CZ12994U1 - Kvasničná biomasa obohacená L-karnitinem nebo jeho solemi - Google Patents

Description

Kvasničná biomasa obohacená L-karnitinem nebo jeho solemi Oblast techniky

Technické řešení se týká kvasničné biomasy obohacené L-kamitinem využitelné jako potravní doplněk.

Dosavadní stav techniky * L-kamitin (P-hydroxy-Y-trimethyl-aminomáselná kyselina) je přirozený metabolit, který hraje velmi důležitou roli v lidském metabolismu. Tato hydroxyaminokyselina je nezbytnou součástí ' transportního systému volných mastných kyselin mitochondriální membránou do mitochondrií, kde jsou tyto mastné kyseliny katabolizovány β-oxidací. Tento proces je nezbytnou součástí energetického metabolismu buňky. Kromě toho L-kamitin aktivuje metabolickou oxidaci aminokyselin s větveným řetězcem, podílí se na regulaci inzulínové aktivity a publikován byl i popis jeho rolí v imunologických procesech a při regulaci mužské fertility. Acetyl-L-karnitin hraje důležitou úlohu v metabolismu centrálního nervového systému a přispívá k prevenci některých neurodegeneračních změn spojených se stárnutím. Biosyntéza L-kamitinu z aminokyselin lysinu ametioninu v lidském těle je známa. Pokud není v těle syntetizováno dostatečné množství kamitinu, je nutno ho přijímat v dostatečném množství potravou, aby se zabránilo vývoji deficienčních symptomů.

Dostatečný příjem L-kamitinu je obzvláště důležitý u kojenců, pro které je esenciální živinou, protože se u nich ještě dostatečně nevyvinula schopnost jeho biosyntézy. Suplementace L20 kamitinem je také doporučována například u lidí s deficitem bílkovin a aminokyselin ve stravě, těhotných a kojících žen, nebo veganských vegetariánů.

L-kamitin je také aktivní součástí různých farmaceutických produktů s různým terapeutickým zaměřením. Je často doporučován jako podpůrný lék při různých kardiovaskulárních onemocněních, konkrétně při ischémii myokardu, angíně pektoris, srdečním selhání a srdečních arytmiích, dále pacientům závislým na hemodialýze za účelem omezení svalové astenie a svalových křečí aje také účinný při chronické arteriopatii, neurologických onemocněních spojených se stárnutím, některých imunitních dysfunkcích, nebo diabetických komplikacích. Byl také popsán pozitivní účinek L-kamitinu na lipidový metabolismus, celkový lipidový profil a stabilizační efekt na membrány červených krvinek. Kromě těchto čistě terapeutických aplikací je L-kamitin častou součástí různých potravinových doplňků zaměřených zejména na sportovní výživu, konkrétně na zvýšení vytrvalosti a prevenci svalové únavy a křečí, přírůstek svalové hmoty, nebo také na rekonvalescenci po těžkých zraněních a redukci tělesné hmotnosti.

L-kamitin obsahuje asymetrický uhlík a tudíž se může vyskytovat ve formě dvou stereoizomerů označovaných L a D. V savčích organismech se vyskytuje výhradně levotočivý L-izomer. Pro suplementaci stravy byly původně používány i takzvané racemační směsi, obsahující stejný podíl obou izomerů. Biologicky aktivní je však pouze L-izomer a protože byly objeveny některé nepříznivé účinky D-kamitinu v lidském organismu, který je inhibitorem metabolických funkcí < L-kamitinu, je dnes pro farmaceutické a nutriční účely výhradně používána L-forma kamitinu.

Do dnešní doby bylo patentováno několik různých výrobních postupů průmyslové výroby L40 kamitinu. Tato sloučenina může být vyrobena čistě chemickou syntézou, syntézou s využitím několika různých enzymů, nebo biotransformačními postupy s využitím řady různých mikroorganismů.

Syntetické postupy vycházející z opticky neaktivních sloučenin, nebo racemických směsí vedou ke vzniku racemické směsi D- a L- izomerů kamitinu. Proto je nezbytná separace izomerů z této jejich směsi, nejčastěji frakční krystalizací jejich solí s některými opticky aktivními kyselinami z alkoholických roztoků se zpětnou konverzí na L-kamitin (BE 660 039). Výraznou nevýhodou těchto postupů je, že vedou k minimálně 50% ztrátě na konečném produktu. Proto byly navrženy

-1 CZ 12994 Ul také syntetické postupy, které jsou založeny na enantioselektivní redukci butyro-4-chloro-3oxoesteru s použitím rutheniových katalyzátorů a které vedou výhradně ke vzniku L-izomeru kamitinu (WO 0029370, EP(-B-) 295 109, EP(-A-) 339 764). Další možností, jak získat čistě syntetickým postupem výhradně L-izomer kamitinu, je vycházet z opticky aktivní sloučeniny, jako je například D-mannitol (US 4 413 142).

