CZ113694A3

CZ113694A3 - Derivatives of bile acids process of their preparation and their use as medicaments

Info

Publication number: CZ113694A3
Application number: CZ941136A
Authority: CZ
Inventors: Gunther Dr Wess; Alfons Dr Enhsen; Heiner Dr Glombik; Werner Dr Dr Kramer
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1993-05-08
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 1994-11-16
Also published as: NO941679D0; HU9401411D0; IL109579A0; CA2123050A1; FI942076A; NO941679L; AU6194894A; FI942076A0; EP0624593A2; NZ260470A; EP0624593A3; HUT67522A; AU667009B2; JPH07304792A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových derivátů žlučových kyselin, způsobu jejich přípravy, farmaceutických přípravků na bázi těchto sloučenin, jakož i použití těchto derivátů žlučových kyselin jako léčiv.

Dosavadní stav techniky

Žlučové kyseliny mají důležitou fyziologickou funkci při trávení tuků, například jako kofaktory pankreatických lipáz a jako přírodní detergenty pro solubilizaci tuků a vitamínů rozpustných v tucích. Žlučové kyseliny jsou syntetizovaný^ v játrech jako koncový produkt metabolismu cholestinu, ukládány ve žlučníku a uvolňovány ze žlučníku kontrakcí do tenkého střeva, ve kterém realizují jejich fyziologický účinek. Největší podíl uvolněných žlučových kyselin se zpětně získá přes enterohepatický oběh. Žlučové kyseliny takto znovu dospějí přes mesenteriální žíly tenkého střeva a vstupní žilní systém jater do jater. Při opětovné resorpci ve střevě hrají úlohu jak aktivní, tak pasivní transportní procesy. Hlavní množství žlučových kyselin se na konci tenkého střeva, tj.v terminálním kyčelníku, zpětně resorbují specifickým, na Na⁺ závislým transportním systémem a dospějí tak prostřednictvím mesenteriálního žilného řečiště a žilného vchodu zpět do jater, aby odtud mohly být buňkami jater znuvu vylučovány do žluče.

V enterohepatickém oběhu vystupují žlučové kyseliny jako volné kyseliny ale také. ve formě glycinových a taurinových konjugátů.

Již delší dobu jsou k vázání žlučových kyselin používány neresorbovatelné, nerozpustné, bázické zesítované polymery c >· a tyto látky jsou na základě těchto vlastností terapeuticky využívány. Deriváty žlučových kyselin popsané v patentové přihlášce EP-A-0 489 423 mají vysokou afinitu k intestinálnímu trasportnímu systému žlučových kyselin a umožňují proto specifickou inhibici enterohepatického oběhu. Za předmět takové terapie je třeba považovat všechna onemocnění, při ktet rýcn je žádoucí inhibice resorpce žlučových kyselin ve střevě, zejména v tenkém střevě. Tímto způsobem jsou například léčeny cholagenní dirrhoea (průjem) po resekci kyčelníku nebo také zvýšená krevní hladina cholesterolu. V případě zvýšené hladiny cholesterolu v krvi může být dosaženo snížení této hladiny zásahem do enterohepatického oběhu. Snížením množství žlučových kyselin nacházejících se v enterohepatickém oběhu se stimuluje odpovídající nová syntéza žlučových kyselin z cholesterolu probíhající v játrech. Ke krytí spotřeby cholesterolu v játrech je třeba použít LDL-cholesterol nacházející se v krevním oběhu, přičemž se zapojuje zvýšené množství hepatických LDL-receptorú. Takto dosažené urychlení LDL-katabolismu se projevuje snížením atherogenního podílu cholesterolu v krvi.

Vzhledem k výše uvedenému je stále nezbytné hledat nová léčiva, která by byla schopna snížit hladinu atherogenního cho lesterolu, popřípadě ovlivnit enterohepatický oběh se zřetelem na zvýšené vylučování žlučových kyselin a následné snížení hladiny cholesterolu v krvi.

Tento úkol je řešen deriváty žlučových kyselin podle vynálezu.

