí sterility, která nemusí být specifická.

V souladu s druhým aspektem vynálezu je poskytnuta rekombinantní nebo izolovaná DNA sekvence, obsahující promotor, který přirozeně řídí expresi callasového enzymu, zejmé na 53 kDa callasového enzymu Brassica napus nebo ekvivalentního proteinu v jiném členu čeledi Brassicaceae.

Pro přirozenou specifitu regulace exprese A6 genu; není nezbytné, aby A6 promotor byl připojen ke ke specificky rozrušené DNA pro poskytnutí vhodného systému samčí sterility ( i když může být); může být použita nespecificky rozrušená DNA,.

A6 promotory z jiných členů čeledi Brassicaceae a modifikované A6 promotory mohou být použity a je-li to nezbytné lokalizovány nebo identifikovány a izolovány jak je popsáno výše pro A6 kódující sekvence, mutatis mutandis. ^pět jsou preferované promotory z B.napus a A.thaliana a jsou přirozeně používány k řízení kódujících sekvencí uvedených na obr. 1 a 4, které budou popsány později.

A6 promotor-obsahující DNA v souladu s vynálezem může, jak je indikováno výše, být použita k navození samčí sterility u rostlin, zejména těch, které patří do čeledi

Brasaicaceae, různými způsoby, které budou diskutovány dále. V důležitém provedení vynálezu je dříve popsaný promotor· operativně připojeni k DITA, která, je-li exprimována, působí samčí sterilitu).

Když je účinný sterilitní systém kompletní, musí propagace rodičovských semen' probíhat buá asexuálními způsoby nebo cestou opylení linie samčí sterility isogenraí samčí fertilní linií a následující identifikací nebo selekcí rostlin se samčí sterilitou; mezi potomky. Tam, kde je použita vegetativní propagace vytváří předkládaný vynález kompletní systém pro produkci hybridů. Je-li nezbyt né znovunavození' fertility pro produkci úrody semeni, vytváří předložený vynález základ nového systému samčí sterility. V některých úrodách semen, kde je hladina zkříženého opýiení vysoká, mohou směsi semen mohou umožnit obejití znovunavození. $amčí sterilita bude zejména užitečná v plodinách;, kde není vyžadováno znovunavození fertility jako je Brassica spp., a v dalších jedlých rostlinách jako je salát, špenát a cibule

DNA v souladu s vynálezem a inkorporující A6 promotor může řídit. DNA samčí sterility a tak produkovat rostliny se samčí sterilitou¹, které mohou být použity při produkci hybridů. Promotory jsou vysoce tapetum-specifické a tak sterilitní DNA je pouze exprimována v tapetu. Kontrola exprese je velmi silná a DNA není exprimována v jiných v

buňkách rostliny. Systém zabraňuje produkci životaschopných zn pylu. Všechny transformované rostliny a jejich progeny mají samčí sterilitu; není zde problém s meiotickou segregací.

-10Konstrukt, obsahující promotor operativně připojený k DNA samčí sterility může být transformován do rostlin (zejména rodu Qrassica, ale také druhu jako je Nicotiana a Hordeum) způsoby, které jsou samy o sobě dobře známé, ^ato transformace: vede k produkci rostlin, jejichž buňky obsahují cizórodou chimérickou DNA sekvenci složenou z promotoru a DNA samčí sterility. DNA samčí sterility kóduje RNA, protein nebo polypeptid, které, jsou-li produkovány nebo nadprodukován.y v buňkách tyčinek rostlin, brání' normálnímu vývoji buněk tyčinek. A6 promotor může být použit pro řízeni různých DNA sekvencí samčí sterility, které kódují RNA, proteiny nebo polypeptidy, asi způsobují poškození mechanismu produkce životaschopných samčích gamet. Vynález není omezen sekvencemi řízenými, ale mnoho třiď a příkladů sekvencí samčí sterility řízených promotorem je preferováno.

Napříklaď řiditelná DNA samčí sterility může kodovat lytický enzym. Lytický enzym může působit degradaci jedné nebo více biologicky důležitých molekul Sako jsou makromolekuly zahrnující nukleovou kyselinu, protein (nebo glykoprotein), karbohydrét a ( za.některých podmínek) lipid.

Ribonukleásy (jako je RNasa T1 a barnasa) jsou příklady enzymů, které působí lýzi RNA. Příklady enzymů, které lyžuji DNA zahrnují exonukleásy a andonukleásy, bu3 místně specifické jako je EcoRI nebo místě nespecifické.

Glukanasy jiné než callasa, ke kterým je přirozeně navázána kódující sekvence promotoru podle vynálezu představují příklady enzymů, které působí lýzi karbohydrátů* Enzym glukanasa (callasa) je přirozeně produkován v prašnícícfc, kde působí na uvolněni mladých mikrospoxr z ochranného obalu polyglukanu ustanoveného před meiosou. Objevení se enzymové aktivity je vývojově regulováno tak, aby

-1 1koincidovalo se správným stupněm vývoje mikrospor. Důležitou atrakcí glukaná® jako potenciální sterilitní DNA je, že v přírodě jsou nalezeny rostliny, které mají samčí sterilitu! díky mutacím způsobeným špatným načasováním· exprese callasy a destrukcí mikrospor. Dva typy jsou rozpoznávány v závislosti na tom, jeli objevení se oallasové aktivity časné nebo pozdní. Exprese mnoha genů, včetně těoh, které jsou exprimovány v prašníku, vykazují různé modely temporální regulace. Proto,pro využití oallasy jako sterilitní DNA, musí promotor zvolený pro řízení exprese genu poskytovat vhodnou vývojovou regulaci aktivity glukanasy, výhodně napodobením modelu exprese nalezeného ve spojení s přirozenou samčí sterilitou·. Jeden způsob; dosažení samčí sterility je izolace promotoru z tapetum-specifického genu se stejným modelem exprese jak byl nalezen· pro glukanasovou aktivitu v rostlinných mutantech se samčí sterilitou.

^e-li pozdní exprese glukanasy nepravděpodobná pro produkci sterility v rostlinách s funkčním· genem prašníkové glukanasy, měl by sterilitní faktor vyžadovat promotor schopný řízení trahskripce před objevením se normální glukanasové aktivity. V RM cms mutantu Petunia (Izhar S. a Franke! R. Theor.Appl. Genet., 41 104-108 (1971)) se exprese callasy v prašníku nejprve objevuje na konci meiotické profáze· a zvyšuje se na maximum kompletací melosy. Tento model exprese kontrastuje s tím, který je v normálních rostlinách Petunia, kde glukanasová aktivita v prašnících se objevuje současně s rozlomením tetrad a uvolněním mladých mikrospor. O aberantním modelu oallasové aktivity/ nalezeném v cms mutantu se soudí, že je odpovědný za destrukci mikrospor a samčí sterility. Pro napodobení této mitáce použitím sterilitní DNA kódujícího glukanasového enzymu vyžaduje promotor schopný řízení transkripce ©NA.samší sterility v prašnících; a výhodně v tapetu, během fáze prašníkového vývoje mezi profází meiosy a objevením se tetrad mikrospor; A3 a A9 promotory diskutované výše jsou velmi vhodné pro řízení tohoto genu. íapetum-specifický (nebo alespoň prašníkově-specifický) promotor je také výhodný, protože

Λ

-12(1 > 3 )-glukany byly nalezeny jinde v rostlinách, například v prvcích lýkové sítoviny,kde pravděpodobně mají základní funkce.

