ES2199302T3 - Inhibidores de trombina. - Google Patents

Inhibidores de trombina.

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ES2199302T3 ES96937337T ES96937337T ES2199302T3 ES 2199302 T3 ES2199302 T3 ES 2199302T3 ES 96937337 T ES96937337 T ES 96937337T ES 96937337 T ES96937337 T ES 96937337T ES 2199302 T3 ES2199302 T3 ES 2199302T3
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Constant Adriaan Anton Van Boeckel
Peter Diederik Jan Grootenhuis
Jacobus Albertus Maria Peters
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Akzo Nobel NV
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Abstract

LA INVENCION TRATA DE INHIBIDORES DE LA TROMBINA DE UNION NO LENTA DE FORMULA: A - B - C - LYS - D, EN LA CUAL A ES H, 2 HIDROXI - 3 - CICLOHEXILPROPIONILO - , R 1 , R 1 - O CO - , R 1 - CO - , R 1 - SO 2 - , (CHR 2 )N COOR 3 , O UN GRUPO PROTECTOR DE N, ESTANDO R 1 SELECCIONADO ENTRE - ALQUILENO (C 1 - 6) - COOH, ALQUILO (C 1 - 12), ALQUENILO (C 2 - 12), ARILO (C 6 - 14), ARALQUILO (C 7 - 15) Y ARALQUENILO (C 8 - 16), ESTANDO LOS GRUPOS ARILO SUSTITUIDOS CON ALQUILO (C 1 - 6), ALCOXI (C 2 - 12), HIDROXI O HALOGENO; R 2 ES H O TIENE EL MISMO SIGNIFICADO QUE R 1 , R 3 SE SELECCIONA ENTRE H, ALQUILO (C 1 - 12), ALQUENILO (C 2 - 12), ARILO (C 6 - 14), ARALQUILO (C 7 - 15) Y ARALQUENILO (C 8 - 16), ESTANDO LOS GRUPOS ARILO SUSTITUIDOS CON ALQUILO (C 1 - 6), ALCOXI (C 2 - 12), HIDROXI O HALOGENO; N ES UN NUMERO ENTERO DE 1 A 3; B ES UN ENLACE, L - ASP O UN DERIVADO DE ESTER DEL MISMO, LEU, NORLEU, - N(BENCILO) - CH 2 - CO , - N(2 - INDANO) - CH 2 - CO - , D - 1 - PIQ, D - 3 - PIQ, D - TIQ, ATC OUN D - AMINOACIDO QUE PRESENTA UNA CADENA LATERAL AROMATICA HIDROFOBA; C ES AZT, PRO, PEC, NORLEU(CICLO)GLY, UN AMINOACIDO DE FORMULA - N[CICLOALQUILO (C 3 - 8)] - CH 2 CO - O - N(BENCILO) - CH 2 - CO - , D SE SELECCIONA EN TRE COOH, TETRAZOL, OXAZOL, TIAZOL Y BENZOTIAZOL, O A Y C PRESENTAN LOS SIGNIFICADOS MENCIONADOS ANTERIORMENTE, B ES D CICLOALQUILALANINA (C 3 - 8), Y D ES TETRAZOL, OXAZOL, TIAZOL O BENZOTIAZOL; O UN PROFARMACO DEL MISMO; O UNA SAL FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE DEL MISMO; CON LA EXCEPCION DEL COMPUESTO ME - D - PHE - PRO - LYS - COOH. LOS COMPUESTOS PUEDEN UTILIZARSE COMO AGENTES ANTITROMBOTICOS.

Description

Inhibidores de trombina.
La presente invención se refiere a inhibidores de trombina de unión no lenta, a un procedimiento para la preparación de dichos inhibidores, a las composiciones farmacéuticas que los contienen, y al uso de estos inhibidores de trombina como agentes antitrombóticos.
Se ha centrado mucha atención en la inhibición de la trombina como anticoagulante potencial. Los inhibidores de la enzima trombina, una serina proteasa clave en la cascada de coagulación de la sangre han sido considerados durante cierto tiempo candidatos potenciales para la profilaxis y la terapia anticoagulante. En particular, los múltiples papeles desempeñados por la trombina en sus acciones sobre los factores de coagulación, los componentes de la sangre circulante, y las células de la pared del vaso hacen de ella una diana particularmente atractiva en una variedad de estados patológicos. Por otra parte, las limitaciones asociadas con los anticoagulantes empleados en la actualidad, en particular la aparición de complicaciones hemorrágicas, necesita una investigación sobre agentes que actúen más específicamente.
Se han descrito muchos inhibidores de la serina proteasa de tipo péptido, entre los cuales están los inhibidores del estado de transición de la trombina. Muchos de estos últimos compuestos, sin embargo, son inhibidores de unión lenta. El uso de inhibidores de la trombina de acción lenta está abierto a las críticas. In vivo, la trombina es regenerada constantemente en el plasma y los inhibidores de la trombina funcionan principalmente retrasando la formación de trombina a través de la inhibición de las etapas de amplificación mediadas por trombina. Para retardar semejante cascada de amplificación, sería preferible un inhibidor de unión no lenta. Sería necesaria una dosis más grande de un inhibidor de acción lenta para lograr el mismo efecto, con el correspondiente incremento de riesgo de efectos secundarios.
Los inhibidores de trombina relevantes han sido descritos por Brady y col., en Bioorganic & Medicinal Chemistry, 3 (1.995), 1063-78 donde se describen derivados D-Phe-Pro-Arg-amida y D-Phe-Pro-Lys-X, siendo X un cetoéster o una amina. Estos compuestos son descritos por ser inhibidores de trombina de unión lenta, y del mismo modo estos compuestos están excluidos de la presente invención. En la investigación de inhibidores de trombina de unión no lenta Jones y col., J. Enzyme Inhibition, 9 (1.995), 43-60 intentaron obtener una mejora utilizando derivados D-Cha-Pro-Lys-COOH. Sin embargo, aunque se demostró que estos derivados son inhibidores de trombina más potentes, todavía manifiestan propiedades de unión lenta.
En un intento reciente de obtener inhibidores de trombina de unión no lenta potentes Lewis y col., Thrombosis and Haematostasis, 74(4), 1.995, 1104, prepararon derivados Me-D-Phe-Pro-Lys-X, siendo X carboxamida o ácido carboxílico. Estos compuestos, entre los cuales se describe específicamente Me-D-Phe-Pro-Lys-COOH, se clasifican como inhibidores de unión lenta. Por lo tanto este compuesto no satisface los requerimientos de la presente invención y está excluido de protección.
Se describe un inhibidor de trombina con una lisina sustituida con alquilo en US 5.523.308. En referencias anteriores se describen otras secuencias Phe-Pro-Lys, por ejemplo por Iwanowicz y col. en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2 (1.992), 1607-12, que describen derivados D-Phe-Pro-Lys-X, siendo X entre otros, un cetoéster. Tales compuestos también pueden ser descritos como inhibidores de trombina de unión lenta.
También se describen otros tipos de péptidos para la inhibición de diferentes serina proteasas. Tsutsumi y col. en J. Med. Chem., 37 (1.994), 3492-3502 describen compuestos de tipo péptido que tienen extremos C-terminales de tiazol y benzotiazol. Se descubrió que tales derivados de tiazol son 300 veces más potentes que los correspondientes análogos de tiofeno. Adicionalmente se postuló que los grupos heterocíclicos C-terminales proporcionarían una interacción de enlaces de hidrógeno crítica con la histamina de la proteasa prolil endopeptidasa. Aunque adicionalmente se sugirió que este rasgo bien puede ser susceptible de extensión a otras serina proteasas, las trombina proteasas no eran mencionadas específicamente. La explicación mecánica de Tsutsumi fue cuestionada por Edwards y col. en J. Med. Chem., 38 (1.995), 76-85, pero también estos autores encontraron que los inhibidores de elastasa del tipo D-Phe-Val-Pro-Val-X, siendo X tiazol y benzotiazol, son inhibidores de unión no lenta de la serina proteasa relevante. Estos autores también sugieren el desarrollo de peptidil-\alpha-cetoheterociclos como inhibidores de otras serina proteasas.
La presente invención hace referencia al sorprendente descubrimiento de que las enseñanzas de Edwards, Tsutsumi y otros también pueden ser aplicadas a los inhibidores de trombina. La aplicación de los heterociclos C-terminales a los compuestos como describen Lewis, Jones y Brady proporciona potentes inhibidores de trombina que tienen propiedades de unión no lenta a la trombina. Por otra parte, muchos de estos compuestos muestran vidas medias biológicas y biodisponibilidad oral mejoradas.
La invención se refiere por lo tanto a inhibidores de trombina de unión no lenta de fórmula:
A-B-C-Lys-D
\newpage
donde
A es H, R_{1}, R_{1}-O-CO-, R_{1}-CO-, R_{1}-SO_{2}-, -(CHR_{2})_{n}COOR_{3}, o un grupo protector,
donde
R_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{12}, alquenilo C_{2}-C_{12}, arilo C_{6}-C_{14}, aralquilo C_{7}-C_{15} y aralquenilo C_{8}-C_{16}, el grupo arilo del cual puede estar sustituido con alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{2}-C_{12}, hidroxi, o halógeno;
R_{2} es H o tiene el mismo significado que R_{1};
R_{3} se selecciona entre H, alquilo C_{1}-C_{12}, alquenilo C_{2}-C_{12}, arilo C_{6}-C_{14}, aralquilo C_{7}-C_{15} y aralquenilo C_{8}-C_{16}, el grupo arilo del cual puede estar sustituido con alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{2}-C_{12}, hidroxi, o halógeno;
n es un entero de 1 a 3;
B es un enlace, L-Asp o un derivado éster del mismo, -N(bencil)-CH_{2}-CO, D-Tiq, Atc, D-ciclohexilalanina o un D-aminoácido que tiene una cadena lateral aromática hidrófoba;
C es Pro o un aminoácido de una de las fórmulas -N[cicloalquil C_{3}-C_{6}]-CH_{2}-CO- o -N(bencil)-CH_{2}-CO-;
D se selecciona entre tiazol y benzotiazol;
o un profármaco del mismo, donde los profármacos son derivados protegidos con N-alcoxicarbonilo de la fórmula general;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos de la presente invención son útiles para tratar y prevenir las enfermedades mediadas por trombina y asociadas con trombina. Esto incluye numerosos estados trombóticos y protrombóticos en los que la cascada de coagulación está activada, entre estos se incluyen, pero no están limitados a, trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar, tromboflebitis, oclusión arterial a partir de trombosis o embolismo, reoclusión arterial durante o después de la angioplastia o la trombolisis, la restenosis tras la lesión arterial o los procedimientos cardiológicos invasivos, la trombosis o el embolismo venoso post-operatorio, la aterosclerosis aguda o crónica, la apoplejía, el infarto de miocardio, el cáncer y la metástasis, y las enfermedades neurodegenerativas. Los compuestos de la invención también pueden ser utilizados como anticoagulantes en circuitos sanguíneos extracorpóreos, según sea necesario en diálisis y cirugía. Los compuestos de la invención también pueden ser utilizados como anticoagulantes in vitro.
Los compuestos preferidos según la invención son los compuestos en los que D es tiazol. Adicionalmente, preferiblemente A es H, alquilo C_{1}-C_{12}, -CO-aralquilo C_{7}-C_{15}, -SO_{2}-arilo C_{6}-C_{14}, -SO_{2}-aralquilo C_{7}-C_{15}, -SO_{2}-alquilo C_{1}-C_{12}, -(CHR_{2})_{n}COOR_{3}, siendo R_{2} H o alquilo C_{1}-C_{12} y siendo R_{3} H, alquilo C_{1}-C_{12} o bencilo; y C es Pro o -N[cicloalquil C_{3}-C_{6}]-CH_{2}-CO-. Son particularmente preferidos los inhibidores de trombina de unión no lenta donde A es
-(CH_{2})_{n}COOR_{3}, siendo R_{3} H, alquilo C_{1}-C_{12} o bencilo; B es D-ciclohexilalanina, o D-Phe opcionalmente monosustituido con alcoxi o halógeno; y C es Pro. Es específicamente preferido el inhibidor de trombina de unión no lenta HOOC-CH_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
El grupo protector de N definido en la definición del radical A es cualquier grupo protector de N utilizado en péptidos. Los grupos protectores de N adecuados pueden ser encontrados en T.W. Greene y P.G.M. Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, Segunda Edición (Wiley, NY, 1.991) y en The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3 E. Gross and J. Meienhofer, Eds., (Academic Press, Nueva York, 1.981).
Según se utiliza aquí, alquilo es un grupo alquilo ramificado o no ramificado que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, isopentilo, dodecilo, y similares.
El término alquileno C_{1}-C_{6} representa un grupo alquileno ramificado o no ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, tal como -(CH_{2})_{m}- y m es de 1 a 6, -CH(CH_{3})-, -CH(CH_{3})-(CH_{2})-, etc. El grupo alquileno preferido es metileno.
Alquenilo es un grupo alquenilo ramificado o no ramificado que tiene de 2 a 12 átomos de carbono. Los ejemplos son etenilo, propenilo, alilo, y similares.
Los grupos aralquilo y aralquenilo son grupos alquilo y alquenilo respectivamente, sustituidos con uno o más grupos arilo, siendo el número total de átomos de carbono de 7 a 15 y de 8 a 16, respectivamente. Los grupos aralquilo preferidos tienen v.g. la fórmula -(CH_{2})_{p}-CH-(C_{6}H_{5})_{2}, siendo p 1 ó 2, o -(CH_{2})_{q}-C_{6}H_{5} opcionalmente sustituido con halógeno, siendo q 1, 2 ó 3.
Arilo en la definición anterior y en la definición de arilo, según se utiliza en el compuesto de la invención, es un radical aromático de 6 a 14 átomos de carbono. El grupo arilo puede contener adicionalmente uno o más heteroátomos, tales como N, S, u O. Los ejemplos de los grupos arilo son fenilo, naftilo, (iso)quinolilo, indanilo, y similares. El más preferido es el grupo fenilo. El grupo arilo puede estar sustituido con uno o más grupos alquilo, preferiblemente los grupos metilo, alcoxi, preferiblemente metoxi, hidroxi, o halógeno. El término halógeno representa flúor, cloro, bromo o yodo. El halógeno preferido es el cloro.
Los términos D-1-Piq y D-3-Piq representan 1- y 3-carboxiperhidroisoquinolina, respectivamente. El término Tiq representa ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolino-carboxílico. Atc es ácido 2-aminotetralin-2-carboxílico. Los términos Azt y Pec representan ácido 2-azetidino-carboxílico y ácido pipecolínico, respectivamente.
El término norLeu(ciclo)Gly representa un fragmento estructural de fórmula
1
El término cadena lateral aromática hidrófoba representa un alquilo C_{1}-C_{12} sustituido con uno o más grupos arilo C_{6}-C_{14} (que pueden contener un heteroátomo, v.g. nitrógeno) tal como fenilo, piridinilo, naftilo, tetrahidronaftilo, y similares, cuya cadena lateral hidrófoba puede estar sustituida con sustituyentes hidrófobos tales como halógeno (preferiblemente cloro), trifluorometilo, alquilo inferior (por ejemplo metilo o etilo), alcoxi inferior (por ejemplo metoxi), feniloxi, benciloxi, y similares.
El término cicloalquilo C_{3}-C_{6} representa ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.
Tetrazol, oxazol, tiazol y benzotiazol tienen las siguientes fórmulas, respectivamente:
2
En la invención también se incluyen los profármacos de los compuestos de la fórmula general, que tras la administración son metabolizados en compuestos activos. Los profármacos adecuados son derivados protegidos con N-alcoxicarbonilo (preferiblemente N-etoxicarbonilo) de la fórmula general.
Utilizado aquí el término farmacéuticamente aceptable hace referencia a las sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto de origen y preferiblemente no confieren efectos tóxicos no deseados. Los ejemplos de tales sales son las sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, y similares. También se pueden formar sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tánico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutámico, y similares. Se pueden formar sales con cationes metálicos polivalentes tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel y similares, o con un catión orgánico formado a partir de N,N'-dibenciletilendiamina o etilendiamina, o combinaciones de los mismos (v.g. una sal tanato de cinc).
