CZ133998A3 - Inhibitory thrombinu, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem - Google Patents

Description

Inhibitory thrombinu, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká inhibitorů thrombinu, způsobu výroby těchto látek a farmaceutického prostředku, který tyto sloučeniny obsahuje.

Dosavadní stav techniky

V poslední době je zaměřena pozornost na inhibici thrombinu a vyhledávají se látky, které jsou schopné tuto inhibici vyvolat jako potenciální antikoagulační látky. Inhibitory thrombinu, klíčové serinproteázy v kaskádě látek, zajištujícíh srážení krve byly určitou dobu považovány za látky, které bude možno použít k prevenci koagulace k léčebným účelům. Zvláště mnohočetný účinek thrombinu na koagulační faktory, složky krevního oběhu a buňky cévních stěn činí tuto látku cílem účinku při různých pathologických stavech. Mimoto omezeni, spojená s běžně užívanými antikoagulačními látkami, zvláště výskyt komplikací, při nichž dochází ke krvácení, nutí vědecké pracovníky nacházet látky, jejichž účinek by byl více specifický.

Řada inhibitorů typu peptidové serinproteázy nebo ř obdobného peptidu s týmž účinkem byly popsány jako látky, při jejichž použití dochází k přechodné inhibici thrombi. nu. Řada z nich jsou však látky s pomalou vazbou, jejichž užití je v současné době podrobováno kritice. In vivo je thrombin trvale vytvářen v plasmě a inhibitory thrombinu primárně působí tak, že zpomalují tvorbu thrombinu inhibicí amplifikačního stupně, ovládaného thrombinem. Aby bylo možno tento postup zpomalit, bylo by zapotřebí použít in • · · ·

- 2 hibitor s rychlejší vazbou nebo použít velké dávky inhibitoru s pomalou vazbou, čímž dochází ke zvýšenému riziku nežádoucích vedlejších účinků.

Inhibitory thrombinů jsou popisovány například v publikaci Brady a další, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 3, 1995, 1063 až 78, popisují se látky typu D-Phe-Pro-Arg-amid a D-Phe-Pro-Lys-X, kde X znamená zbytek keroesteru nebo aminu. Tyto látky jsou inhibitory thrombinů s pomalou vazbou a nejsou tedy vhodné pro svrchu uvedený účel. Při vyhledávání inhibitorů s rychlejší vazbou byly podobné inhibitory popsány v publikaci Jones a další, J. Enzyme Inhibition, 9, 1995, 43 až 60, jde o látky typu D-Cha-Pro-Lys-COOH. I když jsou tyto deriváty účinnějšími inhibitory thrombinů, jde stále ještě o inhibitory s pomalou vazbou.

V publikaci Lewis a další, Thrombosis and Haemostasis, 74(4), 1995, 1107 se popisuje příprava derivátů typu Me-D-Phe-Pro-Lys-X, kde X znamená zbytek karboxyamidu nebo karboxylové kyseliny. Tyto látky, z nichž se specificky uvádí jako výhodná látka Me-D-Phe-Pro-Lys-COOH jsou rovněž inhibitory s pomalou vazbou. Nemohou tedy splnit svrchu uvedené nároky.

Dále ještě je v US 5 523 308 popsán inhibitor thrombinu, který obsahuje lysin, substituovaný alkylovým zbytkem.

V některých dřívějších publikacích byly popsány ještě jiné řetězce typu Phe-Pro-Lys, například v publikaci Iwanowicz a další, Bioorganis and Medicinal Chemistry Letters, 2, 1992, 1607 až 12, kde se popisuje derivát typu D-Phe-Pro-Lys-X, kde X může být například zbytek ketoesteru. Jde opět o inhibitory s pomalou vazbou.

• · ·· · ·· · ·· ♦ · • ··· · · « ·· *· • ». 9 · · · ·····♦ » · · · *· · · ··· ··· e* » ····

- 3 Mimoto byly popsány ještě další typy peptidů pro inhibici různých serinproteáz. Například v publikaci Tsutsumi a další, J. Med. Chem., 37, 1994, 3492 až 3502 se popisují látky, podobné peptidům, které mají na svém C-zakončení thiazolové a benzothiazolové skupiny. Bylo prokázáno, že takové thiazolové deriváty jsou 300x účinnější než odpovídající thiofenové analogy. Dále bylo předpokládáno, že C-terminální heterocyklické skupiny zajistí kritickou interakci mezi vodíkovou vazbou histaminu a prolylendopeptidázy. Přestože bylo dále předpokládáno, že tato vlastnost by mohla platit i pro ostatní serinproteázy, nebyly specificky uvedeny proteázy thrombinu. Mechanické vysvětlení Tsutsumiho a další, bylo dále přezkoumáváno v publikaci Edwards a další, J. Med. Chem., 38, 1995, 76 až 85, avšak i tito autoři prokázali, že inhibitory elastázy typu D-Phe-Val-Pro-Val-X, kde X znamená zbytek thiazolu nebo benzothiazolu, jsou inhibitory příslušné serinproteázy bez pomalé vazby. Proto i tito autoři předpokládají, že bude možno použít peptidyl-alfa-ketoheterocyklické sloučeniny i jako inhibitory dalších serinproteáz.

Vynález je založen na překvapujícím zjištění, že výsledky, uvedené v publikacích Edwards a další, a Tsutsumi a další, je možno aplikovat také na inhibitory thrombinu. Použití C-terminálních heterocyklických skupin u sloučenin, popsaných Lewisem, Jonesem a Bradym, vede k získání účinných inhibitorů thrombinů bez pomalé vazby. Mimoto má řada těchto látek zlepšený biologický poločas a dobrou biologickou dostupnost při perorálním podání.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří inhibitory thrombinu obecného vzorce I

A-B-C-Lys-D (I) kde

- 4 A znamená atom vodíku, 2-hydroxy-3-cyklohexylpropionyl, ^Rl’ V⁰’⁰⁰’ ^Ri“CO“’ ^κι^θ2~’ ~(^^HR2^n^C®^^R3 ^nebo N-ochranná skupina, kde znamená -alkylen-COOH o 1 až 6 atomech uhlíku v alkylenové částí, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, alkenyl o 2 až 12 atomech uhlíku, aryl o 6 až 14 atomech uhlíku, aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku, nebo aralkenyl o 8 až 16 atomech uhlíku, přičemž arylová skupiny mohou být substituovány substituentem ze skupiny alkyl o 1 až 6 atomech uhlíku, alkoxyskupina o 2 až 12 atomech uhlíku, hydroxyskupina nebo atom halogenu,

R₂ znamená atom vodíku, nebo má význam, uvedený svrchu pro symbol R^,

R₃ znamená atom vodíku, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, alkenyl o 2 až 12 atomech uhlíku, aryl o 6 až 14 atomech uhlíku, aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku nebo aralkenyl o 8 až 16 atomech uhlíku, přičemž arylové skupiny mohou být substituovány alkylovou skupinou o 1 až 6 atomech uhlíku, alkoxyskupinou o 2 až 12 atomech uhlíku, hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a n znamená celé číslo 1 až 3,

B znamená chemickou vazbu, L-Asp nebo jeho esterový derivát,

Leu, norLeu, -N(benzyl)-CH₂-C0-, -N(2-indan)-CH₂~C0-, D-l-Piq, D-3-Piq, D-Tiq, Atc nebo zbytek D-aminokyseliny s hydrofobním aromatickým postranním řetězcem,

C znamená Azt, Pro, Pec, norLeu(cyklo)Gly, nebo zbytek aminokyseliny -N(cykloalkyl o 3 až 8 atomech uhlíku)-CHg-CO- nebo -N(benzyl)-CH₂~CO-,

D znamená COOH, zbytek tetrazolu, oxazolu, thiazolu nebo benzthiazolu, nebo

- 5 • «

A a C mají svrchu uvedený význam, B znamená D-cykloalkylalanin o 3 až 8 atomech uhlíku v cykloalkylové části a D znamená zbytek tetrazolu, oxazolu, thiazolu nebo benzothiazolu, nebo prekursor těchto sloučenin nebo farmaceuticky přijatelná sůl těchto látek, s výjimkou sloučeniny Me-D-Phe-Pro-Lys-COOH.

Sloučeniny podle vynálezu je možno použít k léčení a prevenci chorob, zprostředkovaných působením thrombinu nebo spojených s jeho účinkem. Jde o celou řadu thrombotických a prothrombotických stavů, při nichž dochází k aktivaci koagulačního systému a vyvíjí se hluboká žilní trombóza, plicní embolie, thromboflebitida, uzávěr tepen thrombem nebo embolií, opětný uzávěr teplny v průběhu nebo po angioplastice nebo thrombolýze, restenosa po poranění tepny nebo po chirurgických zákrocích na oběhovém systému včetně srdce, pooperační žilní thrombosa nebo embolie, akutní nebo chronická arterosklerosa, mozková mrtvice, infarkt srdečního svalu, zhoubné nádory a metastázy a neurodegenerativní onemocnění. Sloučeniny podle vynálezu je také možno použít jako antikoagulační látky v mimotělním krevním oběhu, například při dialýze a chirurgických zákrocích. Mimoto je uvedené látky možno použít také in vitro.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou ty látky, v nichž D znamená skupinu COOH. Mimoto A s výhodou znamená atom vodíku, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, -CO-aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku v aralkylové části, -S0₂~alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, -SC^-aryl o 6 až 14 atomech uhlíku nebo SO₂-aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku, B znamená chemickou vazbu, L-Asp, norLeu, D-l-Piq nebo D-Phe a C znamená Pro, norLeu(cyklo)Gly nebo -N-cyklopentyl-CH₂-CO-. Velmi výhodné ·· ···· · · · · • · ·· · · • · ·· ·· ·· ·«···♦ • ····» · · • β> · · · ·. ·· ·· *

- 6 jsou ty inhibitory thrombinu, v nichž A znamená -SO₂-benzyl, B znamená chemickou vazbu a C znamená norLeu(cyklo)Gly nebo ty látky, v nichž A znamená -SOg-ethyl, B znamená D-Phe a C znamená Pro nebo také ty látky, v nichž A znamená atom vodíku, B znamená D-l-Piq a C znamená Pro.

Dalšími výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou ty látky, v nichž D znamená zbytek oxazolu nebo thiazolu. Mimoto A s výhodou znamená atom vodíku, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, 2-hydroxy-3-cyklohexylpropionyl, -C0-(CH₂)_nC00H, -CO-aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku v aralkylové části, -S0₂~aryl o 6 až 14 atomech uhlíku, -SOg-aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku, -SO₂~alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku nebo -(CHR₂)_nCOOR₃, R₂ znamená atom vodíku nebo alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, R₃ znamená vodík,alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku nebo benzyl a C znamená Pro, norLeu(cyklo)Gly nebo -N(cykloalkyl o 3 až 8 atomech uhlíku)-CHg-CO-. Zvláště výhodné jsou ty inhibitory thrombinu, v nichž A znamená skupinu -(CH₂)_nCOOR₃, kde R₃ znamená vodík, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku nebo benzyl, B znamená D-cykloalkylalanin o 3 až 8 atomech uhlíku v cykloalkiylové části nebo D-Phe, popřípadě monosubstituovaný alkoxyskupinou nebo atomem halogenu a C znamená Pro. Nejvýhodnějšími sloučeninami podle vynálezu jsou ty látky, v nichž D znamená thiazolový zbytek. Zvláště výhodný je inhibitor vzorce HOOC-CH₂-D-Cha-Pro-Lys-(2-thiazolyl).

N-ochrannou skupinou ve významu A může být jakákoliv N-ochranná skupina, běžně užívaná v chemii peptidů. Vhodné skupiny tohoto typu je možno nalézt v souhrnných publikacích T. W. Green a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání, (Wiley, NY, 1991) a The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, sv. 3, E. Gross a J. Meienhofer, Eds., (Academie Press, New York, 1981).

Alkyl v průběhu přihlášky znamená zbytek uhlovodíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující 1 až 12 • · • ·«·· · · · 00···· ·· · · · · *

- 7 atomů uhlíku, například methyl, ethyl, isopentyl, dodecyl a podobně.

Alkylenový zbytek o 1 až ž atomů uhlíku znamená skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem o 1 až 6 atomech, například skupinu ”^^CH2^m~’ ^{kde m cel}® číslo 1 až 6, -CH(CH₃)-, -0Η(0Ηθ)-(0Η₂)- a podobně. Výhodnou alkylenovou skupinou je methylenová skupina.

Alkenyl je nenasycená skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem o 2 až 12 atomech uhlíku. Jako příklad je možno uvést ethenyl, propenyl, allyl a podobně.

Aralkylové a aralkenylové skupiny jsou alkylové a alkenylové skupiny, substituované nejméně jednou arylovou skupinou, přičemž celkový počet atomů uhlíku je 7 až 15 a 8 až 16. Výhodnými aralkylovými skupinami jsou například -(CH)-CH-(C_cH), kde p je 1 nebo 1 nebo -(CH_O) -C_cH_c,

e. p o o d. ά q o □ kde q je 1, 2 nebo 3, skupina může být substituována atomem halogenu.

Aryl ve svrchu uvedeném významu a také jako samostatná arylová skupina je aromatická skupina o 6 až 14 atomech uhlíku. Arylová skupina může dále obsahovat nejméně jeden heteroatom, například N, S nebo 0. Arylovými skupinami jsou například fenyl, naftyl, (iso)chinolyl, indanyl a podobně. Nejvýhodnější je fenyl. Arylová skupina může být substituována nejméně jednou alkylovou skupinou, s výhodou methylovým zbytkem, alkoxyskupinou, s výhodou methoxyskupinou, hydroxyskupinou nebo atomem halogenu. Atomem halogenu je atom fluoru, chloru, bromu nebo jodu, s výhodou atom chloru.

Skupiny D-l-Piq a D-3-Piq znamenají 1- a 3-karboxyperhydroisochinolinovou skupinu. Skupina Tiq je zbytek

ΦΦ

Φ Φ · • ΦΦΦ • · * • 99 ΦΦΦ »· • «

kyseliny 1,2,3,4-tetrahydroisochinolinkarboxylové. Atc znamená, zbytek kyseliny 2-aminotetralin-2-karboxylové. Azt znamená kyselinu 2-azetidinkarboxylovou a Pec znamená kyselinu pipekolinovou.

Skupina norLeu(cyklo)Gly znamená strukturní fragment vzorce

-NH-CH

N-CH₂-C(O)Hydrofobní aromatický postranní řetězec znamená alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, substituovaný nejméně jednou arylovou skupinou o 6 až 14 atomech uhlíku, popřípadě obsahující heteroatom, například atom dusíku, jako je fenyl, pyridinyl, naftyl, tetrahydronaftyl a podobně, přičemž hydrofobní vedlejší řetězec může být substituován hydrofobními substituenty, jako jsou atom halogenu, s výhodou chloru, trifluormethyl, nižší alkyl, například methyl nebo ethyl, nižší alkoxyskupina, například methoxyskupina, fenyloxyskupina, benzyloxyskupina a podobně.

Cykloalkyl o 3 až 8 atomech uhlíku znamená cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl nebo cyklooktyl.

Tetrazolová, oxazolová, thiazolová a benzothiazolová skupina mohou být vyjádřeny následujícími vzorci

N II N

H ···· • · · · · · · · ·· • ··· t · · ··· • *·'« · · * · ♦ · · * • · ·· a · · · * «····» · · v · · · ·

- 9 Vynález zahrnuje také prekursory sloučenin obecného vzorce I, které se po podání v organismu metabolizují na účinné látky. Může jít například o deriváty s N-alkoxykarbonylovou, s výhodou N-ethoxykarbonylovou ochrannou skupinou.

Farmaceuticky přijatelné soli jsou soli, které si uchovávají žádoucí biologickou účinnost původní látky a s výhodou nemají žádné nežádoucí toxické účinky. Jako příklad je možno uvést adiční soli s anorganickými kyselinami, jako jsou kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, fosforečná, dusičná a podobně. Mimoto může jít o soli s organickými kyselinami, jako jsou kyselina octová, štavelová, vinná, jantarová, maleinová, fumarová, glukonová, citrónová, jablečná, askorbová, benzoová, tříslová, pamoová, alginová, polyglutamová a podobně. Soli mohou být vytvořeny také s vícemocnými kationty kovů, například zinku, vápníku, vizmutu, barya, hořčíku, hliníku, mědi, kobaltu, niklu a podobně, nebo s organickými kationty, odvozenými od N,N*-dibenzylethylendiaminu nebo ethylandiaminu, nebo je možno použít kombinace těchto kationtů, například kombinovanou sůl se zinkem a kyselinou tříslovou.

Sloučeniny podle vynálezu obsahují nejméně jeden chirální atom uhlíku a mohou být tedy získány jako čisté enanciomery, jako směs enanciomerů nebo jako směs diastereomerů. Způsoby, jimiž je možno získat čisté enanciomery, jsou známé. Jde například o krystalizací solí s opticky aktivními kyselinami z racemických směsí nebo o chromatografii při použití chirálních sloupců. V případě diastereomerů je rovněž možno použít chromatografii na sloupci, popřípadě v reverzní fázi.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob výroby svrchu uvedených látek, který spočívá v tom, že se váží příslušně chráněné aminokyseliny nebo jejich analogy a pak se odstraní ochranné skupiny.

«· · · · ····· « ··· · · · a · ·· φ · 9 9 9 9 9 99 9 9· • · · · ··*·>

·«···· ·· · · · 9 9

- 10 Sloučeniny podle vynálezu je možno připravit běžnými postupy pro výrobu obdobných látek. Postupuje se tak, že se Nalfa-chráněné deriváty aminokyselin nebo peptidů aktivují a uskuteční se vazba na deriváty aminokyselin nebo peptidů, vhodně chráněné na karboxylové skupině, v roztoku nebo na pevném nosiči. V případě, že postranní řetězec obsahuje reaktivní skupiny, je třeba chránit také tyto skupiny. K ochraně aminoskupiny v poloze alfa se obvykle užije urethonová funkce, může jít například o terč.butyloxykarbonylovou skupinu Boc nebo benzyloxykarbonylovou skupinu Z a jejich substituované analogy, které jsou labilní v kyselém prostředí nebo o skupinu 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou Fmoc, labilní v alkalickém prostředí. Skupinu Z je také možno odstranit katalytickou hydrogenací. Dalšími vhodnými ochrannými skupinami jsou například Nps, Bmv, Bpoc, Aloe, MSC a podobně. Dobrý přehled ochranných skupin, vhodných pro aminoskupinu je možno nalézt v publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, sv. 3, E. Gross a J. Meienhofer, Eds., (Academie Press, New York, 1981). Karboxylovou skupinu je možno chránit tvorbou esterů, například takových, které jsou labilní v alkalickém prostředí, jako je methylester nebo ethylester, nebo je možno vytvořit estery, labilní v kyselém prostředí, jako terč.butylester nebo také estery, labilní při hydrogenolýze, jako benzylester. Skupiny na postranním řetězci, například v případě lysinu je rovněž možno chránit svrchu uvedenými skupinami. Aktivaci karboxylové skupiny vhodně chráněné aminokyseliny nebo peptidu je možno uskutečnit působením azidu, směsného anhydridu, aktivního esteru nebo karbodiimidu, zvláště v přítomnosti katalyzátoru a látek, potlačujících racemizaci, jako jsou 1-hydroxybenzotriazol, N-hydroxysukcinimid, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin nebo N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid. Užít je možno také anhydridy na bázi fosforečných kyselin, • · * 4 4 4 4 4 4444

444 4 4 4 4 4 44

444 44 4 4444 4

4444 ··· »44444 44 4 4» 44

- 11 popsané například v publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, tak, Jak byla svrchu uvedena a také v Pure and

Applied Chem., 59(3), 331 až 344, 1987.

Sloučeniny mohou být připraveny také postupem s použitím pevné fáze podle Merrifielda. Pro toto použití jsou známé různé pevné nosiče a různé postupy, shrnuté například v publikacích Barany a Merrifield, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, sv. 2, E. Gross a J. Meienhofer, Eds., (Acad. Press, N.Y., 1980), dále Kneib-Cordonier a Mullen, Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705 až 739, 1987 a Fields a Noble, Int. J. Peptide Protein Res., 35, 161 až 214, 1990.

Ochranné skupiny je možno odstranit a v případě syntézy peptidů na pevné fázi také peptid je od nosiče možno odštěpit různým způsobem v závislosti na povaze ochranných skupin a na typu vazby na pevný nosič. Ochranné skupiny je obvykle možno odstranit v kyselém prostředí za přítomnosti látek, které váží vznikající produkty, jak je popsáno například ve svazcích 3, 5 a 9 svrchu uvedené publikace The Peptides Analysis, Synthesis, Biology.

Další možnost je použití enzymů při syntéze sloučenin podle vynálezu. Postupy tohoto typu byly shrnuty například v publikaci H. D. Jakubke, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, sv. 9, S. Udenfriend a J. Meienhofer, Eds., (Acad. Press, N. Y., 1987).

At již byly sloučeniny podle vynálezu vyrobeny jakýmkoliv způsobem, je možno je použít pro výrobu farmaceutických prostředků, které jsou určeny k léčení chorobných stavů včetně nežádoucího zvýšení krevní srážlivosti. Při výrobě farmaceutických prostředků budou sloučeniny podle vynálezu • c

- 12 v typických případech použity spolu s farmaceutickým nosičem. Pokud jde o farmaceutické nosiče, může jít o poměrně jednoduché látky, například o sterilizovanou vodu pro injekční podání, nebo také o poměrně složité materiály, jako mikrokuličky a biologicky degradovatelné implantáty.

Farmaceutické prostředky s obsahem účinných látek podle vynálezu se s výhodou podávají perorálně, podkožně, místně, nosní sliznicí, nitrožilně, nitrosvalově nebo například ve formě implantátu. Je také možné podávání depotních dávek těchto látek.

Přesná dávka a intervaly mezi jednotlivými dávkami budou v případě farmaceutických prostředků s obsahem sloučenin podle vynálezu záviset na potřebách nemocného, jemuž je účinná látka podávána, na závažnosti choroby a na dalších faktorech, konečnou dávku musí vždy určit ošetřující lékař. Při parenterálním podání je obvykle možno použít nižší dávky než u jiných způsobů podání, které jsou závislé na vstřebávání. Jako příklad je možno uvést dávky v rozmezí 0,001 až 100 mg/kg, s výhodou 0,01 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti.

Farmaceutický prostředek, obsahující sloučeninu podle vynálezu může být použit také jako pomocný prostředek při nutnosti akutního antikoagulačního léčení. V těchto případech se uvedený přípravek podává společně s dalšími účinnými látkami, podávanými k léčení takového stavu.

Sloučeniny podle vynálezu je také možno použít ve formě implantátů, tak jak byly popsány například v US patentovém spisu^;č. 4 767 628. Implantát tohoto typu obvykle obsahuje takové množství účinné látky podle vynálezu, které může zajistit pomalé uvolňování této látky po delší dobu, například více než jeden měsíc.

- 13 ·· ··φ ·

9·

Při výrobě farmaceutických prostředků, určených pro enterální nebo parenterální podání se postupuje běžným způsobem, popsaným ve standardních publikacích, jako jsou Gennero a další, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. vyd. Mack Publishing Company, 1990, jde zvláště o část 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture, str. 1519 až 1580. Ve směsi s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami je možno sloučeniny podle vynálezu lisovat na pevné lékové formy, jako pilulky nebo tablety nebo zpracovávat například na kapsle nebo čípky. Při použití farmaceuticky přijatelných tekutin je možno sloučeniny podle vynálezu podávat také ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí, například pro infekční podání nebo jako sprej, například pro aplikaci na nosní sliznici.

Při výrobě lékových forem s obsahem jednotlivé dávky, například tablet, je možno použít běžné pomocné látky, například plniva, barviva, polymerní pojivá a jiné materiály. Obecně je možno použít jakoukoliv farmaceuticky přijatelnou látku, která neruší účinnost sloučenin podle vynálezu. Z vhodných nosičů jde například o laktosu, škrob, deriváty celulózy, jejich směsi nebo podobné látky, použité ve vhodném množství.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají v žádném směru sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

99··

- 14 ___2_£_2_Ζ_θ_£_θ_2_ί___Ζ_Σ_2_έ_1_θ_2_2.

Následující názorné Příklady demonstrují různé aspekty předloženého vynálezu.

Příklad 1

Příprava 3,3-difenylpropionyl-Pro-I^s-( 2-thiazolylu )

Příprava 3,3-difenylpropiony1-promylmethylesteru

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,50 gj 3,3-difenylpropionové kyselinyj ve 100,0 ml ethylacetátu; a vychlazenému na teplotu O°CJ bylo postupně přidáno 5,03 gj 1,3-dicyklohexylkarbodiimiduj 3,28 g; 1-hydroxybenzotriazolu.hydrátu; 3,66 gj H-Pro-OMe.HCIJ a 3,10 ml triethylaminu.

Vzniklá reakční směs byla poté míchána při teplotě 0°C po dobu 1,0 hodiny; a poté byla ponechána v klidu při teplotě místnosti přes noc. Následně byla reakční směs vychlazena na teplotu minus 20,0°C; a poté byla filtrací odstraněna 1,3-dicyklohexylmočovina. Filtrát byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; 8 vodou;, s 5%ním vodným roztokem hydrogensíranu draselného; a nakonec s nasyceným vodným roztokem chloridu sodného.Poté byl filtrát vysušen se sírahem sodným; a následně byl za vakua zahuštěn;.

Zbytek byl přečištěn chromatografii na oxidu křemičitém; za použití směsi dichlormethan : ethylacetát; ( 9 : 1; objemové poměry).

• · · · * ·

Bylo získáno 5,68 g žádaného’, 3,3-difenylpropionyl-promylme thyle steru, ve formě krystalické látky, práškovítého charakteru.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = O,,75J ( silikagei; dichlormethan : ethylacetát; ) (7:3; objemové poměry )

Příprava 3,3-difenylpropionyl-prolyl-OH

V 60,0 ml směsi dioxan :: voda; ( 7 : 3J objemové poměry); bylo rozpuštěno 5,60 gj 3,3-difenylpropionyl-prd|.>ylmethylesteru, ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); a vzniklý roztok byl během 30,0 minut smíchán po částech; při teplotě místnosti; se 6,20 mi; 4M; vodného roztoku hydroxidu sodného, při udržování pH na hodnotách 10,0 - 10,50.

Po uplynutí 30,0 minut byla vzniklá reakční směs neředěna se 60,0 ml vodyj a následně bylo k ní přidáno tolik vodného roztoku 4M kyseliny chlorovodíkové, až bylo dosíleno ve směsi pH = 2,0· Poté byla vodná vrstva extrahována s ethylacetátem.. Spojené organické fáze byly p pomyty postupně s vodouý a s nasyceným vodným roztokem chloridu sodného; poté byly vysušeny se síranem sodnýmj a rozpouštědlo bylo následně odpařeno.

Bylo získáno 5,18 g,žádaného; 3,3-difenvlpropionyl-prol)ylOH; ve formě látky sirupovité konzistence.

Chromatografie na tenké vrstvě :

O,65J ( silikagelj směs ethylacetát : pyridin :: kyselina octová : voda; ( 63 : 20 : 6 : 11; objemové poměry )· ···· • · ·

- 16 Příprava N-terc:. -butyloxykarbony1-Lys-(benzyloxykarbonyl)-NtféOMfe = BOC-Lys-(CBz)-NMeQMe

Suspenze, připravená nasusepndováním 10,0 g' N-terc.-butyloxgkrbonyl-Lys-( benzyloxykarbonyl )-OH-dicyklohexylaminu;(BOCLys-(CBz)-OH.DCHA ); do 200,0 ml dichlormethanu, byla 2X promyta a vychlazeným; 0,1N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové; a ku výsledné organické fázi bylo poté přidáno 6,0 gj 2»-( 1Hbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborátu; a 1,82 gj Ο,Ν-dimethyl-hydroxylaminu.HCi; a pH této směsi bylo následně upraveno přídavkem triethylaminu na pH 8,0.

Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny; a následně byla postupně promyta a vychlazeným; 2N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové; a vodou; a 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; ajnakonec ještě s vodou.

Oddělená organická vrstva byla vysušena ae síranem sodným; zfiltrována^ a odpařena. Zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém; za použití dichlormethan : methanol; ( 50 :: 50; objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 7,20 gj žádaného produktu BOC-Ly a-(CBz)-NMe-0Me

Chromatografie na tenké vratvě ::

- 0,55; ( ailikagei; dichlormethan :: methanol; ( 95 : 5;

( objemové poměry ).

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-Lya-(benzyloxykarbonyl)-(2thiazolylu) = BOC-Lys-(CBz)-(2-thiazolyl)

Ku roztoku, připravenému ze 63,90' mmolu; n-butyllithia v 5©,0 ml diethyletheru*, a vychlazenému na teplotu minus 78,0°c; byl přidán po kapkách, za stálého míchání, roztok, připravený ·· · · ·· ····

- 17 rozpuštěním 10,50 g} 2-bromthiazolu} ve 30,0 ml diethyletheru. Poté_p co byla vzniklá reakční směa míchána při teplotě minus 78,0°C po dobu 30,0 minut,byl k ní pomalu přidán roztok, připravený rozpuštěním 8,20 g} N-terc.-butyloxykarbony1-Lys(benzyloxykarbonyl)-NMeOBFe} ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)} v 75,0 ml tetrahydrofuranu. Poté, co byla tato reakční směs míchána při teplotě minus 78,0°G po dobu 1,0 hodiny} byl k ní přidán 5%ní vodný roztok h^drogenuhličitanu sodnéhcr>.

Poté byla směs vytemperována ns teplotu místbosti, a vodná a organická fáze byly odděleny. Vodná vrstva byla poté extrahována s diethyletherem; a spojené orgahické vrstvy byly promyty s vodou}, vysušeny se síranem sodným} zfiltrovány a odpařeny.

Zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém} za použití směsi ethylacetát : heptan} ( 3 í 1} objemové poměry)} jako elučního činidla.

Bylo získáno 8,60 g žádaného BOC-Lys-(CBz)-(2-thiazolylu).

Chromátografie na tenké vrstvě :

- 0,77} ( silikagel} ethylacetát : heptan} (3:1} ( objemové poměry ).

Příprava H-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny = H-Lys-(CBz)-(2-thÍ8zolyl). TFA

Roztok,, připravený rozpuštěním 500,0 mg} BOC-Lys-(CBz)-(2thiazolylu)} ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)} v 50%ní směsi kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu} ( celkem 5,0 ml)} byl míchán při teplotě místbosti po dobu 1,0 hodiny} a poté, po odstranění rozpouštědla odpařením, byla izolována v surové formě žádaná kyselina H-Lys-(CBz)-(2-thiazolyl)-trifluoroctová} která byla bezprostředně použita v dalším stupni.

φφφφ φφ φφφφ φφ · · • ΦΦ φφ φ · ♦ φ · φ φφφ φφφ · φ φφ φ ΦΦΦ Φ · · ··· · · Φ φφφ· φφ· • ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ φφφ·

-18Chrometografie ne tenké vrstvě r

Rp « 0,25J ( siliksgei; ethylacetát : pyridin : kys.octová ( : vodaj ( 63 : 20 : 6 : 11; objemové poměry)

Příprava 3,3-difenylpropionyl-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)— ( 2-thiazolylu ) - 3,3-difenylpropionyl-Pro-Itfs-(CBz)-( 2thiazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 385,0 mg; 3,3-difenylpropionyl-propyl-OH; v 5,0 ml dimethylformamiduj a vychlazenému na teplotu 0°C; bylo postupně přidáno 270,0 mgj 1,3-dicyklohexylkarbodiimidu; 176,0 mg; 1-hydroxybenzotriazolu; 515,0 mg kyseliny H-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové;(získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); a 0,28 ml N-e thylmorfolinu.

Vzniklá reakční směs byla poté míchána při teplotě 0°C po dobu 1,0 hodiny; a následně byla ponechána v klidu ,při teplotě místnosti, přes noc.. Poté byla směs vychlazena na teplotu mínus a filtrací byla odstraněna 1,3-dicyklohexylmočovina.

Pg odpaření filtrátu byl zbytek rozpuštěn v e thy láce tátu’, a postupně byl promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou; s 5%ním vodným roztokem hydrogensírahu draselného; a s nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Po vysušení se síranem sodným, byl roztok za vakua zahuštěn.

Poté byl zbytek přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém; za použití směsi ethylacetát : hepáín; ( 4 : 1); objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 332,0 mg žádaného; 3,3-difenylpropionyl-ProLys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu ).

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ - 0,40; ( silikagel; směs ethylacetát : heptanj (3 : 1;

( objemové poměry ).

4··* • Φ Φ Φ Φ φ Φ · Φ ·

ΦΦΦ φ Φ Φ 4 4 44 • φ 4 · Φ · · ΦΦΦ· · φ φφφΦ «44 • ««ΦΦΦ Φ· · · ♦ ··

- 19 Příprava 3,3-difenylpropionyl-Pro-Lys-( 2-thiazolylu)

Celkem 320,0 mgj 3,3-difenylpropionyl-Pro-lÁFs-(benzyloxykarbonyl )-(2-thiazolylu)\ ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)J bylo reagováno se 3,30 ml směsi z kyseliny trifluoroctové, a thioanisoluj( 10 : 1J objemové poměry); při teplotě místnosti, po dobu 3,0 hodin.

Poté byla vzniklá reakční séis^OHBštěna, a zbytek byl rozpuštěn ve vodě. Vodná fáze byla rozsáhle promyta s diethyletherem. Oddělená vodná fáze, obsahující žádaný 3,3-difenylpropionyl-Pro-Lys-(2-thiazolyl)J. byla nanesena přímo na sloupec: preparativní, výsokovýkonné kapalinové chromatografieJ( systém Supercosil-LC-18-DB)J kde byla zpracována za použití gradientového elučního systému; 20,0%J 0,50M pufr, fosforečnanu sodnéhoj pH 2,1 OJ 60,0%_r vodaj 20,0%,. směs acetonitril : vodaj (3:2* objemové poměry); až do 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného; pH 2,1 o; a 80,0%, směsi acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); při trvání operace 45,0 minut; 8 průtokové ryhhlosti 20 ml/min.

Bylo získáno 47,0 mg žádaného; 3,3-difenylpropionyl-Pro-Lys( 2-thiazolylu).

Chromátografie na tenké vřestvé :

E^ = θ,57; ( za použití silikagelu, a směsi ethylacetát :

( pyridin : kys.octová : vodaj ( 63 : 20 : 6 : 11; ( objemové poměry); jako elučního činidla.

R·^ ( kapalinová chromátografie ):

32,90 min..; 20,0%J 0,50M pufr, fosforečnanu sodného, pH 2,10J 60,0%, vodaj 20,0%, směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); až do 20,0%J 0,50WF pufr fosfprečňanu sodného; pH 2,10J 0% voda; a 80,0%, směs acetonitril : vodaj( 3 i: 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

···· ·· ····

- 20 Příklad 2

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1 *_t byly připraveny i následující sloučeniny:

Sloučenina a)

Příprava H-D-feny1-prolin-lysin-( 2-thiazolylu) = H-D-Phe-Pro1(73-( 2- thiazolyl ) ( kapalinová chromatohrafie 5 :

25,67 min.5 20%, 0,5M pufr fosforečnanu sodnéhoJ pH 2,1 OJ 30,0%, vodaj 0% směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); až do 20,0%, 0,5M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20%, voda; a 60%,_: směs acetonitril ’ vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40 minutách.

Sloučenina b)

Příprava H-D-1-tetrahydroisochinolin-Pro-Lys-(2-thiazolylu )

R^ ( kapalinová chromatografie ) :

23,40 min.; 20%; 0,5M pufr fosforečnanu sodnéhoJ pH 2,1 OJ 80%, vodaj 0% směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); až 20,0%; 0,5M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20%, vodaj a 60,0%, směs acetonitril : vodaj (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

··«·

- 21 Sloučenina c)

Příprava H-D-(p-Cl)- Phe-Pro-Lys-( 2-thiazolylu) ( kapalinová chromátografie ):

30,47 min.; 20%; 0,5M pufr fosfore Sinánu sodného; pH 2,10; 80% vodaj 0%, směs acetonitrii : voda; (3:2; objemové poměry ); až 20,0%; 0,5M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 20,0%, voda a 60%; směs acetonitrii : voda; (3:2; objemové poměry)} ve 40 minutách.

Sloučenina d)

Příprava indanglycyl-(N-cyklopropyl)-Gly-Lys-(2-thiazolylu )

R^( kapalinová chromátografie ):

27,38 min.J 20%; 0,50M pufr fosforečnanu sodnéhoJ pH 2,1 OJ 80% voda; 0%, směs acetonitrii : voda; (3:2; objemové poměry ); až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 20%, voda; a 60,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry ); ve 40,0 minutách.

Sloučenina e)

Příprava H-E-Phe-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys-( 2-thiazolylu ) «>··<·

- 22 R ( kapalinová chromátografie ) :

v

31,07 min·; 20,0%; 0,50M’, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0% vodaj 0%; směs acetonitril ^: voda; (3:2; objemové poměry )J až do 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 20%, vodaj 60,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina f)

Příprava acetyl-D-Phe-( N-cyklopropyl)-Gly-Lys-( 2-thiazolylu)

R^( kapalinová chrométografie ):

33,73 min.J 20%J 0,50M, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 80%, vodaj 0%, směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry )J až do 20,0%; 0,50M, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20,0%, vodaj 60%, směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina g)

Příprava H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu )

R_t( kapalinová chromátografie ):

30,59 mini.; 20%J 0,50M, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 80,0%, vodaj 0%; směs acetonitril : vodaj (3:2; objemové poměry); až do 20,0%; 0,50M, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20%, vodaj a 60,0%J směs acetonitril ; vodaj (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

···· • · · ·

- 23 Sloučenina h)

Příprava H-D-Phe-(N-eyklopropyl)-Gly-Lys-(2-thiazolylu )

R^( kapalinová chromátografie )í

5,10 min.J izokratická elucej eměs methanol : 25,0 m]0F fosforečnan; pH 7,OJ ( 55 :: 45 )

Sloučenina i)

Příprava 3,3-difenylpropionyl-(N-cyklopropyl)-Gly-Lys-( 2thiazolylu )

R^( kapalinová chromatografie ):

8,10 min.J izokratická elucej směs methanol : 25 mM fosforečnan; pH 7,OJ ( 75 : 25 )

Sloučenina j)

Příprava H-D-Phe-(N-cyklobutyl)-Gly-Lys-( 2-thiazolylu )

R^ ( kapalinová chromatografie ):

30,59 min.J 20%; 0,50M, fosforečnan sodný(pufr), pH^;2,10; 80%; voda; 0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry ); až do 20,0%; 0,50 M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20%; voda; a 60%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40 minutách.

···· ·· ···· • ·

- 24 Sloučenina k)

Příprava H-2-aminotetralin~2-karboxylová kyselina-Pro-Lys-(2thiazolylu)

Η^( kapalinová chromatografie ):

27,79 + 28,04 min.J 20,0%; 0,50M puffosforečnanu sodnéhoj pH 2,10J 80,0%, vodaj 0%, směs acetonitril : voda; (3 : 2; objemové poměry); až do 20,0%; 0,50 MJ pufr fosforečnanu sodného; pH 2,JO; 20,0%, voda; a 60,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina 1) (el)

Příprava H-D-Phe-(N-benzyl)-Gly-Lys-( 2-thiazolylu)

R_t ( kapalinová chromatografie ):

16,99 min.; 20%; 0,50 Mj pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 60,0%, vodaj 20,0%, směs acetonitril : voda; (3:2* objemové poměry), až do 20,0%; 0,50M, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 0,0% voda; 80,0%; směs acetonitril í vodaj (3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina m)

Příprava H-H-cyklohexylalanin-(N-cyklopropyl)-Gly-Lys-(2thiazolylu)

44*4 ·· ···· ·«· ·· • · · 4 4 44 • · 4 » ··· • 4 4 4 4 4 4 444 4 · • ····· 4 · • 4 · 444 ·· ·♦♦ ··

- 25 R_t ( kapalinová chromátografie ):

30,84 min·.; 20,0%; 0,50m, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 80,0%_r vodaj 0%, směs acetonitril : voda; ( 3 : 2';°^bá®niové poměry);, až do 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10;

20,0% tfodaj a 60,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina n)

Příprava p-chlor-3-fenylpropionyl-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys-( 2thiazolylu) kapalinová chromátografie ):

36,15 min.; 20,0%J 0,50M, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 60,0%;. vodaj 20,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); až do 20,0%; 0,50M, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 0,0% vodaj a 80,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina o)

Příprava (N-benzyl)-Gly-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys-(2-thiazolylu)

R^( kapalinová chromátografie ):

28,14 min.; 20,0%; 0,50M,_: pufr fosfore Číňanu sodného; pH 2,10J 80,0%, voda; 0,0% směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); až do 20,0%; 0,50M pufr fosforečSanu sodného; pH 2,1 OJ a 80,0%, směs acetonitril : vodaj (3:2; objemové poměry ); ve 40,0 minutách.

···· ·· · · · φ · · · · • · φ ····· φφφ Φ f · φ φ φφ • · « · φ ···· · • · ♦ « · · · • · · · · & φφ ··

Příklad 3

Příprava HOOC-C^-D-cyklohexylalalnin-ÍN-cyklopentylJ-Gly-Lys( 2-thiazolylu )

Příprava N*-cyklopentyl-Gly-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 23,20 gj H-Gly-OMe. HC1J ve 200,0 ml methanolu, bylo přidáno 15,60 g cyklopentanonu. Poté, co byla vzniklá aměa míchána po dobu 15,0 minut, bylo k ní přidáno 7,0 g* kyantetrahydroboritanu sodného;9 pH směsi bylo upraveno na hodnotu 6,0»

Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin. Za účelem dokončení reakce, byl ku směsi přidán ještě 1,0 g cyklopentanonu, a směs byla dále míchána, přičemž průběh reakce byl sledován pomocí chromatografie na tenké vrstvě. Po zjištění, že všechen výchozí materiál už z reakční směsi vymizel, byla směs okyselena na pH 2,OJ a poté byla míchána ještě po dobu 30,0 minut.

Po odpaření rozpouštědla ze směsi byl zbytek zředěn s vodou; a vzniklý roztok byl promyt s etherem. Po uprávě pH pomocí 6N vodného roztoku hydroxidu sodného,, byl roztok extrahován s dičhlormethanem.( pH bylo upraveno na hodnotu 12,0). Po oddělení organických a vodných fází, byly spojené organické vrstvy promyty a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, poté byly vysušeny se síranem sodnýmj a za vakua byly odpařeny.

Bylo získáno 16,0 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, ve formě látky olejovité konzistence.

= 0,46;(na oxidu křemičitém, za použití směsi ethylacetát : pyridin : kys.octová voda; ( 63 : 20 :: 6 : 1i; objemové poměry); jako elučního činidla.

• · • ··· · ·· • · · ·· • ··· ·· • · · ·· • · ··

Příprava Nů(t-butyloxykarbonyl-methyl)-D-cyklohexylalanin-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 26,0 gj H-D-cyklohexylalanin-0-ffié.í5O (hydrochloriduX H-D-Cha-OMe.HCl)) ve 300,0 ml acetonitrilu, bylo přidáno za stálého míchání 17,0 gj t-butylbromacetátuj a pH vzniklé reakční směsi bylo upraveno na pH 8,50 s diisopropylethylaminem.

Poté byla směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin; a následně byla za vakua odpařena. Zbytek byl rozpuštěn v dichlormethanu; a vzniklý roztok byl promyt s vodou; a po vysušení se síranem sodným, byl za vaku8 odpařen.

Chromatografii zbytku na silikagelu,, za použití směsi hexan : ethylacetát; <9:1» objemové poměry); bylo získáno 20,0 g žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

0,46J(na oxidu křemičitém, za použití směsi ethylacetát : pyridin; : kys,octová : voda; ( 15,75 :5:1,5 : 2,75; objemové poměry); jako elučního činidla.)

Příprava Ν,Ν'-EOC ť t-butyloxykarbonyl-methyl)-D~cyklohexylalaninOMe

U roztoku, připraveného smíchánítii 20,0 gj N-(t-butyloxymethyl)-D-cyklohexylal8nin-0Me; (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); a 17,0 gj di-t-butyldikarbonátu, bylo pomocí diisopropylethylaminu upraveno pH na hodnotu 8,5. Vzniklá reakční směs byla poté míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodinj a následně bylo rozpouštědlo zs vakua odstra něno.

Ku zbytku byl přidán dichlormethan a voda. Po oddělení byla organická vrstva promyta s vychlazeným 1N roztokem kyseliny

0 0 ♦ ·t ··· · Μ· · · 4·

I 0 · t

I • 00 0

0 0 0

00·0 · chlorovodíkové ; poté 3 vodou; s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a nakonec ještě s vodou.Poté byla organická vrstva vysušena se síranem sodným; a filtrát byl odpařen.

Bylo získáno 28,0 g, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, ve formě pevné látky, amorfního charakteru.

0,_:60;(na oxidu křemičitém; za použití směsi ethylacetát: pyridin : kys.octová : voda; ( 252 : 20 : 6 : 11; objemové poměry); jako elučního činidla.)

Příprava N,N-BOC-(t-butyloxykarbonyl-methyl)-D-cyklohexylalaninOH

Roztok, připravený rozpuštěním 28,0 gj N,N-BOC-(t-butyloxyker bony1-methyl)-D-cyklohexylalalnin-OMeJ (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 420,0 ml směsi dioxan : vodaj (9:1); byl smíchán s takovým dostatečným množstvím 1N roztoku hydroxidu sodného, aby pH reakční směsi se udržovalo po dobu 90,0 minut, při teplotě místnosti, na hodnotě pH » 13,0.

Po okyselení, byla směs nalita do vody; a poté byla extrahována 3 dichlormethanem. Po oddělení organické a vodné fáze, byla organická vrstva promyta s vodou; a následně byla vysušena se síranem sodným; a filtrát byl odpařen.

Bylo získáno 24,0 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

0,23J.(za použití oxidu křemičitého; a směsi dichlormethanu a methanolu; (9:1), jako elučního činidla^ ( objemové poměry).

- 29 ·· ····

Příprava N,N-BOC-(t-butyloxykarbony1-methy 1)-D-cyklohexylalanin(N-cy klopě nty1)-Gly-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 24,0 gj N,N-BOC-(tbutyloxykarbonyl)-D-cyklohexylalsnin-OH* (získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 300,0 ml N,N-dimethylformamidu,. bylo přidáno 10,20 gj N-cyklopentyl-Gly-OMe; a 21,20 gj 2-(1H-bentotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborátuj a poté bylo pH vzniklé reakční směsi upraveno na pH = 8,50.

Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti přes noí, a následně byla odpařením zahuštěne.Po přidání vody 8 ethylacetátu ku zbytku, byla organická vrstva oddělena; a promyta postupně s 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodouj s 5%ním hydrogenuhličitaném sodným; a ještě s vodou; a nakonec byla vysušena se síranem sodným.

Filtrát byl odpařen,, a zbytek byl zpracován chromatografií na silikagelu, za použití směsi hexan : ethylacetát; (8 : 2)J jako elučního činidla. Frakce, obsahující žádaný, v nedpise uvedený produkt, byly shormážděny a odpařeny.

Bylo získáno 17,0 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

= 0,57J,(za použití oxidu křemičitého} a směsi hexanu a ethylacetátu,( 7 : 3); jako elučního činidla ( objemové poměry).

Příprava N,N-BOC-(t-butyloxyksrbony1-me thy1)-D-cyklohexylalanin( N-cyklopentyl)-Gly-OH

Analogickým postupem, popssným už výše v rámci přípravy N,N-BOC-(t-butyloxykarbony1-me thy1)-D-cyklohexylalanin-0HJ bylo zmýdelněno 17,0 gj N,N-BOC-('fc-butyloxykarbonyl-methyl)-D-cyklo4 ♦ • « · · • · · • · ·· • 9

9 9 hexylalanin-(N-cyklopentyl)-Gly-OMe;( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupjě); a bylo získáno 15,0 g{ pevného produktu, amorfního^charakteru, který byl následně zpracován chromatografií na silikagelu, za použití směsi dichlormethanu a methanoluj ( 95 : 5J objemové poměry)·, jako elučného činidla.

Bylo získáno 13,0 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

0,30j(za použití oxidu křemičitého; a směsi dichlormethanu a methanoluj ( 9 : 1J objemové poměry); jako elučního činidla.

Příprava HOOC-CH^-D-cyklohexylalanin-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys( 2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1J byla za použití N,N-BOC-(t-butyloxykarbonyl-methyl)-D-cyklohexylalanin-(N-cyklopentyl)-Gly-0H* (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); jako výchozího materiálu, získána v nadpise uvedená, žádaná sloučenina.

R^( kapalinová ohromatografie ):

23,57 min.J 20,0%; 0,50M pufru fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 60%, vodaj 20%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); až 20,0%;0,50M pufru fosforečnanu sodného; pH 2,10J a 80,0%, směs acetonitril : voda; (3 :: 2 ; objemové poměry)’, ve 40,0 minutách.

- 31 « «··· ·· · · · · ·· * * ,, « , ····· • ··· · » » · · ·· , * β · i « · ····· ] a · · g · ·· ,, a·· »a I ·»··

Příprava HOOC-CH₂-©-cyklohexylala_<Inin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

a) Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 11; byla připravena ze použití prolinu.HC1J a N-hydroxysukcinimidu; v nadpise uvedená, žádaná sloučenina, t.j, HOOC-CH₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Iy s-(2-thia zolyl ) ·

R_t( kapalinová chromatografie ) :

31,44 min. J 20%, 0,50MJ pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80%, voda; 0%j stpěs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); až do 20%;0,50M pufir fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20,0%, voda; a 60,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 4

Příprava 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-psi-/C0C0/-0H

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-OMe

- BOC-Iys-(CBz)-OMe

Ve směsi,, připravené smícháním dichlormethanu a methanolu, v poměru 9 : 1J ( objemové poměry);(celkem 500,0 ml); bylo rozpuštěno 25,0 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-Iys-( benzyloxykarbonyl)OH; a poté, co bylo ku vzniklému roztoku přidáno 21,10 g; 2-(1Hbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetraměthyluroniumtetrafluorboráiu; byle pH reakční směsi upraveno s triethylaminem na pH 8,0.

Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny; a následně byla promyta s vychlazeným 2N roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodou; 5%ním vodným roztokem hydrogen··« ·

uhličitanu sodného’, a naKonec ještě s vodou». Oddělená organická vrstva byla vysušena se síranem sodným; zfiltrována; a odpařena. Zbytek byl přečištěn chromátografií na oxidu křemičitém, za použití směsi ethylácetát : heptanj (1:4; objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 26,70 g; žádaného produktu; t,j. BOC-Lys-(CBz)OMe.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf - O,79J ( za použití silikagelu; a směsi aethylacetát :

heptanj( 3 : 1J objemové pooměry); jako elučního činidla.

Příprava N-terc?.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-p3i/ kyanacetátu/ - BOC-Eys-(CHz)-psi-/kyanacetát /

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 20,0 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-( benzyloxykarbonyl)-0Me; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)J v 600,0 ml vysušeného dichlormethanu; a vychlazenému na teplotu minus 78,0°C’jbylo přidáno pdjkapkách 127,0 mi; 1M roztoku diisobutylaluminiumhydridu v hexanu takovou rychlostí, aby teplotě reakční směsi byla stále nižší než minus 70,0°C.Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě minus 78,0°C po dobu 30,0 minut, bylo k ní přidáno 500,0 mi; 5%ního+yjdného roztoku kyseliny citrónové( kys. 2-hydroxypropan-1,2,3-kárboxylová ); a vzniklá, dvoufázová směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 10,0 minut. Poté byly vodná a organická fáze odděleny, a vodná vrstva byla extrahována 3 dichlormethanem.

Spojené dichlormethanové extrakty byly promyty s vodou; a po vysušení se síranem sodným, byly zfiltrovány. Zíakaný roztok byl v atmosféře dusíku vychlazen v lázni ze sněsi ledu a vody;

9· ···· ·· · ti· · · · ·♦ • 9 · · ·« 9 · 9·· • 9 9 ·> 9* · · · · ·· • · · · 9··· ··· e·.· ·· 9··

- 33 a byl k němu přidán roztok, připravený smícháním 24,85 g*_t kyanidu sodného; a 2,89 gj benzyltriethylamoniumchloriduj v 500,0 ml vody. Poté byl ku reakční směsi přidán během 30,0 minut, po částech,. ( 6 x 6,0 ml); za intentenzivního míchání,, acetanhydrid.

Po oddělení vodné a organické fáze, byla organická vrstva extrahována 2x s dichlormethanem. Spojené dichlormethanové extrakty byly promyty s vodou; vysušeny se síranem sodným; zfiltrovány’,. a za vakua byly odpařeny. Zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém, za použití směsi dichlormethan : ethylacetát; ( 9 : 1J objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 17,20 gj žádaného, v nadpise uvedeného produktu, t.j. BOC-Lys-(CBz)-psi-/kyanacetátu/.

Chromatografie na tenké vrstvě :

- 0,60; ( za použití silikageluj _g směsi dichlormethan :

( ethylacetát; 7 : 3; objemové poměry); jako eluč( ního činidla ).

Příprava N-terc.-butyloxykarbony1-Lys-(benzyloxykarbonyl)-psi/CH0HC0/-0Mě = BOC-Lys-(CBz)-psi-/CH0HC0/-0Me

Do roztoku, připraveného rozpuštěním 17,20 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-psi-/kyanacetátu/; (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 500,0 ml směsi, připravené smícháním diethyletheru a methanolu( 3 : 1; objemové poměry); a vychlazeného v atmosféře dusíku na teplotu minus 20,0°C; bylo vháněno při teplotě nižší než minus 5,0°c; celkem 54,70 g plynného chlorovodíku. Vzniklá reakční směs byla poté ponechána při teplotě 4,0°C přes noc v^klidu. Poté bylo ku reakční směsi přidáno po kapkách^a při teplYě nižší než minus 5,0°C; celkem 85,0 ml vody.

·♦ · ♦

- 34 Poté,, co byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 4,0 hodinj byla organická fáze oddělena, a promyta s vodou. Vodná vrstva byla nasycena s chloridem sodným,* a extrahována následně se směsí sekund.-butanolu a dichlormethanu; (3:2J objemové poměry). Organická fáze byla poté promyta se solankou, vysušena se síranem sodným, zfiltrována, a za vakua byla poté odpařena.

Bylo získáno 17,40 g surového aminu.

Ku zbytku, vyjmutému do 200,0 ml dimethylformamidu, bylo přidáno 8,70 g bis-(terč.-butyl)-anhydriduj a takové množství triethylaminu, až bylo dobíleno pH reakční směsi 5,0. Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti přes noc; a následně bylo rozpouštědlo za sníženého tlaku odpařeno.Zbytek byl rozpuštěn v ethylácetátuj a vzniklý roztok byl postupně promyt s vodou a se solankou, vysušen se síranem sodným, zfiltrován, a nakonec za vakua odpařen.

Zbytek byl přečištěn chromatografii na oxidu křemičitém, za použití směsi ethylacetát : heptan; ( 1 : 1; objemové poměry), jako elučního činidla.