EP-A-0 489 423 se týká dimerních derivátů žlučových kyselin obecného vzorce

G1-X-G2 .

ve kterých je spojení G1 a G2 provedeno v polohách 3, 7, 12

nebo přes boční řetězec prostřednictvím vazebného členu X. Deriváty žlučových kyselin, ve kterých je G1 spojen s X přes polohy 7 nebo 12 a G2 je spojen s X přes polohy 3, 7, 12 nebo přes boční řetězec, nejsou v příkladech uvedené evropské patentové přihlášky popsány.

Podstata vynálezu

Vynález se týká derivátů žlučových kyselin obecného vzor ce I

G1-X-G2 (I) ve kterém

G1 znamená zbytek obecného vzorce II

(II) ve kterém znamená OKa, kde Ka znamená ion alkalického kovu, ion kovu alkalických zemin nebo kvartérní amoniový ion, skupinu -OL, skupinu -NHL, skupinu přes aminovou skupinu vázanou aminokyselinu nebo aminosulfonovou kyselinu, jako například

-nhch₂cooh, -nhch₂ch₂so₃h, -nch₂cooh, -nch₂ch₂so₃h ch₃ ch₃ a jejich alkylestery, ve kterých alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, soli alkalických kovu a spli kovů alkalických zemin, jakož i kvartérní amoniové soli, přičemž ' znamená atom vodíku, alkylovou nebo alkenylovou skupinu obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, která je rozvětvena nebo nerozvětvena, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, fenylovou nebo benzylovou skupinu, která je nesubstituována nebo jednou až třikrát substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující atom fluoru, atom chloru, atom bromu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a alkoxylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, znamená atom vodíku, alkylovou nebo alkenylovou skupinu obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, která je rozvětvena nebo nerozvětvena, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, benzylovou skupinu, bifenylmethylovou nebo trifenylmethylovou skupinu, jejichž jádra jsou nesubstituována nebo jednou až třikrát substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující atom fluoru, atom chloru, atom bromu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a alkoxylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu

-P-OL ,

II o

-S-OL

II o

nebo

-C-L kde L má výše uvedený význam,

R a r\ popřípadě R⁴ a R vždy dohromady znamenají atom kyslíku karbonylové skupiny nebo

R až R jednotlivě a nezávisle jeden na druhém znamenají

OL

H, -OT, -ST, -NHT, O-C-T, -S-C-T, -NH-C-T, -O-P-OT, -O-S-OT, -T přičemž T má význam jako L nebo má volnou valenci k vázání skupiny X, přičemž celkem z G1 vychází pouze jedna volná valence k vázání skupiny X, znamená jednoduchou vazbu nebo skupinu obecného vzorce III

-[-{N)_s-A-N-C-(CH₂)_q-C-]_r-N-(B)_t(III) ve kterém

A a B znamenají alkylenové řetězce, které jsou rozvětvené nebo nerozvětvené a které mohou být případně přerušené skupinou -0- nebo -S-,

L , L a L , které jsou stejne nebo odlišné, mají význam jako

L, g znamená 0 až 5, r znamená nulu nebo 1, s znamená nulu nebo 1, t znamená nulu nebo 1,

G2 znamená zbytek obecného vzorce IV

Oj.· (IV)

ve kterém

Z znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený pro Y, g

R znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený pro R^,

10 2 5

R až R mají významy uvedené pro R až R , přičemž celkem z G2 vychází pouze jedna volná valence ke skupině X.

Sloučeniny podle vynálezu mají vysokou afinitu ke specifickému transportnímu systému žlučových kyselin tenkého střeva a inhibují koncentračně závisle a kompetitivně resorpci žlučových kyselin.

Kromě toho nejsou samotné sloučeniny podle vynálezu resorbovány a nedospějí tudíž do krevního oběhu. Aplikací tohoto principu účinku může být velmi specificky a účinně přerušen enterohepatický oběh žlučových kyselin.

Použitím sloučenin podle vynálezu je možné snížit množství žlučových kyselin nacházejících se v enterohepatickém oběhu, takže dochází ke snížení hladiny cholesterolu v krevním séru.^

Při použití sloučenin podle vynálezu lze rovněž jen v malé míře očekávat avitaminózy a stejně tak lze jen v omezené míře očekávat ovlivnění resorpce ostatních léčiv nebo také negativní účinek na střevní flóru. Rovněž nebyly pozorovány vedlejší účinky (zácpa, steatorrhoea), které jsou známé u použití polymerů, tzn.