Los compuestos de esta invención poseen uno o más átomos de carbono quirales, y por lo tanto pueden ser obtenidos en forma de un enantiómero puro, o en forma de una mezcla de enantiómeros, o en forma de una mezcla que contenga diastereoisómeros. Los métodos para obtener los enantiómeros puros son bien conocidos en la técnica, v.g. cristalización de sales que son obtenidas a partir de ácidos ópticamente activos y la mezcla racémica, o cromatografía utilizando columnas quirales. Para los diastereoisómeros se pueden utilizar columnas de fase directa o de fase reversa.
En la invención se incluye adicionalmente un procedimiento para preparar un compuesto de la fórmula, incluyendo el procedimiento el acoplamiento de los aminoácidos o los análogos de aminoácidos adecuadamente protegidos, seguido de la eliminación de los grupos protectores.
Los compuestos según la fórmula general se pueden preparar de una manera convencional para tales compuestos. En este punto, se activan derivados aminoácido adecuadamente protegidos en N\alpha (y protegidos en la cadena lateral si se encuentran presentes cadenas laterales reactivas) o péptidos y se acoplan a derivados aminoácido o péptidos con el grupo carboxilo adecuadamente protegido ya sea en solución o sobre un soporte sólido. La protección de las funciones \alpha-amino tiene lugar generalmente por medio de funciones uretano tales como los grupos t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z) y los análogos sustituidos de grupo ácido lábil o el grupo 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc) de grupo alcalino lábil. El grupo Z también puede ser eliminado mediante hidrogenación catalítica. Entre otros grupos protectores adecuados se incluyen Nps, Bmv, Bpoc, Aloc, MSC, etc. Se proporciona una buena visión de conjunto de los grupos protectores de amino en The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3 E. Gross y J. Meienhofer, Eds., (Academic Press, Nueva York, 1.981). La protección de los grupos carboxilo puede tener lugar mediante formación de un éster v.g. ésteres lábiles mediante álcalis como metilo o etilo, ésteres lábiles mediante ácidos como t-butilo, o ésteres hidrogenolíticamente lábiles como bencilo. La protección de las funciones de la cadena lateral como las de lisina puede tener lugar utilizando los grupos anteriormente mencionados. La activación del grupo carboxilo de los aminoácidos o péptidos adecuadamente protegidos puede tener lugar mediante el método de la azida, el anhídrido mixto, el éster activo, o la carbodiimida, especialmente con la adición de compuestos catalíticos y supresores de la racemización como 1-hidroxibenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina, N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida. Asimismo se pueden utilizar los anhídridos de ácidos con una base de fósforo. Ver, v.g. The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, supra y Pure and Applied Chem. 59(3), 331-344 (1.987).
También es posible preparar los compuestos mediante el método en fase sólida de Merrifield. Se conocen diferentes soportes sólidos y diferentes estrategias ver, v.g. Barany y Merrifield en The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2, E. Gross y J. Meienhofer, Eds., (Acad. Pres, N.Y., 1.980), Kneib-Cordonier y Mullen Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1.987) y Fields y Noble Int. J. Peptide Protein Res., 35, 161-214 (1.990).
La eliminación de los grupos protectores, y, en el caso de la síntesis peptídica en fase sólida, la escisión del soporte sólido, puede tener lugar de diferentes maneras, dependiendo de la naturaleza de los grupos protectores y del tipo de conector al soporte sólido. Normalmente la desprotección tiene lugar en condiciones ácidas y en presencia de captadores. Ver, v.g. los volúmenes 3, 5 y 9 e la serie de The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, supra.
Otra posibilidad es la aplicación de enzimas en la síntesis de semejantes compuestos; para las revisiones ver v.g. H.D. Jakubke en The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9, S. Udenfriend y J. Meienhofer, Eds., (Acad. Press, N.Y., 1.987).
Como quiera que se elaboren, los compuestos son útiles para la fabricación de medicamentos que tienen uso en el tratamiento de estados de enfermedad que implican una coagulación de sangre no deseada. En semejante caso el compuesto concreto sintetizado se asociará típicamente con un portador farmacéutico. Los portadores farmacéuticos pueden variar de algo tan relativamente simple como agua esterilizada para inyectables a algo tan relativamente complicado como microesferas e implantes biodegradables.
En cuanto a los medicamentos, los compuestos son administrados preferiblemente oralmente, subcutáneamente, tópicamente, intranasalmente, intravenosamente, intramuscularmente o localmente (v.g. vía implante). También es posible la administración de depósito.
La dosis exacta y el régimen de administración de estos compuestos y composiciones dependerán necesariamente de las necesidades del sujeto individual al que se está administrando el medicamento, el grado de aflicción o necesidad, y por supuesto, del criterio del médico. En general la administración parenteral requiere dosis más bajas que los otros métodos de administración que dependen más de la absorción. Sin embargo ilustrativamente, las dosis están en el intervalo de 0,001-100 mg por kg de peso corporal, preferiblemente 0,01-10 mg por kg de peso corporal.
El medicamento fabricado con los compuestos también puede ser utilizado como coadyuvante en la terapia anticoagulante aguda. En tal caso, el medicamento es administrado con otros componentes útiles en el tratamiento de semejantes estados de enfermedad.
Los compuestos también pueden ser utilizados con dispositivos farmacéuticos implantables tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos 4.767.628. En ese caso el dispositivo contendrá cantidades suficientes de compuesto para liberar lentamente el compuesto (v.g. durante más de un mes).
Los métodos para elaborar medicamentos que puedan ser adaptados para que contengan el compuesto para la administración entérica o parenteral se describen en la referencia normalizada, Gennaro y col., Remington's Pharmaceutical Sciences, (18ª ed., Mack Publishing Company, 1.990, ver especialmente la Parte 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture), páginas 1519 a 1580. Mezclados con coadyuvantes farmacéuticamente adecuados, los compuestos pueden ser comprimidos en unidades de dosificación sólidas, tales como píldoras, tabletas, o ser elaborados en cápsulas o supositorios. Por medio de líquidos farmacéuticamente adecuados los compuestos también pueden ser aplicados en forma de solución, suspensión, emulsión, v.g. para su uso en una preparación inyectable, o en forma de pulverización, v.g. para su uso como pulverización nasal.
Para elaborar unidades de dosificación, v.g. tabletas, se contempla el uso de aditivos convencionales tales como cargas, colorantes, aglutinantes poliméricos y similares. En general se puede utilizar cualquier aditivo farmacéuticamente aceptable que no interfiera en la función de los compuestos activos. Entre los portadores adecuados con los que se pueden administrar las composiciones se incluyen lactosa, almidón, derivados de celulosa y similares, o mezclas de los mismos, utilizados en cantidades adecuadas.
La invención se explica adicionalmente mediante la referencia a los siguientes Ejemplos ilustrativos.
Ejemplo 1 3,3-Difenilpropionil-Pro-Lys-(2-tiazolilo) 3,3-Difenilpropionil-prolil-metiléster
A una solución fría (0ºC) de ácido 3,3-difenilpropiónico (5,0 g) en acetato de etilo (100 ml) se añadieron sucesivamente DCCI (1,3-diciclohexil-carbodiimida, 5,03 g), HOBT (hidrato de 1-hidroxibenzotriazol, 3,28 g), H-Pro-OMe.HCl (3,66 g) y trietilamina (3,1 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1 hora y después se mantuvo a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a -20ºC y la DCU (1,3-diciclohexilurea) se eliminó mediante filtración. El producto filtrado se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua, hidrogenosulfato de potasio al 5% y cloruro de sodio acuoso saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/-acetato de etilo; 9/1 v/v) para rendir 5,68 g de 3,3-difenilpropionil-prolilmetiléster en forma de un polvo cristalino. TLC: R_{f} = 0,75, gel de sílice, diclorometano/acetato de etilo = 7/3 v/v.
3,3-Difenilpropionil-prolil-OH
Se trató 3,3-difenilpropionil-prolil-metiléster (6,5 g) disuelto en dioxano/agua, 7/3 v/v (60 ml) con una solución de hidróxido de sodio 4 M (6,2 ml) en porciones a lo largo de 30 minutos a la temperatura ambiente, manteniendo el pH a 10-10,5. Al cabo de 30 minutos la mezcla de reacción se diluyó con agua (60 ml), se añadió una solución de ácido clorhídrico 4 M hasta un pH de 2,0 y la capa de agua se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, cloruro de sodio acuoso saturado y se secaron sobre sulfato de sodio y el disolvente se eliminó mediante evaporación rindiendo 3,3-difenilpropionil-prolil-OH en forma de jarabe (5,18 g). TLC: R_{f} = 0,65, gel de sílice, EPAW (acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua) 63/20/6/11 v/v/v/v.
Boc-Lys(CBz)-NMeOMe
Se suspendió Boc-Lys(CBz)-OH.DCHA (10 g) en diclorometano (200 ml). La suspensión se lavó con solución de ácido clorhídrico 0,1 N dos veces. Se añadieron tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (6,0 g) y O,N-dimetil-hidroxilamina-ácido clorhídrico (1,82 g) a la fase orgánica resultante y el pH se ajustó a pH 8 añadiendo trietilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla se lavó sucesivamente con una solución de ácido clorhídrico 2 N fría, agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5%, y agua. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/metanol; 5/5 v/v) para rendir Boc-Lys(Cbz)-NMeOMe (7,2 g). TLC: R_{f} = 0,55, gel de sílice, diclorometano/metanol 95/5 v/v.
Boc-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
A una solución fría (-78ºC) agitada de n-butil litio (63,9 mmoles) en éter dietílico (58 ml), se añadió gota a gota una solución de 2-bromotiazol (10,5 g) en éter dietílico (30 ml). La solución se agitó a -78ºC durante 30 minutos, después de lo cual se añadió lentamente una solución de Boc-Lys(Cbz)-NMeOMe (8,2 g) en THF seco (tetrahidrofurano, 75 ml). La mezcla se agitó a -78ºC durante 1 hora, después e añadió hidrogenocarbonato de sodio acuoso al 5%. Se dejó que la mezcla se calentara a la temperatura ambiente y se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo con éter dietílico. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano; 3/1 v/v) para rendir Boc-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (8,6 g). TLC: R_{f} = 0,77, gel de sílice, acetato de etilo/heptano = 3/1 v/v.
H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA
Se disolvió Boc-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (500 mg) en TFA (ácido trifluoroacético)diclorometano al 50% (5 ml) y se agitó a la temperatura ambiente durante 1 hora. El H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA se aisló con un rendimiento cuantitativo tras la eliminación del disolvente por evaporación, y se utilizó inmediatamente en la siguiente etapa. TLC: R_{f} = 0,25, gel de sílice, EPAW = 63/20/6/1 v/v/v/v.
3,3-Difenilpropionil-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
A una solución fría (0ºC) de 3,3-difenilpropionil-prolil-OH (385 mg) en dimetilformamida (5 ml) se añadieron sucesivamente DCCI (270 mg), HOBt (176 mg), H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (515 mg) y N-metilmorfolina (0,28 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1 hora y después se mantuvo durante la noche a la temperatura ambiente. La mezcla se enfrió a -20ºC y se eliminó la DCU mediante filtración. El producto filtrado se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato de sodio acuoso al 5%, agua, hidrogenosulfato de potasio acuoso al 5% y cloruro de sodio acuoso saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano; 4/1 v/v) para rendir 3,3-difenilpropionil-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (332 mg). TLC: R_{f} = 0,40, gel de sílice, acetato de etilo/heptano = 3/1 v/v.
3,3-Difenilpropionil-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se trató 3,3-difenilpropionil-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (320 mg) con TFA/anisol 10/1 v/v (3,3 ml) durante 3 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua. La fase acuosa se lavo extensivamente con éter dietílico.
La capa acuosa, que contenía 3,3-difenilpropionil-Pro-Lys-(2-tiazolilo) se cargó directamente sobre una columna Supelcosil LC-18-DB de HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 60%/C al 20% a A al 20%/C al 80% a lo largo de 45 minutos, a una velocidad de flujo de 20 ml/minuto. (A: tampón fosfato de sodio 0,5 M pH 2,1, B: agua, C: acetonitrilo/agua; 3/2 v/v).
Rendimiento: 47 mg de 3,3-difenilpropionil-Pro-Lys-(2-tiazolilo). TLC: R_{f} = 0,57, gel de sílice, EPAW = 63/20/6/
11 v/v/v/v. R_{t} (LC): 32,9 min. A al 20%/B al 60%/C al 20% a A al 20%/B al 0%/C al 80% en 40 min.
Ejemplo 2
De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1 se prepararon:
(a). H-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 25,67 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(b). H-D-1-Tiq-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 23,40 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(Tiq = tetrahidroisoquinolina)
(c). H-D-(p-Cl)-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 30,47 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(d). Indanoglicil-(N-ciclopropil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo) (comparativo)
R_{t} (LC): 27,88 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(e). H-D-Phe(N-ciclopentil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 31,07 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(f). Acetil-D-Phe(N-ciclopropil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 33,73 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(g). H-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 30,59 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(Cha = ciclohexilalanina)
(h). H-D-Phe(N-ciclopropil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 5,1 min. isocrático; MeOH/fosfato 25 mM pH = 7 55/45.
(i). 3,3-difenilpropionil-(N-ciclopropil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 8,1 min. isocrático; MeOH/fosfato 25 mM pH = 7 75/25.
(j). H-D-Phe-(N-ciclobutil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 30,59 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(k). H-Atc-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 27,79 + 28,04 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(Atc = ácido aminotetralin-2-carboxílico)
(l). H-D-Phe-(N-bencil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 16,99 min. A al 20%/B al 60%/C al 20% a A al 20%/B al 0%/C al 80% en 40 min.
(m). H-D-Cha-(N-ciclopropil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 30,84 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(n). p-cloro-3-fenilpropionil-(N-ciclopentil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 36,15 min. A al 20%/B al 60%/C al 20% a A al 20%/B al 0%/C al 80% en 40 min.
(o). (N-bencil)-Gly-(N-ciclopentil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 28,14 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/C al 80% en 40 min.
Ejemplo 3 HOOC-CH_{2}-D-Cha-(N-ciclopentil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo) N-Ciclopentil-Gly-OMe
A una solución de 23,2 g de H-Gly-OMe-HCl en 200 ml de metanol se añadieron 15,6 g de ciclopentanona. La mezcla se agitó durante 15 minutos y se añadieron 7 g de cianoborohidruro de sodio. El pH se ajustó a 6. La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a la temperatura ambiente. Para completar la reacción se añadió 1 g de ciclopentanona y se continuó agitando. La reacción se controló mediante TLC. Cuando toda la sustancia de partida hubo desaparecido, la mezcla se aciduló a pH 2 y se agitó durante 30 minutos. El disolvente se eliminó y el residuo se diluyó con agua. La solución se lavó con éter, el pH se ajustó a 12 con hidróxido de sodio 6N y se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a vacío para rendir 16 g de un aceite.
R_{f} = 0,46 en acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
N-(t-butiloxicarbonil-metil)-D-Cha-OMe
A una solución agitada de 26 g de H-D-Cha-OMe.HCl en 300 ml de acetonitrilo se añadieron 17 g de bromoacetato de t-butilo. El pH de la reacción se ajustó a 8,5 con diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 16 horas a la temperatura ambiente y se evaporó a vacío. El residuo se disolvió en diclorometano y la solución se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a vacío. La cromatografía sobre gel de sílice en hexano/acetato de etilo 9:1 v/v dio 20 g del producto del título.
R_{f} = 0,46 en acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 15,75/5/1,5/2,75 v/v/v/v sobre sílice.