Prostorová regulace enzymu by měla také zajistit úspěch na cílových buňkách. Sekrece do lokulárního prostoru je dosaženo podmínkou ve výhodném provedení', translační fúzí přirozené nebo jakékoliv vhodné signální sekvence se sekvencí kódující glukanasu.

DNA kódující glukanasir je výhodnou DNA samčí sterility, jelikož nemá žádný produkt, který je cytotoxický mimo cílové buňky. Glukanasa jako DNA samčí sterility napodobuje přirozené systémy a je inherentně méně destruktivní než například’ ribonukleasa a také nepůsobí problémy, jestliže '•prosákne” do jiných buněk.

Actinidim je příkladem proteasy, a DNA, která jej kóduje může být vhodnou DNA samčí sterility. Jiné příklady zahrnují papain zymogem a papain aktivní protein.

Lipasy, které odpovídají nukleovým kyselinám mohou být vhodné jako DNA samčí sterility a zahrnují fosfolipasu

DNA samčí sterility nemusí kodovat lytický enzym. Jiné příklady DNA samčí sterility kódují enzymy, které katalyzují syntézy fytohormonů jako je isopentyl transferasa, která je zahrnuta v syntéze cytokininm a jeden nebo více en zymů zahrnutých v santéze auxinu. DNA kódující lipoxygenasu nebo jiné enzymy mající škodlivý efekt mohou být také použity.

Jiné DNA samčí sterility obsahujíantisense” sekvence. Zavedení kódujícího regionu genu v opačné orientaci vzhle-13dem k orientaci nalezené v přírodě může vést ke snížené produkci genu a tím; produkci menšího nebo žádného genového produktu. RNA transkribovaná z antisense'’ DNA je schopna se vázat k a narušovat funkci, verze RNA, mající smysl, sekvence normálně' nacházené v buňce a tím poškozovat funkci. Příklady takových anti-sense LNA jsou antisense DNA A6 genu produkované v prašníku za řízení A6 promotoru. Protože tento gen: je normálně exprimován. v tapetu, u opačné orientace k němu lze očekávat rozrušení tapetélní funkce a samčí sterilitu jako výsledek.

Pro opačně orientovanou DNA není podstatné, zda je transkribována v čase^?, kdy je produkován přirozený, smysl mající transkripční produkt. Opačně orientovaná RNA bude obecně pouze vázáná když existuje její smysl mající komplementární řetězec a tak bude· mít své toxické účinky pouze je>li tanskribována RNA, mající smysl. Opačně orientovaná DNA, odpovídající některé nebo všem DNA, kódujícím; A6 genový produkt tak může tak být produkována nejen tehdy, když je exprimován A6 genový produkt. Taková opačně orientovaná DNA může být exprimována přirozeně za řízení jakýmkoliv vhodným promotorem.

V souladu s dalším· aspektem vynálezu je poskytnuta nuk· leová kyselina s opačnou orientací, která obsahuje transkriv bovatelný řetězec DNA komplementární k alespoň části řetězce DNA, který je přirozeně transkribován v genu, kódujícím enzym callasu, jako je: 53 kDa callasa enzym v S.napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu čeledi Brasslcaceae.

Opačně orientovaná DNA v souladu s tímto aspektem vynálezu může být pod kontrolou* jakéhokoliv vhodného promotoru, který umožňuje transkripci během, alee ne nezbytně pouze během, vývoje tapeta. Jak ja uvedeno výše, může být promotor' konstitutivní, ale není vyloučeno použití tapetum specifického promotoru jako je A3 nebo A9 jak je popsáno výše ve vztahu k druhému aspektu vynél^u a může

-14být preferován© pro ještě větší kontrolu-. Taková opačně orientovaná DNA by mohla být použitelná v navození samčí sterility členů čeledi Brassicaceae:'.

Ještě další příklad DNA samčí sterility kóduje RNA enzym (známý jako ribozyme) schopný vysoce specifického štěpeni' dané cílové sekvence (Haseloff a Gerlach Nátuře 334 585-591 (1988). Podobně jako opačně orientovaná DNA, ribozym DNA (kódující v tomto případě ribozym, který je cílený proti RNA kódující A6 gen) není exprimován pouze v době exprese A6 genu·'. Opět může být možné použití vhoďného promotoru k řízení ribozym-kodující DNA, zahrnujícího ten, který je adaptován pro konstitutivní expresi.

Podle dalšího aspektu vynálezu je poskytnuta DNA, kódující ribozym schopný specifického štěpeni RNA kodoyánbuggenem., kódujícím enzym callasu, jako je 53 kDa callasa enzym v ET.napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu čeledi Brassicaceae. Taková ribozym kočující DNA fey měla být obecně použitelná při navození samčí sterility u členů čeledi Brassicaceae.

Ve výhodných provedeních DNA sekvencí podle vynálezu, zahrnujících ty, které obsahují konst_rukt A6 promotor-DNA samčí sterility, 3* transkripci regulující signály, zahrnující polyadenylační signál, mohou být poskytnuty. Výhodné 3'transkripci regulující signály jsou odvozeny od 35S genu květákové mozaiky. Mělo by být známo, že mohou také být použity jiné signály regulující 3*transkripci.

Opačně orientovaná nukleová kyselina a ribozym kódující nukleová kyselina popsané výše jsou příklady více: obecných zásad; podle jiného aspektu vynálezu je zde poskyt nuta DNA, která působí (například svoji expresí) selektivní rozrušení správné exprese callasy, nebo ve výhodných provedeních A6, genu.

-15Rekombinantní DNA v souladu s vynálezem může být ve formě vektoru. Vektorem může například být plasmid, kosmid nebo fág. Vektory budou často zahrnovat jeden nebo víc© selektujících markérů pro umožnění selekce transfektovaných buněk, (nebo transformovaných: v tomto popise jsou tyto výrazy použity jako zaměnitelné') a výhodně pro usnadnění selekce buněk, přechovávajících vektory inkorporováním heterologní DNA. Vhodné start a stop signály budou obecně přítomny. Dále, je-li vektor zamýšlen pro expresi, budeu přítomny dostatečné regulační sekvence pro řízení exprese; nicméně DNA podle předloženého vynálezu bude obecně exprimována v rostlinných buňkách a tak mikrobiální hostitelská exprese nebude mezi primárními cíli předloženého vynálezu) i když není vyloučena. Vektory nezahrnující regulační sekvence jsou vhodné jako klonovací vektory.

Klonovací vektory mohou být zavedeny do E.coli nebo jiného vhodného hostitele, který usnadňuje manipulaci s nimi.. V souladu s dalším aspektem vynálezu je zde poskytnuta hostitelská buňka transfektovaná nebo transformovaná výše popsanou DNA.

DNA v souladu s tímto vynálezem může být připravena jakoukoliv obvyklou metodou, zahrnující kopulaci spolu s následujícími nukleotidy a/nebo ligací oligo- a/nebo polynukleotidů, zahrnujících procesy in vitro, ale rekombinantní DNA technologie představuje metodu; volby.

Konečně, DNA v souladu s vynálezem (aí/i) A6 promotor plus gen samčí sterility, ii) opačně orientované DNA k A6 genu nebo ribozomová DNA cílená k A6 RNA) bude zavedena do rostlinných buněk, jakýmikoliv vhodnými způsoby. V souladu s dalším aspektem vynálezu je poskytnuta rostlinná buňka, obsahující DNA podle vynálezu jak je popsána výše.