že nedochází k nepříznivému ovlivnění trávení tuků. S ohledem na vysokou afinitu ke specifickému transportnímu systému žlučových kyselin tenkého střeva, stačí použít sloučeniny podle vynálezu v malých dávkách, takže léčiva s obsahem účinných látek'podle vynálezu jsou pro lékaře a pacienta obzvláště přijatelné.

Obzvláště výhodné jsou sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém

G1 znamená zbytek obecného vzorce II

ve kterém

Y znamená

OH, O-(C_rC₄)-Alkyl, -NHCH₂COOH,

-NCHnCOOH, -NHCH₂CH₂SO₃H, -NCH₂CH₂SO₃H l l

CH₃ ^CH3

R¹ znamená atom vodíku, benzylovou skupinu, bifenylmethylovou skupinu, formylovou skupinu nebo acetylovou skupinu,

R² a r\ popřípadě R⁴ a R⁵ vždy'společně znamenají atom kyslíku karbonylové skupiny nebo

5

R až R jednotlivě a nezávisle jeden na druhém znamenají 0 0

H, -OT, -NHT, -O-C-T, -NH-C-T, -T přičemž T znamená atom vodíku, rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo volnou valenci k mústkové skupině X, přičemž celkem z G1 vychází pouze jedna volná Valence k vázání skupiny X, znamená vazbu

-ch₂ch₂nh-ch₂ch₂ch₂nh-{CH₂)_n-N-C-(CH₂)_m-C-N-(CH₂)₀kde n znamená 2 nebo 3, m znamená 1 až 4, o znamená 2 nebo 3,

G2 znamená zbytek obecného vzorce IV

ve kterém (IV)

Z znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený výše pro Y, znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený výše pro R a

Β? až mají výše uvedené významy pro R^ až R\ přičemž celkem z G2 vychází pouze jedna volná valence ke skupině X.

Vynález se také týká způsobu přípravy sloučenin obec ného vzorce I, jehož podstata spočívá v tom, že se

a) v případě, že X znamená jednoduchou vazbu, uvedou v reakci vhodné formy G1 a G2 způsobem, který je v principu znám, nebo se

b) v případě, že X znamená můstkovou skupinu, uvedou v reakci b1) reaktivní formy G1-X s G2, popřípadě b2) reaktivní formy G2X s G1 způsobem, který je v principu znám, nebo se

c) z G1-X1 a X2-G2 připraví sloučeniny obecného vzorce I (G1-X-G2) známým způsobem nebo, pokud tento způsob není znám, dále blíže popsaným způsobem, přičemž X vzniká z Xl a X2 vytvořením kovalentní vazby, zejména při kondenzační nebo substituční reakci.

a) X znamená jednoduchou vazbu.

Žlučové kyseliny G1 se používají buá ve volné formě nebo v chráněné formě. Po spojení s G2, která se rovněž nachází, se případně provede odštěpení ochranných skupin a C-24karboxylová funkce se případně převede na derivát. Jako ochranné skupiny pro alkoholové skupiny se účelně hodí formylová skupina, acetylová skupina, tetrahydropyranylová skupina nebo terc.butyldimethylsilylová skupina. Jako ochranné skupiny pro

c.

C-24-karboxylovou skupinu přichází v úvahu různé alkylové nebo benzylesterové skupiny ale také například ortho-esterové skupiny. Tak se například uvede v reakci kyselina žlučová výhodně v poloze 3 ale také v poloze 7 s aktivovanými formami ' karboxylových kyselin, jakými jsou chloridy nebo smíšené anhydridy kyselin, za přidání bází, jakými jsou trialkylamin nebo p. ridin ale také hydroxid sodný, ve vhodných rozpouštědlech, jakými jsou například tetrahydrofuran, methylenchlorid nebo ethylacetát ale také dimethylformamid (DMF) nebo dimethoxyethan (DME). Různé izomery mohou být například rozděleny chromatograficky. Použitím vhodných ochranných skupin je možné reakci provést selektivně.

Analogicky je možné převést odpovídající aminožlučové kyseliny na odpovídající amidy. Také v tomto případě může být reakce provedena za použití žlučových kyselin ve volné nebo chráněné formě.