N,N-Boc.(t-butiloxicarbonil-metil)-D-Cha-OMe
El pH de una solución de 20 g de N-(t-butiloxi-metil)-D-Cha-OMe y 17 g de dicarbonato de di-t-butilo se ajustó a pH 8,5 con diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 16 horas a la temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a vacío. Al residuo se añadieron diclorometano y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con cloruro de hidrógeno 1N frío, agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5% y agua. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y el producto filtrado se evaporó hasta un sólido amorfo con un rendimiento de 28 g.
R_{f} = 0,60 en acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 252/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
N,N-Boc.(t-butiloxicarbonil-metil)-D-Cha-OH
Una solución de 28 g de N,N-Boc.(t-butilcarbonil-metil)-D-Cha-OMe en 420 ml de dioxano:agua 9/1 se trató con suficiente hidróxido de sodio 1N para mantener el pH a 13 durante 90 minutos a la temperatura ambiente. Tras la acidulación, la mezcla se vertió en agua y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio. El producto filtrado se evaporó y rindió 24 g del compuesto del título.
R_{f} = 0,23 en diclorometano/metanol 9/1 v/v sobre sílice.
N,N-Boc.(t-butiloxicarbonil-metil)-D-Cha-(N-ciclopentil)-Gly-OMe
A una solución de 24 g de N,N-Boc.(t-butiloxi-carbonil-metil)-D-Cha-OH en 300 ml de N,N-dimetilformamida se añadieron 10,2 g de N-ciclopentil-Gly-OMe y 21,2 g de tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU).
El pH de la mezcla se ajustó a 8,5. La mezcla se agitó durante la noche a la temperatura ambiente y se concentró por evaporación. Se añadieron agua y acetato de etilo al residuo. La capa orgánica se separó y se lavó con cloruro de hidrógeno 1N, agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5% y agua y se secó sobre sulfato de sodio. El producto filtrado se evaporó y el residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice en hexano:acetato de etilo 8:2 como eluyente. Rendimiento: 17 g.
R_{f} = 0,57 en hexano/acetato de etilo 7/3 v/v sobre sílice.
N,N-Boc.(t-butiloxicarbonil-metil)-D-Cha-(N-ciclopentil)-Gly-OH
Utilizando el mismo procedimiento que para N,N-Boc.(t-butiloxicarbonil-metil) -D-Cha-OH, se saponificaron 17 g de N,N-Boc.(t-butiloxicarbonil-metil) -D-Cha-(N-ciclopentil)-Gly-OMe y rindieron 15 g de un sólido amorfo. La cromatografía sobre gel de sílice con diclorometano/metanol 95/5 v/v como eluyente dio 13 g del compuesto del título.
R_{f} = 0,30 en cloruro de metileno/metanol 9/1 v/v sobre sílice.
HOOC-CH_{2}-D-Cha-(N-ciclopentil)-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
Utilizando N,N-Boc.(t-butiloxicarbonil-metil)-D-Cha-(N-ciclopentil)-Gly-OH en procedimientos similares a los descritos para el Ejemplo 1, se preparó este compuesto.
R_{t} (LC): 23,57 min; A al 20%, B al 60%, C al 20% a A al 20%, C al 80% en 40 min.
(a) De una manera similar a la descrita antes utilizando Prolina.HCl y HONSu (como en el Ejemplo 11) se preparó HOOC-CH_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
R_{t} (LC): 31,44 min; A al 20%, B al 80%, C al 0% a A al 20%, B al 20%, C al 60% en 40 min.
Ejemplo 4 (comparativo)
3-Fenilpropionil-Pro-Lys-\psi[COCO]-OH Boc-Lys(Cbz)-OMe
Se disolvió Boc-Lys(Cbz)-OH (25 g) en diclorometano/metanol = 9/1 v/v (500 ml). Se añadió TBTU (21,1 g) y la solución se ajustó a pH 8 mediante la adición de trietilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla se lavó sucesivamente con solución de cloruro de hidrógeno 2N fría, agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5%, y agua. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano = 1/4 v/v) para rendir Boc-Lys(Cbz)-OMe (26,7 g).
R_{f} = 0,79 gel de sílice, acetato de etilo/heptano = 3/1 v/v.
Boc-Lys(Cbz)\psi[cianoacetato]
A una solución fría (-78ºC) de Boc-Lys(Cbz)-OMe (20 g) en diclorometano seco (600 ml) se añadió gota a gota hidruro de diisobutilaluminio (127 ml de solución en hexano 1 M) a una velocidad que mantuviera la mezcla de reacción por debajo de -70ºC. La solución resultante se agitó a -78ºC durante 30 minutos. Se añadió una solución de ácido cítrico al 5% (500 ml) a la mezcla de reacción. La mezcla de las dos capas se agitó a la temperatura ambiente durante 10 minutos, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano. Las capas de diclorometano combinadas se lavaron con agua y se secaron sobre sulfato de sodio y se filtraron. La solución se colocó en nitrógeno y se enfrió sobre un baño de agua con hielo. Se añadió una solución de cianuro de sodio (24,85 g) y cloruro de benciltrietilamonio (2,89 g) en agua (500 ml). Con agitación vigorosa se añadió en porciones anhídrido acético (6 x 6 ml) a lo largo de un período de 30 minutos. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano. Las capas de diclorometano combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/acetato de etilo = 9/1 v/v) para rendir Boc-Lys(Cbz)\psi[cianoacetato] (17,2 g).
TLC: R_{f} = 0,60, gel de sílice, diclorometano/acetato de etilo = 7/3 v/v.
Boc-Lys(Cbz)\psi[CHOHCO]-OMe
Una solución de Boc-Lys(Cbz)\psi[cianoacetato] (17,2 g) en éter dietílico/metanol = 3/1 v/v (500 ml) se enfrió a -20ºC en nitrógeno, y se introdujeron 54,7 g de ácido clorhídrico gaseoso manteniendo la temperatura por debajo de -5ºC. La mezcla de reacción se mantuvo a 4ºC durante la noche. Se añadió agua (85 ml) gota a gota a la mezcla de reacción manteniendo la temperatura pro debajo de 5ºC. Después de agitar durante 4 horas a la temperatura ambiente la capa orgánica se separó y se lavó con agua. La capa acuosa se saturó con cloruro de sodio y se extrajo con sec-butano/diclorometano = 3/2 v/v. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío para dar 17,4 g de la amina bruta. El residuo se recogió en dimetilformamida (DMF, 200 ml), se añadieron anhídrido bis-(t-butílico) (8,7 g) y trietilamina hasta un pH de 8. La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó por evaporación a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó con agua y salmuera sucesivamente, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano = 1/1 v/v) para rendir Boc-Lys(Cbz)\psi[CHOHCO]-OMe (6,22 g).
TLC: R_{f} = 0,75, gel de sílice, acetato de etilo/heptano = 3/1 v/v.
3-Fenilpropionil-Pro-Lys(Cbz)\psi[CHOHCO]-OMe
Se disolvió Boc-Lys(Cbz)\psi[CHOHCO]-OMe (60 mg) en ácido trifluoroacético/diclorometano al 50% (6 ml) durante 1 hora a la temperatura ambiente. La amina bruta se aisló con un rendimiento cuantitativo tras la eliminación del disolvente por evaporación, y se utilizó inmediatamente para preparar 3-fenilpropionil-Pro-Lys(Cbz)\psi[CHOHCO]-OMe.
Se disolvió 3-fenilpropionil-Pro-OH en DMF seca (5 ml). Tras la adición de trietilamina (196 ml), la mezcla de reacción se colocó en nitrógeno y se enfrió a -15ºC. Con posterioridad se añadió cloroformiato de isobutilo (183 ml) y la mezcla se agitó durante 15 minutos a -15ºC. La amina bruta se disolvió en DMF seca (5 ml), se neutralizó utilizando trietilamina y se añadió gota a gota a la solución del anhídrido mixto fría. La reacción se agitó durante 1 hora a -15ºC y después se mantuvo a 0ºC durante la noche. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente:diclorometano/metanol = 95/5 v/v) para rendir 3-fenilpropionil-Pro-Lys(Cbz)\psi[CHOHCO]-OMe (246 mg).
TLC: R_{f} = 0,92, gel de sílice, EPAW = 63/20/6/11 v/v/v/v.
3-Fenilpropionil-Pro-Lys\psi[CHOHCO]-OMe
A una solución de 3-fenilpropionil-Pro-Lys(Cbz)\psi[CHOHCO]-OMe (240 mg) en metanol (5 ml) se añadió paladio sobre carbono al 10% (50 mg) y 216 ml de solución de cloruro de hidrógeno 2N. La mezcla se hidrogenó a la presión atmosférica y a la temperatura ambiente durante 1 hora. El catalizador de paladio se eliminó mediante filtración y el disolvente se eliminó por evaporación a presión reducida rindiendo 3-fenilpropionil-Pro-Lys\psi[CHOHCO]-OMe cuantitativamente.
TLC: R_{f} = 0,13, gel de sílice, diclorometano/metanol = 9/1 v/v.
3-Fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe
A una solución de fenilpropionil-Pro-Lys\psi[CHOHCO]-OMe (196 mg) en DMF seca (5 ml) se añadió anhídrido bis(t-butílico) (102 mg) y el pH se ajustó a pH 8,5 añadiendo trietilamina. La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se evaporó a vacío y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 98/2 v/v para rendir 3-fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe (189 mg).
TLC: R_{f} = 0,43, gel de sílice, diclorometano/metanol = 9/1 v/v.
3-Fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OH
Se disolvió fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe (185 mg) en dioxano/agua = 7/3 (5 ml) y se trató con solución de hidróxido de sodio 2 M (267 ml) en porciones a lo largo de 30 minutos a la temperatura ambiente, manteniendo el pH a 10 - 10,5. Al cabo de 30 minutos la mezcla de reacción se diluyó con agua (20 ml), se añadió cloruro de hidrógeno 2 M hasta un pH de 2,0 y la capa de agua se extrajo con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (50 ml), salmuera (50 ml) y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a vacío para rendir 3-fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OH (228 mg).
TLC: R_{f} = 0,60, gel de sílice, EPAW = 63/20/6/11 v/v/v/v.
3-Fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[COCO]-OH
A una solución de fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OH (220 mg) en diclorometano seco (5 ml) se añadieron 255 mg de peryodinano (reactivo de Dess-Martin). Al cabo de 1 hora de agitación a la temperatura ambiente, se añadió una solución de tiosulfato de sodio al 2% (15 ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. La capa orgánica se separó, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío para dar 3-fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[COCO]-OH-cetoácido (411 mg).
TLC: R_{f} = 0,47, gel de sílice, EPAW = 63/20/6/11 v/v/v/v.
3-Fenilpropionil-Pro-Lys\psi[COCO]-OH
Se trató 3-fenilpropionil-Pro-Lys(Boc)\psi[COCO]-OH (411 mg) con ácido trifluoroacético/agua al 90% durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua y se cargó directamente en una columna Supelcosil LC-18-DB de HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 70%/C al 10% a A al 20%/B al 0%/C al 80% a lo largo de 45 minutos, a una velocidad de flujo de 20 ml/minuto. (A: tampón fosfato 0,5 M pH 2,1, B: agua, C: acetonitrilo/agua; 3/2). Rendimiento: 71 mg de 3-fenilpropionil-Pro-Lys\psi[COCO]-OH.
R_{t} (LC): 24,9 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
De una manera similar a la descrita antes se prepararon:
(a). 3,3-Difenilpropionil-Pro-Lys\psi[COCO]-OH
R_{t} (LC): 36,42 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(b). 3-Fenilpropionil-(N-ciclopentil)-Gly-Lys\psi[COCO]-OH
R_{t} (LC): 34,29 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(c). 3-[(p-Cl)-fenil]propionil-(N-ciclopentil)-Gly-Lys\psi[COCO]-OH
R_{t} (LC): 39,52 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(d). 3-[(p-Cl)-fenil]propionil-Pro-Lys\psi[COCO]-OH
R_{t} (LC): 31,31 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
(e). Naftilsulfonil-Asp-Pro-Lys\psi[COCO]-OH
R_{t} (LC): 30,45 min. A al 20%/B al 80%/C al 0% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 5 H-D-Cha-Pro-Lys-(2-benzotiazolilo) Boc-Lys(Cbz)-\psi[CHOH]-(2-benzotiazolilo)
A una solución fría (-78ºC) de Boc-Lys(Cbz)-OMe (1 g) en diclorometano (25 ml) se añadió gota a gota hidruro de diisobutilaluminio (DiBAL-H, 7,6 ml de una solución en hexano 1 M) con lo que la temperatura de reacción se mantuvo por debajo de -70ºC. La solución resultante se agitó a -78ºC durante 30 minutos. A la mezcla de reacción se añadió una solución de ácido cítrico al 5%. La mezcla de dos capas se agitó a la temperatura ambiente durante 10 minutos, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo dos veces con diclorometano. Las capas de diclorometano combinadas se lavaron con agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y se secaron sobre sulfato de sodio y se filtraron. La solución se colocó en nitrógeno y se añadió 2-(trimetilsilil)-benzotiazol (0,79 g) y la mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a la temperatura ambiente. Tras evaporar hasta sequedad el residuo se disolvió en tetrahidrofurano seco (15 ml) y se añadió fluoruro de amonio (3,8 ml de una solución en THF 1 M). La mezcla se agitó durante 2 horas a la temperatura ambiente y se añadió agua. El producto se extrajo con diclorometano y se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/acetato de etilo; 9/1 v/v) para rendir 724 mg de Boc-Lys(Cbz)-\psi[CHOH]-(2-benzotiazolilo).
TLC: R_{f} = 0,35, gel de sílice, diclorometano/acetato de etilo = 7/3 v/v.
Boc-Lys(Cbz)-(2-benzotiazolilo)
A una solución de Boc-Lys(Cbz)-\psi[CHOH]-(2-benzotiazolilo) (700 mg) en diclorometano seco (10 ml) se añadió 1 g de peryodinano (reactivo de Dess-Martin). Tras agitar durante 1 hora a la temperatura ambiente, se añadió solución de tiosulfato de sodio al 2% y la mezcla se agitó durante otros 30 minutos a la temperatura ambiente. La capa orgánica se separó, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano; 3/1 v/v) para rendir 193 mg de Boc-Lys(Cbz)-(2-benzotiazolilo).
TLC: R_{f} = 0,85, gel de sílice, acetato de etilo/heptano = 3/1 v/v.
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Boc-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-benzotiazolilo)
Se disolvió Boc-Lys(Cbz)-(2-benzotiazolilo) (193 mg) en TFA/diclorometano al 50% (2 ml) y se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente. La amina bruta se aisló con un rendimiento cuantitativo tras la eliminación del disolvente por evaporación, y se utilizó inmediatamente para preparar Boc-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-benzotiazolilo). Se disolvió Boc-D-Cha-Pro-OH en dimetilformamida seca (4 ml). Tras la adición de diisopropiletilamina (DIPEA, 66 ml), la mezcla de reacción se colocó en nitrógeno y se enfrió a -15ºC. La amina bruta se disolvió en DMF seca (4 ml), se neutralizó utilizando diisopropiletilamina y se añadió gota a gota a la solución del anhídrido mixto fría. La reacción se agitó durante 1 hora a -15ºC y después se mantuvo a 0ºC durante la noche. La mezcla se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano; 1/1 v/v) para rendir Boc-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-benzotiazolilo) (191 mg).
TLC: R_{f} = 0,66, gel de sílice, acetato de etilo/heptano = 3/1 v/v.
H-D-Cha-Pro-Lys-(2-benzotiazolilo)
Se trató Boc-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-benzotiazolilo) con ácido trifluoroacético/tioanisol 10/1 v/v (2,2 ml) durante 3,5 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua. La fase acuosa se lavó extensivamente con éter dietílico. La capa acuosa, conteniendo H-D-Cha-Pro-Lys-(2-benzotiazolilo) se cargó directamente columna Supelcosil LC-18-DB de HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% a lo largo de 45 minutos, a una velocidad de flujo de 20 ml/minuto. (A: tampón fosfato de sodio 0,5 M pH 2,1, B: agua, C: acetonitrilo/agua; 3/2 v/v). Rendimiento: 98 mg de H-D-Cha-Pro-Lys-(2-benzotiazolilo).