Výhodně je DNA transformována do rostlinných buněk poušitím bezraménkového Ti-plasmidového vektoru- a neseného Agrobacterianr postupy v oboru známými, například jak je popsáno v EP-A-0116718 a EP-A-0270822. Alternativně by cizorodá DNA měla být zaváděna přímo do rostlinných buněk za použití zařízení s elektrickým nábojem. Tato metoda je preferována jestliže je Agrobacterium neúčinné, například je-li rostlina, která je příjemcem jednoděložné. Jakákoliv jiná metoda, které poskytuje stabilní inkorporaci DNA v nukleární DNA jakékoliv rostlinné buňce jakéhokoliv rodu může být také vhodná.

Výhodná DNA v souladu s vynálezem také obsahuje druhý chimérický gen (“markér“ gen), který umožňuje transformované rostlině’, obsahující cizorodou DNA, aby byla snadno rozlišitelná od jiných rostlin, které neobsahují cizorodou DNA. Příklady takového markér genu zahrnujf rezistenci k antibiotikům (Herrera-Estrella a spol., EMBO ď. 2, 987-995 (1983)), herbicidní rezistenci (EP-A-0242246) a expresi glucuronidasy (GUS) (EP-A-0344029)· Exprese markér genu je výhodně řízena druhým promotorem, který dovoluje' expresi v jiných buňkách než je tapetum,a tak dovoluje selekci buněk nebo tkáně, obsahující markér· v jakémkoliv stadiu regenerace rostliny. Výhodný druhý promotor je odvozen od genu, který kóduje 35S podjednotku obalového proteinu viru květákové mozaiky (CaMV). Nicméně může být použit jakýkoliv jiný vhodný sekundární promotor.

^elá rostlina může být regenerována z jediné transformované rostlinné buňky a vynález proto poskytuje transgenní rostliny (nebo jejich části, jako je propagační materiál) obsahující DNA v souladu s vynálezem jak je popsáno výše. Regenerace může být prováděna známými metodami. Když transformované rostlina kvete, může být vidět, že má samčí steri

-17litu, která se projeví neschopností produkovat; životaschopná pylová zrna. Jestliže jsou pylová zrna produkována mohou se změnit na neživotaschopná neschopností ovlivnit semena na rostlině příjemce.

Samčí sterilita omezená- prostředky podle předloženého vynálezu, může být obnovena vhodným obnovovacím systémem, jehož charakter bude korespondovat a jednotlivým způsobem použitým pro navození samčí sterility rostliny. Specifické a preferované restaurační systémy popsané dále jsou založeny na rozdílných mechanismech: opačně orientované RNA a ribozymech.

Opačně orientovaná RNA: tam, kde poškozující gen kóduje' ne-prašníkovou mRNA, jako je mRNA pro protein actinidin, je restaurace poskytnuta křížením do rostliny se samčí sterilitou genu, kódujícího opačně orientovanou RNA specifickou k poškozující mRNA řízením tapetum-specifickým promotorem se vhodnou časovou regulací'. Toto bude vést k destrukci správně orientované mRNA a navrácení fertility. Tento přistup není aplikovatelný, je-li poškozujícím činitelem předčasně exprimovaná callasa, protože exprese callas.pvé mRNA v opačné orientaci povede k destrukci jak cílové poškozující callasové mRNA tak normální callasové mRNA, která je v$pžadována pro uvolnění mikrospor a produkci životaschopných zrn pylu. Fertilita tak nemůže být restaurována.

Ribozymy: tento postup je obecněji aplikovatelný, protože cílové místo pro ribozymy je malé a proto může být zpracována do jakékoliv mRNA. Toto v zásadě umožňuje jakékoliv zavedené mRNA stát se specificky^cílenou pro destrukci. Tak jsou mRNA kódující nespecifické poškozující funkce jako je actinidin rozrušeny a fertilita je restaurována křížením v genu, kódujícím robozomy specifická k actinidinové mRNA.

-18Tam, kde je poškozujícím činidlem callasa, dosáhne se restaurace? křížením v genech, kódujících ribomymy specifické ke krátké syntetické sekvenci, zaváděné do ne-transla tovaného leadra přeůaturovaně exprimované poškozující calla sové mRNA. Protože^ tato sekvence není přítomna v normální nemodifikované callasové mRNA je správné načasování callasové aktivity neúčinné a fertilita je restaurována.

Byly popsány některé výhodné rysy vynálezu pouze w souvislosti s jeho jedním aspektem. Je třeba chápat, že? preference se vztahují na všechny aspekty vynálezu mutatis mutandis.

Popis obrázků na připojených výkresech

Vynález bude nyní ilustrováni mnoha neomezujícími příklady, které se odkazují na připojené obrázky, kde:

obr.1 představuje DNA sekvenci B.napus cDNA A6 spolu s odvozen,óa proteinovou sekvencí ORP obsaženou v A6, obr. 2 ukazuje seřazení odvozené primární struktury B.napus a A.thaliana A6 genů? s primární strukturou dříve popsaných glukanas, klíč je následující:

Bn A6: 53 kDa prašníkový-specifický protein B.napuis At G62: odpovídající A6 protein z A.thaliana NPGLUG: tabáková /3-1,3-glukanása (základní) (De Loose a spol., Gene 70 13-23 (1988)

BEÁN: fazolová β-1,3-glukanása (Edington a spol.,

Plant Mol.Biol. 16, 81-94 (1991 ))

PR-Q: tabáková/5-1,3-glukanása (extra-celulární) (Payne a spol., Plant Mol.Biol. 15 797-808 (1990))

Barley: Hoj a spol., Plant Mol.Biol. 13» 31-42 (1989)

-19Obr.Jpředstavuje restrikční enzymovou mapu A. thaliana genomického klonu G6.2. Jsou uvedena pouze relevantní místa a tato nesmějí být unikátní v G6.2. Poloha kódujícího regionu A6 je .-. označena jako plý obdélník.

Je také znázorněn rozsah inzertu klonovaného do plasmidu pDIH9,

Obr. 4 představuje DNA sekvenci a předpokládanou strukturu A.thaliana A6 genu. Podtržené' sekvence je v souladu & TATA box motivem.

Obr.5a představuje porovnání DNA sekvencí z B.napus cDNA A6 s A.thaliana A6 genem. Podtržené trinukleotidy označují start a stop polohy A6 kódujících sekvencí.

Obr.5b představuje porovnání předpokládaného? polypeptidu kódovaného? B-.napus cDNA A6 s tím, který je kodován A.thaliana A6 genem.

Obr. 6 představuje konstrukci chimérického genu, obsahujícího transkripční fúzi mezi A6 promotorem a E.coli genem, kódujícím -glucuronidasu.

Obr.7a se vztahuje k příkladu 3a a ukazuje konstrukci chimérického genu, obsahujícího transkripční fúzi mezi A6? promotorem a sekvencí kódující zralou barnasu.

Obr. 7b se týká příkladu 3h? a ukazuje konstrukci chimérického genu, obsahující transkripční fúzi mezi A6 promotorem a sekvencí, kódující actinidin.

Obr.8 představuje konstrukci chimerních. genů mezi tapetumspecifickými promotory a A.thaliana callasou: a) transkripční fúze mezi A9 promotorem a callasou, b) transkripční fúze¹ mezi A9 a A6 promotory s callasou postrádající sekvenci kódující proteinový C-terminální rozsah a

-20Obr. 9 představuje konstrukci plasmidů pWP80, pW83 a pW88.