Bylo získáno 6,22 gj žádaného, v nadpise uvedeného produktu t.j. BOC-Lys-(CBz)-psi-/CHOHCO/-OMe.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,75’, ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát :

( heptan; 3 : objemové poměry); jako elučního ( činidla .)

Příprava 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-psi-/CHOHC0/-0Me = 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-(CBz)-psi-/CHOHCO/-OMe

- 35 V 6,0 ml směsi 50%ní kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu,, bylo rozpuštěno 60,0 mg N-tere.- butylox^^bonyl-Lya( benzyloxykarbonyl)-psi-/CH0HC0/-0Me; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)J a vzniklý roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny.

Po odstranění rozpouštědla odpařením, byl izolován ve kvantitativním výtěžku surový amin, který byl bezprostředně použit pro přípravu žádanéhoj3-fenylpropionyl-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl )-psi-/CH0HC0/-0Me·

Ku směsi, ^připravené rpzpuštěním 3-fenylpropionyl-Pro-OH} v 5,0 ml dimethylformamičtu, bylo přidáno 196,0 ml triethylaminu, a vzniklá reakční směs byla v atmosféře dusíku vychlazena na teplotu minus 15_r0°C. Poté bylo ku reakční směsi přidáno 183,0 ml isobutylchlorformiátu*, a směs byla následně míchána při teplotě minus 15,0°C po dobu 15,0 minut_rPoté byl surový amin rozpuštěn v 5,0 ml vysušeného dimethylformamiduj a po zneutraliiování získaného roztoku s triethylaminem, byl přidán po kapkách ku vychlazené směsi roztoku^-anhydriduí za stálého míchání)..

Poté byle reakční směs míchána při teplotě minus 15,0°C po dobu 1,0 hodiny’, a následně byla ponechána při teplotě 0°C přes noc v klidu.

Po odpaření směsi do sucha, byl zbytek rozpuštěn v ethylacetátu;. a poté byl postupně promyt s vodou; s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného;, a se solankou; a £o vysušení se síranem sodným, byl roztok za vakua zahuštěna Zbytek byl přečištěn chromatografii na oxidu křemičitém, za použití směsi di-r chlormethan : methanolJ ( 95 : 5J objemové poměry); jako elučního činidla.

3ylo získáno 246,0 mg žádaného 3-fenylpropionyl-Pro-Lya( benzyloxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/-OMe·

Chromátografie na tenké vrstvě ::

·· · ♦ • t · · · ♦ φ · · · · + ···.·# · · ·

Rp - O,92J ( za použití silikagelu* a směsi ethylacetát :

( pyridin : kys.octová :: vodaj ( 63 :: 20 : 6 ε ( 11J objemové poměry )_ř jako elučního činidla).

Příprava 3-fenylprópioisyl-Pro-Lys-psi-/CHQHC0/-0Me

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 240,0 mgj 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-psi-/CH0HC0/-0MeJ (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 5,0 ml methanolu, bylo přidáno 50,0 mg’₍10%ního palladia na aktivním uhlí, a 216,0 mlj 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové.

Vzniklá reakční směs byla hydrogenována za atmosferického tlaku, při teplotě místnosti, po dobu 1,0 hodiny.Poté byl palladiový katalyzátor odstraněn filtrací; a filtrát byl za sníženého tlaku odpařen.

Byl získán v kvantitativním výtěžku žádaný nadpise uvedený produkt, t.j. 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-psi-/CHOHCO/-OMe.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,13; ( za použití silikagelu; a směsi dichlormethan :

( methanol; ( 9 : 1J objemové poměry); jako eluč( ního činidla )♦

Příprava 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-( ?N??tera.-butyloxykarbonyl)psi-/CHOHCO/-OMe - 3-fenylpropionyl-Pro-Iys-(B0C)-psi~/CH0HC0/OMe ·· ·· • · ·

9 9·

9·· 9

Ku roztoku·^ připravenému rozpuštěním 196,0 mgj 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-psi-/CHOHCO/-OMe; v 5,0 ml vysušeného diemethylformamidu, bylo přidáno 102,0 mgj bis-(terč.-butyl)-anhydriduJ a pH reakční směsi bylo přídavkem triethy laminu upraveno na pH 8,50. Vzniklá reakční směs byla poté míchána při teplotě místnosti přes noc, poté byla za vakua odpařena, a výsledný zbytek byl přečištěn chromátohrafií na oxidu křemičitém; za použití směsi dichlormethan : methanol; ( 98 : 2J objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 189,0 mg žádaného produktu, t.j. 3-fenylpropionyl-Pro-L·ys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/-OMe.

Chromátohrafie n^tenké vrstvě :

0,43J ( za použití silikagelu; s směsi dichlormethan :: ( methanolu; ( 9 : 1J objemové poměry); jako eluční ( ho činidla ),

Příprava 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-(N-terc»- butyloxykarbonyl)psi-/CH0HC0/-0H = 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-(B0C)-psi-/CH0HC0/-0H

Ku roztoku, připravenému rozpuštěném 185,0 mgj 3-fenylpropiony1-Pro-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/CH0HC0/-0Mé;(získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 5,0 ml směs dioxanu a vody; (7:3); bylo přidáno po částech; během 30,0 minut; při teplotě místnosti; a za udržování rozmězí pH v hodnotách 10,0 - 10,50; celkem 267,0 mlj2M vodného roztoku hydroxidu sodného.

Po uplynutí 30,0 minut, byla reakční směs neředěna se 20,0 ml vody; a poté bylo k ní přidáno tolik 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové, až bylo docíleno pH 2,0. Následně byla reakční směs J t.j. vodná vrstva, extrahována s dichlormethanem.

- 38 Spojené dichlormethanové extrakty byly postupně promyty s 50,0 ml solanky; a s 50,0 ml vody; a po vysušení se síranem sodným, byly zfiltrovány; a za vakua byly zahuštěny.

Bylo získáno 228,0 mg, žádaného 3-fenylpropiony1-Pro-Lys( N-terc.- butyloxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/-OH^

Chromatografie na tenké vrstvě ::

Rip = 0,6©; ( za použití silíčagelu; a směsi ethylacetát ::

pyridin : kys.octová : vodaj (63 : 20 : 6 : 11; objemové poměry); jako elučního činidla.

Příprava 3-f enylpr opi ony 1-Pro-Ly s- (N-tercz. -buty loxy karbony 1) psi- /C0C0/-0HÍ

Ku roztoku,připravenému rozpuštěním 220,0 mgj 3-fenylpropiony 1-Pro-Ly 3- (N-terc. -buty loxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/-OH; (získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 5,0 ml vysušeného dichlormethanu, bylo přidáno 255,0 mgj perjodinanu ( Dess-Martinovo reagens).Poté, co byle vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny, bylo k ní přidáno 15,0 ml J 2%ního roztoku thiosíranu sodného; a tato směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut.

Poté, co byla organická vrstva ve směsi oddělena, byla promyta s vodou’, a poté byl8 vysušena se síranem sodným; zfiltrovánaj a za vakua byla odpařena^

Bylo získáno 411,0 mg surové ketokyseliny; 3-fenylpropionylPro-Lya-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/C0C0/-0H.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Ef = 0,47; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát ::

( pyridin : kys.octová : vodaj ( 63 : 20 : 6 : ( 11; objemové poměry),' jako elučního činidla).

•4 4444

- 39 Příprava 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-psi-/C0C0/-0H-^T

Celkem 411,0 mg} surové formy 3-fenylpropionyl-Pro-Iya( N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/COGO/-OH} ( získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)} bylo reagováno se směsí 90%ní kyseliny trifluoroetové a vody, při teplotě místnosti, po dobu 1,0 hodiny.

Tato reakční směs byla poté za vakua zahuštěna} a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě; a bezprostředně přímo nanesen na sloupec preparativní vysokovýkonné kapalinové chromátografie ( systém Supercošil-LC-18-DB), za použití gradientově eluce se systémem 20%}. 0,50M pufr fosforečnanu sodného} pH 2,10} 70,0% voda} 10%} směs acetonitril : voda} (3:2} objemové poměry )} až 20,0%}0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,1 OJ 0,0% voda} a 80%} směs acetonitril : voda} (3:2} objemové poměry)} během 45,0 minut; a při rychlosti průtoku 20,0 ml/min.

Bylo získáno 71,0 mg žádaného produktu, t.j. 3-fenylpropionyl-Pro-Lys-psi-/C0C0/-0H.

R^( kapalinová chromátografie ):

24,90 min;.} 20%} 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10} 80,0%} voda^až 20,0%} 0,50M pufr fosforečňau sodného} pH 2,10} 20,0% voda} a 60%} sm^s acetonitril : voda} ( 3 :: 2} objemové poměry)} ve 40,0 minutách.

Analogickým postupem, popsaným výše, byly připraveny i následující Sloučeniny :

φ φφφφ φφ Φφφφ φφ φφ φφφ φφ · φφφφ φ φφφ φφφ φ φ φφ • φφφ φφ φ φφφφ · φ φφφφ φφφ φφφ φφφ φφ φ ·· ··

- 40 Sloučenina a)

Příprava 3,3-difenylpropionyl-Pro-Lys-psi-/COGO/-OH'

R^( kapalinová chromátografie ):

36,42 mini.; 20%; 0,50M^r pufr_z fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0%, vodaj 0,0% směs acetonitrii : voda; (3:2; objemové poměry);

až do 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,T0; 20,0% vodaj a 60,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry), ve <0,0 minutách.

Sloučenina b)

Příprava 3-fenylpropionyl-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys-psi-/C0C0/-0H

R_t ( kapalinová chromátografie ):

34,29 min.; 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 80%; vodaj 0,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry);

až do 20,0%; 0,50M^rpufr fosforečnanu sodného; 2,10 pH; 20,0%, voda; a 60,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 4o,0 minutách.

Sloučenina c)

Příprava 3-/(p-Gl)-fenyl/-propionyl-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys-psi/ COCO/-OH

R^( kapalinová chromátografie I :

0 0 · «000

- 41 39,52 min.; 20,0%J 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 80,0%, vodaj 0,0%, směs acetotoitril : voda; (3:2; objemové poměry); až do 20,0%J 0,50M'pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20,0$; voda; a 60,0%;. směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina d)

Příprava 3-/(p-01)-fenyl/-propionyl-Pro-Lys-psi-/C0C0/-GH

R^( kapalinová chromstografie ):

31,31 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10J 80,0%; vodaj 0,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry);, až do 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20,0%; vodaj a 60,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J. objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Sloučenina e)

Příprava naftylsulfonyl-Asp-Pro-Lys-psi-/COCO/-OH

R_t( kapalinová chromátografie ):

30,45 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J ®0,0%; voda; 0,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); až do 20,0%; 0,50 M pufr fosforečnanu sodnéhoJpH 2,1 OJ 20,0%,· voda; a 60,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

·· ····

- 42 ···

Příklad 5

Příprava H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-benzothiazolylů )

Příprava N-terc.-butyloxykarbony1-Lya-( benzyloxykarbonyl)-psi/CH0H/-(2-benzothiazolylu) = BOC-Lys-(CBz )-ρsi-/CHOH/4^í2-benzothiazolylα)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 1,0 gj N-terc.-butyloxykarbony1-Lys-(benzyloxykarbonyl)-OMeJ ve 25,0 ml dichlormethanu·, a vychlazenému na teplotu minus 78,0°C, bylo přidáno po kapkách 7,60 mi; 1M roztoku diisobutylaluminiumhydridu v hexanu, přičemž teplota reakční směsi byla stále udržována nižší než minus 70,0°C. K výsledné reakční směsi, byl po 30 minutovém míchání, při teplotě minus 78,0°C; přidán 5%ní vodný roztok kyseliny citrónové.

Poté_r co byla vytvořená/dvoufázová směs₍ míchána při teplotě místnosti po dobu 10,0 minutJ byly vodná a organická fáze odděleny; a vodná vrstva byla následně extrahována 2x s dichlormgtfygg.g$. Spojené dichlormethanové extrakty byly promyty postupη£νζΓ'5%~ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a s vodou; a poté byly vysušeny se síranem sodným;, a zfiltrovány.

Ku získanému roztoku bylo v atmosféře dusíku přidáno 0,79 gj 2-(trimethylsilyl)-benzothiazolu; a tato reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin.Po odpaření směsi do sucha, byl výsledný zbytek rozpuštěn v 15,0 ml vysušeného tetrahydrofuranu, a ku vzniklému roztoku bylo přidáno 3,80 mlj 1M*roztoku tetrabutyl8moniumfluoridu v tetrahydrofuranu. K této reakční směsi, která byla míchána poté při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin, byla přidána vodaj a produkt byl extrahován s dichlormethanemja následně byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém, za použití směsi dichlormethan : ethylacetát; ( 9 : 1 i objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 724,0 mgj žádaného N-terc.-but.yloxykarbonyl- 43 * ♦· • ·· ···« ·· ··

9 9 9 9 99

9 9 9 999

999 99 · 99 9 ·· • ♦ Φ · · ·♦

99 99 9 9 9 · · · *♦

Lys-( benzyloxykarbonyl)-psi-/CH0H/-(2-benzothiazolylu).

Chromátografie na tenké vře tvé

- O,35J ( za použití_ssilikagelu; a směsi dichlormethan ( : ethylácetát; (7:3; objemové poměry); ja( ko elučního činidla ).

Příprava N*-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2benzothiazoiylu ) = BOC-Lys-(CBz)-(2-benzothiazolyl )

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 700,0 mg; N-terc.butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-psi-/CHOH/-(2-benzthiazalylu; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně),ve 10,0 mi; vysušeného dichlormethanu, bylo přidáno 1,0 g* perjodinanu (Desa-Martinovo reagens).Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny,, byl k ní přidán 2%ní vodný roztok thiosíranu sodného; a tato směs byla míchána při teplotě místnosti dalších 30,0 minut. Po oddálení organické a vodné fáze, byla organická vrstva promyta s vodou, vysušena se síranem sodným, a po zfiltrování byla za vakua odpařena.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém,, za použití směsi ethylacetát : heptanj 3 :: 1, objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 193,0 mgý žádaného N-terc.-butyloxykarbonylLys- ( benzyloxykarbonyl)-(2-benzothiazolylu ).

Chromátografie na tenké vrstvě :

R^ » 0,85;. ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát :

( heptanj 3 : 1)J objemové poměry, jako eluč( ního činidla).

• ···· ·· · • ··· • · · • to *”

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D-cyklohexylalalanin-ProIya-( benzyloxykarbonyl)-C 2-benzothiazolylu) - BOC-D-Cha-ProLyg-CCBz )-(2-benzothiazolyl) •to ····

Roztok, připravený rozpuštěním 193,0 mgj N-terc.-butyloxy karbpnyl-Lya-( benzyloxykarbonyl)-(2-benzothiazolylu); (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 50%ní směsi kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu]( 2,0 ml); byl míchán při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny.

Poté, co bylo ze směsi odpařeno rozpouštědlo, byl surový amin izolován ve kvantitativním výtěžku, a poté bezprostředně použit pro přípravu N-terc.-butyloxykarbony1-B-cyklohexylalaninPro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-benzothiazolylu).

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním N-terc.-butyloxykarbony 1-D-cyklohexylalanin-Pro-OH; ve 4,0 ml dimethylformamidu, bylo přidáno 66,0 mi; diisopropylethylaminuj a vzniklá reakční směs byla umístěna do prostředí dusíku; a vychlazena na teplotu mi-r nus 15,0°C. Poté byl ku vzniklé směsi přidán isobutylchlorformiát ( 50,0 ml); a tato směs byla ponechána míchát po dobu 15,0 minut při teplotě minus 15,0°C.

Surový amin byl rozpuštěn ve 4,0 ml vysušeného dimethylformamiduj zneutralizován s diisopropylethylaminem, a tento roztok byl přidán po kapkách ku vychlazenému, míchanému roztoku anhydridu. Vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 1,0 hodiny při teplotě minus 15,0°C; a poté byla ponechána při teplotě 0°C přes noc v klidu. Po následném odpaření směsi do sucha, byl výsledný zbytek rozpuštěn v ethylacetátu, a postupně byl promyt s vodou; 5%ním roztokem hydrogenuhličitaňu sodného; s vodou; a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl roztok za vakua zahuštěn.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografii na oxidu křemičitém, za použití směsi ethylacetát : heptan; (1 : 1J objemové poměry); jako elučního činidla.

···

- 45 Bylo získáno 191,0 mg; žádaného N-terc.-butyloxakrbonylB-cyklohexylalanin-Pro-Iys-( benzyloxykarbonyl)-(2-benzothiazolylu).

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rp = 0,66; ( za použití silkageluj a směsi ethylacetát ::

( heptan; 3 :: 1; (objemové poměry); jako eluč( ního činidla.

Příprava H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-benzothiazolylu)

V rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně získaný N-tere,-butyloxykarbonyl-D-cyklohexylalalnin-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl )-( 2-benzothiazolyl ) , byl reagován se 2,20 mi; směsi kyseliny trifluoroctové a thioanisolu; ( 10 : 1* objemové poměry); při teplotě místnosti; po dobu 3,50 hodiny.Vzniklá reakční směs byla za vakua zahuštěna, a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě.

Poté, co byla vodná fáze rozsáhle promyta s diethyletherem, byla oddělená vodná vrstva, obsahující H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-benzothiazolyl), nanesena přímo ηβ sloupec preparativní vysokovýkonné kapalinové chromatohrafie( systém Supelcosil-LC-18-DB), za použití gradientového elušního systému 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 80,0%, voda; až 20%; 0,5^M; pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 20%; voda a 60,0%; směs acetonitril : vodaj (3:2; objemové poměry); během 40,0 minut; a rychlosti průtoku 20,0 ml/ min.

Bylo získáno 98,0 mg; žádaného H-D-cyklohexylalalnin-ProLys-( 2-benzothiazolylu).

( kapalinová chromátografie ):

·ΦΦ· ·· ···· ·· φ · · φ φ · · ♦ φ φφφ φφφ φ φ φφ φ ΦΦΦ·· φ ··· · · φ φφφφ φφφ φφφφφφ φφ · ·· · ♦

- 46 42,.0 mim.; 20,0%; 0,50Μ pufr fosforečnanu sodného; ρΗ 2,1 OJ

80,0%,. voda až 20,0%; 0,50M^rpufr fosforečnanu sodného; pH 2,10;

20,0%; voda a 60,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 6

Příprava H-E-cyklohexylalalnin-Pro-Lys-(2-tetrazolylu) =

H-D-Cha-Pro-Lys-(2-tetrazolyl)

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl -Lys-( benzyloxykarbonyl)psi-(CHOAc)-(2~tetrazolylu) = B0C-Lys-(CHz)-psi-(CH0Ac)-(2tetrazolyl)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 5,40 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-( benzyloxykarbonyl)-psi-/kyanacetátu/ý ve 39,0 ml dimethylaformamidu, bylo přidáno 801,0 mg chloridu amonného; a 975,.0 mg natriumazidu, t.j. sodná sůl azoimidu.

Vzniklá reakční směs byla zahřívána na teplota 80,0°C ; a míchána v atmosféře dusíku po dohu 48,0 hodin. Vysrážená sůl byla odfiltrována; a filtrát byl za sníženého tlaku odpařen do sucha·

Bylo získáno 4,90 gj žádaného, v nadpise uvedenéh produktu.

Chromatografie na tenké vrstvě :

= 0,42; ( za použití silikagelu,’ a směsi toluen : voda;

( 6 : 4)Jobjemové pSíěry); jako elučního činidla).

···· ·· ····

- 47 Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-( benzyloxykarbonyl)psi-(CH0H)-(2-tetr8zolylu) = B0C-Lys-(CBz)-psi-(CH0H3-(2tetrazolyl)

V 60,0 mlj směsi dioxanu a vodyj (7:3); bylo rozpuštěno ¹,2!Lg; N-terc~.-butyloxykarbonyl-Iys-r( benzyloxykarbonyl)pai-(CHAc)-(2-tetrazol.ylu)(získaného v rámci předcházejícího, výše popaaného Stupně); a ku vzniklému roztoku bylo přidáno 2,65 mi; 2N^: vodného roztoku hydroxidu sodného.

Vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2,50 hodiny; a během této doby bylo zjištěno, že reakce je dokončena. Poté bylo pH směsi upraveno na pH 5,0; a výsledná směs byla za sníženého tlaku odpařena do sucha. Výsledný zbytek byl rozpuštěn ve směsi methanolu a dichlormethanu; (1:1); a nerozpustná sůl byla odfiltrována.

Bylo získáno 1,27 g v nadpise uvedeného,a žádaného deacetylovaného produktu.

Ohromatografie na tenké vrstvě :

Rf - 0,40; ( za použití silikagelu; a směsi toluen : etha( noi; 6 : 4 ( objemové poměry); jako elučního ( činidla).

Příprava ΝΙ-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)- (2tetrazolylu) - B0C-Lys-(CBz)-(2-tetrazolyl)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,56 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-( benzyloxykarbonyl)-psi-(CHOH)-(2-tetrazolylu); ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 37,0 ^L^ylicl^ormethanu, bylo přidáno 1,38 g; DessMartinova perjodanového reagens; a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut.

·· · · • · ·· · ♦ ··· ·· · to to to to • ··· ·· · · · ·· • · · · · to · ♦··· to • · · · · · · · ······ ·· · ·· · ♦

- 48 Poté byla reakční směs smíchána s 10%ním, vodným roztokem thiosíranu sodného; a po oddělení organické a vodné fáze, byla organická vrstva extrahována s vodouja 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a vodná vrstva byla spojena a extrahována s 1-butanolem. Butanolová vrstva byla za sníženého tlaku odpařena do suchaJ a výsledný zbytek byl chromátografován na sloupci se silikagelem, za použití směsi ethylacetát,: pyridin : kys.octová : voda; ( 263 : 20 : 6 : 11; objemové poměry), jako elučního činidla.

Bylo získáno 0,22 g žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

Chromátografie na tenké vrstvě :

- 0,30; ( ze použití silikagelu; a směsi ethylacetát :

( pyridin : kys.octová : voda; 63 : 20 : 6 : 11» ( objemové poměry; jako elučního činidla.

Příprava H-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-tetrazolyl)-trifluoroctové kyseliny = H-Lys-(CBz)-(2-tetrazolyl). TFA

Směs, připravená rozpuštěním 0,21 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-tetrazolylu);( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 16,0 ml směsi kyseliny trifluoroctové a vody; ( 9 : 1)J byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny; a poté byla za vakua zahuštěna na produkt olejovíté konzistence.

^lo získáno 0,34 g; žádaného, v pjadgise uvedeného produktu, který byl bezprostředně použit pr§Vtripeptidu, t.j. N-terc.butyloxykarbonyl-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)(2-tetrazolylu)7 připravovaného v dalším Stupni.

···· ·· ····

- 49 99·· • 9 9 9 9 9 99

9 99 9 · · ···· » · 9 9 9 · · ··· 99

9 9 9 9 9 99

999 999 99 9 9999

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-tetrazolylu) - BOC-D-Cha-Pro-Lys-(CBz)( 2-tetrazolyl)

Analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 1J týkajícím se synthesy dipeptidového podílu,, bylo připraveno 0,19 g* N-terc«-butyloxykarbonyl-D-cyklohexylalanin-Pro-OH; který byl zkuplován s 0,17 gj H-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-tetrazolylu); analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 5.

Přečištěním na silikagelu, za použití směsi ethylacetát : pyridin : kys.octová : vod8j ( 163 : 20 : 6 : 11J objemové poměry), jako elučního činidla, bylo získáno 0,21 gj žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,17; ( za použití silikagelu, a směsi ethylacetát :

pyridin : kys.octová : vodaj( 63 : 20 : 6 : 11; objemové poměry), jako elučního činidla.

Příprava H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-tetrazolylu)

Odstraněním chránících skupin, z N-terc.-butyloxykarbonylD-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-tetrazolylu); a přečištění produktu, bylo provedeno analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 5.

Bylo získáno 20,0 mgj v nadpise uvedené, žádané sloučeniny,

R^( kapalinová chromátografie ):

23,30 min. a 24,50 min.J 20,0%, 0,50M, pufr, fosforečnanu sodného, pH 2,10; 80,0%, voda, až 20,0%, 0,50M pufr , fosforečnanu sorného, pH 2,10; 20,0% voda, a 60,0%, směs acetonitril ? voda;

(3:2;

objemové poměry), ve 40,0 minutách.

- 50 ·· ΦΦΦ· ···· • Φ φφ • •Φ φ φ φ φ φ φ φ

Φ·· Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦ • φ · Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ Φ Λ

Φ Φ ΦΦΦ · Φ ·

ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ Φ ΦΦ Φ ·

Příklad 7

Příprava H00C-CH₂-C0-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Přípraνβ H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2thiazolyl).trifluoroctové kyseliny = H-D-Cha-Pro-Lys-(CBz)-(2thiazolyl).TFA

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 5; byl připraven N-terc.-butyloxykarbony1-D-cyklohexylalalanin-ProLys- ( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl).

Roztok, připravený rozpuštěním 0,30 g; výše uvedeného tripeptidu; ve 3,0 ml směsi kyseliny trifluoroctové a dichlormethanuj (1 : 1; objemové poměry); byl míchán při teplotě místnosti po? dobu 1,0 hodiny.Poté byl roztok za sníženého tlaku odpařen do sucha; a poté 3 x odpařen s toluenem.

Byl získán v kvantitativním měřítku produkt olejovíté konzistence, H-D-Cha-Pro-Lys-(CBZ)-(2-thiazolyl).TFA; který použit bezprostředně v následujícím, níže popsaném Stupni.

Chromatografie n8 tenké vrstvě :

R-g. ²⁵ 0,30; ( za použití silik8gelu·, a směsi ethylacetát :

( pyridin. : kys.octová : voda; (163 : 20 : 6 :: ( 11; objemové poměry ); jako elučního činidla.

Příprava ( t-butyl-OOC-CH₂-CO)-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu )

Roztok, připravený rozpuštěním 0,33 gj H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny^ získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně);

• ·· · • · • ··

- 51 ve 3,0 ml vysušeného dichlormethanu, byl smíchán se 76,0 mg} mono-terciárním butylmalonátem; a pH reakční směsi bglo pomocí triethylaminu upraveno přibližně na pH 8,0. Násilně byl ku reakční směsi přidán benzotriazolyloxytris-ídimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát \ ( 211,0 mg)Ja reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin; a poté při teplotě 4,.0°C}po dobu dalších 16,0 hodin.

Poté byla směs za vakua zahuštěna, rozpuštěn zbytek v ethylacetátu, a tento roztok byl promyt 3x s vodou; a solankou. Organická vrstva byla opět za vakua zahuštěna poté, co byla vysušena se síranem hořečnatým.

Výsledný zbytek byl chromátohrafován na oxidu křemičitém; za použití směsi heptanu a ethylacetátu; (2:8; objemové poměry), jako elučhího činidla .

^ylo získáno 270,0 mg žádaného; v nadpise uvedeného acetylovaného tripeptidu, t.j. ( t-butyl-OOC-CH^-CO)-D-cyklohexy1alanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu).

Chromátografie na tenké vrstvě :

- 0,21J ( za použití silikagelu; a směsi heptan : ethyl( acetátj 8 : 2*, objemové poměry); jako eluční( ho činidla).

Příprava H00C-CH2“00-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Odstranění chránících skupin,a přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromátografií produktu, získaného v předcházejícím, výše popsaném Stupni, bvlo provedeno analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 5 výše.

Bylo získáno 124,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu • · · · ·· 4 4 4 4 · ·· · • · * ·····

444 4 · · · ··· • · · · · · ··· ·9 • 4 · 4 · ·· •4* 4··4444

R^( kapalinová chromátografie ) :

38,.23 min.} 20,0%} 0,50 M;pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10} 80,0% voda; až 20,0%} 0,50M, pufr fosforečnanu sodného} pH 2,10} 20,0%, voda; a 60,0%} směs acetonitril : voda} (3:2} objemové poměry )} ve 40,0 minutách.