R_{t} (LC): 42 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 6 (Comparativo)
H-D-Cha-Pro-Lys-(2-tetrazolilo) Boc-Lys(Cbz)\psi(CHOAc)-(2-tetrazolilo)
A una solución de Boc-Lys(Cbz)\psi(CHOAc)-[2-cianoaectato] (5,4 g) en 39 ml de dimetilformamida se añadieron 801 mg de cloruro de amonio y 975 mg de azida de sodio. La mezcla de reacción se calentó a 80ºC y se agitó en nitrógeno durante 48 horas. La sal precipitada se separó por filtración y la solución se evaporó a presión reducida hasta sequedad. Esto rindió 4,9 g del compuesto deseado.
TLC: R_{f} = 0,42, gel de sílice, tolueno/etanol = 6/4 v/v.
Boc-Lys(Cbz)\psi(CHOH)-(2-tetrazolilo)
Se disolvió Boc-Lys(Cbz)\psi(CHOAc)-(2-tetrazolilo) en 60 ml de dioxano/agua 7/3 y se añadieron 2,65 ml de solución de hidróxido de sodio 2N. La solución se agitó a la temperatura ambiente durante 2,5 horas después de lo cual la reacción parecía haberse completado. El pH se ajustó a 5 y la mezcla resultante se evaporó hasta sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en metanol/diclorometano 1/1 y la sal insoluble se separó por filtración. Esto dio como resultado 1,27 g del producto desacetilado.
TLC: R_{f} = 0,40, gel de sílice, tolueno/etanol = 6/4 v/v.
Boc-Lys(Cbz)-(2-tetrazolilo)
A una solución de 0,56 g de Boc-Lys(Cbz)\psi(CHOH)-(2-tetrazolilo) en 37 ml de diclorometano seco, se añadieron 1,38 g de reactivo peryodinano de Dess-Martin. La mezcla se agitó a la temperatura durante 30 minutos después de lo cual la reacción se sofocó con una solución de tiosulfato de sodio en agua al 10%. La capa orgánica se extrajo con agua e hidrogenocarbonato de sodio (5% en agua). Las capas acuosas se combinaron y se extrajeron con 1-butanol. La capa de 1-butanol se evaporó hasta sequedad a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía sobre una columna de gel de sílice utilizando el eluyente: acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua = 263/20/6/11 v/v/v/v.
H-Lys(Cbz)-(2-tetrazolilo).TFA
Se disolvió Boc-Lys(Cbz)-(2-tetrazolilo) (0,21 g) en 16 ml de ácido trifluoroacético/agua 9/1. La mezcla se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente después de lo cual la solución se concentró a vacío para rendir un aceite. Rendimiento: 0,34 g, utilizados inmediatamente para preparar el tripéptido Boc-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tetrazolilo).
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Boc-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tetrazolilo)
Se preparó Boc-D-Cha-Pro-OH (0,19 g) según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para el radical dipeptídico. El acoplamiento a H-Lys(Cbz)-(2-tetrazolilo) (0,17 g) se realizó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 5. La purificación sobre gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua = 163/20/6/11 v/v/v/v) rindió 0,21 g del compuesto deseado.
TLC: R_{f} = 0,17, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua = 63/20/6/11 v/v/v/v.
H-D-Cha-Pro-Lys-(2-tetrazolilo)
La eliminación de los grupos protectores y la purificación mediante HPLC se realizaron mediante un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 5. Rendimiento: 20 mg.
R_{t} (LC): 23,3 min. y 24,5 min. A al 20%/B al 80%a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 7 (comparativo)
HOOC-CH_{2}-CO-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo) H-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA
Se preparó Boc-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) según el procedimiento descrito para el Ejemplo 5. Se disolvieron 0,30 g de este tripéptido en 3 ml de ácido trifluoroacético/diclorometano 1/1 y la solución se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente. La solución se evaporó hasta sequedad a presión reducida y se evaporó simultáneamente tres veces con tolueno. Rendimiento: cuantitativo, aceite, utilizado inmediatamente para la siguiente etapa.
TLC: R_{f} = 0,30, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua = 163/20/6/11 v/v/v/v.
(t-Butil-OOC-CH_{2}-CO)-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se disolvió H-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (0,33 g) en 3 ml de diclorometano seco y se añadieron 76 mg de malonato de mono-t-butilo y el pH se ajustó a aproximadamente 8 con trietilamina. A continuación, se añadió benzotriazoliloxitris(dimetilamino)-tetrafluoro-fosfato de fosfonio (211 mg) y la mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 2 horas y a 4ºC durante las siguientes 16 horas. La solución se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo y se lavó tres veces con agua y salmuera. La capa orgánica se concentró de nuevo a vacío tras haber sido secada sobre sulfato de magnesio. El residuo se sometió a cromatografía sobre sílice utilizando heptano/acetato de etilo 2/8 v/v como eluyente. Esto rindió 270 mg del tripéptido acetilado.
TLC: R_{f} = 0,21, gel de sílice, heptano/acetato de etilo = 8/2 v/v.
HOOC-CH_{2}-CO-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
La eliminación de los grupos protectores y la purificación mediante HPLC se realizaron mediante un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 5.
Rendimiento: 124 mg.
R_{t} (LC): 38,23 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 8 (comparativo)
HOOC-(CH_{2})_{2}-CO-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (HOOC-(CH_{2})_{2}-CO)-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se disolvió H-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (0,33 g) en 3 ml de diclorometano seco y 0,335 ml de piridina. A esta solución se añadieron 48 mg de anhídrido succínico y la solución resultante se agitó a la temperatura ambiente en nitrógeno. Al cabo de 4 horas la reacción parecía haberse completado y fue sofocada con unas pocas gotas de agua. La mezcla se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con ácido diluido, agua y salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Tras la eliminación de la sal la capa orgánica se concentró a vacío lo que produjo 32 mg de un aceite.
TLC: R_{f} = 0,37, gel de sílice, diclorometano/metanol = 9/1 v/v.
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HOOC-(CH_{2})_{2}-CO-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
La eliminación de los grupos protectores y la purificación mediante HPLC se realizaron mediante un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 5. Rendimiento: 187 mg.
R_{t} (LC): 38,31 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 9 HOOC-CH(CH_{3})-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (t-Butil-OOC-CH(CH_{3}))-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se disolvió H-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (0,33 g) en 2 ml de acetonitrilo. A continuación, se añadieron 0,50 g de t-butiléter de ácido 2-bromopropiónico seguido de 25 mg de yoduro de sodio. El pH de la solución se ajustó a 8 con diisopropiletilamina y se mantuvo a esa alcalinidad durante 12 días a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio y de nuevo se concentró. El residuo se sometió a cromatografía sobre sílice utilizando acetato de etilo/tolueno 1/1 v/v como eluyente. Rendimiento: 279 mg.
TLC: R_{f} = 0,75, gel de sílice, acetato de etilo.
HOOC-CH(CH_{3})-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
La eliminación de los grupos protectores y la purificación mediante HPLC se realizaron mediante un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 5. Rendimiento: 40 mg y 29 mg (diastereoisómeros separados).
R_{t} (LC): 30,06 min. y 34,87 min. (diastereoisómeros separados) A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 10 HOOC-(CH_{2})_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (t-Butil-OOC-(CH_{2})_{2}-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se disolvió H-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (0,21 g) en 5 ml de acetonitrilo. A continuación, se añadieron 1,84 g de t-butiléter de ácido acrílico en 3 porciones. El pH de la solución se ajustó a 8 con diisopropiletilamina y se mantuvo a esa alcalinidad durante 13 días a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio y de nuevo se concentró. El residuo se sometió a cromatografía sobre sílice utilizando acetato de etilo/tolueno 2/1 v/v como eluyente. Rendimiento: 92 mg.
TLC: R_{f} = 0,62, gel de sílice, acetato de etilo.
HOOC-(CH_{2})_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
La eliminación de los grupos protectores y la purificación mediante HPLC se realizaron mediante un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 5. Rendimiento: 40 mg.
R_{t} (LC): 32,83 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 11 (comparativo)
N-Me-D-norLeu-Pro-Lys-(2-tiazolilo) N-Me-D-norLeu-OMe.HCl
A 270 ml de metanol, enfriado a -15ºC, se añadieron 18,2 g de cloruro de tionilo. Con posterioridad, se dejó que la temperatura se elevara a -10ºC después se mantuvo constante durante 20 minutos después de lo cual se añadieron 10 g de H-D-norLeu-OH. La temperatura se incrementó lentamente y se mantuvo constante a reflujo durante 5 horas. El producto se cristalizó en metanol y éter dietílico a 4ºC y esto rindió 12,9 g.
TLC: R_{f} = 0,61, gel de sílice, n-butanol/ácido acético/agua 10/3/1 v/v/v.
\newpage
Boc-D-norLeu-OMe
Se disolvió H-D-norLeu-OMe.HCl (12,9 g) en 200 ml de metanol seco seguido de la adición de dicarbonato de di-t-butilo (15,5 g) y trietilamina (19,8 ml). La reacción se agitó durante 3 horas a la temperatura ambiente después de lo cual la mezcla se concentró a vacío. A continuación, el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con agua. El producto se sometió a cromatografía sobre sílice utilizando heptano/acetato de etilo 3/1 v/v. Rendimiento: 16,9 g.
TLC: R_{f} = 0,55, gel de sílice, heptano/acetato de etilo 3/1 v/v.
N-Me-Boc-D-norLeu-OMe
Se disolvió Boc-D-norleu-OMe (16,9 g) en 200 ml de dimetilformamida seca en nitrógeno. A continuación, se añadió yoduro de metilo (24,9 ml), se enfrió a 0ºC, se añadió hidruro de sodio (3,31 g) y la mezcla se dejó reaccionar durante 16 horas a la temperatura ambiente. La mezcla se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con cloruro de hidrógeno diluido (0,1 N), agua, hidrogenocarbonato de sodio (5%) y agua, se secó y se concentró de nuevo. Esto rindió 18,8 g de producto alquilado.
TLC: R_{f} = 0,56, gel de sílice, heptano/acetato de etilo 3/1 v/v.
N-Me-Boc-D-norLeu-OH
Se disolvió N-Me-Boc-D-norLeu-OMe (18 g) en 400 ml de dioxano/agua 9/1 v/v y el pH de la solución se ajustó a 12 con hidróxido de sodio 1N. La reacción se dejó continuar durante 2 horas, manteniendo el pH constante a 12. El procedimiento de elaboración implicaba un ajuste del pH a 2, enfriamiento sobre hielo, adición extra de agua (400 ml) y una extracción con diclorometano. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó, se filtró y se concentró a vacío. Esto rindió 18,9 g de producto que contenía algo de dioxano.
TLC: R_{f} = 0,26, gel de sílice, diclorometano/metanol 9/1 v/v.
N-Me-Boc-D-norLeu-Pro-OH
Primero se preparó el éster de N-hidroxisuccinimida partiendo de N-Me-Boc-D-norLeu-OH. Se disolvieron 18 g de este derivado en acetonitrilo (250 ml), y después se añadieron EDCI (14,5 g) y N-hidroxisuccinimida (HONSu) (8,7 g). La reacción requería 16 horas a la temperatura ambiente después de lo cual el disolvente se eliminó, el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con agua y se secó. Esto rindió 24,3 g de éster de ONSu bruto. La siguiente etapa fue disolver prolina.HCl (20,9 g) en 300 ml de dimetilformamida y 300 ml de agua y ajustar el pH a 8 con solución de hidróxido de sodio 2N. Una solución del éster de ONSu (24,3 g en 300 ml de dimetilformamida) se añadió gota a gota a esta solución manteniendo el pH constante. La reacción se completó al cabo de 5 horas, después de lo cual el disolvente orgánico se eliminó en gran parte mediante evaporación a presión reducida. Se añadió agua extra (300 ml) y el pH se ajustó a 2. El producto se extrajo con acetato de etilo y se lavó con agua. Después de secar, filtrar y concentrar se obtuvo el producto en forma de un aceite de color amarillo en 22,2 g. El producto bruto se sometió a cromatografía sobre sílice utilizando acetato de etilo/metanol 8/2 v/v como eluyente. Rendimiento: 13,2 g.
TLC: R_{f} = 0,65, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 163/20/6/1 v/v/v/v.
N-Me-D-norLeu-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se realizaron el acoplamiento del anhídrido de ácido mixto entre N-Me-Boc-D-norLeu-Pro-OH y H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA, la desprotección y la purificación según los procedimientos descritos en el Ejemplo 5. Rendimiento: 107 mg.
R_{t} (LC): 23,22 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 12 N-Me-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Todas las etapas que conducían a este tripéptido se relizaron de una manera similar a la descrita para el ejemplo 11, y partiendo de Boc-D-Cha-OH. Rendimiento: 253 mg.
R_{t} (LC): 31,82 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 13 N-Me-D-Phe-N-ciclopentil-Gly-Lys-(2-tiazolilo) N-Me-Boc-D-Phe-N-ciclopentil-Gly-OMe
Se disolvieron N-Me-Boc-D-Phe-OH (preparado según el Ejemplo 11) (26 g) y N-ciclopentil-Gly-OMe (21 g, ver el Ejemplo 3) en 300 ml de dimetilformamida. A continuación, se añadió TBTU (36 g) y el pH se ajustó a 8 con diisopropiletilamina (20 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas y después se concentró a vacío, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con hidrogenocarbonato de sodio (5%) y salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y de nuevo se concentró a vacío. Rendimiento: 24,8 g.
TLC: R_{f} = 0,62, gel de sílice, diclorometano/metanol 95/5 v/v.
N-Me-Boc-D-Phe-N-ciclopentil-Gly-OH
Se disolvió N-Me-Boc-D-Phe-N-ciclopentil-Gly-OMe (17,3 g) en 150 ml de tetrahidrofurano/agua 135/15 v/v y se añadieron 4 g de hidróxido de sodio (en agua). Al cabo de 2 horas la reacción se detuvo ajustando el pH a 2 y el producto se extrajo con diclorometano. Después de lavar con agua, secar sobre sulfato de magnesio, concentrar a vacío y cristalizar en diclorometano/éter dietílico, la reacción rindió 13,1 g.
TLC: R_{f} = 0,52, gel de sílice, diclorometano/metanol 9/1 v/v.
N-Me-D-Phe-N-ciclopentil-Gly-Lys-(2-tiazolilo)
Las siguientes etapas se realizaron según el procedimiento descrito para el Ejemplo 11. Rendimiento: 110 mg.
R_{t} (LC): 33,43 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 14 N-Me-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se preparó N-Me-Boc-D-Phe-Pro-OH según la descripción del Ejemplo 1. El acoplamiento del anhídrido de ácido mixto a H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo), la desprotección y la purificación se realizaron según el Ejemplo 5. Rendimiento: 148 mg.
R_{t} (LC): 27,22 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 15 3,3-Difenilpropionil-Pro-Lys(etoxicarbonil)-(2-tiazolilo)
Se preparó 3,3-difenilpropionil-Pro-Lys-(2-tiazolilo) como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se elaboró una solución de 20 mg de este péptido en dioxano/agua 4/1 (4 ml) y el pH se ajustó con hidróxido de sodio 1N a 12. A continuación, se añadieron 22 mg de cloroformiato de etilo y la solución se agitó durante 2 horas a la temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de magnesio, se concentró a vacío y finalmente, se liofilizó en t-butanol/agua 1/1 v/v. Rendimiento: 15 mg.
TLC: R_{f} = 0,92, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v.