V obrázcích jsou použity následující zkratky pro restrikční enzymy:

B> BamHI; Bg, BglII; G, Glal; Hd, HinďlII; K, KpnI;

N, Notl; Nc, Nool; Np, NspI; Nr, Nrul; P, Pstl; RI,

EcoRI; RV, EooRV; S, SSttl; Sa, Sáli; Sp, SpHI; Srn,

Smál; Sil, SacJI; X, Xhol; Xb, Xbal.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace cDNA kódující prašník specifickou^(1,3)glukanasu (callasu) z Brassica napus a izolace odpovídajícího genu z Arabidopsis thaliana

Prašník-specifické cDNA byly izolovány diferenciálním· screeningem Brassica napus cDNA knihoven, konstruovaných z RNA extrahovaných z vyříznutých prašníků jak je popsáno dále (Scott a spol., Plant Mol.Biol. v tisku). cDNA klon A6 byl izolován z knihovny konstruované z prašníků, které byly 1,8 až 2,0 mm dlouhé.. Tato knihovna byla konstruována ve vektoru Lambda Zapil (Stratagene). A6 cDNA byla použita jako sonda pro izolaci homologních genů z A.thaliana genomické knihovny konstruované ve vektoru Lambda Dash (Stratagene ).

Materiály a metody

Rostlinný materiál: Všechen semenný materiál pro izolaci nukleové kyseliny byl získán ze 2 až 3 týdhy starých rostliffi pěstovaných v řízeném prostředí růstové komůrky s 18hodinovou periodou· při 24 °'G. Semenáěková RNA pro screening a analýzu Northern blot byla získána z B.napus oleifera var. ”Topaz. Samčí fertilní pupeny byly shromážděny z na poli

-21rostoucích rostlin B.napus oleifera var.”Lictor” (Nickersons Seeds, Cambridge, UK). Samčí sterilní pupeny byly získány z na poli rostoucích rostlin B.napus var. CMSogura” (Nickersons Seede, Cambridge, UK).

Vyříznutí prašníků. Pro konstrukci cDNA byly špičky květů rychle sklizeny a uchovávány při 4 °C podle potřeby, ale ne déle než 5 hodin» Prašníky byly vyříznuty z pupenů přiměřené velikosti za použití jemných kleštiček a ihned zmrazený v kapalném dusíku.

Sbírání pupenů. Velké vzorky kompletních přeslenů pupenů, ve stadiu těsné před otevřením prvních květů, byly o?

zmrazený v kapalném dusíku a uchovávány při t80 C.

Cytologické přípravné stadium prašníků a pupenů.

Vývojové stadium; pupenů předem stanovené délky bylo hoďnoceno světelným mikroskopeg&ckým hodnocením sporogenních buněk,, mikrospor nebo; pylových zr® extrudovaných z celých prešníků rozdrcených za přítomnosti aceto-orceinu nebo akridinové oranže. Přesné stanovení délky pupenu bylo provedeno za použití' slabého; světelného mikroskopu opatřeného kalibrovanou mřížkou upravenou pro hodnocení okem,.

Byla měřena délka pupenů očB základny pediclu k okraji nejjdelšího kališního lístku.

Izolace a analýza RNA. ^ateriál zamýšlený pro Northern dot blot analýzu s nízkou resolucí nebo pro· mRNA izolaci byly mlety na jemný prášek v hmoždíři chlazeném kapalným dusíkem.. Všechna RNA byly izolována z prášku za použití metody na bázi fenolu jak bylo již popsáno (Draper a spol., ”Plant Geneti© Transformation and Gene Expression; A Laboratory Manual”, Blackwell Scientific Publishers, Oxford (1988)). Poly(A)⁺RNA byla čištěna dvěma cykly oligo(dT)celulozové chromatografie v podstatě jak je popsán© v práci Maniatise a spol. (manual). RNA pro dot blot s vysokou resolucí byla izolována podle metody Verwoerda a spol.,

-22Nu©.Aoids Res, 17 2362 (1989).

Konstrukce a screening cDNA knihovny. cDNA byly syntetizovány z póly(A) RNA za použití (Amersham) nebn (Pharmacia) cDNA syntézních kitů,, podle pokynů výrobce.. cDNA byly ligovány do EcoRI štěpeného defoforylátovaného lambda Zap I (Stratagene) (“sporogenesis” knihovna) nebo lambda Zap II (Stratagene) (mikrosporov$ vývojová'* knihovna) a a zabaleny použití Amersham in vitro balících extraktů. (Při klonování do lambda Zap II, byly použity EcoRI linkery (Pharmacia Ltd); tyto linkery také obsahují' vnitřní Notl místa, takže celá cDNA může být získána jako Notl fragment, s tou podmínkou, že cDNA neobsahuje vnitřní Notl místa).. Klony byly diferenciálně screenovény na dvojitých HYBOND-N filtrech (Amersham) sb /^²P/- značenou jednořetězcovou cDNA sondou připravenou buá ze vhodné prašníkové póly (a)⁺RNA nebo semenáčkové po!y(A)⁺RNA podle Sargent Methods in EnzymoX. 152 423-432 (198?).(Výraz HYBOND-N je ochranná známka).

RNA tečkové a gelové bloty. Všechna RNA pro tečkové bloty? byla sledována na HYBOND N (Amersham) podle pokynů výrobce. Byly provedeny Northern gely a RNA přenesena na HYBOND-N podle Fourneye (BRL Focus 19 5-7 (1988)). Hybridizace a promytí HYBOND-N filtrů byly provedeny podle instrukcí výrobce.,

In sítu hybridizace'. Pro uložení a sekcionování B.napus pupeny byly zmrazený v CRYO-M-BED (TAAB Laboratories Equipment Ltd.). (Výraz CRYO-M-BED je ochranná známka). Sekce; byly nařezány na nominální 10 /um tloušíku, usazeny na podložní sklíčka (Van Prooijen-Knegt a spol. Histochemical J. 14 333-344 (1983)) fixací ve 4% paraformaldehydu a dehydratovány. /^^S/rUTP ( > 1000 Ci/mmol, Amersham; Sď. 1303) značenésense a anti-sense RNA sondy byly transkri.bovány z T3 a T7 promotorů BLUESCRIPT SK“ (Stratagene), ve ktefiých jsou cDNA klonovány. (Vyraz BLUESCRIPT SK je

-23ochranná známka). Po transkripci byly sondy štěpeny alkalickou hydrolýzou pro získánísondových fragmentů přibližně 150 bp délky. Hybridizační roztok toyl 50% formamid¹, 300 mM NaCl, 10 mM Ná₂HPO₄ pff 6,8, 10 mM Tris-HCl pff 7,5, 5 mM EDTA, 0,02% telecí sérový albumin, 0,02 Ficoll, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 10 mM dithithreitol, 10% dextran sulfát, 0,7mg/ml E.coli tRNA, 50-100 ng/ml sondový zásobní roztok (6,7x10^ cpm/ng. sondy). Sekoe byly hybridizovány ve 30 /ul hybridizačního; roztoku při 50 °C po 16 hodin. Řezy byly promyty 3x1 h při 50 °'C v 50% formamidu, 300mM NaCl, 1 OmM Na₂HPO₄ pff 6,8, 10 mM Tris-HCl pff 7,5 a pak opláchnuty v RNasa A pufrui pro odstranění formamidu. RNasa A ošetření (150 /Ug/ml RNasa A v 500mM NaCl, lOmM Tris HC1 pff 7,5), bylo prováděno při 37 °C po 1 h. Řezy pak byly promyty dvakrát v 2xSSC (0,3M NaCl, 0,03M Na-citrát, pff 7,0) při 65 °C po 30 minut, dehydratovány postupně alkoholy a sušeny. Pro’ autoradiografii byly řezy ponořeny při 45 °C do ILFORD K5 nukleárn stopové emulzi (1 g/ml ve směsi 1:59 glycerin/voda). (Výraz ILFORD K5 je ochranná známka). Čas expozice byl mezi 2 a 14 dny. Vyvíjeno bylo v KODAK D19. (Výraz KODJ1K D19 je ochranná známka). Následující bylo vybarvení připravených sekcí methylenovou modří a bylo trvalé.