Příklad 8

Příprava HOOO-(CH^)2*-C0-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu'

Příprava (HOOC-ÍCB^^-COÍ-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-íhenzyloxykarbony1)-(2-thiazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,33 g} H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny} ve 3,0 ml vysušeného dichlormethanuja 0,335 ml pyridinu, bylo přidáno 48,0 mg sukcinanhydridu a výsledná reakční směs byla míchána v atmosféře dusíku při teplotě místnosti. Po 4,0 hodinách bylo zjištěno, že reakce je skončena, d^měsi bylo přidáno několik kapek vody.

Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna} zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu} a vzniklý roztok byl promyt se zředěnou kyselinou; s vodou}a se solankou; a poté byl vysušen se síranem hořečnatým.Po odstranění sole byla organická vrstva zahuštěna za vakua} a bylo získáno 320,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, ve formě látky olejovíté konzistence.

Chromátografie na tenké vrstvě :

R^, = 0,37} ( za použití silikagelu, 8 směsi dichlormethan ( : methanol} (9:1} objemové poměry); jako ( elučního činidla).

- 53 Příprava HOOC- (CH₂ )₂-CO-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( 2-thiazolylu)

Odstranění chránících skupin a přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromátohrafií u sloučeniny (H00C-(CH₂)₂-C0-)-Dcyklohexylalahin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu) bylo provedeno analogickým:’ postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 5.

Bylo získáno 187,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R_t( kapalinová chromátografie 5 :

38,31 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 80,0%, voda až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 20,0%, voda a 60,0%, směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 9

Příprava H^OOC.-CH(CH^)-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu) Příprava (t-butyl-OOC-CH(CH^))-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu) = (t-butyl-OOC-CH(CH^))-DCha-Pro-Lys-(CBz)-( 2-thiazolyl)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,33 gj H-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl).trifluoroctové kyseliny; ve 2,0 ml acetonitrilu, bylo přidáno nejpr^ve 0,50 gj terč.-butylesteru kyseliny 2-brompropionové; a poté ještě 25,0 mg jodidu sodného. Poté bylo pH vzniklé reakční směsi upraveno pomocí diisopropylethylaminu na pH 8,OJ a při tomto pH byla re8kční směs udržována^ ( při teplotě místnosti)ý po dobu 12,0 dnů.

• ·

- 54 Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna; zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátuj^zniklý roztok byl promyt s vodou;

vysušen se síranem hořečnatým, a znovu zahuštěn.

Zbytek byl chromatografován na oxidu křemičitém; za použití směsi ethylacetát : toluen; (1:1); jako elučního činidla.

Bylo získáno 279,0 mg; žádané; v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie na tenké vrstvě :

- 0,75; ( za použití silikagelu; a ethylacetátu jako) ( elučního činidla).

Príprave H\00C-CH(CH^)-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Odstranění chránících skupin; a přečištění produktu, získaného v předcházejícím, výše popsaném Stupni, t.j. (ť-butylOOC-CH(CH^)ϊ-H-cyklohexylalalanin-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)(2-thiazolylu), vysokovýkonnou kapalinovou chromátografií,bylo provedeno analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 5.

Bylo získáno 40,0 mg;a 29,0 mg žádané,* v nadpise uvedené sloučeniny, ve formě oddělených diastereoizomerů.

R^( kapalinová chromatografie ):

20,0%; 0,50M; pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0%, voda; 30,06 min*, a 34,87 min. , ( oddělené diastereoizomery); až 20,0%; 0,50M;, pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1OJ 20,0%, voda; a 60,0%; aměa acetonitril : voda; (3 : 2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

- 55 Příklad 10

Příprava H00C-(CH₂)₂-D-cyklohexylalaňin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava (t-butyl-000-(CH₂)₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys( benzyloxykarbonyl)-( 2-thiezolylu ) = (t-buty1-000-(CH₂)₂D-Cha -Pr o-Ly s - (CBz) - (2- thi a z o ly 1 V.)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,21 gj H-D.-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny; v 5,0 ml acetonitrilu, bylo přidáno ve 3 částechjcelkem 1,84 mlj terč.-butylesteru kyseliny akrylové.

Poté, co bylo pH vzniklé reakční směsi upraveno pomocí diisópropylethylaminu na pH 8,0; byla tato reakční směs udržována při zmíněné alkalitě; a při teplotě místnosti; po dobu 13 dnů.Poté byla směs za vakua zahuštěna, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátuj a vzniklý roztok byl promyt s vodou, poté vysušen se síranem sodným; a opět zahuštěn.

Zbytek byl chromátografován na oxidu křemičitém,, za použití směsi ethylacetát : toluen; ( 2 : 1J objemové poměry), jsko elučního činidla.

Bylo získáno 92,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chrpmatografie ne tenké vrstvě :

Rf. = 0,62J ( za použití silikegelu, a ethylacetátu jako) ( elučního činidla).

Příprava H)S(00C-(CH₂)₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

- 56 ·· ····

Odstranění chránících skupin; a přečištění produktu,získaného v předcházejícím,, výše popsaném Stupni; t.j. (t-butylOOC-(CH^)^-D-Cha-Pro-Lys-tCBz)-(2-thiazolylu)J vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii, bylo provedeno analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 5.

Bylo získáno 40,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R^( kapalinová chromá tografie )::

32,83 min.J 20,.0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; 2,10 pH; 80,0%; voda; až 20,0%φ 0,50KT pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 20,0%; voda; a 60,0%; směs acetonitril 5 vodaj (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách»

Příklad. 11

Příprava _-D-norLeu-Pro-Ly3-(2-thiazolylu)

Příprava H-D-norLeu-OMe. hydrochloridu

Poté, co bylo ku 270,0 ml methanolu, vychlazenému na teplotu minus 15,0°C,. přidáno 18,20 g thionylchloridu, byla teplota vzniklé směsi upravena na minus 10,0°C; a při této teplotě byla reakční směs udržována po dobu 20,0 minut. Poté bylo ku směsi přidáno 10,0 gj H-D-norLeu-OH; a poté, co byla teplota směsi pomalu zvýšena; byla zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem po dobu 5,0 hodin.

Produkt byl překrystalizován ze směsi methanolu a diethyletheruj při teplotě 4,0°C.

Bylo získáno 12,90 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

- 57 ···

Chromátografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,61J (za použití silikageluj a směsi n-butanol :

( kys.octová : vodaj ( 10 :: 1 : 3J objemové po( měry,)J jako elučního činidla^.

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D-norLeu-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 12,90 gj H-D-norLeuOMe. hydrochloriduj ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 200,0 ml vysušeného methanolu, bylo přidáno 15,50 gj di-terc.-butyldikarbonátuj a 19,80 mlj triethylaminu.

Vzniklá reakční směs byls míchána při teplotě místnosti, po dobu 3,0 hodin; a poté byla za vakua zahuštěna.Získaný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu; a vzniklý roztok byl promyt s vodou.

Produkt byl chrométografován na oxidu křemičitém, za použití směsi heptan : ethylacetátj ( 3 : 1J objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 16,90 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf - O,55J ( za použití silikagelu; a směsi heptan : ethyl( acetátj 3 : 1J objemové poměry); jako elučního ( činidla.)

Příprava N-fife' -N-terc.-butyloxykarbonyl-D-norLeu-OMe

- 58 Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 16,90 g* N-terc.butyloxykarbonyl-D-norLeu-OMe; ( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 200,0 ml vysušeného dimethylformamiduf( v atmosféře dusíku); bylo přidáno 24_f90 mi; methyljodidu, vychlazeného na teplotu 0°c; a 3,31 g* hydridů sodného. Vzniklá reakční směs byla ponechána reagovat při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin.

Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna; a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu; a vzniklý roztok byl promyt se zředěnou 0,1N vodnou kyselinou chlorovodíkovoůy^pdté \ s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a s vodou; a po vysušení byl znovu zahuštěn.

Bylo získáno 18,80 g žádaného, v nadpise uvedeného alkylovaného produktu.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,56; ( za použití silikagelu; a směsi heptan : ethyl( acetát; ( 3 : 1; objemové poměry); jako eluční( ho činidla)*

Příprava Ní-W -N-terc.-butyloxykarbonyl-D-norLeu-OH

II roztoku, připravenému rozpuštěním 18,0 gj N--Nterc.-butyloxykarbonyl-D-norLeu-OMe;( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve směsi 400,0 ml dioxanu a vodyj ( 9 : 1J objemové poměry); bylo . pomocí vodného/ 1N3 roztoku hydroxidu sodného; upraveno pH na hodnotu 12,0; a u této směsi byla ponechána probíhat reakce, při konstantním pH 12,OJ po dobu 2,0 hodin.

Balší postup zahrnuje uprávu pH směsi na pH 2,0; vychlazení pomocí ledu; přidání 400,0 ml vody; a extrakci s dichlormethanem.

• · · · · ·

- 59 Po oddělení organické a vodné fázej byla organická vrstva promyta se solankou; vysušena; zfiltrovánaj a za vakua byla zahuštěna .

Bylo získáno 18,90 která obsahovala nějaký g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny, dioxen.

Chromatografie na tenké vrstvě :

= 0,26; ( za použití silikagelu, a směsi dichlormethanu) ( a methanolu; ( 9 : 1J objemové poměry),’ jako ) ( elučního činidla).

Příprava N-Me ,-N-terč,-butyloxykarbony1-D-norLeu-Pro-OH

Nejprve byl připraven N-sukcinimidesteB z N-methyl-Nterc.-butyloxykarbonyl-D-norfeeu-OH; získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně.

Roztok, připravený rozpuštěnímVvyše ve 250,0 ml acetonitrilu, byl smíchán se thylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu. HC1;

zmíněného derivátu,

14,50 gj 1-(3-dimea 8,70 gj N-hydroxy sukcinimidu.

Během 16,0 hodin proběhla při teplotě místnosti požadovaná reakce. Po této době bylo rozpouštědlo odpařeno,' a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu.Vzniklý roztok byl promyt s vodou,* a vysušen.

Bylo získáno 24,30 gj surového ONSu esteru.

Příští operace zahrnovala přípravu směsi ze 20,90 gj prolinu HCi; ve 300,0 ml dimethylformamidu a 300,0 ml vodyj a úpravu pH směsi, pomocí 2N vodného roztoku hydroxidu sodného, na pH 8,0. K uvedené směsi byl přidán po kapkách roztok 24,30g ONSu esteru ve 300,0 ml dimethylformamidu; přičemž bylo pH směsi •

- 60 udržováno na konstantní hodnotě. . , , organické

Poté, co byla reakce po 5,0 hodinách ukončena, byloYř»ozpouštědlo z velké části| za sníženého tlaku odpařením odstraněno; a ku směsi bylo přidáno 300,0 url vody; a pH bylo upraveno na pH 2,0. Produkt byl extrahován s ethylacetátem, a promyt s vodou,_; vysušen, zfiltrován, a zahuštěn.

Bylo získáno 22,20 g žlutě zbar^ného, surového produktu, který byl chromatografován na oxidu křemičitém, za použití ethylacetátu a methanolu; ( 8 : 2J objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 13,20 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = O,65J ( za použití silikagelu,· a směsi ethylacetát :) ( pyridin : kys.octová : vodaj ( 163 :: 20 6 ( 11J objemové poměry)J jako fcfeučního činidla?)

Příprava N-ffie . ,-D-norLeu-Pro-Lys-(2-thiazolylu )

Smíšené anyhydridoyé kuplování mezi sloučeninami N-methylNr-tera,-butyloxykarbony 1-H-norLeu-Pro-OH; a H-Lys-(benzyloxykarbonyl )-(2-thiazolyl). trif luoroctovou kyselinouj sejmutí chránící skupiny; a přečištění, byly provedeny dle analogických postupů, popsaných výše_zv rámci Příkladu 5.

Bylo získáno 107,0 mg, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R^( kapalinová chromatografie ):

23,22 min.J 20,0%J 0,505/1 pufr fosforečnanu sodného,* pH 2,10J 80,0%_r voda[až 20,0%J 0,50M pufr fosforečnanu sodnéhoj pH 2,1 OJ 20,0%; voda₍'a 60,0%J směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2Jobjemové poměry)J ve 40,0 minutách.

9

9 9 9 9 9 9 99 • 999 · · · ·♦ ·♦ « · · · 9 · 9 999 99

9 9 9 9 · 99

9 999 99 9 9 9 9 9

- 61 Příklad 12

Příprava N- -.-W -D-cyklohexylalenin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Všechny operace, vedoucí ku přípravě v nadpise zmíněného tripeptidu, byly provedeny analogický^ postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 11J a za použití N-terc.-butyloxykarbonylD-cyklohexylalanin-OH; jako výchozího materiálu.

Bylo získáno 253,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R^( kapalinová chromátografie ):

31,82 min.; 20,0%; 0,50M‘pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 80,0%, voda;až 20,0%; 0,50M, pufr fosforečnanu sodného, pH

2,1 OJ 20,0%, voda a 60,0%; směs acetonitril :: vodaj ( 3 : 2J objemové póměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 13

Příprava N-Jfcé _-D- Ph® -N-cyklopentyl-Gly-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava N- M'e, -N-terč.-butyloxykarbony 1-D- Phe -N-cyklopentyl-Gly-OMe

Ku směsi, připravené smícháním 26,0 gj N-Me-řL-terc.-butyloxykarbonyl-D-Phe-OH;(připraveného analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 11J), a 21,0 gj N-cyklopentyl-GlyOMeJ ( viz Příklad 3)J ve 300,0 ml dimethylformamidu, bylo přidáno 36,0 gj 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborátuj a pH vzniklé reakční směsi bylo upraveno pomocí 20,0 ml diisopropylethylaminuj na pH 8,0.

Poté, co byla reakční směs míchána po dobu 16,0 hodinj byla za vakua zahuštěna; e zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu; a vzniklý roztok byl promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného', a solankou.Poté byl roztok vysušen se síranem hořečnatým, a opět za vakua zahuštěn.

Bylo získáno 24,80 g žádané; v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,62; ( za použití silikagelu; a směsi dichlormethanu') ( a methanolu; (95 : 5J objemové poměry); jako ) ( elučního činidla.)

Příprava N-Me-N-terc.-butyloxykarbonyl-D-Phe-N-cyklopentylGly-OH = N-Me-BOC-D-Phe-N-cyklopěntyl-Gly-OH

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 17,30 g* N-Me-Nterc. -butyloxykarbonyl-D-Phe-N-cyklopentyl-Gly-OMe; ( získanému v předcházejícím, výše popsaném Stupni); ve 150,0 ml směsi tetrahydrofuranu a vody; ( 135 : 15J objemové poměry); bylo přidáno 4,0 gj hydroxidu sodného ( ve vodě).

Po 2,0 hodinách byl průběh reakce ve směsi zastaven tím, že pH reakční směsi bylo upraveno na pH 2, OJ a produkt byl extrahován s dichlormethanem. Poté, co byl extrakt promyt s vodou, byl vysušen se síranem hořečnatým; a následně byl za vakua zahuštěn.

Zbytek byl překrystali zován ze směsi dichlormethanu a diethyletheru ; a bylo získáno 13,10 g žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

Chromátografie na tenké vrstvě :

• · · ·

- 63 Rf = 0,52; ( za použití silikagelu; a směsi dichlormethanu') ( a methanolu; ( 9 : 1; objemové poměry); jako ) ( elučního činidla).

Příprava N-Me-D-Phe-N-cyklopentyl-Gly-Lys-(2-thiszolylu)

Všechny potřebné kroky byly provedeny analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 11.

Bylo získáno 110,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R_t( kapalinová chromatografie ):

33,43 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 80,0% voda; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,1 OJ 20,0% vodej a 60,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 14

Příprava N-Me-D-Phe-Pro-Lys-( 2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 1J byl připraven N-Me-N-terc.-butyloxykarbonyl-D-Phe-Pro-OH. Smíšené anhydridové kuplování ku H-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu); sejmutí chránící skupiny,* a přečištění; byly provedeny analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 5, výše.

Bylo získáno 148,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R^( kapalinová chromátografie ):

• · ·«

- 64 27,22 min.; 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného} pH 2,10}

80,0%, νοάθ,’θζ 20,0%} 0,50M, pufr fosforečnanu sodného} pH

2,10} 20,0%,’ voda} a 60,0%, směs acetonitril : voda} ( 3 ; 2} objemové poměry)} ve 40,0 minutách.

Příklad 15

Příprava 3,3-difenylpropiony1-Pro-Lys-(ethoxykarbonyl)-(2thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 1 výše, byl připraven 3,3-difenylpropiony1-Pro-Lys-(2-thiezolyl).

U roztoku, připraveného rozpuštěním výše zmíněného dipeptidu ( 20,0 mg)} ve 4,0 ml směsi dioxanu a vody} ( 4 : 1)} bylo pomocí 1N roztoku hydroxidu sodného upraveno pH n8 hodnotu 12. Poté,co bylo k tomuto roztoku přidáno 22,0 mg ethylchlorformiátu; byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin.

Poté byla reakční směs neředěna s vodou} a :následně byle extrahována : s dichlórme.tfiaftem. Sxskený extrakt byl promyt s vovysušen se síranem hořečnatým; za vakua zahuštěn} a nakonec byl vymražen ze směsi terč.-butanol : voda} (1:1} objemové poměry).

Sylo získáno 15,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie ne tenké vrstvě :

R_f = 0,92} ( za použití silikagelu} a směsi ethylacetát} ( pyridin} kys.octová} voda} ( 63 : 20 : 6 : 1 1} ( objemové poměry ).

φφ φφφφ φφφ • · • φ φφφ φ

Příklad 16

Příprava H00C'-CH₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-oxazolylu)

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-pai/CHOH/-(2-oxazolylu )

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,975 gj N-terc,butyloxykarbonyl-Lys-( benzyloxykarbonyl)-0Me; ve 25,0 ml dichlormethanu; a vychlazenému v atmosféře dusíku na teplotu minus 78,0°C, bylo přidáno 6,0 mlj 1M roztoku diiaobutylaluminiumhydridu v hexanu.

Po uplynutí 15,0 minut, kdy byla reakce dokončena, byla reakční směs nalita do 150,0 mi; 2%ního vodného roztoku kyseliny citronovéj ( kys. 2-hydroxypropan-1,2,3-trikarboxylová ); a reakční směs byla zfiltrována. Po oddělení byla organická vrstva oddělena; promyta s vodou a se solankou, a po vysušení se síranem hořečnatým byla zahuštěna.

Výsledný zbytek byl spoluodpařen s toluenem, a bylo získáno 0,92 gj N-terč.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-H.

Výše uvedený aldehyd (0,89 g)byl rozpuštěn v 1,40 ml toluenu;. a ku vzniklému roztoku bylo přidáno 0,90 gj 2-(trimethylsilyl)-oxazolu, ( připraveného analogickým postupem, popsaným v odborném časopise J,Med.Chenr.,38,76 (1995); autoři Edwards

P.D.; Wolamin D.J.; Andisik D.W, a Davis W.J.); a vzniklá reakční směs byla zahřáta na teplotu 80,0°C. P_o uplynutí 60,0 hodin byla reakční směs zahuštěna, a výsledný zbytek byl rozpuštěn v 5,0 ml tetrahydrofuranu, a poté smíchán se 3,0 mi; 3M roztoku tetrabutylamoniumfluoridu v tetrahydrofuranu, a tato směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin.

Poté byla reakční směs zahuštěna; a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu,. a vzniklý roztok byl promyt s 3%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a se solankou; a po vysušení • ·· ·

• · · · · · · ·· 9 9 9 99 · · · • · · · 9 · se síranem hořečnatým byla odpařena..

Zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu, za použití gradientově eluce se směsí ethylacetátu a dichlormethanu; (2:1» objemové poměry); až ethylacetátu; a byla získána látka olejoví té konzistence,, která byla pře chromá tograf ována na silikagelu, zs použití gradientově eluce se směsí ethylacetátu a heptanuj (1 : 1J objemové poměry); až směsí ethylacetátu a heptanu; ( 1 : 3J objemové poměry).

Bylo získáno 0,22 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie ne tenké vrstvě

- 0,70; ( za použití silikagelu; e ethylacetátu, jako) ( elučního činidla ).

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2oxazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,22 gj N-terc.-butyloxy karbony 1-Lys-(benzyloxykarbonyl )-psi-7CH0H'/-(2-oxazolylu); v 10,0 ml dichlormethanu, bylo přidáno 0,22 gj perjod^Bnu( DessMartinovo reagens). Poté, co byla Vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,5$ hodiny, bylo k ní přidáno 10,0 ml vodného; 5%ního roztoku thiosíranu sodného; a tato směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 15,0 minut.

Poté byla organická vrstva oddělena, promyta s vodou; s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného’, a se solankou, a po vysušení se síranem hořečnatým, byla zahuštěna.

Zbytek byl přečištěn chromatografii na silikagelu, ze použití směsi heptan : ethylacetát; ( 1 : 1; objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 162,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie ns tenké vrstvě :

·· ····

- 67 R_f = O,7O; ( za použití silikagelu, a ethylacetátu,jako ( elučního činidla ).

Příprava N-terč.-butyloxykarbonyl-Lys-(benzyloxykarbonyl)( 2-oxazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,22 gj N-terc.-butyloxykarbony1-Lys-(benzyloxykarbonyl )-psi-/CHOH/-( 2-oxazolylu) ; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně )J v 10,0 ml dichlormethanu, bylo přidáno 0,22 g perjodanu( DessMartinovo reagens), Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,50 hodiny, bylo k ní přidáno 10,0 ml vodného, 5%ního roztoku thiosíranu sodného, a tato směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 15,0 minut.

Po oddělení byla poté organická vrstva promyta s vodou, s vodným 5%ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného, a se solankou, a po následném vysušení se síranem hořečnatým, byla zahuštěna ·

Zbytek byl přečištěn chromatografií na silikagelu, za použití směsi heptan : ethylacetát; ( 1 : 1; objemové poměry),jako elučního činidla.

Bylo získáno 162,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,50;( za použití silikagelu, a směsi heptan : ethyl-') ( acetát; (1:3; objemové poměry), jako eluč- ) ( ního činidla).

- 68 ···· ·· ·· ♦ • ···e · • ♦ · · · •· · · ··· ··· *· ·· · ··· ·· ·· • · · · ·

•	• ·	··
•	• ···	•	•
•	•	•	•
•	··	··

Příprava (t-BuOOCCH^)- (N-terc. -butyloxykarbony 1)-D.-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(benzyloxykarbony1)-(2-oxazolylu )

Pro přípravu v nadpise uvedené sloučeniny byl použit analogický postup, popsaný výše v ráčeni Příkladu 5.

Sejmutí/Chránících skupin u O,16gJ N-terc.-buty1oxykarbony 1 -Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-oxazolylu); a kuplovaním s 0,19 g* (tBuOOCCHgXN-terc.-butyloxykarbonyl)-D-cyklohexylalaninPro-OHJ bylo získáno 0,19 gj v nadpise uvedené, žádané sloučeniny, t.j. (tBuOOCCHgXN-terc.-butyloxykarbonylí-D-cyklohexylalalanin-Pro-Ly3-(benzyloxykarbonyl)-(2-oxazolylu).

Chromatografie na tenké vrstvě :

= 0,30J( za použití silikagelu; a směsi heptan r. ethyl-') ( acetátj (1:3; objemové poměry); jako eluční-} ( ho činidla. )

Příprava HOOCCH₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-oxazolylu)

Pro přípravu v nadpise uvedené sloučeniny byl použit analogický postup, popsaný výše v rámci Příkladu 5J kdy z 0,19 gj (tBuOOCCH^)(N-terc.-butyloxykarbonyl)-D-cyklohexylalanin-ProLys-(benzyloxykarbonyl)J bylo připraveno 52,0 mg žádané^v nadpise uvedené sloučeniny..

R ( kapalinová chromatografie ):

28,46 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 80,0%, vody; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1(i; 20,0%; vodaj a 60,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

- 69 Příklad 17

Příprava ethylSO^norLeu- (cyklo )-Gly-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu

Ku roztoku, připraveném rozpuštěním 10,0 gj L-alfa-aminoepsilon-kaprolaktamu; ve 30,0 ml směsi dioxanu a vody} (2 : 1J objemové poměry); bylo přidáno nejprbve 7,80 mi; 1N vodného roztoku hydroxidu sodného; a poté ještě 18,80 gj di-t-butylkarbonátu( za stálého míchání ).

Vzniklá reakční směs byla poté míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin, a poté byla za vakua zahuštěna.Výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu', a vzniklý roztok byl promyt s vodou a se solankou; vysušen se síranem sodným; zfiltrován, a poté byl za vakua odpařen.

Zbylý surový materiál byl mechanicky zpracována vyjmut s hexanem; zfiltrovánj θ za vakua byl vysušen.

Bylo získáno 16,0 g žádaného, v nadpise uvedeného N-terc.butyloxykarbonyl-L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rg - 0,85; ( za použití oxidu křemičitého;, a směsi ethylace-) ( tátu a heptanuj ( 1 1J objemové poměry); ja- ) ( ko elučního činidla. )

Příprava Neteře.-butyloxykarbonyl-norLeu-(cyklo)-Gly-0Me • 444 • 4 · ·

44

4 4· · · 4·

4 4«44

4 <4 . · ·· *

- 70 Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 10,0 g} N-terc.-butyloxykarbonyl-L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu;( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)} ve 100,0 ml dichlormethanu} a vychlazenému na teplotu minus 20,0°C, byl pomalu přidán 1M roztok bis-(trimethylsilyl)-amidu^ve směsi tetrahydrof uranu a cyklohexanu} (1:1} objemové poměry)}( 1 ekvivalent)} a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 30,0 minut. Poté byl ku směsi přidán methylbromacetát}( 4,0 ml)} a reakční směs byla míchána při teplotě místnosti 2,0 hodiny.

Poté byl ku reakční směsi přidán další roztok bis-(trimethylsilylí-amidu^ve směsi tetrahydrofuranu a cyklohexanu} (1:1} objemové poměry), s cílem reakci dokončit.Po skončení této operace byla reakční smě»/ naředěna s dichlormethanem, a promyta postupně s 0,1N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové} s vodou} s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, a se solankou} a po vysušení se síranem sodným; a zfiltrování, byla za vakua odpařena.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém,, za použití směsi heptan : ethylacetát} (6:4} objemové poměry)} jako elučního činidla.

Bylo získáno 12,0 g} žádaného, v nadpise uvedeného N-terc.butyloxykarbony1-norLeu-(cyklo)-Gly-0Me·

Chromátografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,55} ( za použití oxidu křemičitého a směsi ethyláce-) ( tátu a heptanu} (6:4} objemové poměry), ja-) ( ko elučního činidle).

Příprava ethylS0₂-norLeu-(cyklo)-Gly-0Me

- 71 Sloučenina, připravená v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně; t.j. N-terc.-buty loxykarbonyl-norLeu-( cyklo )Gly-OMe; ( 3,0 g); byla rozpuštěna ve směsi 50%ní kyseliny trifluoroctové, a dichlormethanu,' a po míchání po dobu 1,0 hodiny při teplotě místnosti byla vzniklá reakční směs za vakua odpařena

Surový amin byl rozpuštěn ve 30,0 ml dichlormethanu; a ku vzniklému roztoku byl přidánr pomalu, a při teplotě 0°C,roztok, připravený rozpuštěním 1,29 gj ethansulfonylchloridu, v 10,0 ml dichlormethanu, přičemž pro udržení pH na hodnotě 8,0; během reakce, byl přidán ku směsi triethylamin.Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny, byla za vakua zahuštěna, a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu.