Ejemplo 16 (comparativo)
HOOC-CH_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-oxazolilo) Boc-Lys(Cbz)\psi[CHOH]-(2-oxaxolilo)
A una solución de 0,975 g de Boc-Lys(Cbz)-OMe en 25 ml de diclorometano a -78ºC en atmósfera de nitrógeno se añadieron 6 ml de una solución de hidruro de diisobutilaluminio en hexano 1 M. Al cabo de 15 minutos se completó la reacción, la mezcla de reacción se vertió en 150 ml de una solución de ácido cítrico al 2% y se filtró. La capa orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó (sulfato de magnesio) y se concentró. El residuo se evaporó simultáneamente con tolueno para dar 0,92 g de Boc-Lys(Cbz)-H. Este aldehído (0,89 g) se disolvió en 1,4 ml de tolueno y se añadieron 0,90 g de 2-(trimetilsilil)oxazol (preparado según Edwards, P.d., Wolanin, D.J., Andisik D.W., y Davis W., J. Med. Chem. 38, 76 (1.995)) y se calentó a 80ºC. Al cabo de 60 horas la mezcla de reacción se concentró, el residuo se disolvió en 5 ml de tetrahidrofurano, se trató con 3 ml de solución de fluoruro de tetrabutilamonio en tetrahidrofurano 3 M y se agitó a la temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se concentró, se disolvió en acetato de etilo, se lavó con solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio al 3% y salmuera, se secó (sulfato de magnesio) y se evaporó. La purificación mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de acetato de etilo/diclorometano = 2/1 (v/v) a acetato de etilo proporcionó un aceite que fue sometido a cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de acetato de etilo/heptano = 1/1 (v/v) a acetato de etilo/heptano = 1/3 (v/v) para dar 0,22 g del compuesto del título.
TLC: R_{f} = 0,7, gel de sílice, acetato de etilo.
Boc-Lys(Cbz)-(2-oxazolilo)
A una solución de 0,22 g de Boc-Lys(Cbz)-\psi[CHOH]-(2-oxazolilo) en 10 ml de diclorometano se añadieron 0,22 g de peryodinano (reactivo de Dess-Martin). Al cabo de 1,5 horas de agitación a la temperatura ambiente se añadieron 10 ml de tiosulfato de sodio acuoso al 5% y la mezcla se agitó durante 15 minutos a la temperatura ambiente. La capa orgánica se separó, se lavó con agua, hidrogenocarbonato de sodio acuoso al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con heptano/acetato de etilo = 1/1 (v/v) rindió 162 mg del compuesto del título.
TLC: R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/acetato de etilo = 1/3 (v/v).
(tBuOOCCH_{2})(Boc)-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-oxazolilo)
Se utilizó el procedimiento descrito para el Ejemplo 5. La desprotección de 0,16 g de Boc-Lys(Cbz)-(2-oxazolilo) y el acoplamiento con 0,19 g de (tBuOOCCH_{2})(Boc)-D-Cha-Pro-OH proporcionaron 0,19 g de (tBuOOCCH_{2})(Boc)-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-oxazolilo).
TLC: R_{f} = 0,3, gel de sílice, heptano/acetato de etilo = 1/3 (v/v).
HOOCCH_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-oxazolilo)
Se utilizó el procedimiento descrito para el Ejemplo 5. 0,19 g de (tBuOOCCH_{2})(Boc)-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-oxazolilo) proporcionaron 52 mg del compuesto del título.
R_{t} (LC): 28,46 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 17 (comparativo)
EtilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys-(2-tiazolilo) Boc-L-\alpha-amino-\varepsilon-caprolactama
A una solución agitada de L-\alpha-amino-\varepsilon-caprolactama (10 g) en dioxano/agua (2/1 v/v) (30 ml) se añadió una solución de hidróxido de sodio 1N (7,8 ml) seguido de carbonato de di-t-butilo (18,8 g). La mezcla se agitó durante 16 horas a la temperatura ambiente y se concentró a vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. La sustancia bruta se trituró con hexano, se filtró y se secó a vacío para rendir Boc-L-\alpha-amino-\varepsilon-caprolactama (16 g).
TLC: R_{f} = 0,85, acetato de etilo/heptano = 1/1 (v/v).
Boc-norLeu(ciclo)Gly-OMe
Se disolvieron Boc-L-\alpha-amino-\varepsilon-caprolactama (10 g) en diclorometano (100 ml). A -20ºC se añadió lentamente una solución 1 M de bis(trimetilsilil)amiduro en THF/ciclohexano (1/1 v/v) (1 equiv.) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Con posterioridad se añadió bromoacetato de metilo (4 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas a la temperatura ambiente. Se añadió bis(trimetilsilil)amiduro en THF/ciclohexano adicional (1V¿/1 v/v) para forzar la finalización de la reacción. La mezcla se diluyó con diclorometano y se lavó con una solución de ácido clorhídrico 0,1 N, agua, hidrogenocarbonato de sodio acuoso al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: heptano/acetato de etilo 6/4 v/v para rendir Boc-norLeu(ciclo)Gly-OMe (12 g).
TLC: R_{f} = 0,55, acetato de etilo/heptano = 6/4 (v/v) sobre sílice.
EtilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-OMe
Se disolvió Boc-norLeu(ciclo)Gly-OMe (3 g) en TFA/diclorometano al 50% (30 ml) y se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó a vacío. La amina bruta se disolvió en diclorometano (30 ml) y se añadió lentamente una solución de cloruro de etanosulfonilo (1,29 g) en diclorometano (10 ml) a 0ºC. Se añadió trietilamina para mantener el pH a 8 durante la reacción. La mezcla se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente, después de lo cual la mezcla se concentró a vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con solución de hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/acetato de etilo 95/5 v/v% para rendir EtilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-OMe (1,45 g).
TLC: R_{f} = 0,30, diclorometano/acetato de etilo 9/1 (v/v) sobre sílice.
EtilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-OH
Una solución de etilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-OMe (1,45 g) en 50 ml de dioxano/agua 9/1 v/v se trató con suficiente hidróxido de sodio 1N para mantener el pH a 13 durante 2 horas a la temperatura ambiente. Tras la acidulación, la mezcla se vertió en agua y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio. El producto filtrado se evaporó y rindió 600 mg del compuesto del título.
TLC: R_{f} = 0,45, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se disolvió etilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-OH (482 mg) en dimetilformamida seca (5 ml). Tras la adición de etildiisopropilamina (0,36 ml), la mezcla de reacción se colocó en nitrógeno y se enfrió a -20ºC. Con posterioridad se añadió cloroformiato de isobutilo (140 ml) y la mezcla se agitó durante 15 minutos a -20ºC. Se disolvió H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA en dimetilformamida seca (3 ml) y se añadió gota a gota a la solución del anhídrido mixto fría, manteniendo el pH a 8,5 mediante la adición de etildiisopropilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a -20ºC. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 95/5 v/v) para rendir etilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (607 mg).
TLC: R_{f} = 0,63, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 60/3/1/1 v/v/v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys-(2-tiazolilo)
Se trató etilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (600 mg) con ácido trifluoroacético/tioanisol 10/1 v/v (10 ml) durante 4 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua. La fase acuosa se lavó extensivamente con éter dietílico. La capa acuosa se concentró a vacío, se evaporó simultáneamente con ácido clorhídrico diluido y se liofilizó en agua. El producto bruto se cargó sobre una columna Deltapack C18 RP para HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 40%/C al 40% a lo largo de 40 minutos, a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. Rendimiento: 233 mg de etilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys-(2-tiazolilo).
R_{t} (LC): 26,73 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 18 (comparativo)
BencilSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys-(2-tiazolilo)
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 17.
R_{t} (LC): 37,05 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 19 (comparativo)
7-Metoxi-2-Naftilsulfonil-norLeu(ciclo)Gly-Lys-(2-tiazolilo)
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 17.
R_{t} (LC): 26,40 min. A al 20%/B al 60%/C al 20% a C al 100% en 40 min.
Ejemplo 20 (comparativo)
(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R)-carbonil-Pro-Lys-(2-tiazolilo) Ácido 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carboxílico
El ácido 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carboxílico ha sido sintetizado como se describe en
EP0643073, Ejemplo 1.
TLC: R_{f} = 0,85, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carbonil-Pro-O-tBu
A una solución fría (0ºC) de ácido 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S) -carboxílico (500 mg) en dimetilformamida (5 ml) se añadieron sucesivamente DCCI (1,3-diciclohexilcarbodiimida, 342 mg), HPBT (hidrato de 1-hidroxibenzotriazol, 319 mg), H-Pro-OtBu (270 mg) y trietilamina (0,55 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1 hora, y después se mantuvo a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a -20ºC y la DCU (1,3-diclohexilurea) se eliminó por filtración. El producto filtrado se concentró a vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se lavó sucesivamente con solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio al 5%, solución acuosa de ácido cítrico al 3%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: heptano/acetato de etilo 4/1 v/v) para rendir 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carbonil-Pro-O-tBu) (634 mg).
TLC: R_{f} = 0,90, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carbonil-Pro-OH
Se agitó éster t-butílico de 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S) -carbonil-Pro-O-tButilo (600 mg) en una mezcla de diclorometano (1 ml), ácido trifluoroacético (3 ml), anisol (0,15 ml) durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío a baja temperatura y el residuo se disolvió en agua a pH 9,5. La fase acuosa se lavó con éter dietílico, después de lo cual la capa acuosa se aciduló a pH 2,5 mediante una solución de ácido clorhídrico 2M. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío para rendir
TLC: R_{f} = 0,54, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 60/3/1/2 v/v/v/v sobre sílice.
2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carbonil-Pro-Lys(Cbz)-(2- tiazolilo)
Se disolvió 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carbonil-Pro-OH (500 mg) en dimetilformamida seca (5 ml). Tras la adición de etildiisopropilamina (0,4 ml), la mezcla de reacción se colocó en nitrógeno y se enfrió a -20ºC. Se añadió con posterioridad cloroformiato de isobutilo (156 ml) y la mezcla se agitó durante 15 minutos a -20ºC. Se disolvió H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (594 mg) en dimetilformamida seca (3 ml) y se añadió gota a gota a la solución de anhídrido mixto fría, manteniendo el pH a 8,5 mediante la adición de etildiisopropilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a -20ºC. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 95/5 v/v %) para rendir 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carbonil-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (80 mg).
TLC: R_{f} = 0,42, acetato de etilo/heptano3/1 v/v sobre sílice.
(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R)-carbonil-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se trató (4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R,S)-carbonil-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (875 mg) con ácido trifluoroacético/anisol 10/1 (10 ml) durante 4 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua, la fase acuosa se lavó extensivamente con éter dietílico. La capa acuosa se concentró a vacío, se evaporó simultáneamente con ácido clorhídrico diluido y se liofilizó en agua. El producto bruto se cargó en una columna Deltapack C18 RP para HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 53%/C al 27% a lo largo de 40 minutos, a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. Rendimiento: 211 mg de (4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R)-carbonil-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
R_{t} (LC): 28 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 21 EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo) Boc-D-Cha-Pro-OBzl (Bzl = bencilo)
Se preparó Boc-D-Cha-Pro-OBzl de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1 utilizando Boc-D-Cha y Pro-OBzl.
TLC: R_{f} = 0,5, diclorometano/metanol 95/5 v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OBzl
Se disolvió Boc-D-Cha-Pro-OBzl (3,8 g) en TFA/diclorometano al 50% (25 ml) y se agitó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó a vacío. La amina bruta se disolvió en diclorometano (50 ml) y se añadió cloruro de etanosulfonilo (0,8 ml) a -78ºC. Se añadió trietilamina para mantener el pH a 8 durante la reacción. La mezcla se agitó durante 30 minutos a la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a vacío. El residuo se disolvió en éter dietílico y se lavó con solución de ácido clorhídrico 1N, agua, solución de hidrogenocarbonato de sodio al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. La trituración del material bruto con metanol rindió EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OBzl (3,0 g).
TLC: R_{f} = 0,6, diclorometano/metanol 95/5 v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH
A una solución de etilSO_{2}-D-Cha-Pro-OBzl (10 g) en tetrahidrofurano (250 ml) se añadió una solución de fluoruro de tetrabutilamonio en tetrahidrofurano 1 M (84 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a la temperatura ambiente y se vertió en agua (1 litro). La solución acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con una solución de ácido clorhídrico 1N y agua, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cristalización en acetato de etilo/éter diisopropílico para rendir EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH (6,0 g).
TLC: R_{f} = 0,2, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se disolvió etilSO_{2}-D-Cha-Pro-OH (397 mg) en dimetilformamida seca (3 ml). Tras la adición de etildiisopropilamina (0,19 ml), la mezcla de reacción se colocó en nitrógeno y se enfrió a -20ºC. Se disolvió H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA en dimetilformamida seca (3 ml) y se añadió gota a gota a la solución de anhídrido mixto fría, manteniendo el pH a 8,5 mediante la adición de etildiisopropilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a -20ºC y 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano 2/1 v/v) para rendir EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (575 mg).
TLC: R_{f} = 0,32, acetato de etilo/heptano 2/1 v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se trató etilSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (570 mg) con ácido trifluoroacético/anisol 10/1 (44 ml) durante 4 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua. La fase acuosa se lavó extensivamente con éter dietílico. La capa acuosa se concentró a vacío, se evaporó simultáneamente con ácido clorhídrico diluido y se liofilizó en agua. El producto bruto se cargó en una columna Deltapack C18 RP para HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 30%/C al 50% a lo largo de 40 minutos, a una velocidad de flujo de 80 ml/minuto. Rendimiento: 275 mg de etilSO_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
R_{t} (LC): 26,06 min. A al 20%/B al 60%/C al 20% a C al 100% en 40 min.
Ejemplo 22 EtilSO_{2}-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) Boc-D-Phe-Pro-OBzl
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1 utilizando Boc-D-Phe y Pro-OBzl.
TLC: R_{f} = 0,9, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 60/3/1/2 v/v/v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-D-Phe-Pro-OH
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 21 utilizando Boc-D-Phe-Pro-OBzl.
TLC: R_{f} = 0,48, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-D-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se preparó etilSO_{2}-D-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 21 utilizando etilSO_{2}-D-Phe-Pro-OH y Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).
TLC: R_{f} = 0,32, acetato de etilo/heptano 8/2 v/v sobre sílice.
EtilSO_{2}-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se trató etilSO_{2}-D-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (336 mg) con ácido trifluoroacético/tioanisol 10/1 v/v 44 ml) durante 4 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua. La fase acuosa se lavó extensivamente con éter dietílico. La capa acuosa se concentró a vacío, se evaporó simultáneamente ácido clorhídrico diluido y se liofilizó en agua. El producto bruto se cargó sobre una columna Deltapack C18 RP para HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 65%/C al 15% a A al 20%/B al 20%/C al 60% a lo largo de 40 minutos, a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto). Rendimiento: 160 mg de etilSO_{2}-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
R_{t} (LC): 38,47 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 23 (comparativo)
D-Hpl-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (Hpl = ácido 3-hexahidrofenil-láctico) H-D-Hpl-OMe
Se disolvió H-D-Cha-OH (1,0 g) en una mezcla de ácido clorhídrico 1N (4,8 ml), agua (19,4 ml) y ácido acético (9,7 ml). A 0ºC se añadió lentamente una solución de nitrito de sodio (3,4 g) en agua (5,8 ml) y la mezcla se agitó durante la noche a la temperatura ambiente. Con posterioridad se añadió ácido clorhídrico al 37%, (4,8 ml) y la mezcla se agitó durante 15 minutos a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se disolvió en éter/acetona. Tras la filtración, la solución se concentró a vacío y el material bruto se agitó en metanol (25 ml) durante 18 horas. El pH era 1,5. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: tolueno/metanol 97/3 v/v. para rendir H-D-Hpl-OMe (612 mg).
TLC: R_{f} = 0,9, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 163/20/6/11 sobre sílice.
THP-D-Hpl-OMe (THP = tetrahidropirano)
A una solución agitada de H-D-Hpl-OMe (450 mg) en diclorometano (2 ml) se añadieron 3,4-dihidro-2H-pirano (0,285 ml) y p-toluenosulfonato de piridinio (60 mg). La mezcla se agitó durante 6 horas a la temperatura ambiente y se diluyó con éter. La mezcla se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. El material bruto se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano 1/4 v/v) para rendir THP-D-Hpl-OMe (498 mg).