a) Analýza B.napus A6 cDNA

Northern hybridizační analýza za použití RNA extrahované z B.napus prešníků, pylu, pestíků a semenáčků zjistila, že A6 byl exprimován pouze v prašnících délky 1,5 až 2,0 mm s maximální expresí při asi 1,8 mm. A6 temporální exprese vyznačuje periodu ve vývoji prašníku, kdy jsou mikrosporocyty v meiotickém dělení na časnou mikrosporovou interfázi. A6 cDNA má délku 1532 bp a obsahuje čtecí rámeček (open-reading frame - ORF) zasahující z polohy 1-1424 bp (obr.1) což potvrzuje, že tento klon nemá úplnou délku. Vyhodnocená velikost S.napus A6 mRNA z Northern gel blotů je asi 1700 bp, což opět potvrzuje, že tento klon

-24nemé úplnou délku. ORF kóduje polypeptid 474 aminokyselin s molekulovou hmotností 53 kDa, který je homologní k patogenesi-vztažen$m(PR)a .jiným dříve charakterizovaným fb (1,3)glukanasám (obr .2)a jasně potvrzuje,, že A6 kóduje prašníkspecifickou /3 (1,3)glukanasu (callasu). Jak bude popsáno dále v příkladu 6, produkce opačně orientované RNA k A6 transkriptu v prašnících transgenních rostlin produkuje rostliny se samčí sterilitou. Tyto rostliny mají fenotyp, který je konzistentní, při biochemické a cytologické hladině, s potvrzením, že A6 kóduje callasu.

Srovnání A6 s /¾ (1,3)glukanasami ukazuje, že A6 je výrazně delší díky přítomnosti dlouhého C-terminálního prodloužení, kde začátek tohoto prodloužení odpovídá C-zakončení zralého β(1,3)-glukanasového enzymu. Hladina homologie A6 k jiným glukanasám přes velmi signifikantní (33 % iden tita v oblasti homologie) je nicméně menší než je mezi nejroz dílnějšími dříve izolovanými fb (1 ,3 )glukanasami (51% identita). Tak A6 protein^- není rozpoznáván protilátkami zasahujícími do acidické PR glukanasy rajčete nebo do bázické hormonálně indukovanéβ (1,3)glukanasy tabáku. Není pozorována žádná hybridizace k B.napus prašníkové RNA nebo k B,napus cDNA knihovně za použití ^²P značených A.thaliana genomiékých glukanaspvých sekvencí (od F.Ausubel) nebo použitím ^J P značeného pGL43, klonu, obsahujícího; bázickou /2j(1 ,3)glukanasu z N.tabacum·. (Shinshi a spol. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85, 5541-5545 (1988)). N_ení tak možno klonovat prašník-specifické callasy použitím dostupných /3(1,3)glukanasových sekvencí nebo protilátek. Nicméně porovnání A6 s; jinými glukanasami uvedené na obr. 2 umožňuje identifikaci aminokyselin;, které jsou pravděpodobně konzervovány ve všech glukanasách. To umožňuje sestavení oligonukleotidů, které budou specifickými sondami pro /2(1 ,3 )glukanasy^T a tak umožní

-25klonování prašník-specifických glukanasových cDNA nebo genů z jiných rostlinných druhů. Callasa může být rozlišena oď jiných/?) (1 ,3)glukanas díky svému jedinečnému prostorovému a časovému; modelu exprese spojenému s možností delšího C-koncového prodloužení než u jiných /5(1,3)glukanas.

b) Izolace a charakterizace homologních genů k A6 v A. thaliana.

Dva genomické klony byly izolovány z A.thaliana genomické knihovny, které hybridizují k B.napus A6 cDNA. Jeden, G6.2, byl analyzován detailně (obr. 3)* 3,2 kb) EcoRI fragment byl subklonován ďo EcoRI řezu pTZ18U /Pharmacia) za tvorby pD'IH9 (obr. 3) a byla sekvenována kódující oblast A6 a 88 bp ve směru (obr. 4). Porovnání B.napus a A.thaliana A6 sekvencí ukazuje, že byly z 85 % identické v kódujících oblastech (obr.5a) v hladině nukleotidů a z 83 % identické v proteinové hladině (obr.5b). Porovnání sekvencí ukazuje, že ORF kódovaný⁷ B.napus cDNA je vždy plné délky a pravděpodobně postrádá asi 5 zbytků na N-koňci. A. thaliana A6 gen kóduje produkt 479 aminokyselin s předpovězenou molekulovou hmotností 53,7 kDa. A6 proteiny měly hyd rofobní N-koncovou sekvenci, což je v souladu s pravidly definovanými von Heijnem: (ď.Mol.Biol. 184, 99-105 (1985) pro signální sekvence. Callasa je sekretována z tapeta do prašní kového loculu, proto by mohla být možná jako sekvence.

Jiný genomický klon (G6.1), který byl izolován, byl částečně sekvenován a byl označen jakn vlastně identický s G6.2 jak v A6 kódující oblasti tak také v předpokládané A6 promotorové oblasti.

-26Příklad 2

Použití A6 promotoru pro řízení exprese glukuronidasy w prašnícíoh Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum a 2ea mays

Pro demonstraci, že domnělá promotorově oblast A6 je schopna řízení exprese cizorodého genu v A.thaliana,

B.napus, H.vulgare a N.tabacum byla provedena transkripční fúze promotoru ke genu Escherichia coli, kódujícímu H>-glukuronidasu (GUS). 844 bp EcoRI-NspI fragment (poloha 1-884 bp na obr. 4), obsahující předpokládaný A6 promotor· se vyřízne z pDIH9 a konce se zatupí pomocí Klenowa fragmentu. Tento fragment je klonován do Smál místa pBluescript tvořícího pDIH10 (obr»6). A6 promotor jet pak klonován jako Sáli, BamHI fragment do pBT101.1 (Jefferson a spol., EMBO.

J. 6, 3901-3907 (1987)) za tvorby pDIřfl 1 (obr.6). T_ento plasmid obsahuje A6 promotor transkripčně fúzovaný ke GUS. pDIH'1 1 je pak transformován do N.tabacum:, A.thaliana, B.napus H.vulgare a 2.mayss za použití standardních transformačních technik. Transformace H.vulgar© se dosáhne za pomoci mikroprojektilové pušky. Analýza transformovaných rostlin demonstruje, že GUS aktivita je lokalizována v prašníkových tkánícJh, specificky k tapetálním buňkám. Časová regulace GUS aktivity je identická s časovou expresí pozorovanou u A6 genů jak je popsáno v příkladu 1. A6 promotor řídí transkripci v tapetálních buňkách během periody, počíbající v meiocytovém stadiu vývoje a končící během časné mikrosporové interfáze.

Použití A6 promotoru pro vytvoření rostlin se samčí sterilitou

Tapetum-specifické promotory mohou být použity při různých způsobech přípravy rostlin se samčí sterilitou.

-27Například může být samčí sterility dosaženo použitím tapetum-specifického promotoru pro expresi opačně a správně orientovaných (antisense a sense) transkriptů, odpovídajících tapetálním mediátorů (viz příklad 6), řízení prematurované exprese glukanasové aktivity (viz příklad 4) a řízení exprese cytotoxickýcli činidel jako jsou proteasy a nukleasy.