Vzniklý roztok byl promyt postupně s 5%ním vodným roztokem Hydrogenuhličitanu sodného; s vodou, a se solankou; a po vysušení se síranem sodným, a zfiltrování, byl za vakua odpařen.Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografii na oxidu křemičitém, za použití směsi dichlormethan : ethylacetát; ( 95 : 5; objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 1,45 gj žádaného ethylSO^-nodLeu-C cyklo)-GlyOMe.

Chromatografie na tenké vrstvě :

= 0,30; ( za použití oxidu křemičitého, a směsi dichlor- ) ( methan : ethylacetát;(9 : 1J objemové poměry);) ( jako elučního činidla ).

Příprava e thylSOg-norLeu-(cyklo)-Gly-0H

Roztok, připravený rozpuštěním 1,45 gj ethylSO^-norLeu-r ( cyklo)-Gly-OMé; ( získaného v rámci předcházejícího, výše po psaného Stupně); v 50,0 ml směsi dioxan : voda; ( 9 : 1J

- 72 objemové poměry); byl reagován při teplotě místnosti, po dobu

2,0 hodin, s dostatečným množstvím vodného 1N roztoku hydroxidu sodného tak, aby pH bylo udržováno na hodnotách 13. Po okyselení byla reakční směs nalita do vody, a extrahována s dichlorme thanem.

Po oddělení byla organická vrstva promyta s vodou, a vysušena se síranem sodným. Filtrát byl odpařen.

Bylo získáno 600,0 mg žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie na tenké vrstvě :

0,45; ( za použití oxidu křemičitého a ( acetát : pyridin : kys,octová ( 20 :: 6 : 11J objemové poměry); ( činidla).

směsi ethyl- ) voda; ( 63 :) jako elučního^)

Příprava ethylSO^-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(benzyloxykarbonyl)(2-thiazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 482,0 mg;ethylS0₂norLeu-(cyklo)-Gly-OH; ( získaného v rámci předcházejíčího,výše popsaného Stupně); v 5,0 ml dimethylformamidu, bylo přidáno 0,36 ml ethyldiisopropylaminuj a vzniklá reakční směs byla v atmosféře dusíku vychlazena na teplotu minus 20,0°C. Poté byl ku směsi přidán isobutylchlorformiátj( 140,0 ml); a reakční směs byla při teplotě minus 20,0°C míchána po dobu 15,0 minut.

Poté byl ku vychlazenému směsnému roztoku anhydridu přidán po kapkách roztok, připravený rozpuštěním H-Lys-(benzyloxyksrbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny, ve 3,0 ml vysušeného diemthylaformamidu, přičemž pH reakční směsi bylo pomocí ethyldiisopropylaminu udržováno na hodnotě pH 8,50,Poté byla reakční směs míchána při teplotě minus 20,0°C. po dobu • 444 · · · · ··· • 4 4· 44 · 4444 4 • 4 4··444 • •4444 4· « *’ *·

- 73 15,0 minut J a poté byla odpařena do sucha. Výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a získaný roztok byl postupně promyt a 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou; a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl za vakua zahuštěn.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromátografií na oxidu křemičitém; za použití směsi dichlormethan : methanol; ( 95 5; objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 607,0 mg, žádaného ethylSO^-norLeu-C cyklo)Gly-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu).

Chromatografie na tenké vrstvě :

= 0,63; ( za použití oxidu křemičitého; a směsi ethyl- ) ( acetát : pyridin : kys.octová : voda; ( 60 : ) ( 3 : 1 :: 2J objemové poměry), jako elučního či-) ( nidla.)

Příprava ethylS0₂-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(2-thiazolylu)

V předcházejícím, výše popsaném Stupni připravený ethylSO^norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl); 600 mg ); byl reagován ve IQýOml směsi kys.trifluoroctové a thioanisoluj ( 10 : 1J objemové poměry); při teplotě místnosti, po dobu 4,0 hodin.

Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna; a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě.Poté, co byla vodná fáze intenzivně promyta s diethyletherem, byla vodná vrstva za vakua zahuštěna, a poté spoluodpařena se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, a následně byla lyofilizována z vody.

Surový produkt byl nanesen na sloupec preparativní/vysokovýkonné kapalinové chromatografie, ( syštem Deltapack C18 RP), za použití gradientového systému 2O,O%;O,5OM pufr fosforečnanu <· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · ·» · · • · ·· · · · ·· · * • ··· · · · ··· · · • 0 · 0 ···· ··· β·α ·· ·00 ··

- 74 sodného, pH 2,1 OJ 80,0%, voda; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,1 OJ 40,0%, voda*a 40,0%, směs acetonitril r vodaj ( 3 : 2J. objemové poměry); během 40,0 minut, při rychlosti .průtoku 50,0 ml/min.

Bylo získáno 233,0 mg/žádaného ethylSO^-norLeu-(cyklo)-GlyLys-(2-thiazolylu).

R^( kapalinová chromátografie )::

26,73 min.J 20,0%^ý^ů^r fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 80,0.%/ vodaj až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 20,0%, vodaj. a 60,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 ’· 2J objemové poměry);. ve 40,0 minutách..

Příklad 18

Příprava benzylSO^-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(2-thiazolylu)

V nadpise uvedená sloučenina byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 17.

R^.( kapalinová chromátografie ):

37,05 min.J 20,0%J 0,50M pufr fosforeč%nanu sodného, pH 2,1 OJ 80,0%|VodaJ až 20,0%J 0,50M pufr fosforečnanu sodnéhoJpH 2,10J 20,0%, voda;a 60,0%, směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad. 19 ·· ···· • · « ·· · · · ·· • ··· · · · 9 999

99999 9 999 99

9 9 9 9 9 99

999999 99 9 9 9 ·»

- 75 Příprava 7-methoxy-2-naftylsulfonyl-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys( 2-thiazolylu)

V nadpise uvedená sloučenina byla připravena analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 17/výše.

R ( kapalinová chromátografie):

26,40 min.; 20,0%J 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 60,0% vodaj 20,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry),, až 100,0%; směs acetonitril : vodaj( 3 :: 2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 20;

Příprava (4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1(R)-karbonyl-Pro-Lys( 2-thiazolylu)

Příprava 2-benzyloxykarbonyl-(4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1(R,S)-karboxylové kyseliny

V nadpise uvedená 2-benzyloxykarbonyl-(4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1-(R,S)-karboxylová kyselina, byla synthetizována analogický^ postupem, popsaným v Evropském patentu ( EP)0643073;(Příklad 1).

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,85; ( za použití, oxidu křemičitého; a směsi ethyl-⁵) ( acetát : pyridin : kys.octová : vodaj ( 63 :) ( 20 :: 6 : 11J objemové poměry), jako elučního} ( činidla).

• · · · · ·· · · · ··· • · · ♦ · * · • e ·· ·· ·· β * · · · · ··· • · · · · ······ ·· · ··

- 76 Příprava 2-benzyloxykarbonyl-(4sR,8aR)-perhydroisochinolin-1 ( R,S)-karbony1-Pro-O-tBu

Ku vychlazenému roztoku( 0°C); připravenému rozpuštěním 2-benzyloxykarbonyl-(4aR,88R)-perhydroisochinolin-1 (R,S)-kar·boxylové kyseliny; ( 500,0 mg); v 5,0 ml dimethyIformamidu,.bylo postupně přidáno 342,0 mg; 1,3-dicyklohexylkarbodiimidu; 319,0 mg 1-hydroxybenzotriazolhydrátu; 270,0 mgJH-Pro-OtBu; a 0,55 ml triethylaminu.

Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě 0°C po dobu 1,0 hodiny, byla ponechána při teplotě místnosti přes noc v klidu.Poté byla reakční směs ochlazena na teplotu minus 20,0°CJa filtrací byla odstraněna 1,3-dicyklohexylmočovine. Filtrát byl za vakua zahuštěn^ a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu. Vzniklý roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s 3%ním vodným roztokem kyseliny citrónové; s vodouy a se solankou, a po vysušení se síranem sodným byl za vakua zahuštěn..

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém, za použití směsi heptanu a ethylacetátu; ( 4 : 1J objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 634,0 mg žádaného 2-benzyloxykarbony1-(4aR, 8aR)-perhydroisochinolin-1(R,S)-karbony1-Pro-O-tBu.

Chromátografie na tenké vrstvě :

R^, = 0,90; ( za použití oxidu křemičitého', a směsi ethyl( acetát : pyridin : kys.octová : voda; ( 63 : ( 20 : 6 11; objemové poměry ),' jako elučního ( činidla.

Příprava 2-benzyloxykarbonyl-(4eR,8aR)-perhydroisochinolin-1 ( R,S)-karbonyl-Pro-OK » · • · • · · · · · · · ····«· · · <· ♦ · · *

- 77 Směs,, připravená smícháním 600,0 mg; 2-benzyloxykarbonyl(4aR,.8aR)-perhydroisochinolin-1 (R,S)-karbonyl-Pro-0-t-butyle steru; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve směsi 1,0 ml dichlormethanuj 3,0 ml kyseliny trifluoroctové; 0,15 ml anisolu, byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny..

Poté byla reakční směs za nízké teploty/ a za vakua zahuštěna,, a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě při pH 9,50.Poté, co byla vodná fáze promyta s diethylethrem, byla okyselena pomocí 2M roztoku kyseliny chlorovodíkové ne pH 2,50?. Poté byla vodná vrstva extrahována s ethylacetátem, a organická fáze byla promyta se solankou, vysušena se síranem sodným, a následně byla zahuštěna.

Bylo získáno 588,0 mg žádaného 2-benzyloxykarbonyl-(4aR,8aR)perhydroisochinolin-1 (R,S)-karbonyl-Pro-OHv

Chromátografie na tenké vrstvě ;·

R_f = 0,54; ( za použití oxidu křemičitého; a směsi ethylacetát : pyridin : kys.octová : voda; (60 : 3 : (1 2; objemové poměry;) jako elučního činidla.

Příprava 2-benzyloxykarbonyl-(4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1( R,S)-karbonyl-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 500,0 mg; 2-benzyloxykarbonyl-(4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1(R,S)-karbonyl-ProOH; ( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 5,0 ml vysušeného dimethylformamidu, bylo přidáno 0,41 mi; ethyldiisopropylaminu; a vzniklá reakční směs byla v atmosféře dusíku vychlazena na teplotu minus 20,0°C.Poté, co bylo ku směsi přidáno 156,0 ml isobutylchlorformiátu, byl8 reakční směs míchána při teplotě minus ΖΟ,ΟθΟ, po dobu 15,0 minut»

- 78 Poté byl ku směsnému vychlazenému roztoku anhydridu přidán po kapkách roztok, připravený rozpuštěním 594,0 mg;. H-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny,ve 3,0 ml vysušeného di thylaformamidu, přičemž pH reakční směsi bylo pomocí ethyldiisopropylsminu udržován© na hodnotě pH 8,50. Poté byla reakční směs míchána při teplotě minus 20,0°C po dobu 15,0 minut, a následně byla vysušena do sucha.

Výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu,’ a vzniklý roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou, a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl za vakua zahuštěn.Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém, za použití směsi dichlormethanu a methanolu; ( 95 : 5J objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 880,0 mg; žádaného 2-benzyloxykarbonyl-(4aR, 8aR)-perhydroisochinolin-1(R,S)-karbonyl-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu ).

Ohromatografie na tenké vrstvě :

R_f = 0,42J( za použití oxidu křemičitého; a směsi ethyl-3 ( acetátu a heptanu; (3 : 1; objemové poměry);} ( jako elučního činidla).

Příprava (4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1(R)-karbony1-Pro-Lys( 2-thiazolylu)

V 10,0 ml směsi kyseliny trifróroctové a thioanisoluj ( 10 : 1; objemové poměry); bylo reagováno po dobu 4,0 hodin; a při teplotě místnosti; 875,0 mg J(4aR,8aR)-perhydroisochinolin -1(R,S)- karbonyl-Pro-Lys-(2-thiazolylu).Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna; a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě.

Poté, co byla vodná fáze promyta intentivně s diethyl• ·« · · · · ·· • · 9 9 99 9 * · « · · · ··· · ♦ • · · · · · · ·· «9999

- 79 etherem, byla za vakue zahuštěna; a spoluodpařena se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou; a poté byla lyofilizována z vody.

Surový produkt byl nanesen na sloupec preparativní/vysokovýkonné kapalinové chromátografie^( sytém Deltapack C18 RP); za použití gradientově eluce systémem 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,J0; 80,0% voda,, až 20,0%; 0,50·<; pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 53,0%; voda; a 27,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); během 40,0 minut, při rychlosti průtoku 50,0ml/min.

Bylo získáno 211,0 mg žádaného; (4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1(R)-ksrbonyl-Pro-Lys-(2-thiazolylu).

R^( kapalinová chromátoferafie):

28,0 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0%, vodajaž 20,0%; 0,50M'pufr fosforeč%nanu sodného, pH

2,1 OJ 20,0%, voda| a 60,0%^ směs acetonitril vodaj (3:2; objemové poměry); jako elučního čimidla; ve 40,0 minutách.

Příklad 21

Příprava ethylS0₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava N-terc.-butyloxyk8rbonyl-D-cyklohexylalanin-Pro-0benzylu = BOC-D-Che-Pro-OBzl

V nadpise uvedený, žádaný N-terc.-butyloxyksrbonyl-Dcyklohexylalanin-Pro-Obenzyljbyl připraven analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 1J za použití N-terč.-butyloxykarbonyl-D-cyklohexylslaninuj a Pro-Obenzylu.

• ·· ·

- 80 Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,50;( za použití oxidu křemičitého,* a směsi dichlor-) ( methanu a methanoluj( 95 : 5J objemové poměry);

( jako elučního činidla.)

Příprava ethylS0₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Obenzylu

Roztok,připravený rozpuštěním 3,80 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-D-cyklohexylalanin-Pro-OBzi;· ( získaného v rámci předcházejícího,. výše popsaného Stupně); ve 25,0 ml směsi 50%ní kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu, byl míchán při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut.Poté byla reakční směs za vakua odpařena.

Surový amin byl rozpuštěn v 50,0 ml dichlormethanu; a ku vzniklému roztoku bylo přidáno při teplotě minus 78,0°C J 0,80 ml ethansulfonylchloridu, přičemž přídavkem triethylaminu bylo pH reakční směsi udržováno na pH 8,0. Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě 0°C po dobu 3,0 hodin, bylo k ní přidáno 25,0 ml vody, a směs byla dále míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut.Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna,’ a výsledný zbytek byl rozpuštěn v diethyletheru,. a vzniklý roztok byl postupně promyt.s 1N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové’, s vodou,’ s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a se solankou, a po vysušení se síranem sodným a zfiltrování, byl za vakua odpařen.

Surový materiál byl mechanicky zpracovány vyjmut s methanolem, a byly získány 3,0 g žádaného ethylS0₂-D-cyklohexylalanin-Pro-OBzl.

Chromatografie na tenké vrstvě :

• · · ·

- 81 R^ = 0,60}( za použití oxidu křemičitého} a směsi dichlor-) ( methanu a methanolu} ( 95 : 5} objemové poměry)} ( jako elučního činidla).

Příprava ethylSOg-D-cyklohexylalanin-Pro-OH

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 10,0 g} ethylS02~Dcyklohexylalanin-Pro-OBzl} ( získaného v rámci předcházejícíno, výše popraného Stupně)} ve 250,0 ml tetrahydrofuranu, bylo přidáno 84,0 ml} 1M roztoku tetrebutylamoniumfluoridu, v tetra-r hydrofuranu.

Vzniklá reakční směs byla poté míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut} a poté byla nalita do 1,0 litru vody. Vodný roztok byl poté extrahován s ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly poté postupně promyty s 1N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkobé; a s vodou, a po vysušení se síranem sodným, bylg za vakua zahuštěny.

Výsledný zbytek byl přečištěn krystalizací ze směsi ethylacetátu a diisopropyletheru.

Bylo získáno 6,0 g žádaného ethylSOj-D-cyklohexylalaninPro-OH.

Chromátografie na tenké vrstvě ::

R_f - 0,20}( za použití oxidu křemičitého, 8 směsi ethyl-') ( acetát : pyridin : kys.octová : voda} (163 :) ( 20 : 6 : 11 j objemové poměry)} jako elučního) ( činidla.)

Příprava ethylS02~D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl )-(2-thiazolylu) • ·· ·

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 397,0 mgj ethylSOgD-cyklohexylalanin-Pro-OH;( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)J ve 3,0 ml vysušeného dimethylformamidu, bylo přidáno 0,19 mi; ethyldiisopropylaminuj a vzniklá reakční směs byla v atmosféře dusíku ochlazena na teplotu minus 20,0°C. Poté, co bylo ku reakční směsi přidáno 130,0 ml; isobutylchlorformiátu, byla směs míchána při teplotě minus 20,0°C po dobu 15,0 minut.

Poté byl ku směsnému, vychlazenému roztoku anhydridu,přidán po kapkách roztok, připravený rozpuštěním H-Lys-(benzyloxykarhonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny/ve 3,0 ml vysušeného dimethylformamidu, přičemž pH reakční směsi bylo pomocí ethyldiisopropylaminu udržováno na hodnotě pH 8,50.Poté byla reakční směs míchána při teplotě minus 20,0°C po dobu 15,0 minut; a poté ještě 1,0 hodinu při teplotě místnosti.

Po odpaření reakční směsi k suchu, byl výsledný zbytek rozpuštěn v ethylacetátu, a vzniklý roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhli či tanu, .sodného; s vodou, a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl za vakua zahuštěn.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií ns oxidu křemičitém, za použití směsi ethylacetát : heptanj ( 2 : 1; objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 575,0 mg žádaného ethylSO^-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu).

Chromatografie na tenké vrstvě

Rf = O,32J( za použití oxidu křemičitého, a směsi ethyl-) ( acetát : heptanj( 2:1; objemoté poměry); ) ( jako elučního činidla.) ·· ·♦·· ·· · ♦ · ····· • ··· · · * 9 9·· • 9 · · · · · ··· · · • · · · · ··· ······ ·· · ·· ··

- 83 Příprava ethylS0₂-B-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

V rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně získaný ethylSOg-D-cyklohexylalalnin-Pro-Lys-C benzyloxykarbonyl-( 2thiazolyl); ( 570,0 mg); byl reagován při teplotě místnosti^ a po dobu 4,0 hodin;, ve směsi 44,0 ml kys.trifluoroctové a thioanisolu( 10 : 1J objemové poměry).

Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna, a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě,. Vodná fáze byla poté rozsáhle promyta s diethyletherem. Vodná vrstva byla poté za vakua zahuštěna, spoluodpařena se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, a nakonec byla lyofilizována z vody.

Surový produkt byl nanesen na sloupec preparativníy vysokovýkonné kapalinové chromátografie ( sytém Deltapack C18 RP); za použití gradientového elučního systému 20,0%;. 0,50M pufr fosforečňau sodného, pH 2,1 OJ 80,0% vody; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 30,0% voda; a 50,0%, směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách; a při rychlosti průtoku 80,0ml/min.

Bylo získáno 275,0 mg žádaného, ethylS0₂-D-cyklohexylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu).

R^( kapalinová chromátografie ):

26,06 min.;, 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,1 OJ 60,0%, voda; až 100,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 22

Příprava ethylS0₂-D-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu) • ·

- 84 Příprava N-terc,-butyloxykarbonyl-D-Phe-Pro-OBzl

V nadpise uvedená sloučenina byla připravena analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 1;. za použití N-terc.-butyloxykarbonyl-D-PheJ a Pro-OBzl,

Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,90; ( za použití oxidu křemičitého’, a směsi ethyl-⁵) ( ecetát : pyridin : kys.octová : voda; ( 60 : ) (3:1:2; objemové poměry); jako elučního ) ( Činidla.) příprava ethylSOg-D-Phe-Pro-OH

V nadpise uvedená sloučenina byla připravena analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 21; za použití N-terc.butyloxykarbony1-D-Phe-Pro-OBzl.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = θ,48; ( za použití oxidu křemičitého, a směsi ethyl- ) ( acetát : pyridin : kys.octová : voda; ( 163 :) ( 20 : 6 : 11J objemové poměry); jako elučního ) ( činidla.)

Příprava ethylSO^-D -?he -Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiaz 0lylu ).

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 21J za použití ethylSO^-D-Phe-Pro-OH; a Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2thiazolylu).

Chromátografie na tenké vrstvě ::

Rf, = 0,32; ( za použití oxidu křemičitého, a směsi ethyl-) ( acetát : heptanj ( 6 : 2* objemové poměry); ) ( jako elučního činidla.)

Příprava ethylS02-D-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

V rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně, získaný ethylSC^-D-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)- ( 2-thiazolyl) J (336,0 mg); byl reagován při teplotě místnosti,’ a po dobu 4,0 hodin; se 44,0 ml₍směsi kyseliny trifluoroctové a thioanisoluj ( 10 : 1; objemové poměry).

Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna; a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě. Vodná fáze byla poté rozsáhle promyta s diethyletherem.Vodná vrstva byla poté za vakua zahuštěna; a spoluodpařena se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, a nakonec byla lyofilizována z vody.

Surový produkt byl nanesen na sloupec preparativní,vysokovýkonné kapalinové chromátografie,‘( systém Deltapack C18 RP); za použití gradientového elučního systému 2O,O%JO,5OM pufř fosforečnanu sodného, pH 2,10J 65,0%, vodaj 15,0%, směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečňau sodného; pH 2,1 OJ 20,0%, vodaj a 60,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); během 40,0 minut; a při průtokové rychlosti 50,0 ml/min.

Bylo získáno 160,0 mg žádaného ethylS02-D-Phe-Pro-Lys( 2-thiazoylu).

*· 999·

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9999 9

9 9 9 • ·· ··

- 86 • « · ·

R^( kapalinová chromatografie ):

39,47 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 80,0%, voda;, až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2„10; 20,0%, voda*,, a 60,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 2;

objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 23

Příprava D-Hpl-Pro-Lys-(2-thiazolylu) ( Hpl - kyselina 3-hexahydrofenylmléčná*, nebo kyselina 3-hexahydrofenyl-2-hydroxypropanová )

Příprava H-H-Hpl-OMe

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 1,0 gj H-D-cyklohexylalalnin-OHJ ve směsi 4,80 mlj 1N kyseliny chlorovodíkové; 19,40 ml vody; a 9,70 ml kyseliny octové; byl přidán pomalu^při teplotě 0°C|roztok^ připravený rozpuštěním 3,40 g; dusitanu sodného v 5,80 ml vody; a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti přes noc. Poté bylo ku reakční směsi přidáno 4,80 mlj. 37%ní kyseliny chlorovodíkové; a směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 15,0 minut.

Poté byla reakční směs odpařenaJ a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve směsi etheru a acetonu. Po zfiltrování, byl roztok za vakua zahuštěn, a surový materiál byl míchán ve 25,0 ml methanolu po dobu 18,0 hodin, přičemž pH reakční směsi bylo 1,50. Poté byla reakční směs odpařena k suchu, a výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém za použití směsi toluenu a methsnolu; ( 97 : 3J objemové poměry); jako elučního činidla.

- 87 Bylo získáno 612,0 mgj žádaného H-D-Hpl-OMfe,

•	····	0· 0000	··	0 ·
··	•	• · ·	• ·	0 0
•	• 00	• · r	0 ·	• 0
•	•	• · · ·	0 000	0 ·
•	•	• · ·	0	• 0
• 00	···	·· ·	0·	0·

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,90J( za použití oxidu křemičitého,* a směsi ethyl-) ( acetát : pyridin : kys.octová : vodaj( 163 : ) ( 20 :: 6 r 11 Jobjemové poměry)j jako elučního ) ( činidla.

Příprava tetrahydropyran-D-Hpl-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 450,0 mgj H-D-HplOMeJ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)J ve 2,0 ml dichlormethanu, bylo postupně přidáno 0,285 mlj 3,4dihydro-2H-pyranuJ a 60,0 mgj pyridinium p-toluensulfonátu( za stálého míchání).

Vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 6,0 hodinj a poté byla zředěna s etherem. Poté byla směs promyta se solankou, vysušena se síranem sodným, zfiltrována a nakonec byla za vakua odpařena.Výsledný surový materiál byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém,* za použití směsi ethylacetát heptanj ( 1 : 4J objemové poměry)j jako elučního činidla.

Bylo získáno 498,0 mg, žádaného tetrahydropyran-D-Hpl-OMe.

Chromátografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,64J ( za použití oxidu křemičitého; a směsi ethyl-') ( acetát : heptanj ( 1 : 2J objemové poměry), ) ( jako elučního činidla.)

Příprava tetrahydropyran-D.-Hpl-OH

Roztok, připravený rozpuštěním (i 0,30 g)J tetrahydropyranΠ-Hpl-OMeJ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 200,0 ml směsi dioxan :: vodaj ( 9 : 1)J byl reagován při teplotě místnosti po dobu 18,0 hodin,* s dostatečným množstvím IN toztoku hydroxidu sodného tak_r aby pH směsi se udržovalo na hodnotě 12,0.

Po následném okyselení, byla reakční směs nalita do 500,0 ml vody, a poté byla extrahována s dichlormethanem.Oddělená organická vrstva byla poté promyta s vodou; a vysušena se síranem sodnýur, a filtrát byl odpařen.

Bylo získáno 6,60 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromá tografie na tenké vrstvě ::

Rf- - 0,78; ( za použití oxidu křemičitého; a směsi ethyl( acetát : pyridin : kys.octová : vodaj ( 163 :) ( 20 :: 6 : 1 1J objemové poměry); jako elučního ) ( činidla.)

Příprava te trahydropyran-D-Hpl-Pro-OH

Ku roztoku 5,87 gj tetrahydropyran-D-Hpl-OH; ( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 75,0 ml acetonitrilu, bylo postupně přidáno 4,84 gj (1-(3-dimethylaminopropyl)-3:-ethylkarbodiimidu.hydrochloridu;) a 2,90 g* N-hydroxysukcinimiduj a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin.

Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna £ a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu.Vzniklý roztok byl promyt s vodou a se solankou; vysušen se síranem sodným,' a za vakua byl

- 89 zahuštěni» Výsledný surový materiál byl rozpuštěn ve 100,0 ml dimethylf ormamidu,. a přidán ku směsi, připravené rozpuštěním 6,99 gí prolinu.HC1, ve 200,0 ml směsi dimethylformamidu a vodyj ( 1 : 1; objemové poměry); u které bylo upraveno pomocí hydroxidu sodného pH na hodnotu 8,50.

Poté, co byla tato reakční směs míchána přes noc, byla za vakua zahuštěna; a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě.U vzniklého vodného roztoku bylo při teplotě 0°C. upraveno pH na hodnotu 2,5O; a roztok byl extrahován s ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly postupně promyty s vodou_za se solankou; vysušeny se síranem sodným; a poté byly za vakua zahuštěny.

Výsledný surový materiál byl přečištěn chromatografii na oxidu křemičitém; za použití směsi ethylacetát : methanol; ( 8 : 2jaž 6 :: 4; objemové poměry), jako Ručního činidla.

Bylo získáno 6,75 g žádaného tetr8hydropyran-D-Hpl-Pro-OH.

Chromátografie na tenké vrstvě ::

Rf. = 0_r5^j. ( za použití oxidu křemičitého; a směsi ethyl-Ί ( acetát : pyridin : kys,octová :: voda; 163 : ) ( 20 :: 6 : 11J objemové poměry); jako elučního) ( činidla.)