Společnou nevýhodou všech doposud navržených syntetických postupů je jejich značná složitost, finanční náročnost a nebezpečí kontaminace konečného produktu některými toxickými sloučeninami používanými při výrobě.

I

Snaha zabránit vzniku racemické směsi a nutnosti použití toxických sloučenin vedla také k ío . vývoji postupů kombinujících chemickou syntézu s využitím enzymových procesů, při kterých jsou různé synteticky připravené meziprodukty stereospecificky převedeny na L-kamitin s použitím různých mikrobiálních enzymů.

Například synteticky připravený dehydrokamitin může být asymetricky redukován na L-kamitin bakteriálním enzymem kamitin dehydrogenázou (FR appl. No.772 218, US 4 221 869), γ15 butyrobetain hydroxylován na L-kamitin enzymem hydroxylázou, obsaženým ve sporách plísně Neurospora crassa (US 4 371 618), krotonobetain nebo jeho deriváty stereospecificky hydratován na L-kamitin bakteriálním enzymem kamitinhydrolyázou (US 4 906 568), nebo směsí blíže nespecifikovaných enzymů pocházejících z různých mikroorganismů (US 4 650 759).

Izolace a purifikace mikrobiálního enzymového systému v průmyslovém měřítku je však obvykle opět příliš nákladná. Další nevýhodou je nutnost separace vzniklého L-kamitinu od použitého enzymu.

Levnější postupy průmyslové výroby L-karnitinu využívají k jeho produkci živé mikrobiální kultury. Při těchto postupech odpadá nutnost nákladné izolace a purifikace enzymového systému , a nutnost použití toxických chemických sloučenin. Tyto postupy jsou také obvykle jednodušší a levnější než postupy syntetické či postupy využívající izolované enzymové systémy. L-kamitin je běžně vytvářen jako přirozený metabolický meziprodukt celou řadou různých mikroorganismů. Původně navržené mikrobiologické metody produkce L-kamitinu byly založeny na jeho biosyntéze de novo zběžných fermentačních substrátů, např. spomocí plísně Emericella quadrilineata kultivované v komplexním médiu (např. JP 71 567 / r. 1984).

Později patentované postupy jsou již založeny na stereospecifické biotransformaci achirálních derivátů betainu. Pro tento účel je možno použít celou řadu vyselektovaných mikrobiálních kmenů různých rodů a druhů, obvykle bakteriálních, ale i kvasničných nebo plísňových. Mutantní kmeny byly získány tradičními mikrobiologickými selekčními postupy. Hlavními kritérii selekce mikrobiálních kmenů byly přítomnost enzymů nutných pro konversi použitého derivátu betainu na L-kamitin a požadavek úplné, nebo alespoň částečné inhibice katabolismu L-kamitinu. Použité deriváty betainu nesmí být také katabolizovány a využívány jako zdroj uhlíku jinou metabolickou cestou.

Nejčastěji využívaným biotransformačními mechanismy jsou stereospecifická hydratace krotonobetainu (například US 4 708 936, US 5 300 430) ahydroxylace γ-butyrobetainu (např. US

4 708 936). Dalšími prekursory úspěšně použitými pro mikrobiální transformaci L-kamitinu jsou t

3-dehydrokamitin (například JP 272 086), nitril kamitinu (EP 319 344) a estery betainu různého složení (WO 02061094 A2). Používány jsou také některé sole výše zmíněných derivátů betainu.

V nedávné době byly dokonce chráněn i genetický materiál obsahující geny metabolické dráhy butyrobetain / krotonobetain - L-kamitin (US 5 759 824). Všechny výše zmíněné výrobní postu45 py ústí do procesu izolace konečného produktu L-kamitinu nebo jeho různých solí z reakčního roztoku nebo biotransformačního média ajeho purifikace. Závěrečnou fází izolačních apurifikačních postupů je často opakovaná krystalizace z roztoku organického rozpouštědla. Jedním z často používaných rozpouštědel je etanol. Etanolové matečné louhy vznikající jako odpadní vedlejší produkt po poslední krystalizaci L-kamitinu, či jedné z jeho solí, obsahují ještě nezanedbatelné zbytkové množství této sloučeniny, často až 2 %. Tyto etanolové matečné louhy

-2CZ 12994 Ul je sice možno recyklovat, ale často jsou bez dalšího užitku spalovány jako nebezpečný hořlavý odpad.

Cílem tohoto užitného vzoru je ekonomické zhodnocení odpadních etanolových matečných louhů jejich originálním fermentačním zpracováním na biomasu etanolových kvasnic obohace5 nou L-kamitinem, která může být využita jako potravinový doplněk.