Příklad 3

Konstrukce chimérického A6-barnasa genu a chimérického A6-aktinidin genu a jejich exprese v transgenních rostlinách

Pro demonstraci vhodnosti se A6 promotor použije pro řízení exprese RNAasy, barnasy a proteásy, aktinidinu, v tapetálních buňkách.

Příklad 3A

Konstrukce a exprese chimérní genové fúze mezi tapetum-specifickým A6 promotorem· a barnasou v transgenních rostlinách

Pro demonstraci vhodnosti A6 promotoru se tento použije pro řízení exprese RNAasy, barnasy, v tapetálních buňkách. Použití barnasového genu k vytvoření rostlin se samčí sterilitou bylo popsáno v patentové přihlášce EP-A0344029 (Plant Genetic Systems) a bylo publikováno Marianini a spol. Nátuře 347, 737-741.

Oligonukleotidové primery 5 'GGGTCTAGACGATGGGCAGAGGTTATCAACACGTTTGACGGG 3 'a 5'GTAAAACGACGGCCAGTGCC 3 ' se použijí v polymerázové řetězové reakci (PCR) pro generování fragmentu, kódujícího barstar a maturovaný barbasový produkt z plasmidu pTG2 (Horovitz a spol., J.Mol.Biol.

216, 1031-1044 (1990)). První primer je homologní k nukleo-28tidům 195-221 bp z obr. 1 v Hartley R.W., ď.Mol.Biol. 202, 913-915. Druhý primer je homologní k sekvenci bezprostředně následující po HindlII místu pTZ18G (Pharmacia). PCR fragment je štěpen Xbal a klonován do Xbal-řezu pDIH12 tvořícího pDIR13, ve kterém je A6 promotor transkripčně fúzováni k maturované barnasové sekvenci (obr.7).(pDIH12 je konstruován klonováním KpnI, Xbal fragmentu pDIH10 (obr.6) do KpnI, Xbal-řezu pWP80 (viz dále a WO-A-9211379)). Tato genová fúze je přenesena do pBinl 9 (Bevan a spol. 1984) ligací EcoRV fragmentu pDIH13 k Smal-řezu pBinl 9. p3in19 derivát plasmidu je transformován do N.tabacum, B.napus, H. vulgare a Z.mays, kde exprese barbasy v transgenních rostlinách vede k degradaci tapetálních a mikrosporocytových buněk prašníku a vyvolává samáí sterilitu.

Plasmidy pWP8Q, a pWP88 pWP80, intermediátorový vektor, navržený pro expresi sense a anti-sense RNA použitím A.thaliana tapetum-specifického A9 promotoru?, byl konstruován následovně. Izolace? A.thaliana tapetum-specifického A9 promotora je popsána ve WO-A-9211379. Pro konstrukci pWPSO, je pWP72 (WO-A9211379) štěpen pomocí Xbal a religován, odstraní se tak BamHI místo v polylinkeru a vytvoří se pWP78 (obr.9).

KpnI, Ssťl (Sstl konec otupen Klenowem) A9 promotorový fragment pWP78 je ligován do KpnI, Smal-řezu pJIT60 za tvorby pWP80 (obr. 9). Tento meziproduktový vektor obsahuje 936 bp A9 promotorový fragment fúzovaný k polylinkeru odvozenému z pBluescriptu s 35S CaMV polyadenylaěním signálem. pJITóO je identický k pJIT30 (Guerineau a spol., Plant Mol.Biol. 15, 127-136 (1990) s tím rozdílem, že CaMV 35S promotor pJIT30 je nahrazen dvojitým 35S CaMV promotorem.

pWP83, intermediátorový vektor pro expresi správně a opačně orientované RNA za použití konstitutivního CaMV 35S promotoru, byl konstruován následovně. A9 promotor pWP80 je nahrazen dvojitým CaMV 35S promotorem klono-29váním 785 bp KpnI, Xbal fragmentu pJIT60 ďo KpnI, Xbalřezu pWP8O, za tvorby pWP83 (obr. 9).

pWP88, intermediátorový vektor pro expresi správně a opačně orientované RNA použitím A3 promotoru, byl konstruován následovně. Izolace A.thaliana tapetum-specifiokého A3 promotoru' je popsána ve WO-A-9211 379. CaMV promotor pWP83 je nahrazen A3 promotore® klonováním 745 bp KpnI, hindlll fragmentu pWP87 (WO-A-921 1379) do KpnI, HindlII-řezu pWP83, za tvorby pWP88 (obr. 9).

pWP80, pWP83 a pWP88 jsou proto identické pokud jde o promotorovou oblast a přiléhající rest.rikční enzymová místa.

Příklad 33

Konstrukce a exprese chimerní genové fúze mezi tapetumspedifickým A6 promotorem a aktinidinem v transgenních rostlinách

Cel^ cDNA klon, kódující aktinidin se izoluje jako EcoRI, tíamHI fragment z pK1W1450 (Podivínsky a spol., Nuc.Acids Res. 17, 8363 (1989)) a je reklonován do EcoRI, tíamHI-řezu pBluescriptu KS- (Stratagene) za tvorby pWP100. Oligonukleotiďbvé primery5^<GGGACTAGTCCATGGGTTTGCCOAAATCC 3/ a

5* AATAOGACTCAGTATAG 3 se použijí v PCR reakci pro generování DNA fragmentu, obsahujícího celou kódující oblast aktinidinu, ale se sekvencí bezprostředně před počátkem/ÁTG* genu; mutovaného k típel místu. Pření přiměř je komplementární k polohám 38-55 bp

-30obr. 1 (Podivínsky a spol. 1989) a druhý je homologní k sekvenci bezprostředně následující ke KpnI místu pBluescriptu KS-. Tento PCR fragment se štěpí pomocí Spěl a SstlI a klonuje do Xbal, SstlI-řezu pDIH12 za tvorby pAbact (obr. 70). A6-aktinidin chimérický gen je pak získán jako EcoRV fragment získaný parciálním EcoRV štěpením pAóact a klonováním ďo Smal-řezu pBinl9 (Sevan; a spol. 1984). pSinl 9 derivatizovaný plasmid se transformuje db N.tabacum, B.napus a H.vulgare, kde exprese aktinidinu v transgenních rostlinách vede k samčí sterilitě.

Příklady 4 až 9

Použití kódující sekvence A6 genu pra produkci rostlin se samčí sterilitou

Příklad 4A

Konstrukce a exprese chimérní genové fúze?mezi tapetumspecifickým promotorem A9 a A6 genu v transgenních rostlinách

Časový model exprese tapetum- specifických A3 a A9 genů determinovaný z Northern analýzy a promotor-GUS fúzí ukazmje, že oba promotory jsou aktivní ve stupních vývoje prašníku před uvolněním mikrospor z tetrad (viz WO-A-9211379). Tak je promotor vhodný pro řízení prematurované exprese (1,3) glukanasy v prašnících, což vede k samčí sterilitě. Chimérní fúze mezi těmito promotory a bud B.napus A6 cDNA nebo A. thaliana A8 gen kódující oblastí, může být konstruován.

Na obr. 8a je uvedena konstrukce A9 promotorové fúze k A.thaliana A6 genu. Gligonukleotidové primery jsou navrženy k 5* netranstlatované leader sekvenci A.thaliana genu a k 3' konci tohoto genu tak, že může být získán kompletní A6 gen použitím polymerasové řetězové reakce z pDIH9.