TLC: R_{f} = 0,64, acetato de etilo/heptano 1/2 v/v sobre sílice.
THP-D-Hpl-OH
Una solución de THP-D-Hpl-OMe (10,3 g) en dioxano/agua 9/1 (200 ml) se trató con suficiente hidróxido de sodio 1N para mantener el pH a 12 durante 8 horas a la temperatura ambiente. Tras la acidulación, la mezcla se vertió en agua (500 ml) y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio. El producto filtrado se evaporó y rindió 6,6 g del compuesto del título.
TLC: R_{f} = 0,78, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
THP-D-Hpl-Pro-OH
A una solución de THP-D-Hpl-OH (5,87 g) en acetonitrilo (75 ml) se añadieron sucesivamente EDCI (hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida) (4,84 g) y N-hidroxisuccinimida (2,9 g). La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se concentró a vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El material bruto se disolvió en dimetilformamida (100 ml) y se añadió a una solución de prolina.HCl (6,99 g) en dimetilformamida/agua, 1/1, v/v (200 ml), que se ajustó a pH 8,5 por medio de hidróxido de sodio. Después de agitar durante la noche la mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua. Esta solución acuosa se ajustó a pH 2,5 a 0ºC, seguido de extracción con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a vacío. El material bruto se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/metanol, 8/2 6/4, v/v%) para rendir THP-D-Hpl-Pro-OH (6,75 g).
TLC: R_{f} = 0,52, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 163/20/6/11 v/v/v/v sobre sílice.
THP-D-Hpl-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se disolvió THP-D-Hpl-Pro-OH (390 mg) en dimetilformamida seca (5 ml). Tras la adición de etildiisopropilamina (0,19 ml), la mezcla de reacción se colocó en nitrógeno y se enfrió a -20ºC. Con posterioridad se añadió cloroformiato de isobutilo (130 ml) y la mezcla se agitó durante 15 minutos a -20ºC. Se disolvió H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA
(1,05 eq.) en dimetilformamida seca (5 ml) y se añadió gota a gota a la solución del anhídrido mixto fría, manteniendo el pH a 8,5 mediante la adición de diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a -20ºC y 2,5 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con una solución acuosa de hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano 2/1 v/v) para rendir THP-D-Hpl-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (497 mg).
TLC: R_{f} = 0,42, acetato de etilo/heptano 2/1 v/v sobre sílice.
D-Hpl-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se trató THP-D-Hpl-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (470 mg) con ácido trifluoroacético/tioanisol 10/1 v/v (38,5 ml) durante 4 horas a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua. La fase acuosa se lavó extensivamente con éter dietílico. La capa acuosa de concentró a vacío, se evaporó simultáneamente con ácido clorhídrico diluido y se liofilizó en agua. El producto bruto se cargó en una columna Deltapack C18 RP para HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 65%/C al 15% a A al 20%/B al 20%/C al 60% a lo largo de 40 minutos, a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. Rendimiento: 75 mg de D-Hpl-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
R_{t} (LC): 40,00 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 24 HOOC-CH_{2}-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) H-D-Phe-OMe.HCl
A metanol seco y frío (-20ºC) (1 litro) se añadió gota a gota cloruro de tionilo (130 ml). Se añadió H-D-Phe-OH.HCl (147,6 g) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 30 minutos y después se mantuvo a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se concentró a vacío y se evaporó simultáneamente con metanol (3 veces). El residuo se cristalizó en metanol/éter dietílico rindiendo H-D-Phe-OMe.HCl en forma de un polvo cristalino de color blanco (187,4 g).
TLC: R_{f} = 0,54, gel de sílice, n-butanol/ácido acético/agua 10/1/3 v/v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-D-Phe-OMe
Se añadió bromoacetato de t-butilo (65 ml) a una solución agitada de H-D-Phe-OMe.HCl (62,5 g) en 400 ml de acetonitrilo. El pH de la mezcla se ajustó a 8,5 con N,N-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 16 horas a la temperatura ambiente y se evaporó a vacío. El residuo se disolvió en diclorometano y la solución se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a vacío. La cromatografía sobre gel de sílice en heptano/acetato de etilo 9/1 (v/v)dio 96,4 g de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-D-Phe-OMe.
TLC: R_{f} = 0,90, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 376/31/18/7 v/v/v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-OMe
El pH de una solución de N-(t-butiloxicarbonil-metil)-D-Phe-OMe (96,4 g) y dicarbonato de di-t-butilo (72,2 g) en N,N-dimetilformamida (400 ml) se ajustó a 8,5 con N,N-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 48 horas a la temperatura ambiente. El disolvente se evaporó a vacío. Se añadieron diclorometano y agua al residuo. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y el producto filtrado se evaporó. El residuo se sometió a cromatografía sobre sílice en tolueno/acetato de etilo 9/1 (v/v) como eluyente. Las fracciones que contenían N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-OMe fueron reunidas y evaporadas. Rendimiento: 115,3 g.
TLC: R_{f} = 0,77, gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 9/1 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-OH
Una solución de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-OMe (115,3 g) en 800 ml de dioxano/agua = 9/1 (v/v) se trató con suficiente hidróxido de sodio 2N para mantener el pH a 12 durante 16 horas a la temperatura ambiente. Tras la acidulación, la mezcla se vertió en agua y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio. El producto filtrado se evaporó y rindió 104 g de N-(t-butiloxicarbonilmetl)-N-Boc-D-Phe-OH.
TLC: R_{f} = 0,10, gel de sílice, tolueno/acetato de etilo 7/3 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-Pro-OBzl
A una solución fría (0ºC) de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-OH (5,3 g) en N,N-dimetilformamida (40 ml) se añadieron sucesivamente 1-hidroxibenzotriazol (2,8 g), diciclohexilcarbodiimida (3,2 g), H-Pro-OBzl.HCl (3,78 g) y trietilamina (2,16 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 1 hora y después se mantuvo a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se enfrió a -20ºC y la diciclohexilurea se eliminó por filtración. El producto filtrado se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua, ácido cítrico al 2% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice en heptano/acetato de etilo 6/4 (v/v) como eluyente. Las fracciones que contenían N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-Pro-OBzl se reunieron y se evaporaron. Rendimiento. 4,35 g.
TLC: R_{f} = 0,74, gel de sílice, heptano/acetato de etilo 1/1 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH
Se añadió paladio sobre carbono al 10% (450 mg) a una solución de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-Pro-OBzl (4,35 g) en metanol (50 ml). La mezcla se hidrogenó a la presión atmosférica a la temperatura ambiente durante 45 minutos. El catalizador de paladio se eliminó mediante filtración y el disolvente se eliminó mediante evaporación a presión reducida rindiendo 3,48 g de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-OH.
TLC: R_{f} = 0,63, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 664/31/18/7 v/v/v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
A una solución enfriada (-20ºC) de 375 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-OH y 276 ml de N,N-diisopropiletilamina en 10 ml de N,N-dimetilformamida, se añadieron 100 ml de cloroformiato de isobutilo. La mezcla de reacción se agitó durante otros 20 minutos a -20ºC. Se disolvió H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (362 mg) en 5 ml de N,N-dimetilformamida y se ajustó a pH 8 con N,N-diisopropiletilamina. Esta solución se añadió lentamente a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a -20ºC y después se dejó que se templara a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar 622 mg de producto bruto. La purificación en gel de sílice, utilizando diclorometano/metanol 97/3 v/v como eluyente, proporcionó 394 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).
TLC: R_{f} = 0,50, gel de sílice, diclorometano/metanol 95/5 v/v.
HOOC-CH_{2}-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
El tripéptido protegido (394 mg) se trató con ácido trifluoroacético y tioanisol según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 para proporcionar, tras la HPLC, los 206 mg de HOOC-CH_{2}-D-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
R_{t} (LC): 27,9 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 25 HOOC-CH_{2}-D-p-OCH_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se preparó HOOC-CH_{2}-D-p-OCH_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 24, partiendo de H-D-p-OCH_{3}-Phe-OH.HCl. La desprotección (ver el Ejemplo 1) de 345 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-OCH_{3}-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) dio, tras la purificación mediante HPLC, 153 mg del producto.
R_{t} (LC): 28,9 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 26 HOOC-CH_{2}-D/L-m-F-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-OH.
Según procedimientos análogos a los descritos en el Ejemplo 24, se convirtió H-D/L-m-F-Phe-OH.HCl (5 g) en N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-OH. Rendimiento: 8 g.
TLC: R_{f} = 0,65, gel de sílice, acetato de etilo/metanol 9/1 v/v.
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N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-Pro-OMe
A una solución fría (0ºC) de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-OH (7,9 g) en N,N-dimetilformamida (80 ml) se añadieron sucesivamente 1-hidroxibenzotriazol (4,0 g), diciclohexilcarbodiimida (4,5 g), H-Pro-OMe.HCl (3,6 g) y trietilamina (3,25 ml. La mezcla se agitó a 0ºC durante 1 hora y después se mantuvo a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se enfrió a -20ºC y la diciclohexilurea se eliminó por filtración. El producto filtrado se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua, ácido cítrico al 2% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se purificó sobre gel de sílice en heptano/acetato de etilo 7/3 v/v, para proporcionar 6,9 g del producto.
TLC: R_{f} = 0,65, gel de sílice, heptano/acetato de etilo 1/1 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-Pro-OH
Se trataron 6,9 g de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-Pro-OMe, disueltos en dioxano/agua 9/1 v/v (60 ml), con una solución de hidróxido de sodio 1N (13,8 ml) en porciones a lo largo de 16 horas, manteniendo el pH a 10-10,5. La mezcla de reacción se diluyó con agua con hielo y se aciduló con una solución de cloruro de hidrógeno 2N hasta pH 2. La capa acuosa se extrajo con diclorometano. A continuación, la fase orgánica se lavó con agua fría, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar 14,7 g de material bruto. La purificación sobre gel de sílice en acetato de etilo/metanol 9/1 proporcionó 5,22 g.
TLC: R_{f} = 0,20, gel de sílice, acetato de etilo/metanol 8/2 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se realizó el acoplamiento de N-(t-butiloxicarbonil-metil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-OH (601,3 mg) con H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) en las mismas condiciones descritas en el Ejemplo 24. Rendimiento: 684,3 mg.
TLC: R_{f} = 0,74, gel de sílice, diclorometano/ metanol 95/5 v/v.
HOOC-CH_{2}-D/L-m-F-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se trató N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-F-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (673,5 mg) en las mismas condiciones con ácido trifluoroacético y tioanisol como se describe en el Ejemplo 1 para proporcionar 259 mg del producto bruto tras la purificación mediante HPLC.
R_{t} (LC): 28,4 min. y 29,0 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 27 HOOC-CH_{2}-D-p-CF_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-p-CF_{3}-Phe-OH
Según procedimientos análogos a los descritos en el Ejemplo 24, se convirtió H-D/L-p-CF_{3}-Phe-OH.HCl (10, 12 g) en N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-p-CF_{3}-Phe-OH. Rendimiento: 12,23 g.
TLC: R_{f} = 0,64, gel de sílice, acetato de etilo/metanol 9/1 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-CF_{3}-Phe-Pro-OBzl
Una cantidad de 6,10 g de N-(t-butiloxicarbonil-metil)-N-Boc-D/L-p-CF_{3}-Phe-OH se acopló con H-Pro-OBzl.HCl según el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 24. Tras la elaboración, los diastereoisómeros pudieron ser separados mediante gel de sílice, utilizando heptano/acetato de etilo 75/25 v/v, para proporcionar 0,63 g de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-CF_{3}-Phe-Pro-OBzl.
TLC: R_{f} = 0,35, gel de sílice, heptano/acetato de etilo 7/3 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-CF_{3}-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se redujo N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-CF_{3}-Phe-Pro-OBzl (630 mg) y con posterioridad se acopló a H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 24. Rendimiento: 317,7 mg.
TLC: R_{f} = 0,46, gel de sílice, diclorometano/metanol 95/5 v/v.
HOOC-CH_{2}-D-p-CF_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
La eliminación de los grupos protegidos de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-CF_{3}-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (306,5 mg) se realizó utilizando el mismo método descrito en el Ejemplo 24. Tras la purificación mediante HPLC se aislaron 157 mg de producto.
R_{t} (LC): 36,7 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 28 HOOC-CH_{2}-D-p-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH
Según procedimientos análogos a los descritos en el Ejemplo 24, se convirtió H-D-p-Cl-Phe-OH.HCl (10 g) en N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH. Rendimiento: 16,7 g.
TLC: R_{f} = 0,27, gel de sílice, acetato de etilo/metanol 9/1 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-ONSu
Una solución de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH (14,67 g) en 250 ml de acetonitrilo se trató con N-hidroxisuccinimida (4,11 g) e hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI) (6,86 g) durante la noche a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para proporcionar 19,11 g de éster activo, que se utilizó directamente en la siguiente etapa.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH
Se disolvió H-Pro-OH.HCl (10,79 g) en 100 ml de N,N-dimetilformamida y 100 ml de agua. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8 con una solución de hidróxido de sodio 1N, después de lo cual se añadió gota a gota N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-ONSu (19,11 g) disuelto en 120 ml de N,N-dimetilformamida. La reacción se agitó durante la noche a la temperatura ambiente a pH 8. La mezcla de reacción se enfrió y se ajustó a pH 2 con ácido clorhídrico 1N. La capa acuosa se extrajo con diclorometano. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a vacío. La purificación en gel de sílice, utilizando un gradiente de acetato de etilo/metanol 9/1.
TLC: R_{f} = 0,24, gel de sílice, acetato de etilo/metanol 8/2 v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Según los procedimientos descritos en el Ejemplo 24, se convirtió N-(t-butiloxiarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH (369,4 mg) en el compuesto diana. Rendimiento: 249,1 mg.
TLC: R_{f} = 0,25, gel de sílice, diclorometano/metanol 97/3 v/v.
HOOC-CH_{2}-D-p-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Como se ha descrito en el Ejemplo 1, se desprotegieron 231,5 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) y se purificaron para obtener 109,8 mg del producto.
R_{t} (LC): 33,8 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 29 HOOC-CH_{2}-D-o-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se preparó HOOC-CH_{2}-D-o-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 26, partiendo de H-D/L-o-Cl-Phe-OH.HCl. Los dos diastereoisómeros se separaron en la fase del tripéptido protegido. La desprotección de 230 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-o-Cl-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo), según el método descrito en el Ejemplo 1, proporcionó 116 mg del producto tras la purificación mediante HPLC.
R_{t} (LC): 30,0 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
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Ejemplo 30 HOOC-CH_{2}-D/L-m,p-Di-F-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se preparó el compuesto del título de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 26, partiendo de H-D/L-o,p-di-Cl-Phe-OH.HCl. La eliminación de los grupos bloqueadores del tripéptido protegido (720 mg) seguida de purificación mediante HPLC, como se describe en el Ejemplo 1, proporcionaron 170 mg del producto.
R_{t} (LC): 30,7 min. y 31,1 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 31 HOOC-CH_{2}-D/L-o,p-Di-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se preparó este compuesto de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 26, partiendo de H-D/L-o,p-di-Cl-Phe-OH.HCl. La eliminación de los grupos bloqueadores del tripéptido protegido (1,07 g) seguida de purificación mediante HPLC, como se describe en el Ejemplo 1, proporcionaron 100 mg del producto.
R_{t} (LC): 35,4 min. y 36,1 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 32 HOOC-CH_{2}-D-Tyr-Pro-Lys-(2-tiazolilo) Cbz-D-Tyr(tBu)-OH
Se añadió N-benciloxicarboniloxisuccinimida (5,75 g) a una suspensión de D-Tyr(tBu)-OH (5,0 g) en N,N-dimetilformamida (40 ml). El pH de la solución se ajustó a 8 utilizando trietilamina. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a la temperatura ambiente y después se evaporó hasta sequedad a vacío. El residuo se disolvió en diclorometano y se diluyó con agua con hielo. El pH de la capa acuosa se ajustó a 2,5 con cloruro de hidrógeno 2N. La capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. Rendimiento: 9,95 g.