Kombinace L-kamitinu s kvasničnou biomasou je velmi výhodná. V případě, že se jedná o čistý L-kamitin, odpadá řešení problému sjeho hygroskopicitou a nestabilitou. Další výhodou této kombinace je možnost kombinované suplementace s různými dalšími biologicky aktivními látkami v kvasničné biomase se přirozeně vyskytujícími, nebo tam doplněnými. Jako příklad lze uvést některé vitamíny, aminokyseliny, esenciální stopové prvky a další minerální látky, nebo glutathion. Jako velmi výhodné se jeví zvláště spojení s biomasou etanolových kvasnic obohacenou různými esenciálními stopovými prvky v biologicky aktivních formách (UV 6716, 6232, 5269, nebo 4343). Jiným příkladem je zvýšení absorpce glutathionu přirozeně se vyskytujícího v kvasničné biomase ze zažívacího traktu a synergické zvýšení jeho celkové účinnosti L15 kamitinem (patentová přihláška 2000 - 4620).

Podstata technického řešení

Technické řešení si klade za cíl dát k dispozici biomasu kvasinek rodu Torulopsis nebo Candida, vyznačujících se schopností využívat etanol jako jediný zdroj uhlíku, obohacenou L-kamitinem, nebo některou zjeho solí, na koncentraci převyšující jeho přirozený obsah, minimálně 0,2 % L20 kamitinu v sušině kvasničné biomasy. Ve výhodném provedení je obsah L-kamitinu 0,5 až 5 % v sušině. Kvasničná biomasa, obohacená L-kamitinem jako hlavní účinnou složkou a obsahující i další důležité nutriční faktory, je určena k využití jako potravinový doplněk.

Jako zdroj uhlíku při kvasničné kultivaci v syntetickém médiu je využíván matečný etanolový louh, obsahující zbytkové množství L-kamitinu. Koncentrace L-kamitinu v etanolovém roztoku před vlastní fermentací může být zvýšena některou z běžných fyzikálních metod, například šetrným částečným odpařením etanolového roztoku. Etanolový roztok, obsahující L-kamitin, je do fermentoru dávkován průběžně, čímž je zajištěna jeho stabilní optimální koncentrace v živném médiu po celou dobu fermentace. L-kamitin se postupně akumuluje ze živného média do kvasničné biomasy. Po ukončení fermentace je kvasničná biomasa odseparována a usušena.

Popsaný postup umožňuje reprodukovatelně získávat biomasu stálého složení obsahující Lkamitin v požadované koncentraci. Použití přesně definovaného syntetického média je zárukou nepřítomnosti nežádoucích cizorodých látek.

Příklad provedení

Do 30 litrového fermentoru s užitným objemem 15 1 a dosahovaným přestupem kyslíku

5,5 g.l·¹.!!·¹ bylo napuštěno 141 vody a přidáno 15 g (NH₄)₂SC>4, 9g ELPO^ 9g KOH, 48 g

MgSO4.7H₂O a 0,15 g ZnSO₄. Toto médium bylo inokulovánó 300 g kvasničné pasty kmene Torulopsis ethanolitolerans obsahující 22,5 % hmotn. sušiny. Kultivace probíhala při teplotě 33 °C a pH 4. Hodnota pH byla udržována v konstantním rozmezí periodickým dávkováním vodného roztoku amoniaku o koncentraci 10 % hmotn. Do živného média byl postupně dávkován etanolový roztok L-kamitin L-tartrátu (Lonza), obsahující v 1 litru 690 g absolutního etanolu a 12,9 g L-kamitin báze. Obsah L-kamitinu báze byl stanoven metodou kapilární isotachoforézy. Koncentrace etanolu v živném médiu byla udržována přístrojem Metrex v rozmezí 0,2 až 0,25 % obj. Kultivace byla ukončena přibližně po 5 hodinách po spotřebování 1 1 etanolového roztoku L-kamitinu. Po ukončení kultivace byla kvasničná biomasa odseparována z média odstředěním, promyta vodou a opět odstředěna na kvasničnou pastu. Bylo získáno 2706 g kvasničné pasty obsahující 22,1 % sušiny. V sušině kvasničné pasty bylo metodou kapilární isotachoforézy stanoveno 18,1 g.kg'¹, v odstředěném médiu 0,02 g.F¹ báze L-kamitinu.

-3 CZ 12994 Ul

Z celkově vložených 12,9 g báze L-kamitinu bylo nalezeno 10,8 g akumulováno v kvasničné biomase, což představuje 83,7 % vloženého L-kamitinu. Odstředěné médium obsahovalo 0,27 g

L-kamitinu, což představuje pouze 2,1 % vloženého L-kamitinu.

Kvasničná pasta obohacená kamitinem byla usušena lyofilizací a může být použita jako 5 potravinový doplněk. Suchý produkt obsahoval 1,8 % báze L-kamitinu.

Využitelnost

Potravinový doplněk z kvasničné biomasy obohacené L-kamitinem je určen pro zajištění dostatečného příjmu L-kamitinu a dalších biologicky aktivních látek pro prevenci a pomocnou léčbu některých onemocnění a pro speciální sportovní výživu.

Claims (1)

1. Kvasničná biomasa připravená aerobní kultivací kvasinek rodů Torulopsis nebo Candida v syntetickém živném médiu obsahujícím etanolový roztok sL-kamitinem, vyznačená tím, že obsahuje 0,2 až 10 % L-kamitinu v kvasničné sušině.