Analogicky mohou být připraveny známými standardními způsoby i další sloučeniny podle vynálezu.

b) X znamená můstkovou skupinu

Za účelem spojení G1-X s G2, popřípadě G1 s XG£ se rovněž použijí způsoby uvedené v rámci odstavce a). Také zde se použije zbytek kyseliny žlučové bud v chráněné nebo nechráněné formě. Výhodný způsob přípravy spočívá v tom, že se uvedou v reakci reaktivní formy G1 s reaktivními formami X-G2. Po této reakci případně následuje odštěpení ochranných skupin a převedení C-24-karboxylové skupiny na derivát.

Příprava reaktivních reakčních složek G1-X, popřípadě X-G2 je ilustrována v následujícím reakčnim schématu.

1

Vlil (ix)

(x) (XI)

R = H, Formyl, Acetyl, FV = H, OH, R = Formyl, Acetyl

( X 1 1 ) (XIN)

(XIV)

(XV) c···,.

R = H, Formyl, Acetyl, R' - H, OH, n = 2, 3

Sloučeniny vzorce V, u kterých je chráněna poloha 3, se uvedou v reakci se systémem tvořeným allylbromidem a Hunigovou bází nebo s triethylaminem. V případě, že sloučenina vzorce V má jednu hydroxy-skupinu, potom je alkylace jednoznačná. U sloučenin se dvěma hydroxy-skupinami dojde přibližně stejným dílem k monoalkylaci v polohách 7a 12, přičemž v reakční směsi lze nalézt pouze stopové množství dvojnásobně alkylovaného produktu. Ochranná skupina v poloze 3 může být buď odštěpena methoxidem sodným nebo může být ve sloučenině zachována pro další reakce. Monoalkylované sloučeniny vzorců VI a VII mohou být štěpeny ozonem nebo také systémem OsO^/NaJO^ na aldehydy vzorců VIII a IX. Z těchto sloučenin se jedoduchou redukcí, například za použití natriumborohydridu sodného, snadno získají 7-, popřípadě 12-hydroxyethylsloučeniny vzorců X a XI. Z allylových sloučenin vzorců VI a VII mohou být hydroborací syntetizovány odpovídající 7-, popřípadě 12-hydroxypropyl-deriváty vzorců XII a XIII. Z hydroxyalkyl-sloučenin vzorců X až XIII mohou být v principu známou reakční posloupnos tí (mesylace primární hydroxy-skupiny působením systému tvořeného chloridem kyseliny methansulfonové a pyridinu, azidace působením NaN^ v dimethylformamidu, redukce azidové funkce vodíkem za katalytických podmíne'k) připraveny aminoalkyl-derivá ty vzorců XIV a XV. Další reakce amino-funkcí těchto sloučenin s anhydridem kyseliny jantarové poskytne sloučeniny vzorců (7/ ·

XVI a XVII. Kromě toho jsou vhodné stavební kameny žlučových kyselin popsány v EP-A 0 489 423.

Vynález se dále týká použití sloučenin podle vynálezu’ pro výrobu léčiva. Za tímto účelem se sloučeniny obecného vzorce I rozpustí nebo suspendují ve farmakologicky přijatelných / rozpouštědlech, jakými jsou jedno- nebo vícesytné alkoholy, jako například ethanol nebo glycerol, v triacetinu, olejích, jakými jsou například slunečnicový olej, rybí tuk, etherech, například v diethylenglykoldimethyletheru, nebo také v polyetherech, například v polyethylenglykolu, nebo také v přítomnosti dalších farmakologicky přijatelných polymerních nosičů/ například polyvinylpyrrolidonu, nebo dalších farmaceuticky přijatelných přísad, jakými jsou škroby, cyklodextrin nebo polysacharidy. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány v kombinaci s jinými léčivy.

Sloučeniny obecného vzorce I se podávají v různých dávkovačích formách, výhodně perorálně ve formě tablet, kapslí nebo kapalin. Denní dávka se v závislosti na tělesné hmotnosti a konstituci pacienta pohybuje v rozmezí od 3 mg do 5Ό00 mg, výhodně však v rozmezí od 10 do 1000 mg.