TLC: R_{f} = 0,31, heptano/acetato de etilo 1/1.
Cbz-D-Tyr(tBu)-OMe
Se añadió [tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio] (7,45 g) a una solución de Cbz-D-Tyr(tBu)-OH (9,95 g) en diclorometano (45) y metanol (5 ml). El pH de la mezcla se ajustó a 8 con N,N-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente y después se sofocó con hidrogenocarbonato de sodio al 5%. La fase orgánica se separó y se lavo con agua, ácido cítrico al 2% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. Rendimiento: 10,2 g.
TLC: R_{f} = 0,74, heptano/acetato de etilo 1/1.
H-D-Tyr(tBu)-OMe.HCl
Se añadió paladio sobre carbono al 10% (1,2 g) a una solución de Cbz-D-Tyr(tBu)-OMe (10,2 g) en metanol (100 ml) y cloruro de hidrógeno (5 ml). La mezcla se hidrogenó a la presión atmosférica a la temperatura ambiente durante 2 horas. El catalizador de paladio se eliminó mediante filtración. El producto filtrado se concentró hasta un pequeño volumen seguido de cristalización en éter dietílico. Rendimiento: 5,87 g.
TLC: R_{f} = 0,10, heptano/acetato de etilo 1/1.
HOOC-CH_{2}-D-Tyr-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Este compuesto se preparó de una manera similar ala descrita en el Ejemplo 24, partiendo de H-D-Tyr(tBu)-OMe.HCl. La desprotección de 586 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D-Tyr(tBu)-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo), según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1, dio 283 mg del producto, tras la purificación mediante HPLC.
R_{t} (LC): 20,9 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 33 HOOC-CH_{2}-D/L-p-CH_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) H-D/L-p-CH_{3}-Phe-OH.HCl
Una suspensión de hidruro de sodio (3,28 g, dispersión en aceite mineral al 60%) en etanol (40 ml) se añadió a una solución de a-cloro-p-xileno (10 g), acetamidomalonato de dietilo (19,3 g) y yoduro de sodio (8,55 g) en dioxano (80 ml) y etanol (20 ml). La mezcla de reacción se sometió a reflujo a 80ºC durante 90 minutos. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con hidrogenosulfato de sodio al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El producto se cristalizó en heptano para proporcionar 19,8 g del producto de condensación. Este se trató con cloruro de hidrógeno 6N (420 ml) y ácido acético (210 ml) durante la noche a 95ºC para proporcionar, tras la evaporación hasta sequedad, 21,6 g del producto.
TLC: R_{f} = 0,15, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 664/31/18/7 v/v/v/v.
HOOC-CH_{2}-D/L-p-CH_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Según los mismos métodos descritos en el Ejemplo 24, se preparó HOOC-CH_{2}-D/L-p-CH_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) partiendo de H-D/L-p-CH_{3}-Phe-OH.HCl. La eliminación de los grupos bloqueadores del tripéptido protegido (582 mg) y la purificación mediante HPLC se realizaron en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 1. Rendimiento: 120 mg.
R_{t} (LC): 31,9 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 34 HOOC-CH_{2}-D-m-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Partiendo de bromuro de 3-clorobencilo, se preparó H-D/L-m-Cl-Phe-OH.HCl como se describe en el Ejemplo 33. A continuación, el tripéptido completamente protegido se ensambló según los procedimientos descritos en el Ejemplo 26. En la etapa final se trató 1 g de N-(t-butiloxi-carbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-Cl-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) con ácido trifluoroacético y tioanisol (ver Ejemplo 1). Tras la purificación mediante HPLC se aislaron 195 mg de HOOC-CH_{2}-D-m-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
R_{t} (LC): 31,7 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 35 HOOC-CH_{2}-D-DPA-Pro-Lys-(2-tiazolilo)} (DPA = difenilalanina)
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 24, partiendo de H-D-DPA-OH.HCl. La desprotección de 570 mg de N-(t-butiloxicarbonil-metil)-N-Boc-D-DPA-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo), según los métodos descritos en el Ejemplo 1, proporcionó tras la purificación mediante HPLC 194 mg de producto final.
R_{t} (LC): 35,6 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 36 HOOC-CH_{2}-D-m-OH-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 24, partiendo de H-D/L-m-OH-Phe-OH.HCl. La función hidroxilo fenólica también se protegió con un grupo Boc durante la introducción del grupo Boc en el extremo N. La desprotección (ver el Ejemplo 1) de 1,21 g de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-OBoc-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) proporcionó tras la purificación mediante HPLC el diastereoisómero deseado. Rendimiento: 99 mg.
R_{t} (LC): 23,8 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 37 HOOC-CH_{2}-D/L-m-OCH_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) Boc-D/L-m-OH-Phe-OH
Se disolvió H-D/L-m-OH-Phe-OH.HCl (5,25 g) en dioxano (55 ml), agua (28 ml) y solución de hidróxido de sodio 1 N (29,0 ml). Se añadió dicarbonato de di-t-butilo (6,95 g) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a la temperatura ambiente a pH 9. La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml) y se extrajo con heptano. La capa acuosa se diluyó con acetato de etilo (150 ml) y se aciduló a pH 2 con cloruro de hidrógeno 1N. La fase orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a vacío. Rendimiento: 8,49 g.
TLC: R_{t} = 0,67, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 126/20/6/11 v/v/v/v.
Boc-D/L-m-OCH_{3}-Phe-OMe
Una mezcla de Boc-D/L-m-OH-Phe-OH (8,49 g), carbonato de sodio (23,9 g) y yodometano (20,3 ml) en N,N-dimetilformamida (60 ml) se agitó a 0ºC durante 48 horas. A continuación, la mezcla de reacción se vertió en agua con hielo y se aciduló a pH 2,5 con cloruro de hidrógeno 2N, seguido de la extracción con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice utilizando heptano/acetato de etilo 7/3 v/v. Rendimiento: 6,66 g.
TLC: R_{t} = 0,56, gel de sílice, heptano/acetato de etilo 3/2 v/v.
H-D/L-m-OCH_{3}-Phe-OMe.TFA
Se disolvió Boc-D/L-m-OCH_{3}-Phe-OMe (6,66 g) en diclorometano (20 ml) y ácido trifluoroacético (20 ml) y se agitó a la temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida y el producto bruto se evaporó simultáneamente con tolueno dos veces. Rendimiento: 9,56 g.
TLC: R_{t} = 0,32, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 126/20/6/1 v/v/v/v.
HOOC-CH_{2}-D/L-m-OCH_{3}-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Se utilizó H-D/L-m-OCH_{3}-Phe-OMe.TFA para ensamblar N-(t-butiloxicarbonilmetil)-N-Boc-D/L-m-OCH_{3}-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) conforme a la misma ruta descrita en el Ejemplo 24, el tratamiento de 624 mg del tripéptido protegido con ácido trifluoroacético y tioanisol (ver el Ejemplo 1), seguido de purificación mediante HPLC proporcionó 114 mg del producto.
R_{t} (LC): 29,3 min. y 29,8 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 38 HOOC-CH_{2}-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo) Boc-D/L-p-Br-Phe-OH
Una suspensión de H-D/L-p-Br-Phe-OH (2,44 g) en 25 ml de t-butanol/agua 1/1 v/v se ajustó a pH 9 con una solución de hidróxido de sodio diluido (1N) suficiente. Se añadió dicarbonato de di-t-butilo (3,27 g) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche mientras el pH se mantenía a 9. La mezcla de reacción se diluyó con agua, seguido de extracción con heptano. La capa acuosa se diluyó con acetato de etilo y con posterioridad se aciduló a pH 2,5 utilizando cloruro de hidrógeno 2N. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a vacío. Rendimiento: 3,35 g.
TLC: R_{t} = 0,32, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 126/20/6/1 v/v/v/v.
Boc-D/L-p-Br-Phe-Pro-OH
Se acopló Boc-D/L-p-Br-Phe-OH (3,35 g) a H-Pro-OMe.HCl y con posterioridad se saponificó con hidróxido de sodio según los mismos métodos descritos en el Ejemplo 26. Rendimiento: 3,13 g.
TLC: R_{f} = 0,45, gel de sílice, acetato de etilo/metanol 9/1.
Boc-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
El acoplamiento de Boc-D/L-p-Br-Phe-Pro-OH (750 mg) con H-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) se realizó en las mismas condiciones descritas en el Ejemplo o24. Rendimiento: 1,01 g.
TLC: R_{f} = 0,85, gel de sílice, diclorometano/metanol 9/1 v/v.
\newpage
H-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA
Se disolvió Boc-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (1,01 g) en ácido trifluoroacético (TFA, 10 ml) y se agitó durante 1 hora a la temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida. Rendimiento: 879 mg.
TLC: R_{f} = 0,75 y 0,68, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v.
N-(t-Butiloxicarbonilmetil)-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se añadió bromoacetato de t-butilo (264 ml) a una solución de H-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo).TFA (879 mg) en acetonitrilo (25 ml). El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8 con N,N-diisopropiletilamina después de lo cual la mezcla de reacción se dejó estar a la temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5% y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El producto bruto se purificó sobre gel de sílice utilizando diclorometano/metanol 95/5 v/v para proporcionar 850 mg del tripéptido protegido.
TLC: R_{f} = 0,91, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v.
HOOC-CH_{2}-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo)
Se trató N-(t-butiloxicarbonilmetil)-D/L-p-Br-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) (850 mg) en las mismas condiciones con ácido trifluoroacético descritas en el Ejemplo 1 para obtener, tras la purificación mediante HPLC, 123 mg del producto.
R_{t} (LC): 33,9 min. y 34,4 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 39 HOOC-CH_{2}-D-p-F-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 38, partiendo de H-D-p-F-Phe-OH. La desprotección (ver el Ejemplo 1) de 563 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-D-p-F-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) dio, tras la purificación mediante HPLC, 182 mg del producto.
R_{t} (LC): 29,7 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 40 HOOC-CH_{2}-D/L-m,p-di-Cl-Phe-Pro-Lys-(2-tiazolilo)
Este compuesto se preparó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 38, partiendo de H-D/L-m,p-Cl-Phe-OH. La desprotección (ver el Ejemplo 1) de 480 mg de N-(t-butiloxicarbonilmetil)-D/L-m,p-di-Cl-Phe-Pro-Lys(Cbz)-(2-tiazolilo) dio, tras la purificación mediante HPLC, 191 mg del producto.
R_{t} (LC): 36,8 min. y 37,8 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 41 (comparativo)
BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys\psi[COCO]-OH (Bzl = bencilo) Cbz-Lys(Boc)-OMe
Se disolvió Cbz-Lys(Boc)-OH (28 g) en diclorometano/metanol = 9/1 v/v (500 ml). Se añadió tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (23,6 g) y la solución se ajustó a pH 8 mediante la adición de trietilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a la temperatura ambiente. La mezcla se lavó sucesivamente con una solución de cloruro de hidrógeno 1N fría, agua, hidrogenocarbonato de sodio al 5%, y agua y se secó sobre sulfato de sodio. El producto filtrado se evaporó y el residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice en acetato de etilo/heptano = 1/4 como eluyente. Las fracciones que contenían Cbz-Lys(Boc)-OMe se reunieron y se evaporaron. Rendimiento: 29,1 g.
TLC: R_{f} = 0,85, gel de sílice, acetato de etilo/heptano 3/1 v/v.
Cbz-Lys(Boc)\psi[cianoacetato]
A una solución fría (-78ºC) de Cbz-Lys(Boc)-OMe (29,1 g) en diclorometano seco (800 ml) se añadió gota a gota hidruro de diisobutilaluminio (222 ml de solución en hexano 1M) a una velocidad que mantuviera la temperatura de reacción por debajo de -70ºC. La solución resultante se agitó a -78ºC durante 1 hora. A la mezcla de reacción se añadió una solución de ácido cítrico al 5% (600 ml). La mezcla de dos capas se agitó a la temperatura ambiente durante 10 minutos, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con diclorometano. Las capas de diclorometano combinadas se lavaron con agua y se secaron sobre sulfato de sodio y se filtraron. La solución se colocó en nitrógeno y se enfrió sobre un baño de agua con hielo. Se añadió una solución de cianuro de sodio (36,3 g) y cloruro de benciltrietilamonio (4,2 g) en agua (600 ml). Con agitación vigorosa se añadió en porciones anhídrido acético (2 x 9 ml) a lo largo de un período de 30 minutos. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con diclorometano. Las capas de diclorometano combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente heptano/acetato de etilo = 1/1 v/v) para rendir Cbz-Lys(Boc)\psi[cianoacetato] (26,3 g).
TLC: R_{f} = 0,60, gel de sílice, diclorometano/acetato de etilo 7/3 v/v.
Cbz-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe
Una solución de Cbz-Lys(Boc)\psi[cianoacetato] (26,3 g) en éter dietílico/metanol = 3/1 v/v (600 ml) se enfrió a -20ºC en nitrógeno, y se introdujeron 66 g de ácido clorhídrico gaseoso manteniendo la temperatura por debajo de -5ºC. La mezcla de reacción se mantuvo a 4ºC durante la noche. Se añadió agua (100 ml) gota a gota a la mezcla de reacción manteniendo la temperatura por debajo de 5ºC. Después de agitar durante 16 horas a la temperatura ambiente la capa orgánica se separó y se lavó con agua. La capa acuosa se saturó con cloruro de sodio y se extrajo con sec-butanol/diclorometano = 3/2 v/v. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío para dar 25,4 g de la amina bruta. El residuo se recogió en N,N-dimetilformamida (400 ml), y se añadieron anhídrido bis(t-butílico) (16 g) y trietilamina hasta un pH de 8. La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó mediante evaporación a presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó con agua y salmuera sucesivamente, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice (eluyente: acetato de etilo/heptano = 4/6 v/v) para rendir Cbz-Lys(Boc)-\o [CHOHCO]-OMe (15,8 g).
TLC: R_{f} = 0,75, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v.
H-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe
Se añadieron paladio sobre carbono al 10% (92 mg) y 2,18 ml de una solución de hidrocloruro 1N a una solución de Cbz-Lys(Boc)-\psi[CHOHCO]-OMe (0,92 g) en N,N-dimetilformamida (20 ml). La mezcla se hidrogenó a la presión atmosférica a la temperatura ambiente durante 3 horas. El catalizador de paladio se eliminó mediante filtración y el disolvente se eliminó por evaporación a presión reducida rindiendo H-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe.HCl cuantitativamente.
TLC: R_{f} = 0,47, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 88/31/18/7 v/v/v/v.
BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe
Se preparó ácido (S)-3-bencilsulfonilamido-2-oxo-1-azepinoacético según el procedimiento del ejemplo 18. A una solución fría (0ºC) de ácido (S)-3-bencilsulfonil-amido-2-oxo-1-azepinoacético (BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)(Gly) (400 mg) en N,N-dimetilformamida (20 ml) se añadieron sucesivamente 1-hidroxibenzotriazol (238 mg), diciclohexilcarbodiimida (267 mg), H-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe.HCl (285 mg) y trietilamina (0,32 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 1 hora y después se mantuvo a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se enfrió a -20ºC y la diciclohexilurea se eliminó por filtración. El producto filtrado se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato de sodio al 5%, agua, ácido cítrico al 2%, solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice en diclorometano/metanol = 9/1 (v/v) como eluyente. Las fracciones que contenían BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OMe se reunieron y se evaporaron. Rendimiento: 663 mg.
TLC: R_{f} = 0,91, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v.
BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OH
Se disolvió BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi-[CHOHCO]-OMe (650 mg) en dioxano/agua 7/3 v/v (20 ml) y se trató con solución de hidróxido de sodio 2 M (1,05 ml) en porciones a lo largo de 1 hora a la temperatura ambiente, manteniendo el pH a 12-13. La mezcla de reacción se diluyó con agua (20 ml), se añadió una solución de cloruro de hidrógeno 2 M hasta un pH de 2,0 y la capa acuosa se extrajo con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a vacío para rendir BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OH (740 mg).