Příprava tetrahydropyran-D-Hpl-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)( 2-thiazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 390,0 mg; tetrahydropyran-B-Hpl-Pro-OH; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 5,0 ml dimethylformamidu, bylo přidáno 0,19 mi; e thy Id i i.s o pr opy laminuj a vzniklá reakční směs byla^v atmosféře dusíku vychlazena na teplotu minus 20,0°C.Poté bylo ku reakční směsi přidáno 130,0 ml isobutylchlorformiátu; a směs byla míchána při teplotě minus 20,0°C*po dobu 15 minut» ··· ·· · · · ·· * · · φ φ · φ ΦΦ· · • ' · · · · · ··· «·Φ φφ * ·· ··

- 90 Poté byl ku směsnému, vychlazenému roztoku anhydridu, přidán po kapkách roztok, připravený rozpuštěním 1,05 ekvivalentu, H-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoro£tové kyseliny v 5,0 ml vysušeného dimethylformamidu, přičemž pH reakční směsi bylo pomocí ethyldiisopropylaminu udržováno na hodnotě 8,50.Poté byla reakční směs míchána při teplotě minus 20,0°C po dobu 15,0 minut; a poté ještě 2,50 hodiny při teplotě místnosti.

Po odpaření reakční směsi k suchu, byl výsledný zbytek rozpuštěn v ethylacetátu; a vzniklý roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou; a se solankou,, a po vysušení se síranem sodným, byl za vaku8 zahuštěn.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém, za použití směsi ethylacetát : heptanj( 2:1; objemové poměry), jako elučního činidla.

Bylo získáno 497,0 mgj žádaného tetrahydropyran-D-Hpl-ProLys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu).

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf. = 0,42J ( za použití oxidu křemičitého,. 8 směsi ethylace-) ( tátu a heptanu; (2 : 1J objemové poměry), jako ) ( elučního činidla ).

Příprava L-Hpl-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

V rámci předcházejícího, výše popsaného stupně^získaný tetrahydropyran-U-Hpl-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)J ( 470,0 mg); byl reagován při teplotě místnosti,· a $o dobu

4,0 hodin’, se 38,50 ml směsi kyseliny trifluoroctové a thioanisoluj ( 10 : 1; objemové poměry).

Vzniklá reakční směs byla poté za vakua zahuštěna; a vý• · · ·

- 91 sledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě. Vodná fáze byla poté rozsáhle promyta s diethyletherem; a vodná fáze byla za vakua zahuštěna;.. a spoluodpařena se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, a nakonec byla lyofilizována z vody.

Výsledný surový produkt byl nanesen na sloupec preparativníy-vysokovýkonné kapalinové chromátografie/( systém Beltapack 018 HP); za použití gradientově eluce se systémem 20,0%; 0,50® pufr fosforečnanu sodného; pH2,10J 65,0%, vodaj 15,0%; směs acetonitril.: vodaj ( 3 : 2J objemové poměry); během 40,0 minut J. a při průtokové rychlosti 50,0 ml/min.

Bylo získáno 75,0 mg žádaného D-Hpl-Pro-Lys-(2-thiazolylu).

R_t( kapalinová chromátografie ): pH 2 10*

40,0 min.; 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodnéh<T|\Í3Ó7c)%, vodaj až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 20,0%, voda; a 60,0%; směs acetonitril : vodaj. (3:2} objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 24

Příprava HOQC-CH₂-D-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava H-D-Phe-OMe. HC1

Ku 1,0 litru vysušeného methanolu; vychlazenému na teplotu minus 20,0°C, bylo přidáno po kapkách 130,0 ml? thionyiohloriduj a ku vzniklé směsi bylo přidáno 147,60 mgj H-D-Phe-OH.HC1, a tato směs byla nejprve zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem po dobu 30,0 minut; a poté byla ponechána v klidu při teplotě místnosti přes noc.

• 4

44«·

- 92 Poté byla reakční směs za vakua zahuštěna; a následně byla spoluodpařena 3x a methanolem. Výsledný zbytek byl překrystalizován ze směsi methanolu a diethyletheru.

Bylo získáno 187,40 g žádaného, H-D-Phe-OHb.HCl, ve formě bíle zbarvené krystalické látky,, práškovítého charakteru.

Chromátografie na tenké vrstvě :

B_f = 0,54} ( za použití silikagelu; a směsi n-Butanolu ::

( kys.octové a vody} (10 : 1 : 3; objemové poměry) ( jako elučního činidla).

Příprava N-(t-butvloxykarbonylmethy1)-D-Phe-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním H-D.-Phe-OMe .HCl (65,20 mg)} ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 400,0 ml acetonitrilu, bylo přidáno za stálého míchání 65,0 mi; t-butylbromacetátu; a pH této reakční směsi bylo upraveno pomocí Ν,Ν-diisopropylethylaminu, na hodnotu 8,50.

Poté,, co byla tato reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin, byla za vakua odpařena,' a výsledný zbytek byl rozpuštěn, v dichlormethanu. Vzniklý roztok byl poté promyt s vodou; vysušen se síranem sodným; a za vakua byl odpařen. Chromatografií zbytku na silikagelu, za použití směsi heptanu a ethylacetátu; ( 9 : 1^objemové poměry); bylo získáno 96,40 g}. žádaného N-(terc.-butyloxykarbonylmethy 1)-D-Phe-OMe.

Chromátografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,90} ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát : ) ( pyridin : kys.octová : voda} ( 376 : 31 :: 18 ) ( : 7} objemové poměry)} jako elučního činidla).

• ·

- 93 Příprava N-(terč.-butyloxykarbonylmethyl)-N-( N-terc.^butyloxykarbonyl)-D-Phe-OMe

U směsi, připravené smícháním 96,40 g* N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-D-Phe-OMe; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); a 72,20 g* di-t-butyldikarbonátu; ve 400,0 ml Ν,Ν-dimethylformamidu, bylo upraveno pH pomocí N,N-diisopropylethylaminu, na hodnotu pH 8,50.

Poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 48,0 hodin, bylo rozpouštědlo za vskua odstraněno, a výsledný zbytek byl smíchán s didjlormethsnem a s vodou. Po oddělení byla organická vrstva promyta s vychlazeným IN roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodouf^íiasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, a nakonec ještě s vodou. Po vysušení se síranem sodným’, a zfiltrování, byla organická část odpařena.

Výsledný zbytek byl chromatografován na oxidu křemičitém; za použití směsi toluen : ethylacetát; (9:1; objemové poměry);, jako elučního činidla.

Frakce, obsahující žádaný N-(t-butyloxykarbonylmethy1)-NBOC-D-Phe-OMe; byly shromážděny, a odpařeny.

Bylo získáno 1 1 5,30g žádanétjo;^ nadpise uvedeného produktu.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf - 0,77; ( za použití silikagelu,’ a směsi toluen : ethyl-') ( acetát;(9 : 1; objemové poměry), jako elučního) ( činidla).

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-Phe-OH

Roztok, připravený rozpuštěním 1l5,30gJ N-(t-butyloxykarbony lmethyl)-N-BOC-D-Phe-OMe; (získaného v rámci předcházejícího,

- 94 výše popsaného Stupně)} v 800,0 ml směsi dioxanu 8 vody} ( 9 )} objemové poměry)} byl reagován při teplotě místnosti} a po dobu 16,0 hodin, s dostatečným množstvím 2N roztoku hydroxidu sodného tak, aby pH reakční směsi se udržovalo na hodnotě w

12,0, Po okyselení, byla reakční směs nalita do vody, a poté byla extrahována s dichlormethanem. Organická vrstva dichlormethanového extraktu, byla promyta s vodou, a poté byla vysušena se síranem sodným, e filtrát byl odpařen.

Bylo získáno 104,0 mg, žádaného, N-(t-butyloxykarbonylmethy 1)-N-BOC-D-Phe-OH.

^Ef

Chromatografie na tenké vrstvě :

0,10} ( za použití silikagelu} a směsi toluen : ethyl-} ( acetátj 7 : 3} objemové peáněry)} jako elučního,) ( činidla).

Příprava N-(t-butyloxykarbonylme thy1)-N-BOC-D-Phe-Pro-Obenzylu

Ku vychlazenému roztoku ( teplota 9°C)} připravenému rozpuštěním 5,30 g} N-(t-butyloxykarbonylmethylí-N-BOC-D-Phe-OH; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)} ve 40,0 ml} Ν,Ν-dimethylformamidu, bylo postupně přidáno 2,80 g} 1-hydroxybenzotriazolu} 3,20 g} dicyklohexylkarbodiimidu} 3,78 g H-Pro-O-benzylu.hydrochloridu} a 2,16 ml} triethylaminu} a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě 0°C po dobu 1,0 hodiny} a poté byla ponechána při teplotě místnosti v klidu přes noc.

Poté byla reakční směs ochlazena na teplotu minus 20,0°C} a dicyklohexylmočovina byla odstraněna filtrací}, a filtrát byl odpařen do sucha. VýslQdný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a vzniklý roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného} s vodou} s 2%ním vodným roztokem • · ·

kyseliny citrónové; 8 se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl za vaku8 zahuštěn.

Frakce,, obsahující žádaný N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-NBOC-D-Phe-Pro-O-benzyl, byly shromážděny; 8 odpařeny.

Bylo získáno 4,35 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie na tenké vrstvě ::

Rf - θ,74; ( za použití silikagelu,’ a směsi heptanu a ethyl( acetátuj 1:1, objemové poměry); jako élučního ( činidla.)

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-B0C-D-Phe-Pro-0H

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 4,35 gj N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-Phe-Pro-0-benzylu; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 50,0 mi; methanolu_r bylo přidáno 450,0 mgj 10%ního palladia na aktivním uhlí; a vzniklá reakční směs byla hydrogenována při teplotě místhosti;. a za atmosferického tlaku_r po dobu 45,0 minut.

Po odstranění palladiového katalyzátoru filtrací, bylo rozpouštědlo za sníženého tla^u odpařeno.

Bylo získáno 3,48 g; žádaného; N-(t-butyloxykarbonylmethyl)N-BOC-D-Phe-OH.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,63; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát ::

( pyridin : kys»octová : voda; ( 664 : 31 : 18 ) ( : 7; objemové poměry); jako elučního činidlaJ)

- 96 Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-Phe-Pro-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 375,0 mgj N-(t-butyloxykarbanylmethyl)-N-BOC-E-Phe-Pro-OH; ( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); a 276,0 mi; N,N-diisopropylaminuj v 10,0 ml Ν,Ν-dimethylformamidu, bylo přidáno 100,0 ml isobutylchlorformiátu. Poté byla směs míchána při teplotě minus 20,0°CL po dobu 20,0 minut; a následně byl k ní pomalu přidán roztok, připravený rozpuštěním 362,0 mg; H-I#s-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)-trifluoroctové kyseliny; v 5,0 mi; Ν,Νdimethylf ormamidu; u kterého bylo pH upraveno pomocí N,N_Tdiisopropylethylaminu, na hodnotu pH 8,0·

Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě minus 20,0°C; po dobu 15,0 minut, a poté co, byla vytemperována na teplotu místnosti, byla odpařena do sucha, a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu. Organická fáze byla promyta postupně s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou; a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byla zahuštěna, a bylo získáno 622,0 mg, surového produktu.

Po přečištění zmíněného surového produktu chromatografií na silikagelu, za použití směsi dichlormethan : methanol; ( 97 3J objemové poměry); jako elučního činidla, bylo získáno 394,0 mg žádaného, N-(t-butyloxykarhonylmethyl)-N-BOC-D*-Phe-Pro-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu).

Chromatografie na tenké vrstvě ::

R^ = 0,50; ( za použití silikagelu; a směsi dichlormethanu ( a methanoluj(95 r 5J objemové poměry); jako ( elučního činidla ).

- 97 Příprava HOOC-CH₂-D-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

V předcházejícím, výše popsaném Stupni, získaný tripeptid ( 394,0 mg); byl reagován za účelem odstranění chránících skupin s kyselinou trifluoroctovou; a thioanisolem, analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1. Po přečištění pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie bylo získáno 206,0 mg, žádaného HOOC-CH₂-D-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu).

R ( kapalinová chromatografie):

27,90 min.; 20%; 0,50Mpufr fosforečnanu sodného*, pH 2,10; 80,0%, vodaj, až 20,0%J 0,50M', pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 20%; voda, a 60,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 25

Příprava HOOC-CH₂-D-p-OCH^-Phe-Pro-Lys-( 2-thiazolylu)

V nadpise uvedený, žádaný HOOC-CH^-D-p-OCH^-Phe-Pro-Lys( 2-thiazolyl); byl připraven analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 24 výše, za použití H-D-p-OCHy-Phe-OH.HCi;jako výchozího materiálu.

P_o sejmutí chránících skupin, ( viz Příklad 1); z 345,0 mg; N-(t-butyloxykarbonyIme thyl)-N-BOC-D-p-OCH^-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)*, bylo získáno, po přečištění s vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií; 153,0 mg, žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R ( kapalinová chromatografie ):

v • ·

- 98 28,90 min.* 20,0%; 0,50 M, pufr, fosforečnanu sodnéhoJpH 2,1 OJ 80,.0%; voda', až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného,' pH 2,10;

20,0%, vodaj a 60,0%, směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 26

Příprava HOOC-CH₂-/D/L-m-F-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D/L-m-F-Phe-OH

Analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 24J bylo 5,0 g; H-D/L-m-F-Phe-OH.HCi; konvertováno na žádaný N-(tbutyloxykarbonylmethylí-řF-BOC-D/L-m-F-Phe-OH. Výtěžek 8,0 g.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = θ,65; ( za použití silikageluj a směsi ethylacetátu a } ( methanoluj( 9 : 1J objemové poměry); j8ko eluč-) ( ního činidla).

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D/L-m-F-Phe-ProOMe

Ku vychlazenému roztoku ( teplota 0°C),* připravenému rozpuštěním 7,90 gj N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D/L-m-FPhe-OH; ( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 80,0 mi; Ν,Ν-dimethylformamidu, bylo postupně přidáno ·· ·· • · · · · ♦ · · ··· · · · 0 · ··

- 99 4,0 gj 1-hydroxybenzotriazoluj 4,50 gj dicyklohexylakrbodiimiduj 3,60 gj H-Pro-OMe. HCi; a 3,25 mlj triethylaminu.

Vzniklá reakční směs byla míchána nejprve při teplotě 0°C po dobu 1,0 hodinyj a poté byla ponechána v klidu při teplotě místnosti přes noc.. Poté, co byla reakční směs vychlazena na teplotu minus 20,0°C, byla dicyklohexylmočovina odstraněa filtrací; a filtrát byl odpařen do,sucha. Výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, a vzniklý roztok byl postupně promyt s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou, s 2%ním vodným roztokem kyseliny citrónové, a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl za vakua zahuštěn.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií přes silikagel,, za použití směsi heptanu a ethylacetátu; (7:3? objemové poměry);, jako elučního činidla.

Bylo získáno 6,90 gj žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = O,65J ( za použití směsi heptanu a ethylacetátu;

( 1 : 1; objemové poměry); jako elučního činidla.

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethylí-N-BOC-D/L-m-F-Phe-Pro-Off

Roztok, připravený rozpuštěním 6,90 gj N-(t-butyloxykarbonyImethyl)-N-BOC-D/L-m-F-Phe-Pro-OMfe; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 60,0 mlj směsi dioxanu a vodyj ( 9 : 1J objemové poměry); byl reagován během 16,0 hodin, s postupně přidávanými 13,80 mlj. 1N vodného roztoku hydroxidu sodného, při udržování pH v rozmezí hodnot 10,0 - 10,50.

Poté byla reakční směs naředěna se směsí ledu a vody; a násiáhě byla okyselena na pH 2,0‘pomocí 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Poté byla vodná vrstva extrahována s dichlormethanemj a dichlormethanová, organická fáze,* by 13 promyta s ··99 · · · · · ♦ ·· ···· · 9 · ♦ ·· · • · 9 · · · · ··· ·· • 9 9·· 9 99 ······ ·· · ·· *·

- 100 vychlazenou voďou^ a po vysušení se síranem sodným; a zahuštěním, bylo získáno 14,70 g surového materiálu, který byl přečištěn chromatografií na silikagelu; za použití směsi ethylacetátu a methanolu; ( 9 : 1J objemové poměry), jako elučního činidla .

Bylo získáno 5,22 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě ::

= 0,20; ( za použití silikagelu_r a směsi ethylacetátu a ) ( methanoluj (8:2; objemové poměry),, jako eluč-) ( ního činidla ).

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D/L-m-F-Phe-ProLys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)

Zkuplováním 601,30 mg; N-(t-butyloxykarbonylmethy1)-NBOC-D/L-m-F-Phe-OH; (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); s H-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu); provedeném analogickým postupem, popsaných výše v rámci Příkladu 24J bylo získáno 684,30 mg, žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

Chromátografie na tenké vrstvě r

R_f = 6,74;( za použití silikagelu; a směsi dichlormethanu ( a methanolu; ( 95 : 5ζ objemové poměry); jako) ( elučního činidla ).

• · • · · ··· · • · · ··· · • · ·· ··

101

PřípraV8 HOOC-CH^-D/L-m-F-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Analogickým zpracováním 673,50 mgj N-(t-butyloxykarbonylme thyl )-N-BOC-D/L-m-F-Phe-Pro-Lys- (benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu),( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně);, s kyselinou trifluoroctovou; a thioanisolem, postupy popsanými výše v rámci Příkladu 1J a po přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromatograf i í', bylo získáno 259,0 mgj žádaného, v nadpise uvedeného produktu, v čisté formě.

kapalinová chromatografie )::

28,40 mine.; a 29,0 min.; 20,0%; 0,50® pufr fosforečnanu sodného; pH 2_r10J 80,0%_r vody; až 20,0%;. 0,50® pufr foaforčňanu sodného; 20,0%; voda; a 60,0%; směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 27

Příprava HOOC-CH^-D-p-CF^-Phe-Pro-Lys-t 2-thiazolylu)

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmeth,yl)-N-BOC-D/L-p-CF^-Phe-OH

Analogickým postupe/^popsaným výše v rámci Příkladu 24 J bylo konvertováno 10,12 gj H-D/L-p-CEj-Phe-OH.HCi; na N-(tbutyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D/L-p-CF^-Phe-OH.Výtěžek 12,23 g.

Chromatografie na tenké vrstvě r

0,64; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetátu } ( a methanolu; ( 9 : 1J objemové poměry); jako) ( elučního činidla ), ·ΦΦ· φφ · Φ· · φφφ ·· ····· • ··· ·· · ···· • φ · φ · · · ··· ·· • φφφφ···

ΦΦΦ φφφ φφ · ····

- 102 Příprava Ν- (t-butyloxykarbonylmethyl )-N-BOC-D-p-CFyPhe-Pro0-benzylu

Analogickým postupem^ popsaným výše v rámci Příkladu 24 J bylo zkuplováno 6,10 g* N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D/Lp-CF^-Phe-OH; ( získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně); s H-Pro-O-Bzl.HCl,

Po zpracování mohly být chromátografií na silikagelu, za použití směsi heptanu r ethylacetátuj ( 75 : 25 J objemové poměry) jako elučního činidla); odděleny diastereoizoměry.

Bylo získáno 0,63 gj žádaného, v nadpise uvedenéhojN-(tbutyloxykarbonylmethyl)-N-B0C-D-p-CE^-Phe-Pro-0-henzylu; v čisté formě.

Ohromatografie na tenké vrstvě ::

= O,.35; ( za použití silikagelu; a směsi heptanu: ethyl-) ( acetétuj ( 7 : 3J objemové poměry),* jako eluč-J ( ního činidla.)

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-p-CE^-Phe-ProLys-( benzyloxykarbonyO-( 2-thiazolylu )

Celkem 630,0 mg, N-( t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-pCF^-Phe-Pro-O-benzyluJ (získaného v rámci předcházejícího,výše popsaného Stupně); bylo redukováno; a následně zkuplováno s H-Lys-( benzyloxykarbonyů)-(2-thiazolylem) ,* analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24.

^lo získáno 317,70 mgj žádaného, v nadpise uvedeného produktu..

- 103 •v ····

Ohromatografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,46J ( směs dichlormethan r methanol; (95 : 5; ) ( objemové poměry); jako eluční činidlo.

Příprava HOOC-CH^-D-p-CFy-Phe-Pro-Lys- (2-thiazolylu)

Odstranění chránících skupin z N-(t-butyloxykarbonylmethyl)N-BOC-D-p-CFj-Phe-Pro-Lys- (benzyloxy karbony 1)- (2-thiazolylu); ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); bylo provedeno analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24.

Po přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromátografií bylo izolováno 157,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R^( kapalihová chromátografie ):

36,70 min.; 20,0%; 0,50M'pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0%, voda; až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného, pH 2,10; 20,0%, voda*, a 60,0%; směs acetonitril : voda; (3 : 2*, objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 28

Příprava HOOC-CH^-D-p-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-p-Cl-Phe-OH

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24;

- 104 bylo konvertováno 10,0 gj H-D.-p-Cl-Phe-OH.HCi; na žádaný N( t-butyloxykarbonylmethyl)-N-B0C-D-p-Cl-Phe-0H. Výtěžek

16,70 g.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,27; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát : *) ( methanol; ( 9 : 1J objemové poměry), jako ) ( elučního činidla ).

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-B0C-D-p-Cl-Phe-0NSu

Roztok, připravený rozpuštěním 14,67 gj N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-p-Cl-Phe-OH; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 250,0 ml acetonitrilu,byl reagován přes noc/a při teplotě místnosti/se 4,11 gj N-hydroxysukcinimidu; a 6,86 gj 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu.hydrochloridu.

Reakční směs byla poté odpařena do sucha; a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu. Organická fáze byla poté promyta s vodou, a po vysušení se síranem sodným byla za vakua zahuštěna. Bylo získáno 19,11 gj v nadpise uvedeného, žádaného aktivního esteru, který byl přímo použit v následujícím Stupni.

Příprava N-(t-butyloxykarbonylme thyl)-N-BOC-D-p-Cl-Phe-Pro-OH

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 10,79 gj H-Pro-OH.HC1 ve 100,0 ml Ν,Ν-dimethylformamidu; a 100,0 ml, vody, u kterého bylo pomocí 1N roztoku hydroxidu sodného upraveno pH n8 hodnotu 8,OJ byl přidán po kapkách roztok, připravený rozpuštěním

- 105 • Ί»

19,11 g} N-(t-butyloxy karbony lme thyl)-N-BOC-D-p-Cl-Phe-ONSu} ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně);

ve 120,0 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. přes noc

Poté, co byla vzniklá reakční směs mícháňaVpři teplotě místnosti; a při udržování pH ne hodnotě 8,OJ byla směs ochlazena;. a pH bylo pomocí s 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové upraveno na pH 2,0. Poté byla vodná vrstva extrahována s dichlormethanem, a získaná organická fáze byla promyta s vodou} a po vysušení se síranem sodným_; byla za vakua odpařena.

Po použití přečištění chromatografií na silikagelu,. za nasazení gradientově eluce se směsí ethylacetát ;· methanol} ( 9 :: 1} objemové poměry)} byla získána v nadpise uvedená, žádaná sloučenina.·

Chromatografie n8 tenké vrstvě ::

= 0,24} ( za použití silikagelu} a směsi ethylacetát ( methanol} (8:2} objemové poměry)} jako ) ( elučního činidla ).

Příprava N-(t- butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-p-Cl-Phe-ProLys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24} bylo konvertováno 369,40 mg} N-( t-butyloxykarbonylmethyl)-NBOC-D-p-Cl-Phe-OH} na žádaný, v nadpise uvedený produkt. Výtěžek 249,10 mg.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^, = 0,25} ( za použití silikagelu, a směsi dichlormethan :

( methanol}(objemové poměry'} 97 : 3}), jako ( elučního činidla ).

• ·

- 106 Příprava HOOC-CH^-D-p-Cl-Phe-Pro-Lya-(2-thiazolylu)

Analogickým postupem,, popsaným v rámci Příkladu 1J byly u 231,50 mg; N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D-p-Cl-PhePro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)J sejmuty chránící skupiny; a po přečištění bylo získáno 109,80 mg; žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R^( kapalinová chromátografie ) :

33,80 min.J 20,0%’, 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 80,0%; voda’, až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného, pH

2,1 OJ 20,0%, voda, a 60,0%, směs acetonitril : vodaj ( 3 i 2J objemové poměry)J ve 40,0 minutách.

Příklad 29

Příprava HOOC-CH^-D-o-Cl-Phe-Pro-Lys-t2-thiazolylu)

V nadpise uvedený:; žádaný HOOC-CH^-O-o-Cl-Phe-Pro-Lys( 2-thiazol.yl) J byl připraven analogickým postupem,, popsaným v rámci Příkladu 26 výše; za použití H-D/L-o-Cl-Phe-OH.HClJ jako výchozího materiálu. U chráněného tripeptidu byly odděleny 2 diastereoizomery.

Sejmutím chránících skupin, analogický^'postupem, popsaným v rámci Příkladu 1J bylo z 230,0 mgj N-(t-butyloxykarbonylmethyl) N-BOC-D-o-Cl-Phe-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu); získáno, pb.přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromatografiíj 116,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R ( kapalinová chromátografie ):

- 107 30·,00 min.J 20,0%; 0,50Μ pufr, fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0%, voda; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 20,0%; voda; a 60,0%; směs acetonitril : voda;

( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 30

Příprava HOOC-CH^-R/L-m-p-di-F-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu )

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 26; za použití H-D/L-m-p-di-F-Phe-OH.HCl; jako výchozího materiálu.

Po odstranění chrátoících skupin; u chráněného tripeptidu, ( 720,0 mg); a následném přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii, analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 1;. bylo získáno 170,0 mg žádaného', v nadpise uvedeného produktu.

R^( kapalinová chromatografie ):

30,70 mia.; a 31,10 min.;. 20,0%;. 0,50M^;, pufr fosforečnanu sodného; 80,.0%_r voda; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného,pH' 2_r1 OJ 20,0% voda; a 60,0%, směs acetonitril :: voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad.. 31

Příprava HOOC-CH^-P/L-o-p-di-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina,, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 26; Z8

- 108 použití H-D/L-o,p-di-Cl-Phe-OH.HCl; jako výchozího materiálu.

Po aejmutí chránících skupin, u chráněného tripeptidu ( 1,07 g)J a následném přečištění pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie, analogický^ postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1; bylo získáno 100,0 mg; žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R^( kapalinová chromatografie ):

35,,40 min. a 36,.10 min.J 20,0%; 0,50 M pufr, fosforeč%nanu sodného, pH 2,105 80,0%, voda,*, až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodnéhoj. pH 2,105 20,0%, voda; a 60,0%, směs acetonitril :· voda; (3:2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 32

Příprava HOOC-CH^-D-Tyr-Pro-Lys-^-thiazolylu)

Příprava benzyloxykarbonyl-D-Tyr-(tBu)-OH

Ku suspenzi, připravené smícháním 5,0 g*_t D-Tyr-(tBu)-0H; ve 40,0 mi; Ν,Ν-dimethylformamidu, bylo přidáno 5,75 gJN-benzyloxykarbonyloxysukcinimidu; a pH této reakční směsi bylo upraveno pomocí triethylaminuyna hodnotu pH 8,0.

Poté” byla reakční směs míchána při teplotě místnosti přes nocj a následně byla za vakua odpařena. Výsledný zbytek byl rozpuštěn v dichlormethanu; a zředěn směsí ledem vychlazené vody; a pH vodné vrstvy bylo upraveno pomocí 2N roztoku kyseliny chlorovodíkovéjna pH 2,50.

Po oddělení organické fáze byla vodná vrstva extrahována s dichlormethanemj a získané spojené organické vrstvy byly promyty s vodou, vysušeny se síranem sodným^ zahuštěny.

- 109 Bylo získáno 9,95 g’, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf ~ 0,31}( směs heptan : ethylacetát} 1:1} použitá ) ( jako eluční činidlo ).