-31Primery byly zkonstruovány s restrikčnimi místy Spěl a SstlI pro klonování PGR A6 genu do vektorů, obsahujících tapetum-specické promotory. 5' příměr také obsahuje GTC sekvenci (podtržena), která, v RNA, je cílem pro štěpení ribozymy, popsaném v příkladu 5.

5* oligonukleotidové sekvence je:5'ggactagtgtcagggtgacaaagagatgtctgtto 3*

3'sekvence je:5 * CCCCGCGGTGACAGAGTAACGGTGGGAAACTTGG 3 *

A6 PGR fragment je klonován jako 1548 bp Spěl, SstlI fragment do Xbal, SstlI-řezu pWP80 (viz WO-A-9211379), za tvorby transkripční ffúze mezi A9 a A6 geny (obr. 8a). Tento konstrukt je přenesen do pBun19 jako Sstl, Xhol fragment

Příklad 4b

Konstrukce a exprese chimérických genových fúzí A9 nebo A6 promotoru k A6 genu, který postrádá sekvence, kódující Gterminální prodloužení' prašník-specifické glukanasy v transgenních rostlinách

A6 protein má dlouhé C-terminélní prodloužení, je-li srovnáván s jinými dříve sekvenovánými rostlinnými glukanasami (obr.2). Extracelulární glukanasy nemají C-terminální prodloužení na rozdíl od těch, které jsou známy jako lokalizované v rostlinné vakuole. C-terminální prodloužení v prašník-specifické glukanase musí tak být vyžadováno pro cílení do intracelulárního zásobního tělesa ořed jeho uvolěním do loculu. Odstranění C-terminálního prodloužení

-32A6 může vést k bezprostřednímu exportu· glukanasy do lokulu tak, že A6 promotor dále k A3 a A9 promotoru bude působit samčí sterilitu, je-li exprimován jako konstrukt. Obr. 8b představuje konstrukci chimérických genů mezi A9 a A6 promotory a prašník-specifiokou glukanasu, která postrádá G-terminální prodloužení. Oligonukleotidové primery:

5'GGGACTAOTGTCACGCTGAOAAAGACATGTCTCT‘ÍO 3 ^z a p'CGGGCGGTTAGAAATGTACGTGTAGATTGG y se použijí k PGR 1208 bp fragmentu z pDIH9. Tento je buá klonován jako Spěl, SstlI fragment do pWP80 nebo jako Spěl, SstlX fragment do pDIH12. Oba chimérické geny byly transferovány do p3in19.

Všechny pBinl 9 konstrukty jsou transformovány do N. tabacum, B.napus a H.vulgare. Transgenní rostliny jsou se samčí sterilitou.

Příklad 5

Znovunavrácení fertility u rostlin popsaných v příkladu 4

Znovunavráoení fertility se dosáhne křížčním rostlin se samčí sterilitou s transgenními rostlinami, které v tapetu exprimují ribozym, který rozpoznává a štěpí sekvenci zavedehou k 5 leadru PCR A6 genu (přirozená A6 mRNA postrádá tuto sekvenci a není štěpena). Štěpení' leadru (3^sekvence GUG tj. 14 bp 5' ATG' počátečního kodonu A6 genu) odstraňuje cap místo PCR A6 transkriptu, což vede k rychlé degradaci PCR A6 mRNA a následně k znovunavrácení fertility ve í‘1 progeny.

-33Příklad 6

Konstrukce chimérických genů, produkujících správně a opačně orientovanou RNA k prašník-specifické glukanase v transgenních rostlinách

A3 a A9 promotory jsou transkripčně aktivní během periody, ve které je exprimována prašník-specifická glukanasa. Tak tyto promotory navíc ke konstitutivnímu promotoru (CaMV promotor) a A6 promotoru mohou být použity pro expresi opačně a správně orientované RNA k prašník-specifické glukanase. Jak je popsáno výše a ve WO-A-921 1379, cDNA izolované z prašníkové knihovny mají terminální adaptéry, které umožňují, aby cDNA byla získána jako Notl fragment. Takto je B.napus cDNA štěpena pomocí Notl a klonována v obou orientacích do Notl míst pWP80, pWP83, pWP88 (viz WO-A-9211379 pro tyto tři plasmidy) a pDIH12 (obr.7). Tyto chimérické geny jsou transferovány do pBin19 a transformovány do N.tabacum, B.napus, H.vulgare a Z.mays. Transgenní rostliny mají samčí sterilitu. Mytologické zkoušky rostlin se samčí sterilitou, exprimujících opačně orientovanou A6 RNA, ukazují že uvolňují mikrospory z terad, které vyžaduje degradaci callosy, je snížen©, ve srovnání s rostlinami divokého typu nebo úplně chybí. Biochemicky mály tyto rostliny se samčí sterilitou snížené nebo nedegovatelné hladiny callasy v kapalině loculu prašníku. Obě pozorování potvrzují, že A6 kóduje callasu.

Příklad 7

Obnovení fertility transgenních rostlin, exprimujících opačně orientovanou A6 RNA, popsaných v příkladu 6

Obnovení fertility se dosáhne dvěma způsoby. V prvním se rostliny se samčí sterilitou kříží s rostlinami, obsahujícími dalčí kopie A.thaliana genu (3,2 kb EcoRI fragment

-34pDIH9 je transferován k p3in19 a tento konstrukt transformován do rostlin). Další genové kopie překonávají zpětnou regulaci callasového produktu indukovanou expresí opačně orientované Ab SNA, což vede Jr F1 potomstvu se samčí sterilitou. Druhý způsob obnovení fertility v rostlinách exprimujících opačně orientovanou Ab RNA se dosáhne zkřížením těchto rostlin s rostlinami homozygóťními pro chimerní genové fúze mezi tapetum-speciflckým promotorem, eg A3, Ab nebo A9 a ribozymem řízeným proti GUC sekvenci v opáč ně orientované^ Ab RNA transkriptu v poloze 787-790 bp (obr.1) například. ¥ F1 potomstvu štěpení opačně orientoyaného Ab transkriptu vede k destabiližáci. opačně orientované RNA a následkem je navrácení fertility.

Příklad 8

Exprese ribozymú, řízených proti transkriptu callasy, v transgenních rostlinách

Porovnání nukleotidových sekvencí S.napus Ab cDNA a A.thaliana Ab genomické sekvence (obr.5a) poskytuje 12 GUC trinukleotidů, které jsou v obou sekvencích a jsou potenciálními ribozym cílovými sekvencemi. Dva ribozymy jsou inzertovány do B.napus Ab cDNA sekvence místně řízenou mutagenezí. Jednořetězcová DNA z plasmidu Ab, která obsahuje Ab cDNA klonovanou do EcoRI místa BLUES CRIPT™ SK~ (Straťagene), je připojena k dále uvedeným fosforylatovaným oligonukleotidovým příměrům:

5' CGGCGTCGTAGAGCTTCTGAAGATGGCCCGGTAGGGCCGAAACAIGACCGGC 3' a

5' CGTTGGCTCCTTCCTGAAGATGGCCCGGTAGGGCCGAAACCGGTACGCACC 3'

První přiměř kóduje ribozym, který je cílen ke štěpení GUC v poloze 102 bp na obr. 1 a druhý GUC v poloze 11b9 bp. Podtržená část příměrů kóduje ribozym.