TLC: R_{f} = 0,44 gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v.
\newpage
BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi[COCO]-OH
A una solución de BnSO_{2}-norLeu(ciclo)-Lys(Boc)\psi[CHOHCO]-OH (740 mg) en diclorometano seco (20 ml) se añadieron 450 mg de peryodinano (reactivo de Dess-Martin). Al cabo de 1 hora de agitación a la temperatura ambiente, se añadió solución de tiosulfato de sodio al 2% (20 ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. La capa orgánica se separó, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío para dar BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi[COCO]-OH (497 mg)
TLC: R_{f} = 0,45 gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 63/20/6/11 v/v/v/v.
BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys\psi[COCO]-OH
Se trató BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys(Boc)\psi[COCO]-OH (497 mg, bruto) durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se disolvió en agua y se cargó directamente en una columna Deltapack RP-C18 para HPLC preparativa utilizando un sistema de elución por gradiente de A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 45%/C al 35% a lo largo de 45 minutos, a una velocidad de flujo de 80 ml/minuto. Rendimiento: 200 mg de BzlSO_{2}-norLeu(ciclo)Gly-Lys\psi[COCO]-OH.
R_{t} (LC): 26,37 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 42 (comparativo)
H-(N-CH_{3})-D-norLeu-Pro-Lys\psi[COCO]-OH Boc-(N-CH_{3})-NorLeu-Pro-OH
Este compuesto se preparó según el Ejemplo 11. De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1 se preparó: H-(N-CH_{3})-D-norLeu-Pro-ys\psi[COCO] -OH.
Rendimiento: 69 mg.
R_{t} (LC): 13,27 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 43 (comparativo)
H-D-Phe-Pro-Lys\psi[COCO]-OH Boc-D-Phe-Pro-OMe
A una solución fría (0ºC) de Boc-D-Phe-OH (5 g) en N,N-dimetilformamida (200 ml) se añadieron sucesivamente 1-hidroxibenzotriazol (4,29 g), diciclohexilcarbodiimida (4,29 g), H-Pro-OMe.HCl (3,1 g) y N-etilmorfolina (3 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 1 hora y después se mantuvo a la temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla se enfrió a -20ºC y la diciclohexilurea se eliminó por filtración. El producto filtrado se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó sucesivamente con hidrogenocarbonato de sodio al 5%, solución de cloruro de hidrógeno 0,1 M, cloruro de sodio acuoso saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a vacío. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice en heptano/acetato de etilo = 6/4 (v/v) como eluyente. Las fracciones que contenían Boc-D-Phe-Pro-OMe fueron reunidas y evaporadas. Rendimiento: 1,5 g.
TLC: R_{f} = 0,90 gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 163/20/6/11 v/v/v/v.
Boc-D-Phe-Pro-OH
Se disolvió Boc-D-Phe-Pro-OMe (8,3 g) en dioxano/agua = 6/4 v/v (150 ml) y se trató con solución de hidróxido de sodio 2 M (16,5 ml) en porciones a lo largo de 1 hora a la temperatura ambiente, manteniendo el pH a 12,5. Se añadió solución de cloruro de hidrógeno 2 M a la mezcla de reacción hasta alcanzar un pH de 3,0 y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a vacío para rendir Boc-D-Phe-Pro-OH (6,9 g).
TLC: R_{f} = 0,30 gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua 213/20/6/11 v/v/v/v.
De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1 se preparó: H-D-Phe-Pro-Lys\psi[COCO]-OH.
Rendimiento: 417 mg
R_{t} (LC): 16,22 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
\newpage
Ejemplo 44 (comparativo)
H-(N-CH_{3})-D-Phe-(N-ciclopentil)-Gly-Lys\psi[COCO]-OH} Boc-(N-CH_{3})-D-Phe-(N-ciclopentil)-Gly-OH
Este compuesto se preparó como se ha descrito en el Ejemplo 3 utilizando Boc-(N-CH_{3})-D-Phe-OH t HCl.H-(N-ciclopentil)-Gly-OMe.
TLC: R_{f} = 0,52, gel de sílice, diclorometano/metanol = 9/1 v/v.
De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1 se preparó: H-(N-CH_{3})-D-Phe-(N-ciclopentil)-Gly-Lys\psi[COCO]-OH.
Rendimiento: 87 mg.
R_{t} (LC): 23,92 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 45 (comparativo)
Etilsulfonil-D-Phe-Pro-Lys\psi[COCO]-OH Etilsulfonil-D-Phe-Pro-OH
Este compuesto se preparó según el Ejemplo 22.
De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 41 se preparó: Etilsulfonil-D-Phe-Pro-Lys\psi[COCO]-OH.
Rendimiento: 90 mg.
R_{t} (LC): 28,04 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 46 (comparativo)
(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R)-carbonil-Pro-Lys\psi[COCO]-OH 2-Cbz-(4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R)-carbonil-Pro-OH
Este compuesto se preparó según el Ejemplo 20.
De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 41 se preparó: (4aR,8aR)-perhidroisoquinolino-1(R)-carbonil-Pro-Lys\psi[COCO]-OH.
Rendimiento: 170 mg.
R_{t} (LC): 18,95 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 47 (comparativo)
HOOC-CH_{2}-D-Coa-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (Coa = ciclooctil-alanina) Bromuro de ciclo-octilmetilo
Se disolvió ciclooctilmetanol (8,16 g) en solución de HBr al 47% (70 ml) y se sometió a reflujo durante 1 hora a 130ºC. La mezcla de reacción se vertió en agua con hielo (500 ml) y se añadió una solución de hidrogenocarbonato de sodio saturado (500 ml). La solución acuosa se extrajo con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice en tolueno como eluyente. Las fracciones que contenían bromuro de ciclooctilmetilo se reunieron y se evaporaron.
Rendimiento:9,85 g.
TLC: R_{f} = 0,95, gel de sílice, tolueno.
\newpage
(R,S)-Etil-2-acetilamino-2-ciano-3-ciclooctil-propionato
Se disolvieron t-butilato de potasio (6,85 g) y acetamidocianoacetato de etilo (8,1 g) en dimetilsulfóxido (100 ml) a la temperatura ambiente. Se disolvió bromuro de ciclooctilmetilo en dimetilsulfóxido (25 ml) y se añadió gota a gota a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 44 horas. Tras verterla sobre 500 ml de agua el producto precipitado se filtró y se secó para rendir (R,S)-etil-2-acetilamino-2-ciano-3-ciclooctil-propionato (2,95 g).
TLC: R_{f} = 0,50, gel de sílice, heptano/acetato de etilo = 3/7 v/v.
H-D,L-Ciclo-octilalanina-OH.HCl
Se suspendió (R,S)-etil-2-acetilamino-2-ciano-3-ciclooctil-propionato (2,95 g) en 100 ml de una solución de cloruro de hidrógeno al 20% y se sometieron a reflujo durante 22 horas. La mezcla de reacción se enfrió a 5ºC y el producto precipitado formado se filtró, se lavó con éter dietílico y se secó.
Rendimiento: 2,69 g de H-D,L-Ciclo-octilalanina-OH.HCl (H-D,L-Coa-OH.HCl)
TLC: R_{f} = 0,27, gel de sílice, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua = 63/20/6/11 v/v/v/v.
De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 24 se preparó: HOOC-CH_{2}-D-Coa-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
Rendimiento: 162 mg.
R_{t} (LC): 38,35 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 24 se prepararon:
Ejemplo 48 HOOC-CH_{2}-D-2-Nal-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (Nal = naftilalanina)
Rendimiento: 423 mg.
R_{t} (LC): 35,78 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 49 HOOC-CH_{2}-D-norLeu-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (comparativo)
Rendimiento: 344 mg.
R_{t} (LC): 24,84 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 50 HOOC-CH_{2}-D-Leu-Pro-Lys-(2-tiazolilo) (comparativo)
Rendimiento: 138 mg.
R_{t} (LC): 24,50 min. A al 20%/B al 80% a A al 20%/B al 20%/C al 60% en 40 min.
Ejemplo 51 Análisis Anti-trombina
La trombina (Factor IIa) es un factor de la cascada de coagulación.
La actividad anti-trombina de los compuestos de la presente invención fue evaluada midiendo espectrofotométricamente la velocidad de hidrólisis del sustrato cromogénico s-2238 ejercida por la trombina. Este análisis para la actividad anti-trombina en un sistema tampón fue utilizado para evaluar el valor de la CI_{50} de un compuesto de ensayo.
Medio de ensayo
Tampón Trometamina-NaCl-polietilenglicol 6000 (TNP). Compuesto de referencia: 12581 (Kabi). Vehículo: tampón TNP. Se puede ayudar a la solubilización con dimetilsulfóxido, metanol, etanol, acetonitrilo o alcohol t-butílico que no tienen efectos adversos a concentraciones de hasta el 2,5% en la mezcla de reacción final.
Técnica Reactivos*
Tampón Trometamina-NaCl (TN). Composición del tampón: Trometamina (Tris) 6,057 g (50 mmoles), NaCl 5,844 g (100 mmoles), agua hasta 1 litro. El pH de la solución se ajusta a 7,4 a 37ºC con HCl (10 mmol\cdotl^{-1}). 2. Tampón TNP: Se disuelve polietilenglicol 6000 en tampón TN para dar una concentración de 3^{ }g^{.}l^{-1}. 3. Solución S-2238: Se disuelve un vial de S-2238 (25 mg; Kabi Diagnostica, Suecia) en 20 ml de tampón TN para dar una concentración de 1,25 mg\cdotml^{-1} (2 mmol\cdotl^{-1}). 4. Solución de trombina: Se disuelve trombina humana (16.000 nKat\cdotvial^{-1}; Centraal Laboratorium voor Bloedtranfusie, Amsterdam, Holanda) en tampón TNP para dar una solución de partida de 835 nKat^{.}ml^{-1}. Inmediatamente antes de utilizar esta solución se diluye con tampón TNP para dar una concentración de 3,34 nKat\cdotml^{-1}.
* Todos los ingredientes utilizados son de grado analítico
- Para las soluciones acuosas se utiliza agua ultrapura (calidad Milli-Q).
Preparación de soluciones de compuesto de ensayo y de referencia
Los compuestos de ensayo y de referencia se disuelven en agua Milli-Q para dar concentraciones de partida de 10^{-2} mol\cdotl^{-1}. Cada concentración se diluye por etapas con el vehículo para dar concentraciones de 10^{-3}, 10^{-4} y 10^{-5} mol\cdotl^{-1}. Las diluciones, incluyendo la solución de partida, se utilizan en el análisis (concentraciones finales de la mezcla de reacción: 3\cdot10^{-3}; 10^{-3}; 3\cdot10^{-4}; 10^{-4}; 3\cdot10^{-5}; 10^{-5}; 3\cdot10^{-6}; 10^{-6}, respectivamente).
Procedimiento
A la temperatura ambiente, se pipetean alternativamente 0,075 ml y 0,025 ml de solución de compuesto de ensayo o compuesto de referencia o vehículo en pocillos de una placa de microtitulación y estas soluciones se diluyen con 0,115 ml y 0,0165 ml de tampón TNP, respectivamente. Se añade una alícuota de 0,030 ml de solución de S-2238 a cada pocillo y la placa se pre-calienta y se pre-incuba con sacudimiento en una incubadora (Amersham) durante 10 minutos a 37ºC. Tras la pre-incubación se inicia la hidrólisis de S-2238 mediante la adición de 0,030 ml de solución de trombina a cada pocillo. La placa se incuba (con sacudimiento durante 30 segundos) a 37ºC. Empezando 1 minuto después de la incubación, se mide la absorbancia de cada muestra a 405 nm cada 2 minutos durante un período de 90 minutos utilizando un lector de placa de microtitulación cinético (Twinreader plus, Flow Laboratories).
Todos los datos se recogen en un ordenador personal IBM utilizando LOTUS-MEASURE. Para cada concentración de compuesto (expresada en mol^{.}l^{-1} de mezcla de reacción) y para el blanco se traza la absorbancia versus el tiempo de reacción en minutos.
Evaluación de las respuestas
Para cada concentración final se calculó la absorbancia máxima a partir de la curva de análisis. El valor de CI_{50} (concentración final, expresada en \mumol\cdotl^{-1}, que ocasiona una inhibición del 50% de la absorbancia máxima del blanco) fue calculado utilizando el análisis de transformación logit según Hafner y col. (Arzneim-Forsch/Drug Res. 1977; 27(II): 1871-3).
En la siguiente tabla, se enumeran los valores CI_{50} de los compuestos de la invención.
Ejemplo valor CI_{50} (\muM)
2(e) 4,5
4(b) 4,34
39 19
41 0,135

Claims (9)

1. Un inhibidor de trombina de unión no lenta de fórmula:
A-B-C-Lys-D
donde
A es H, R_{1}, R_{1}-O-CO-, R_{1}-CO-, R_{1}-SO_{2}-, -(CHR_{2})_{n}COOR_{3}, o un grupo protector,
donde
R_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{12}, alquenilo C_{2}-C_{12}, arilo C_{6}-C_{14}, aralquilo C_{7}-C_{15} y aralquenilo C_{8}-C_{16}, el grupo arilo del cual puede estar sustituido con alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{2}-C_{12}, hidroxi, o halógeno;
R_{2} es H o tiene el mismo significado que R_{1};
R_{3} se selecciona entre H, alquilo C_{1}-C_{12}, alquenilo C_{2}-C_{12}, arilo C_{6}-C_{14}, aralquilo C_{7}-C_{15} y aralquenilo C_{8}-C_{16}, el grupo arilo del cual puede estar sustituido con alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{2}-C_{12}, hidroxi, o halógeno;
n es un entero de 1 a 3;
B es un enlace, L-Asp o un derivado éster del mismo, -N(bencil)-CH_{2}-CO, D-Tiq, Atc, D-ciclohexilalanina o un D-aminoácido que tiene una cadena lateral aromática hidrófoba;
C es Pro o un aminoácido de una de las fórmulas -N[cicloalquilo C_{3}-C_{6}]-CH_{2}-CO- o -N(bencil)-CH_{2}-CO-;
D se selecciona entre tiazol y benzotiazol;
o un profármaco del mismo, donde los profármacos son derivados protegidos con N-alcoxicarbonilo de la fórmula general;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El inhibidor de trombina de unión no lenta de la reivindicación 1, donde D es tiazol.
3. El inhibidor de trombina de unión no lenta de la reivindicación 2, donde A es H, alquilo C_{1}-C_{12}, -CO-aralquilo C_{7}-C_{15}, -SO_{2}-arilo C_{6}-C_{14}, -SO_{2}-aralquilo C_{7}-C_{15}, -SO_{2}-alquilo C_{1}-C_{12}, -(CHR_{2})_{n}COOR_{3}, siendo R_{2} H o alquilo C_{1}-C_{12} y siendo R_{3} H, alquilo C_{1}-C_{12} o bencilo; y C es Pro o -N[cicloalquil C_{3}-C_{6}]-CH_{2}-CO-.
4. El inhibidor de trombina de unión no lenta de la reivindicación 3, donde A es -(CH_{2})_{n}COOR_{3}, B es D-ciclohexilalanina, o D-Phe opcionalmente monosustituido con alcoxi o halógeno; y C es Pro.
5. El inhibidor de trombina de unión no lenta de la reivindicación 4, que es HOOC-CH_{2}-D-Cha-Pro-Lys-(2-tiazolilo).
6. Un procedimiento para preparar un inhibidor de trombina de unión no lenta de la reivindicación 1, incluyendo el procedimiento acoplar aminoácidos adecuadamente protegidos o análogos de aminoácidos, seguido de la eliminación de los grupos protectores.
7. Una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de trombina de unión no lenta de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y coadyuvantes farmacéuticamente aceptables.
8. El inhibidor de trombina de unión no lenta de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en terapia.
9. El uso del inhibidor de trombina de unión no lenta de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la fabricación de un medicamento anti-trombótico.
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