Příprava benzyloxykarbony1-D-Tyr-(tBu)-OMe

Ku roztoku, připraveného rozpuštěním 9,95 g} benzyloxykarbony1-D-Tyr-(tBu)-OH} (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně)} ve směsi 45,0 ml dichlormethanuj a 5*,0 ml methanolu,* bylo přidáno 7,45 g} /2-(1H-benzotriazol-1-yl)-

1,1,3,3-tetraměthyluroniumtetrafluorborátu/} a pH vzniklé reakční směsi bylo upraveno pomocí Ν,Ν-diisopropy lethy laminu; na hodnotu pH 8,0.

Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny, byla smíchána s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Po oddělení by18 organická fáze promyta s vodou} a 2%ním vodným roztokem kyseliny citrónové; a se solankou, a po vysušení se síranem sodný, byla za sníženého tlaku zahuštěna.

Bylo získáno 10,20g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,74}, ( směs heptan : ethylacetát} (1 : 1)} jako) ( eluční činidlo).

Příprava H-B-Tyr-(tBu)-0Me, HCl

- 110 Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 10,20 g* benzyloxykarbonyl-D-Tyr-(tBu)-OMe; ( získanému v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 100,0 url methanolu;. a 5,0 ml 4N roztoku kyseliny chlorovodíkové; bylo přidáno 1,20 gj 10%ního palladia na aktivním uhlí; a vzniklá reakční směs byla hydrogenována při teplotě místnosti; a atmosferickém tlaku; po dobu 2,0 hodin.

Poté byl palladiový katalyzátor odstraněn filtrací; a získaný filtrát byl zahuštěn na malý objem; a krystalizován z diethyletheru.

Bylo získáno 5,87 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,10; ( směs heptanu a ethylacetátu; (1 :: 1); jako ) ( elučního činidla )

Příprava HOOC-CE^-D.-Tyr-Pro-Lys-^-thiazolylu )

V nadpise uvedená, žádaná sloučenin^, byl^ připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24J za použití H-D.-Tyr-(tBu)-ONre.HCi; (získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); jako výchozího materiálu.

Sejmutím chránících skupin; u 586,0 mgj N-(t-butyloxyk8rbonylme thyl)-N-B0C-D-Tyr-(tBu)-Pro-Iys-(benzyloxykarbonyl)(2-thiazolylu); analogickými postupy, popsanými v rámci výše popsaného Příkladu 1\ a po přečištění produktu vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii, bylo získáno 283,0 mg; žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R ( kapalinová chromátografie )::

·· ♦ ···

- 111 20,-90: min. * 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ

80,0%; voda; až 20,0%; 0,50η¹ pufr fosforečnanu sodného; pH

2,10J 20,0%,' voda; a 60,0%; směs acetonitril voda; (3:2;

objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 33,

Příprava HOOC-CH₂-D./L-p-CH^-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava Hj-D/L-p-CH^-Phe-OH. hydrochloridu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 10,0 gj a-chlor-pxylenuj 19,30 gj diethylacetamidomalonátuj a 8,55 gj jodidu sodného, byla přidána suspenze,připravená z 3,28 gj hydridu sodnéhoj ( 60%ní disperze v minerálním oleji)’,, ve 40,0 ml ethanolu.

Poté, co byla vzniklá reakční směs zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem při teplotě 80,0°C po dobu 90,0 minut; bylo rozpouštědlo ze sníženého tlaku odstraněno’, a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu. Vzniklý roztok( organická fáze); byl promyt postupně s 5%ním vodným roztokem hydrogensíranu sodného; s 5%ním vodným roztokem hydrogensiřičitanu sodného; s vodou; s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, a se solankou; a poté, po vysušení se síranem sodným, byl za vakua zahuštěn.

Výsledný produkt byl krystalizován z heptanu’, a bylo získáno 19,80 g kondenzačního produktu, který byl reagován přes noc a při teplotě 95,O°C; se 420,0 mi; 6N^! roztoku kyseliny chlorovodíkové; a se 21O',O mi; kyseliny octové.

Po odpaření reakční směsi do sucha, bylo získáno 21,60'g

- 112 žádaného,, v nadpise uvedeného produktu.

Ohromatografie na tenké vrstvě :

- 0,15} ( za použití silikagelu} a směsi ethylacetát}) ( : pyridin: : kys,octová :: voda} ( 664 :: 31 : ) ( 18 :: 7}. objemové poměry)} jako elučního či-} ( nidla ).

Příprava HOOC-CH^-D/L-p-CHy-Phe-Pro-Eys-í 2-thiezolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24} byla připravena žádaná sloučenina} t.j. HOOC-CH^-D/L-p-CH^Phe-Pro-Lys- (2-thiazolyl)} za použití H-D/L-p-CH^-Phe-OH. HC1} ( získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně)} jako výchozího materiálu.

Odstranění chránících skupin z chráněného tripeptidu ( 582,0 mg)}, a přečištění pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie_r bylo provedeno analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 1.

Bylo získáno 120,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu,

R^( kapalinová chromátografie

31,90 min.} 20,0%} 0,501^- pufr; fosforečnanu sodného} pH 2,10} 80,0%, voda', až 20,0%} 0,50Mpufr fosdorečňanu sodného} pH 2,10'} 20,0%, voda} a 60,0%, směs acetonitril : voda} (3:2} objemové poměry)} ve 40,0 minutách.

Příklad 3:4

- 113 Příprava HOOC-CH^-D-m-Cl-Phe-Pro-Lys-í2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 33 J byl připraven ze 3-chlorbenzylbromidu; jako výchozího materiálu, H-D/L-m-Cl-Phe-OH.hydrochlorid.

V další operaci byl sestaven plně chráněný tripeptid dle stejného postupu, popsaného v rámci Příkladu 26 výše.

V konečné fázi tohoto stupně, byl reagován 1,0 g'_t N-(tbutyloxykarbonylme thyl)-B-BOC-D/L-m-Cl-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl )-(2-thiazolyl); s kyselinou trifluoroctovouj. a thioanisolem ( viz Příklad 1).

Po přečištění s vysokovýkonnou kapalinovou chromátografií bylo izolováno 195,0 mg, žádaného HOOC-CH^-H-m-Cl-Phe-Pro-Lys( 2-thiazolylu).

R_t( kapalinová chromatografie ):

31,70 min·.;. 20,0%; 0,50®'pufr, fosforečnanu sodného, pH 2,10; 80,0%, vodaj, až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného, pH 2,10; 20,0%, voda; a 60,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad; 35

Příprava HOOC-CH^-B-difenylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24J za použití H-difenylalanin-OH. hydrochloridu, jako výchozího materiálu. Sejmutím chránících skupin., z 570,0 mg N-(t-butyloxykarbohylme thyl)-N-BOC-D-difenylalanin-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)- (2-thiazolylu), analogickým postupem, popsaným výše v rámci. Příkladu 1'J a po následném přečištění s vysokovýkonnou

- 114 kapalinovou chromatografií; bylo získáno 194,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R^( kapalinová chromatografie )::

35,60 min.; 20,0%;. 0,5(35’ pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10J 80,0%; voda; až 20,0%; 0,5(35· pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 20,0%, voda; a 60,0%, směs acetonitril : vodaj (3 : 2, objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 36

Příprava HOOC-CH^: ₂-D-m-OH-Phe-Pro-Lys-( 2-thiazolylu)

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24J za použití H-D/L-m-OH-Phe-OH,hydrochloridu, jako výchozího materiálu.

Během zavádění chránící skupiny N-terc.-butyloxykarbonylové na N-terminální zbytek, byla rovněž chráněna fenolická hydroxylová funkce. Sejmutím chránících skupin ( viz Příklad 1); u 1,21 gj N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-N-BOC-D/L-m-OBOC-PhePro-Iys-(benzyloxykarbonyl)-2-thiazolylu; byl získán po přečištění pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie, v nadpise uvedený, žádaný diastereoizomer. Výtěžek 99,0 mg.

R_t( kapalinová chromatografie ):

23,80 min.J 20,0%; 0,50M pufr; fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 80,0%, voda’, až 20,0%; 0,50M^rpufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 20,0%, voda*, a 60,0%; směs acetonitril : vodaj (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

φφ φ ·Φ · «· · · · φ φ φ φ· φ φφφ φ· φ *· ·· • φ · φ φ · φ ΦΦ· ·♦

9 9·· 9 99 • 99 ΦΦΦ ΦΦ * ** ”

- 115 Příklad 37

Příprava HOOC-CH^-D./L-m-OCHj-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D/L-m-OH-Phe-OH

Ku roztoku,, připravenému rozpuštěním 5,25 gj H-D/L-m-OHPhe-OH.hydrochloriduJ ve 55,0 ml dioxanuj 28,0 ml vody; a 29,0 ml 1N vodného roztoku hydroxidu sodného, bylo přidáno 6,95 gj di-t-butyldikarbonátuj a vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě místnosti; a pH 9,OJ ]5řes noc.

Poté byla reakční směs naředěna s 200,0 ml vodyj a následná byla extrahována s heptanem. Oddělená vodná vrstva byla zředěna se 150,0 ml e thy láce tátu*, a poté byla okyselena na pH 2,0 s 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové. Po odd-ělení organické fáze byla vodná vrstva extrahována 3 ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly promyty s vodou;, a se solankou; vysušeny se síranem sodným; a poté byly za vakua zahuštěny.

gylo získáno 8,49 g, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny. Chromatografie na tenké vrstvě :

Rg, = 0,67; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát : ) ( pyridin : kys.octová : vodaj ( 126 : 20 : 6 ;) ( 1 1J objemové poměry); jako elučního činidla. )

Příprava N-terc,-butyloxykarbonyl-D/L-m-OCHj-Phe-OMe

Směs, připravená smícháním 8,49 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-D/L-m-OH-Phe-OHJ ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); 23,90 g' uhličitanu sodného; a 20,30 ml ·· ····

- 116 methyljodiduj v 60,0 mlj Ν,Ν-dimethylformamidu, byla míchána při teplotě 60,0°C; po dobu 48,0 hodin.

Poté byla reakční směs nalita do směsi vody a ledu*, a poté, co byla okyselena na pH 2,50; s 2N roztokem kyseliny chlorovodíkové, byla extrahována s ethylácetátem. Oddělené organické vrstvy byly spojeny; a promyty postupně s vodou a se solankou, a po vysušení se síranem sodným byly za vakua zahuštěny.

Výsledný surový produkt byl přečištěn chromatografii na silikagelu’, za použití směsi heptan : ethylacetát; ( objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 6,66 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Ohromatografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,56; ( za použití silikagelu, a směsi heptan : ethyl( 8cetát; objemové poměry); jako elučního činidla ( 3 : 2).

Příprava H-D/L-m-OCH^-Phe-OMe.trifluoroctové kyseliny

Roztok ; připravený rozpuštěním 6,66 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-D/L-m-OCH^-Phe-OMe; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 20,0 ml dichlormethanu; a ve 20,0 ml kyseliny trifluoroctové, byl míchán při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin.

Poté, co bylo rozpouštědlo za sníženého tlaku ze směsi odpařeno, byl výsledný surový produkt 2x spoluodpařen s toluenem.Bylo získáno 9,56 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě

R = 0,32; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát ( pyridin : kys.octová : voda; (126 : 20 : 6 : ) ( 11; objemové poměry), jako elučního činidla.J

117

Příprava HOOC-CE^-D/L-m-OCH^-Phe-Pro-Lys-t2-thiazolylu)

V rámci předcházejícího J výše popsaného Stupně získaná H-D/L-m-OCH^-Phe-OMe.trifluoroctová kyselina, by18 použita pro přípravu N-(t-butyloxykarbonylmethy1)-N-BOC-D/L-m-OCHj-Phe-ProLys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu); dle stejného postupu, popsaného výše v rámci Příkladu 24.

Reakcí 624,0 mg chráněného tripeptiduj s kyselinou trifluoroctovouj a thioanisolemj ( viz příklad 1); a následným přečištěním s vysokovýkonnou kapalinovou chromátografií, bylo získáno 114,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R ( kapalinová chromatografie ):

29,-30 min.; a 29,80 min.; 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného' pH 2_f10J: 80,0%, voda; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 20,0%, voda; a 60,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 38

Příprava HOOC-CH^-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys-í2-thiazolylu)

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D/L-p-Br-Phe-OH

Ku suspenzi, připravené smícháním 2,44 gj H-D/L-p-Br-PheOH; s 25,0 ml směsi; t-butanolu a vody; ( 1 : 1J objemové poměry); u které bylo upraveno pH na 9,0 pomocí zředěného; 1N vodného roztoku hydroxidu sodného, bylo přidáno 3,27 gjdi-tbutyldikarbonátu, a vzniklá reakční směs byla míchána přes noc, za stálého udržování pH na hodnotě -9,0.

• · · · · · ·· ·· • ·· · · • ·· ·· • · ♦♦· · · • · · · • ·4··

Poté byla reakční směs neředěna a vocou, a následně byla extrahována s heptanem. Vodná vrstva byla naředěna s ethylacetátem,'. a poté, za použití 2N roztoku kyseliny chlorovodíkové, byla okyselena na pH 2,50.

Po oddělení organické fáze, byla vodná fáze extrahována s ethylacetátem·; a spojené ethylacetátové vrstvy byly promyty postupně s vodou a se solankou; a po vysušení se sítanw sodným, byly za vakua zahuštěny*.

Bylo získáno 3,35 gj žádané,, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie na tenké vrstvě r

R = 0,32; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát] r?) ( pyridin : kys.octová : voda; ( 126 : 20 : ) ( 6 : 11; objemové poměry); jako elučního či- ) ( nidla ).

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D/L-p-Br-Phe-Pro-OH

V předcházejícím, výše popsaném Stupni získaný N-terc.butyloxykarbonyl-D/L-p-Br-Phe-OH; ( 3,35 g)J byl zkuplován s H-Pro-OMe.hydrochloridemj a následně byl zmýdelněn s hydroxidem sodným, analogickými postupy, popsanými výše v rámci Příkladu 26.

Bylo získáno 3,13 g žádaného, v nadpise uvedeného produktu. Chromatografie na tenké vrstvě :

R_f = 0,45; ( za použití silikagelu,' a směsi ethylacetátu ( 8 methanoluj (9 : 1), jako elučního činidla.)

119

Příprava N-terc,-butyloxykarbony1-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu) ··· ·

Zkuplování N-terc.-butyloxykarbony1-D/L-p-Br-Phe-Pro-OHJ (získaného v rámci předcházejícího,, výše popsaného Stupně); ( 750,0 mg); s H-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylem), bylo provedeno zemana logických podmínek, popsaných v rámci Příkladu 24 výše.

Bylo získáno 1,01 gj žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Ohromatografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,85; ( za použití silikagelu; a směsi dichlormethanu) ( a methanoluj ( 9 : 1J objemové poměry),’ jako ) ( eůučního činidla ).

Příprava H-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys-( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl )-trifluoroctové kyseliny

V rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně získaný N-terc.-butyloxykarbonyl-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl )-( 2- thiazolyl ) J ( 1,01 g)J byl rozpuštěn v 10,0 ml kyseliny trifluoroctové; a vzniklá reekční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny.Poté bylo rozpouštědlo ze směsi za sníženého tlaku odpařeno.

Bylo získáno 879,0 mg, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromátografie na tenké vrstvě ::

R_f = 0,75, a 0,68J ( ze použití silikagelu, a směsi ethyl-) (acetá : pyridin : kys.octová : vodaj ) ( 63 : 20 : 6 1 1J objemové poměry); ) ( jako elučního činidla ).

120

Příprava N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-D/L-p-Br-Phe-Fro-Lys( benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním S79,O mgj H-D/L-pBr-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolyl)» trifluoroctové kyaelinyj. ( získané v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 25,0 mi; acetonitriluj bylo přidáno 264,0 ml/ t-butylbromacetátu; a pH vzniklé reakční směsi bylo upraveno pomocí s Ν,Ν-diisopropylethylaminu; na hodnotu 8,0; a poté byla reakční směs ponechána stát v klidu při teplotě místnosti přes noc.

Po odstranění rozpouštědla odpařením, byl výsledný zbytek rozpuštěn v ethylacetátem. Poté byla organická fáze promyta s vodouj s 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; a se solankou; a po vysušení se síranem sodným, byla za vakua zahuštěna.

Výsledný surový produkt byl přečištěn chromatografií přes silikagelj za použití směsi dichlormethan : methanol;( 95 : 5J objemové poměry); jako elučního činidla.

Bylo získáno 850,0 mg chráněného tripeptidu.

Chromatografie na tenké vrstvě :

R^ = 0,91 J ( za použití silikagelu, a směsi ethylecetát :) ( pyridin : kys.octová : voda; ( 63 : 20 : 6 :) ( 11; objemové poměry); jako elučního činidla.^)

Příprava HOOC-CH^-O/L-p-Br-Phe-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

V předcházejícím, výše popsaném Stupni získaný N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)(2-thiazolyl); ( 850,0 mg); byl reagován s kyselinou trifluoroctovou; a s thioanisolem, za analogických podmínek, popsaných ·* ····

- 121 ···· ·· · ·♦ • ··· ·· • · · ·· • · ·· ··· ··· ·· ··» ·· • ·· · · • ·· ·· • 9 ··· *9

9 99 ·♦99 výše v rámci Příkladu 1 * a po přečištění pomocí vysokovýkonné kapalinové chromátografie, bylo získáno 123,0 mg, žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R^í kapalinová chromátografie ):

33,90 min.; a 34,40 min.; 20,0%; O;50M pufrj fosforečnanu sodnihď^8 JO%, voda; až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,1 OJ 20,0%, voda; a 60,0%, směs ecetonitril : voda£ 3 : 2* objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 39

Příprava HOOC-CH^-D-p-F-Phe-Pro-Lys-ÍZ-thiazolylu)

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připrevena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 38J za použití H-D-p-F-Phe-OH; jako výchozího materiálu.

Sejmutí chránících skupin ( viz Příklad 1); u 563,0 mg N-(t-butyloxykarbonylmethy1)-D-p-F-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl )-(2-thiazolylu), poskytlo, po následném přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií,’ 182,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R ( kapalinová chromátografie ):

29,70 min.; 20,0%J 0,50M pufr} fosforečnanu sodného, pH 2,1 OJ 80,0%, voda; až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečňanunsodného, pH 2,10j 20,0%, voda; a 60,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); ve 40,0 minutách.

• ·· · t · ·· · · · · · to to • ··· ·· » · · » · to • 9 · · * · · * ·»···· »· b ·· ··

- 122 Příklad 40

Příprava HOQC-CK₂-D./E-m,p-di-Cl-Phe-Pro-Lys- (2-rthiazolylu)

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 38J za použití H-D/L-m,p-di-Cl-Phe-OH; jako výchozího materiálu.

Po sejmutí chránících skupin ( viz Příklad 1); u 480,0 mg N-(t-butyloxykarbonylmethyl)-D/L-m,p-di-Cl-Phe-Pro-Lys-(benzyloxykarbonyl)-(2-thiazolylu)‘, a po přečištění vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii; bylo získáno 191,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

R^( kapalinová chromatografie ):

36,80 min. a 37,80 min..; 20,0%; 0,50M'pufr fosforečnanu sodného;. pH 2,.1O; 80,0%, voda; až 20,0%; 0,50M_/pufr fosforečnanu sodnéhoj pH 2,10ý 20,0%,. voda; a 60,0%,’ směs acetonitril :· vodaj. (3:2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 41

Příprava benzyl-S0₂-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-psi-/C0C0/-0HPříprava benzyloxykarbonyl-Lys-( N-terc.-butyloxykarbonyl)OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 28,0 gj benzyloxykarbonyl-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-OH] v 500,0 ml směsi, připravené smícháním dichlormethanu a methanoluj ( 9 : 1J objemové poměry); bylo přidáno 23,60 gj 2-(1H-benzotriazol-1-yl)φφφφ ··· ·· φ φ · φ · • φ · · φ · · φφφφ φ φ φ φ φ φ φφφφφφ « · · · φ · · ·» φφφ φφφ φφ · φφφφ

- 123 1,1,3,,1-tetramethyluroniumtetrafluorborátu; a ρΗ reakční směsi bylo upraveno pomocí triethylaminuj na pH’8,0.

Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 2,0 hodin, byla postupně promyta s vychlazeným 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové; s vodou; s 5%ním vodmým roztokem hydrogenuhličitanu sodnéhoJ a nakonec s vodou; a vysušena se síranem sodným.

Po odpaření filtrátu byl výsledný zbytek chromatografován na silikagelu,. za použití směsi ethylacetát : heptan; (1:4; objemové poměry), j8ko elučního činidla.

Frakce, obsahujcící žádaný benzyloxykarbonyl-Lys-(N-tercrbutyloxykarbonyl)-OMeJ byly shromážděny, a odpařeny.Bylo získáno 29,10 g, žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

Chromatografie na tenké vrstvě ::

^Rf ⁼ °»⁸5J ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát Ό ( heptanj (3 : 1 J objemové poměry); jako eluč-,) ( ního činidla ).

Příprava benzyloxykarbonyl-Lys-(N-terc,-butyloxykarbonyl)-psi/kyanacetátu/

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 29,10 gj benzyloxykarbonyl-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-OMe; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); v 800,0 ml vysušeného dichlormethanu; a vychlazenému na teplotu minus 78,0°c; byl přidán po kapkách 1M roztok diisobutylaluminiumhydridu v hexanu ( 222,0 ml); takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi se stále udržovala na hodnotách nižších než minus 70,0°C,

Poté, co byla reakční směs míchána při teplotě minus 78,0°C po dobu 1,0 hodiny, bylo k ní přidáno 600,0 mlj 5%ního vodného roztoku kyseliny citrónové*, a dvoufázová směs byla míchána

- 124 t···· • ·· φ ··· ·· • · · ·· • · ·· *·«··· · » při teplotě místnosti po dobu 10,0 minut»

Poté byle organická a vodná fáze odděleny; a vodná fáze byla extrahována s dichlormethanem. Spojené dichlormethanové extrakty byly promyty s vodou; vysušeny se síranem sodným} a poté byly zfiltrovány» Filtrát byl v atmosféře dusíku vychlazen lázní chlazenou ledem a vodou} a poté byl' k němu přidán roztok, připravený rozpuštěním 36,30 g} kyanidu sodného} a 4,20 g} benzyltriethylamoniumchloridu, v 600,0 ml vody.

Poté byl ku reakční směsi přidán po částech, za intensivního míchání} a během 30,0 minut}acetanhydrid ( 2 x 9,0 ml).

Poté byly organická a vodná fáze odděleny; a vodná vrstva byla extrahována s dichlormethanem·.

Spojené dichlormethanové vrstvy byly promyty s vodou} vysušeny se síranem sodným,* zfiltrovány} a poté byly za vakua odpařeny .Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na oxidu křemičitém, za použití směsi heptan : ethylacetát} (1:1} objemové poměry)} jako elučního činidla.

Bylo získáno 26,30 g} žádaného benzyloxykarbonyl-Lys(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/kynacetátu/.

Chromatografie ne tenké vrstvě :

Rf. = 0,60} ( za použití silikagelu; a směsi dichlormethan) ( : ethylacetát} (7 : 3, objemové poměry)}jako) ( elučního činidla ),

Příprava benzyloxykarbonyl-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi/CH0HC0/-0Mé

Do roztoku,, připravenému rozpuštěním 26,30 g} benzyloxykarbonyl-Lys- (N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/kyanace tátu/} /získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupněý} ve směsi diethyletheru a methanolu} (3 : 1}objemové poměry)} • ···· 44 ···· ···* • · · · · · · · · · • 444 4 · 4 · · ♦· • « 4 · «ί 4 4 444 44 f ····444

444444 4 4 · ·♦· ·

- 125 ( 600,0 ml)} a vychlazeného v atmosféře dusíku na teplotu minus 20,0°C, bylo při teplotě, nižší než ‘minus 5,0°C} vháněno celkem 66,0 g plynného chlorovodíku.

Poté, co byla vzniklá reakční směs ponechána při teplotě 4,0°C přes noc v klidu, bylo k ní přidáno po kapkách^ a při teplotě nižší než 5,0°C.,' celkem 100,0 ml vody. Poté byla reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 16,0 hodin} a po oddělení organické a vodné fáze, byla organická vrstva promyt8 s vodou, a vodná vrstva byla nasycena s chloridem sodným, a poté byla extrahována se směsí, sek.-butanol : dichlormethan}(3 : 2} objemové poměry)} Organická fáze by18 promyta se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byla zfiltrována} a za vakua odpařena.

Výsledný zbytek ve formě 25,40 g surového aminujbyl vyjmut do 400,0 ml} N, N-dimethy lformamidu} a ku vzniklé směsi bylo přidáno 16,0 g} bis-( terc.-butyl)-anhydridu,· a tolik triethyl aminu, až bylo docíleno pH 8,0. Poté, co byla tato reakční směs míchána při teplotě místnosti přes noc, byla zbavena za sníženého tlaku rozpouštědla odpařením; a výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu·. Vzniklý roztok byl postupně promyt s vodou} a se solankou, a po vysušení se síranem sodným, byl za vakua odpařen;.

Výsledný zbytek byl přečištěn chromatografií na silikagelu, za použití směsi ethylacetát : heptan} (4:6} objemové poměry), jako elučního činidla.

Bylo získáno 15,80 g} žádaného benzyloxykarbonyl-Lys-(Nterc.-butyloxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/-OMé.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,75} ( za použití silikagelu', a směsi ethylacetát :

( pyridin : kys.octová : voda} ( 63 : 20 : 6 ;· ( 11} objemové poměry)} jako elučního činidla.

• ·

- 126 -

Příprava H-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/-OMé

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 0,92 g} benzyloxykarbony 1-Lys- (N-terc.-butyloxykarbony1)-psi-/CHOHCO/-OMe} (získaného v.rámci předcházejícího, výše popsaného .Stupně)} ve 20,0 ml Ν,Ν-dimethylformamidu; bylo přidáno 92,0 mg} 10%ního palladia na aktivním uhlí} a 2,18 ml; 1N roztoku kyseliny chlorovodíkové.

Vzniklá reakční směs byla poté hydrogenována při teplotě místnosti} a za atmosferického tla&i, po dobu 3,0 hodin.Poté byl palladiový katalyzátor pomocí filtrace odstraněn} a rozpouštědlo bylo z roztoku za sníženého tlaku odpařeno.

Byl· získán žádaný H-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi/CH0HC0/-0Me.hydrochlorid} ve kvantitativním výtěžku.

Ohromatografie na tenké vrstvě :

0,47} ( za použití silikagelu, a směsi ethylacetát : ) ( pyridin : kys.octová : voda} (88 : 31 :: 18 :) ( 7J objemové poměry,.)} jako elučního činidla.)

Příprava benzylSO^-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(N-terc.-butyloxykarbony 1 )-psi-/CHOHCO/-OMě

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 18} byla připravena (S)-3-benzylsulfonylamido-2-oxo-1-azepinoctová kyselina.

Ku roztoku _r připravenému rozpuštěním 400,0 mgj kyseliny (S)-3-benzylsulfonylamido-2-oxo-1-azepinoctové; ve 20,0 ml N,Ndimethylformamidu} a vychlazenému na teplotu 0°C} bylo postup&ě přidáno 238,0 mg, 1-hydroxybenzotriazolu} 267 mg dicyklohexylkarbodiimidu} 385,0 mg}H-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi• ΦΦΦ

127 /CH0HC0/-0Mé.hydrochloridu; s 0,32 mlj triethylaminu.

Vzniklá reakční směs byla míchána při teplotě 0°C po dobu 1,0 hodiny; a poté byla ponechána v klidu při teplotě místnosti přes noc. Po ochlazení směsi na teplotu minus 20,0°C; byla dicyklohexylmočovina odstraněna filtrací; a získaný filtrát byl odpařen do sucha.

Výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu; a vzniklý roztok byl promyt postupně s 5%ním; vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; s vodou; s 2%ním vodným roztokem kyseliny citrónové; a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného*, a po vysušen ní se síranem sodným, byl za vakua zahuštěn.

Zbytek byl chromátografován na silikagelu; za použití směsi dichlormethan : methanol; ( 9 : 1; objemové poměry); jako elučního činidla. Frakce, obsahující žádaný benzyl-SC^-norLeu( cyklo)-Gly-Lys-(N-terč.-butyloxykarbony1)-psi-/CH0HC0/-0Me; byly shromážděny; a odpařeny.

Bylo získáno 663,0 mg žádaného, v nadpise uvedeného produktu.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rg = 0,91 J ( za použití směsi silikagelu; a směsi ethylacetát') ( : pyridin : kys.octová ;· voda; ( 63 : 20 r 6 : ) ( 11J objemové poměry), jako elučního činidla, )

Příprava benzyl-S0₂-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/CH0HC0/-0H

Roztok, připravený rozpuštěním 650,0 mg; benzyl-S0₂«norLeu( cyklo)-Gl.y-Lys-(N-terc.-butyloxyk8rbonyl)-psi-/CH0HC0/-0Me; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 20,0 ml směsi*, připravené smícháním dioxanu a vodyj v poměru 7 : 3; ( objemové poměry),* byl reagován s 1,05 mi; 2M roztoku • · 9 ·

128

• f» • · · · 9 « hydroxidu sodného; přidávaného po částech^ během 1,0 hodiny, při teplotě místnosti; a při udržování pH reakční směsi v rozmezí 12,0 - 13,0.

Poté, co byla reakční směs zředěna se 20,0 ml vody, bylo k ní přidáno tolik 2M roztoku kyseliny chlorovodíkové, až bylo docíleno pH 2, OJ a poté byla vodná vrstva extrahována s dichlormethanem. Spojené organické fáze byly promyty postupně s vodou a se solankou; vysušeny se síranem sodným; a poté byly za vakua zahuštěny.

Bylo získáno 740,0 mg žádaného benzyl-S0₂-norLeu-(cyklo)Gly-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/-OH.

Chromatografie najtenké vrstvě :

= 0,44; ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát :) ( pyridin : kys.octová : voda; ( 63 : 20 ;· 6 ( 11; objemové poměry); jako elučního činidlaj.

Příprava benzy1-S0₂«norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/COCO/-OH

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 740,0 mg, benzyl-S0₂norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/CHOHCO/OH; ( získaného v rámci předcházejícího, výše popsaného Stupně); ve 20,0 ml vysušeného dichlormethanu, bylo přidáno 450,0 mg perjodanu ( De.ss-Martinovo reagens); a poté, co byla vzniklá reakční směs míchána při teplotě místnosti po dobu 1,0 hodiny, bylo k ní přidáno 20,0 ml roztoku( 2%ního) thiosíranu sodného; a reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 30,0 minut. Poté, co byla organická vrstva oddělena, byla promyta s vodou, vysušena se síranem sodným; a za vaku8 byla odpařena.

Bylo získáno 497,0 mg, žádaného benzy1-S0₂~norLeu-(cyklo)Gly-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/C0C0/-0H( v surové £ormě)<

• « · 9 • 9 9 9 99 ·

• « » · « · 9 · ·

129

Chromátografie na tenké vrstvě

O,45J( zasilikagelu; a směsi ethylacetát :

( pyridin : kys.octová : vodaj (63 : 20 · 6 : 11\ ( objemové poměry;)jako elučního činidla^.

Příprava benzyl-S0₂-norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-psi-/COCO/-OH

V předcházejícím, výše popsaném Stupni získaný benzyl-S0₂norLeu-(cyklo)-Gly-Lys-(N-terc.-butyloxykarbonyl)-psi-/COCO/-OH; ( 497,0 mg Jsurová forma); byl reagován při teplotě místnosti; po dobu 1,0 hodiny; s 10,0 ml; směsi 90%ní kyseliny trifluoroctové a vody.

Poté byla reakční směs.za v8kua zahuštěna; a výsledný zbytek byl rozpuštěn ve vodě; a získaný roztok byl přímo nanesen na sloupec preparativníjvysokovýkonné kapalinové chromatografie, ( sytém DeltaPak, RP-C-18); za použití gradientového elučního systému z 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 80,0%, vodaj až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného,* pH 2,1 OJ 45,0%, voda;, a 35,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry); během 45,0 minut}a při průtokové rychlosti 80,0 ml/min.

Bylo získáno 200,0 mg, žádaného benzyl-SO₂-norLeu-(cyklo)Gly-Lys-psi-/COCO/-OH.

R^( kapalinová chromátografie ):

26,37 min.; 20,0%, 0,50M pufr, fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0%, voda,, až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného} pH 2,10;. 20,0%, voda, a 60,0%; směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry);, ve 40,0 minutách.

« ·«·· φφ φφφφ ·· ·· φφφ φ φ · «φφφ φφφφ φφ φ φφφφ

Φ φφφ ΦΦ φ «ΦΦΦ · • · Φ Φ · ΦΦΦ «ΦΦΦΦ· ΦΦ Φ ΦΦ Φ *

- 130 Příklad 42

Příprava Η- (řK-CH^ )-D-norLeu-Pro-Lys-psi-/C0C0/-0H'

Příprava N-terc,-butyloxykarbonyl-(N-CH^)-norLeu-Pro-0H

V nadpise uvedená, žádaná sloučenin^; byl$ připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci'Příkladu 11.

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 1; byla připravena i sloučenina H-(N-CH^)-D-norLeu-Pro-Lys-psi/ C0C0/-0H. Výtěžek 69,0 mg.

E- ( kapalinová chromatografie ):

13,27 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10; 80,0%, vodaj až 20,0%; 0,50M, pufr dosforečňanu sodného; pH 2,10; 20,0%, voda*, a 60,0%; směs acetonitril : voda; 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 43

Příprava H-D-Phe-Pro-Lys-psi-/COCO/-OH

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D-Phe-Pro-OMe

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 5,0 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-D-Phe-OH; ve 200,0 ml Ν,Ν-dimethylformamidu; a vychlazenému na teplotu 0°C, bylo postupně přidáno 4,29 gj 1-ftydroxy-benzotriazoluj 4,29 gj dicyklohexylkarbodiimidu; 3,10 g;

• · · · · · «· · ♦ · · « · · ·· · ·

9 & · · ·9

9 9 99

999 999 99·

-131H-Pro-OMe.hydrochloridu; a 3,0 ml] N-e thylmorf olinu.

Vzniklá reakční směs byla poté míchána při teplotě 0°C po dobu 1,0 hodiny, a následně byla ponechána při teplotě místnosti v klidu po dobu 2 dnů..Póté, po ochlazení směsi na teplotu minus 20,0°C, byla filtrací odstraněna dicyklohexylmočovina; a filtrát byl odpařen do sucha.

Výsledný zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátuj a vzniklý roztok byl postupně promyt s 5%ním, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného; 0,1M' roztokem kyseliny chlorovodíkové; nasyceným vodným roztokem chloridu sodného', a po vysušení se síranem sodným, byl za vakua zahuštěni.

Zbytek byl chromatografován na silikagelu,, za použití směsi ethylacetát : heptanj (4:6 Jobjemové poměry); jako elučního činidla.

Frakce, obsahující žádaný N-terč.-butyloxykarbony1-D-PhePro-OMe, byly shromážděny; a odpařeny.

Bylo získáno 1,50 g, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Rf - 0,90;( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát : 'j ( pyridin : kys.octová : vodaj (163 : 20 :: 6 ;: ) ( 11, objemové poměry); jako elučního činidla.?

Příprava N-terc.-butyloxykarbonyl-D-Phe-Pro-OH

Roztok, připravený rozpuštěním 8,30 gj N-terc.-butyloxykarbonyl-D-Phe-Pro-0M^reJ ( získaného v rámci předcházejícího; výše popsaného Stupně); ve směsi dioxanu a vodyj( 6 : 4J objemové poměry); (150,0 ml)J byl reagován při teplotě místnostiJ s během 1,0 hodiny přidávaným ( po částech)) 2M vodným roztokem hydroxidu sodnéhoj ( 16,50 ml), přičemž pH reakční směsi bylo udržováno na pH 12,50.

- 132 Poté bylo ku reakční směsi přidáno tolik 2M roztoku kyseliny chlorovodíkové,, až bylo došáleno pH 3,0; a vodná vrstva byla extrahována s_Qethyláce tátem. Spojené organické fáze byly promyty s vodou/íse solankou; a poté, co byly vysušeny se síranem sodným, byly za vakua zahuštěny.

Bylo získáno 6,90 g; žádaného N-terc.-butyloxykarbony 1-DPhe-Pro-OH.

Chromatografie na tenké vrstvě :

= 0,30; ( Z8 použití silkagelu*, 3 směsi ethylacetát ; *)

(. pyridin : kys.octová : voda; (213 : 20 : 6 : ) ( 11; objemové poměry); jako elučního činidla.)

Příprava H-D-Phe-Pro-Lys-psi-/GOCO/-OH

Analogickým postupem, popsaným v rámci Příkladu 1 výše, byla připravena i v nadpise uvedená, žádaná sloučenina. Výtěžek 417,0 mg.

R^( kapalinová chromatografie 5:

16,22 min.} 20,0%; 0,50M pufrj fosforečňanu sodného,' pH 2,1 OJ 80,0%,. voda*, až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného; pH

2,1 OJ 20,0%, voda; a 60,0%$ směs acetonitril :: voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 44 • · · · · • · · · · ·

133

Příprava H-(N-CH^)-D-Phe-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys-psi-/COCO/Off

Příprava N-terc. -butyloxykarbonyl- (N-CH^ )-D-Phe- (N-cyklopentyl)Gly- OH

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina byla připravena analogickým postupem, popsaným v rámi Příkladu 3J za použití N-terc. butyloxykarbonyl- (N-CH^ )-D.-Phe-OH; a HC1. H-(N-cyklopentyl)-GlyOMeJ jako výchozích materiálů.

Chromátografie na tenké vrstvě :

Rf = 0,52; ( Ζ8 použití silikagelu; a směsi dichlormethanu,) ( a methanoluj (9:1; objemové poměry); jako ) ( elučního činidla).

Příprava H- (N-CH^)-D-Phe-(N-cyklopentyl)-Gly-Lys-psi-/COCO/-OH

Analogickým postupem,, popsaným výše v rámci Příkladu 1J bylo připraveno 87,0 mg, žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

R^( kapalinová chromátografie ):

23,92 min.; 20',0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodnéhoJ pH 2,10; 80,0%» vodaj až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodnéhoJpH 2,10; 20,0%; vodaj a 60,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2* objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 45>

• · ··

- 134 Příprava e thylsulfonyl-D-Phe-Pro-Lys-psi-/COCO/-OH

Příprava ethylsulfony1-D-Phe-Pro-OH

V nadpise uvedená, žádaná sloučeniny byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 22.

Příprava e thylsulf ony l-D-Phe-Pro-Lys-psi-/COC.O/-OH

V nadpise uvedená,, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným v rámci výše popsaného Příkladu 41. Výtěžek 90,0 mg.

R^( kapalinová chromátogarfie)’:

28,04 min.J 20,0%; 0,50M pufr fosforečňanu sodného; pH 2,1OJ 80,0%,. vodaj až 2O,O%;O,5OM pufr fosforečňanu sodného; pH 2,10; 20,0%; vodaj a 60,0%;směs acetonitril : voda; (3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 46

Příprava (4aR,8aR)-perhydroisochinolin-1(R)-karbonyl-Pro-Lyspsi-/COCO/-OH

Příprava 2-benzyloxykarbonyl-(4aR,8aR)-perhydroisochinolin1(R)-karbonyl-Pro-OH • · · · · · • •9 · · w · · ·>· • · ·« · · · ·· · · • φ · · · « *·····

9 9 9 9 9 99

999999 99 9 9 9·«

- 135 V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 20.

Příprava(4aR, 8aR)-perhydroisochinolin-1(R)-karbony1-Pro-Lyspsi-/C0C0/-0HI

V nadpise uvedená, žádaná sloučenina, byla připravena analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 4Ί.Výtěžek 170,0 mg.

R^( kapalinová chromatografie ):

18,95 min.; 2O,O%;O,5OM'pufr fosforečnanu sodného, pH. 2,10J 80,0%, vodaj až 20,0%; 0,5OSE pufr fosforečnanu sodného; pH 2,10* 20,0%J vodaj a 60,0%; směs acetonitril : vodaj ( 3 : 2Jobjemové poměry); ve 40,0 minutách.

Příklad 47

Příprava HOQC-CH^-D-cyklooktylalanin-Pro-Lys-C 2-thiazolylu)

Příprava cyklo-oktylmethylbromidu

Roztok, připravený rozpuštěním 8,16 gj cyklooktylmethanolu, ve 70,0 mi; 47%ní kyseliny bromovodíkové, byl zahříván za refluxuj.(při teplotě 130,0°C); pod zpětným chladičem, pó dobu 1,0 hodiny·

Poté byla vzniklá reakční směs nalita do 500,0 ml ledem vychlazené vodyj 8 bylo k ní poté přidáno 500,0 mlj nasyceného • · · · · • * · · · ·

- 136 vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Poté byl vodný roztok extrahován s dichlormethanemj a spojené dichl ořme titanové, organické fáze,, byly promyty postupně s vodou; 8 se solankou; a po vysušení se síranem sodným, a zfiltrování*, byly za vakua zahuštěny.

Výsledný zbytek byl chromátografován na silikagelu, za použití toluenu, jako elučního činidla.Frakce, obsahující žádaný cyklo-oktylmethylbromid, byly shromážděny; a odpařeny.

Bylo získáno 9,85 g žádané, v nadpise uvedené sloučeniny.

Chromatografie n8 tenké vrstvě :

R_f = 0,95; ( za použití silikagelu; 8 toluenu, jako eluč-) ( ního činidla).

Příprava (R,S)-ethyl-2-acetylamino-2-kyan-3-cyklooktyl-propionátu

Ku roztoku, připravenému rozpuštěním 6,85 gj kalium terc.butylátuj. a 8,10 g\ ethylacetamidokyanacetátuj ( při teplotě místnosti)’, ve 100,0 ml dimethylsulfoxidu, byl přidán potápkách roztok, připravený rozpuštěním cyklooktylmethylbromiduj ve 25,0 mlj dimethylsulfoxiduj a tato reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 44,0 hodin, a poté byla nalita do 500,0 ml vody.

Vzniklá sraženina byla odfiltrována a vysušena.

Bylo získáno 2,95 gj žádaného (R,S)-ethyl-2-acetylamino-2-kyan-

3-cyklookty1-propi onátu.

Chromatografie na tenké vrstvě ::

R^ = 0,50; ( za použití siliksgelúj a směsi heptan ; ) ( ethylacetátj(3 : 7J objemové poměry), jako ) ( elučního činidla).

• · 0 · • · · 99

999 99

9 9 99

99·

999 99999 • 9 9 9 • ·· ··

- 137 Příprava H-D^L-cyklo-oktylamin-OH. hydrochloridu

V předcházejícím, výše popsaném Stupni/získaný (R,S)-ethyl2-acetylamino-2-kyan-3-cyklooktyl-propionát; ( 2,95 g)J byl nasuspendován do 20,0%ního roztoku kyseliny chlorovodík^v^f^T^ vzniklá reakční směs byla zahřívána za refluxu pod zpětným chladičem, po dobu 22,0 hodin.

Poté byla reakční směs ochlazena na teplotu 5,0°C; a vzniklá sraženina byla odfiltrována,* a po promytí s diethyletherem, byla vysušena.

Bylo získáno 2,69 gj žádaného H-D_TL-cyklo-oktylamin-OH,hydroehloridu’< H-D,L-G.oa-OH*HC1 )·

Chromátografie na tenké vrstvě r

Rf = 0,27J ( za použití silikagelu; a směsi ethylacetát :

( pyridin : kys.octová : vodaj ( 63 : 20 r. 6 : ( 11; objemové poměry); j8ko elučního činidla.

Příprava HOOC-CH₂-D-cyklooktylamin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24J byla připravena v nadpise uvedená, žádaná sloučenina. Výtěžek 162,0 mg.

^X_^ap8^inóvá ,Qhromatogr8fie^? )::

38,35 minuj, 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného,pH 2,10; 80,0%_r voda; až 20,0%J 0,50M pufr fosforečnanu sodného,* pH 2,1 OJ 20,0%, voda; a 60,0%; směs acetonitril : vodaj (3:2; objemové poměry), ve 40,0 minutách.

·♦ ···· • · · ·

- 138 • · · 99

999 99

9 9 99

9 99

99999999

Příklad 48

Příprava H00G>CH^-D-2-naftylalanin-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24; byla připravena i žádaná, v nedpise uvedená sloučenina.Výtěžek 423,0 mg.

R^( kapalinová chromatografie ) :

35,78 min.; 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného, pH 2,10J 80,0% voda;, až 20,0%; 0,50M pufr, fosforečnanu sodného, pH 2,10J 20,0%,, voda; a 60,0%, směs acetonitril : voda; (3:2; objemové poměry)', ve 40,0 minutách.

Příklad 49

Příprava HOOC-CH^-D-norLeu-Pro-Lys-í2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24J byla připravena i Žádaná, v nadpise uvedená sloučenina.Výtěžek 344,-0 mg.

R^( kapalinová chromatografie ):

24,84 min»} 20,0%, 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10; 80,0% voda} až 20,0%; 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10;

20,0%, voda} a 60,0%, směs acetonitril : voda; ( 3 : 2J objemové poměry); ve 40,0 minutách.

- 139 Příklad 50

Příprava HOGC-CH^-D-Leu-Pro-Lys-(2-thiazolylu)

Analogickým postupem, popsaným výše v rámci Příkladu 24} byla připravena i žádaná, v nadpise uvedená sloučenina.Výtěžek 138,.0 mg.

R^( kapalinová chromátografie ):

24,50 min.} 2O,O%,O,5OM pufr} fosforečnanu sodného, pH 2,10} 80,0%, voda} až 20,0%, 0,50M pufr fosforečnanu sodného, pH 2,10} 20,0%, voda} a 60,0%, směs acetonitril : voda} (3 : 2} objemové poměry)} ve 40,0 minutách.

Příklad 51

Zkouška na inhibici thrombinu

Faktor Ha thrombinu je jeden z faktorů koagulačního systému. Antithrombinová účinnost sloučenin podle vynálezu byla stanovena spektrofotometricky měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu s-2238 působením thrombinu. Touto zkouškou v pufrovaném systému je možno stanovit hodnotu ICgQ pro zkoumané látky.

Prostředí

Jako prostředí k provedení zkoušky byl použit pufr TNP, obsahující tromethamin, chlorid sodný a polyethylenglykol 6000. Jako referenční látka byla použita sloučenina 12581 (Kabi) v pufru TNP jako nosném prostředí. Rozpustnost je možno usměrnit přidáním dimethylsulfoxidu, methanolu, ethanolu, acetonitrilu nebo terč.butylalkoholu, které až do koncentrace 2,5 % nemají nepříznivý vliv na průběh zkoušky.

140

K provedení zkoušky byla použita následující činidla, všechna s analytickou čistotou.

1) Pufr TN, obsahující tromethamin a chlorid sodný. Tento pufr obsahuje v 1 litru 6,057 g, 50 mmol tromethaminu (Tris), 5,844 g, 100 mmol, NaCl, voda do 1 litru. Roztok se upraví na pH 7,4 při teplotě 37 °C přidáním 10 mmol/1 kyseliny chlorovodíkové .

2) Pufr TNP, obsahující svrchu uvedené složky se připraví tak, že se polyethylenglykol 6000 rozpustí v pufru TN do konečné koncentrace 3 g/1.

3) Roztok S-2238 se připraví tak, že se 25 mg S-2238 (Kabi Diagnostica, Švédsko) rozpustí ve 20 ml pufru TN do konečné koncentrace 1,25 mg/ml, to znamená 2 mmol.

4) Roztok thrombinu. Lidský thrombin (16 000 nKat/lékovka, Centraal Laboratorium voor Bloedtransfusie, Amsterdam, Nizozemsko) se rozpustí v pufru TNP na zásobní roztok s obsahem 835 nKat/ml. Těsně před použitím se roztok zředí pufrem TNP na konečnou koncentraci 3,34 nKat/ml.

Pro přípravu všech vodných roztoků se užije ultračistá voda (Milli-Q kvalita).

Příprava zkušebních vzorků a roztoků referenčních látek

Zkoumané a referenční látky se rozpustí ve vodě Milli-Q _2 na zásobní roztok s koncentrací 10 mol/1. Každá koncentraz—3 ce se postupně ředí nosným prostředím až na koncentrace 10, “4-5 a 10 mol/1. Zředěné roztoky, včetně zásobních roztoků se užiji ve zkušebním vzorku v konečné koncentraci 3x10,

10^-3, 3xl0^-4, 10^-4, 3xl0^-5, 10~⁵, 3xl0^-6 a 10^-6 mol/1.

- 141 • · ····

Provedení zkoušky

Při teplotě místnosti se do vyhloubení mikrotitrační plotny pipetou střídavě přidává 0,075 ml nebo 0,025 ml zkoumané látky nebo referenční látky nebo pouze nosné prostředí a roztoky se zředí 0,115 ml a 0,0165 ml pufru TNP podle množství uloženého roztoku. Pak se do každého vyhloubení přidá 0,030 ml roztoku S-2238 a plotna se předehřeje při předběžné inkubaci za protřepávání v inkubátoru (Amersham) 10 minut při teplotě 37 °C. Po ukončení této předběžné inkubace se zahájí hydrolýza sloučeniny S-2238 přidáním 0,030 ml roztoku thrombinu do každého vyhloubení. Plotny se inkubují 30 sekund při 37 °C za protřepávání. Po jedné minutě inkubace se pak ve vzorku 90 minut každé 2 minuty měří absorbance při 405 nm při použití kinetického odečítače mikrotitračních ploten Twinreader plus, (Flow Laboratories).

Všechny získané údaje se shromažďují v počítači IBM při použití systému LOTUS-MEASURE. Pro každou koncentraci účinné látky, vyjádřenou v mol/1 a také pro slepou zkoušku se graficky vyjádří závislost absorbance na reakční době v minutách.

Vyhodnocení výsledků

Pro každou koncentraci účinné látky se z uvedené závislosti vypočítá maximální absorbance. Hodnotě Ι0₅θ, to znamená koncentrace, která způsobí 50% inhibici maximální absorbance, dosažené ve slepé zkoušce, vyjádřená v mikromol/1 se vypočítá pomocí logitové transformační analýzy způsobem podle publikace Hafner a další, Arzneim.-Forsch./Drug Res., 1977, 27(11), 1871 až 1873,

Hodnoty příkladů jsou

Příklad

2(e)

4(b) • · · 9 • 9 9

9 9 9

- 142 IC₅₀ pro sloučeniny podle vynálezu z některých uvedeny v následující tabulce:

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY • · ····

   1. Inhibitory thrombinu obecného vzorce I

   A - B - C - Lys - D (i) kde

   A znamená atom vodíku, 2-hydroxy-3-cyklohexylpropionyl, R^, R^-O-CO, R^-CO-, R^SO₂-, -(CHRgj^COORg nebo N-ochranná skupina, kde znamená -alkylen-COOH o 1 až 6 atomech uhlíku v alkylenové části, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, alkenyl o 2 až 12 atomech uhlíku, aryl o 6 až 14 atomech uhlíku, aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku, nebo aralkenyl o 8 až 15 atomech uhlíku, přičemž arylové skupiny mohou být substituovány substituentem ze skupiny alkyl o 1 až 6 atomech uhlíku, alkoxyskupina o 2 až 12 atomech uhlíku, hydroxyskupina nebo atom halogenu,

   R₂ znamená atom vodíku, nebo má význam, uvedený svrchu pro symbol

   Rg znamená atom vodíku, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, alkenyl o 2 až 12 atomech uhlíku, aryl o 6 až 14 atomech uhlíku, aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku nebo aralkenyl o 8 až 16 atomech uhlíku, přičemž arylové skupiny mohou být substituovány alkylovou skupinou o 1 až 6 atomech uhlíku, alkoxyskupinou o 2 až 12 atomech uhlíku, hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a znamená celé číslo 1 až 3,

   - 144 B znamená chemickou vazbu, L-Asp nebo jeho esterový derivát, ’ Leu, norLeu, -N(benzyl)-CH₂-CO-, -N(2-indan)-CH₂-CO-,

   D-l-Piq, D-3-Piq, D-Tiq, Atc nebo zbytek D-aminokyseliny s hydrofobním aromatickým postranním řetězcem,

   C znamená Azt, Pro, Pec, norLeu(cyklo)Gly, nebo zbytek aminokyseliny -N(cykloalkyl o 3 až 8 atomech uhlíku)-CHg-CO- nebo -N(benzyl)-CH₂-CO-,

   D znamená COOH, zbytek tetrazolu, oxazolu, thiazolu nebo benzthiazolu, nebo

   A a C mají svrchu uvedený význam, B znamená D-cykloalkylalanin o 3 až 8 atomech uhlíku v cykloalkylové části a D znamená zbytek tetrazolu, oxazolu, thiazolu nebo benzothiazolu, nebo prekursor těchto sloučenin nebo farmaceuticky přijatelná sůl těchto látek, s výjimkou sloučeniny Me-D-Phe-Pro-Lys-COOH.
2. 2. Inhibitory thrombinu podle nároku 1, v nichž D znamená skupinu COOH.
3. 3. Inhibitory thrombinu podle nároku 2, v nichž A znamená atom vodíku, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, -CO-aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku v aralkylové části, -SO₂-alkyl o

   1 až 12 atomech uhlíku, -S0₂~aryl o 6 až 14 atomech uhlíku nebo -SO₂~aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku, B znamená chemickou vazbu, L-Asp, norLeu, D-l-Piq nebo D-Phe a C znamená Pro, norLeu(cyklo)Gly nebo N(cyklopentyl)-CH₂-C0-.
4. 4. Inhibitory thrombinu podle nároku 3, v nichž A znamená -SO₂-benzyl, B znamená chemickou vazbu a C znamená

   - 145 norLeu(cyklo)Gly nebo A znamená -SO^-ethyl, B znamená D-Phe a C znamená Pro nebo A znamená atom vodíku, B znamená D-l-Piq a C znamená Pro.
5. 5. Inhibitory thrombinu podle nároku 1, v nichž D znamená oxazolovou nebo thiazolovou skupinu.
6. 6. Inhibitory thrombinu podle nároku 5, v nichž A znamená atom vodíku, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, 2-hydroxy-3-cyklohexylpropionyl, -CO-aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku v aralkylové části, -CO(CH₂)_nCOOH, -SO₂~aryl o 6 až 14 atomech uhlíku, -SO₂~aralkyl o 7 až 15 atomech uhlíku, -SO₉-alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku, -(CHR_) COOR_, kde R_o znamená atom vodíku nebo alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku a Rg znamená atom vodíku, alkyl o 1 až 12 atomech uhlíku nebo benzyl a C znamená Pro, norLeu(cyklo)Gly nebo -N(cykloalkyl)-CH₂~CO- s cykloalkylovou částí o 3 až 8 atomech uhlíku.
7. 7. Způsob výroby inhibitorů thrombinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se navazují vhodně chráněné aminokyseliny nebo analogy aminokyselin, načež se odstraní ochranná skupina.
8. 8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že jako svou účinnou složku obsahuje inhibitory thrombinu podle některého z nároků 1 až 6 spolu s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami.
9. 9. Inhibitory thrombinu podle některého z nároků 1 až 6 pro použití k léčebným účelům.
10. 10. Použití inhibitorů thrombinu podle některého z nároků 1 až 6 pro výrobu prostředků s antithrombotickým účinkem.