-35Po naoojení je druhý DNA řetězec kompletován s nukleotidy a Klenowem. Plasmiď s oběma ribozomovými inzerty, detegovaný dvojitou kolonovou hybridizací za použití ribozymových primerů (značený konec) jako sond, se klonuje jako Notl fragment, v opačné orientaci, do pWP80, pWP83, pWP88 a pDIH12. Chimérické A3, CaMV 35S, A9 a A6-promotor callasjr ribozymové geny jsou transferovány do pBin19 jak je popsáno pro plasmidy v příkladu 6.Chimérické geny jsou transferovány do p3in19 a transformovány do N.tabacum, B.napus a H.vulgare. Transgenní rostliny mají samčí sterilitu.

Příklad 9

Obnovení fertility u rostlin popsaných v příkladu 8

Křížení rostlin se samčí sterilitou s homozygotními transgenními rostlinami, exprimujícími (z A3,A6, A9 nebo CaMV 35S promotorů) ribozym, který štěpí GUC sekvenci v callasa(mRNA)-specifickém ribozymu, vede k potomstvu, které má samčí sterilitu. Cílová GUC sekvence pro restaurující ribozym je umístěna tak, že štěpení destabilizuje? cílovou mRNA buď odstraněním CAP nebo polyadenylačního signálu. Toto rychle snižuje koncentraci callasa(mRNA)specifického ribozymu v cytoplasmě a vede k obnovení fertility. Restaurující ribozym je konstruován z plasmidu A6 podobným způsobem jak byl popsán v příkladu 8.

Claims

PATENTOVÉ N A'R O K Y

Rekombinantní nebo izolovaná DNA kódující eríz^ar^’ callasu.
2$. DNA podle nároku 13, kde DNA samčí sterility kóduje

RNA, která je schopna štěpení' RNA normálně nacházena v buňkách tapeta rostlin.

29. DNA podle nároku 28, kde DNA samčí sterility kóduje RNA, která je schopna štěpit RNA, kódující enzym calla su, jako je 53 kDa enzym callasa z Brassica napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu čeledi Brassicaceae.

30. DNA kódující ribozym schopný specifického štěpení RNA kódované callasovým genem.

31. DNA kódující ribozym: podle nároku 30, kde callasový gen kóduje 53 kDa enzym callasu z Brassica napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu čeledi Brassicaceae.

32. DNA kódující ribozym podle nároku 30 nebo 31, kde transkripce je pod kontrolou konstitutivního promotoru.

33. DNA kódující ribozym podle nároku 30 nebo 31, kde transkripce je pod kontrolou tapetum-speoifického promotoru.

34. DNA schopná schopná specifického přerušení správné exprese callasového genu.

-4035. DNA podle nároku 34, kde callasový gen kóduje 53 kDa enzym cailasu z brassica napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu, čeledi brassicaceae.

36. DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35, obsahující Y transkripci regulující sekvenci.

37. DNA podle nároku 36, kde 3 transkripci regulující signály jsou odvozeny od 35S genu viru

38.. DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 37, která je rekombinantní a která je ve formě vektoru.

39. DNA podle nároku 38, kde vektorem je kionovaoí vektor a obsahuje jeden nebo více selektovatelných markérů.

40. Mikrobiální hostitelská buňka transfektovaná nebo transformovaná vektorem pádle nároku 38 nebo 39.

41. DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 39, která obsahuje marker-sekvenci, která umožňuje rostlině transformované DNA, aby byla odlišena od rostlin, které nejsou transformovány.

42. DNA podle nároku 41, kde marker-sekvence odpovídá antibiotické nebo herbicidní rezistenci nebo kóduje glukuronidasu.

43. DNA podle nároku 41 nebo 42, kde marker-sekvence je pod kontrolou druhého promotoru, který je tapetum-nespeciflcký.

-4144. DNA podle nároku 43, kde druhý promotor je odvozen od 35S genu viru květákové mozaiky.

49/ Rostlinná buňka, obsahující DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 39 a 41 až 44.

Rostlina nebo alespoň z části buňky část rostliny, jejíž buňky jsou podlá¹ nároku 45.

2. DNA podle nároku 1, kde enzym má aktivitu 53 kDa enzymu callasa z Brassica napus nebo ekvivalentního proteinu? jiného člena čeledi Brassicaceae.
3„ DNA podle nároku 2, kódující 53 kDa enzym callasu z B.napus nebo ekvivalentní enzym' z Arabidopsis thaliana.

4. DNA podle nároku 2 a mající alespoň část sekvence ze sekvencí, které jsou uvedeny na obr.1 nebo obr. 4.

5. DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde kódující sekvence je operativně připojena k promotoru.

6. DNA podle nároku 5, kde promotor je tapetum-specifický.

7. · DNA podle nároku 6, kde promotor je Brassicaceae A3 nebo A9 promotor.

8. Rekombinantní nebo izolovaná DNA, obsahující' pro>motor·, který přirozeně řídí expresi genu, kódujícího enzym callasu.

-379. · DNA podle nároku 8, kde enzym callasa je 53 kDa enzym callasa z Brassica napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu čeledi Brassicaceae.

10. DNA podle nároku 9, obsahující promotor, který řídí expresi 53 kDa enzymu callasy z B.napus nebo ekvivalentního enzymu z Arabidopsis thaliana,

11. DNA podle nároku 9, obsahující promotorovou přirozenou sekvenci 5* ke kódující oblasti sekvence uvedené na obr. 1.

12. DNA podle nároku 9, obsahující promotor 5'ke kódující oblasti sekvence uvedené na obr. 4.

13. DNA podle kteréhokoliv z nároků 8 až 12, kde promotor je operativně připojen k DNA, která je-li exprimována, působí samčí sterilitu u rostlin.

14. DNA podle nároku 13, kde DNA samčí sterility kóduje lytický enzym.

15. DNA podle nároku 14, kde lytický enzym působí lýzi nukleové kyseliny, proteinu, karbohydrátu nebo lipidu.

16. DNA podle nároku 15, kde lytickým enzymem je ribonukleasa nebo deoxyribonukleasa.

17. DNA podle nároku 14, kde lytický enzym působí lýzi karbohydrátu.

18., DNA podle nároku 17, kde lytický enzym je glukanasa.

19» DNA podle nároku 18, obsahující signální sekvenci v translační fúzi se sekvencí kódující glukanasu.

20. DNA podle nároku 15, kde lytický enzym působí lýzi proteinu.

21. DNA podle nároku 20, kde proteolytickým enzymem je aktinidin nebo papain.

22. DNA podle nároku 13, kde DNA samčí sterility kóduje RNA, která opačně orientovaná k RNA normálně nacházené v buňkách rostlinného tapeta.

23. DNA podle nároku 22, kde DNA samčí sterility kóduje RNA, která je opačně orientovaná k RNA, kódující 53 kDa enzym callasu z Brassica napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu čeledi brassicaceae.

24. Opačně orientovaná nukleová kyselina, která obsahuje transkribovatelný řetězec DNA komplementární k alespoň části řetězce DNA, která je přirozeně transkribována v genu, kódujícím enzym callasu.

25. Opačně orientovaná nukleová kyselina podle nároku 24, kde enzym callasa je 53 kDa enzym callasa z Brassica napus nebo ekvivalentní protein v jiném členu čeledi Brassicaceae?.

v t

-3926. Opačně orientovaná nukleová kyselina podle nároku 24 nebo 25, kde transkripce je pod kontrolou konstitutivního promotoru.

27. Opačně orientovaná nukleová kyselina podle nároku 24 nebo 25, kde transkripce je pod kontrolou tapetum-specifického promotoru.
4'

Rozmnožovací materiál z rostliny podle nároku 46.