Sloučeniny podle vynálezu mají cenné farmakologické vlastnosti a hodí se zejména pro použití jako hypolipidemika.

Předmětem vynálezu je proto také léčivo na bázi sloučenin obecného vzorce I, jakož i použití těchto sloučenin jako léčiv, zejména pro snížení hladiny cholesterolu.

Ověření biologických účinků sloučenin podle vynálezu se provádí stanovením inhibice absorpce / H/-taurocholátu v buněčné membráně s kartáčkovým lemem králičího kyčelníku. Inhibiční test se provádí následujícím způsobem:

1. Příprava buněčné membrány s kartáčkovým lememz králičího kyčeníku

5

Příprava buněčné membrány s kartáčkovým lemem z buněk tenkeho střeva se provádí tzv. Mg -precipitační metodou. Králičí samečkové (Neuseeland, tělesná hmotnost 2 až 2,5 kg) se usmrtí intravenózní injekcí 0,5 ml vodného roztoku 2,5 mg TetraR cain-HCl, 100 T 61 a 25 mg Mebezoniumjodidu. Vyjme se tenké střevo, načež se promyje ledově chladným fyziologickým roztokem. K přípravě buněčné membrány s kartáčkovým lemem se použije koncových sedm desetin tenkého střeva (měřeno v orálně-rektalmm směru, tzn. koncový kyčelník, který obsahuje Na -závislý transportní systém žlučových kyselin). Vyjmutá střeva se v sáčcích z umělé hmoty zmrazí pod atmosférou . dusíku na teplotu -80 °C. Za účelem přípravy membránových vesikul se zmražená střeva nechají roztát ve vodní lázni o teplotě 30 °C. Seškrábe se sliznice a takto oddělená sliznice se suspenduje v 60 ml ledově chladného 12 mM Tris-HCl-pufru (pH 7,1), obsahujícího 300 mM manitu, 5 mM EGTA, 10 mg/1 fenylmethylsulfonylfluoridu, mg/1 trypsinového inhibitoru ze sójových bo bú (32 U/mg),

0,5 mg/1 trypsinového inhibitoru z hovězích plic (193 U/mg) a 5 mg/1 Bacitracinu. Po zředění ledově chladnou destilovanou vodou na objem 300 ml se směs toomogenizuje za chlazení ledem v zařízení Ultraturrax (18-Stab, IKA Werk Stuafen,SRN) po dobu minut při 75 % z maximálního výkonu zařízení. Po přidání 3 ml

1M roztoku chloridu hořečnatého (finální koncentrace 10 mM) se nomogenizovaná směs ponechá stát při teplotě 0 °C přesně po do2 + bu jedne minuty. Přídavek iontu Mg ma za následek agregaci a precipitaci buněčných membrán s výjimkou buněčných membrán s kartáčkovým lemem. Po 15 minutovém odstřelování při 3000 x g (5000 otáček za minutu, rotor SS-34) se usazená peleta zavede do odpadu a supernatant, který obsahuje buněčné membrány s kartáčkovým lemem, se odstřeďuje po dobu 30 minut při 267000 x g (15000 otáček za minutu, rotor SS-34). Supernatant se odstraní a usazená peleta se opětovně homogenizuje v Potter Elvejhemově homogenizátoru (Braun, Melsungen, 900 otáček za minutu, 10 zdvihů) v 60 ml 12 mM Tris-HCl-pufru (pH 7,1) obsahujícího 60. mM manitu a 5 mM EGTA. Po přidání 0,1 ml 1M roztoku chloridu hořečnatého a 1 5 minutové inkubační době při teplotě 0 °C se směs znovu cdstřeďuje při 3000 x g. Supernatant se potom ještě odstředuje po

6 dobu 30 minut při 46000 x g (15000 otáček za minutu, rotor SS34). Usazená peleta se vyjme 30 ml 10 mM Tris/Hepes-pufru (pH 7,4) obsahujícího 300 mM manitu a resuspenduje 20 zdvihy v Potter Elvejhemově homogenizátoru při 1000 otáčkách za Řinutu.

Po 30 minutovém odstřelování při 48000 x g (20000 otáček za minutu, rotor SS-34) se usazená peleta vyjme 0,5 až 2 ml Tris/Hepes-pufru (pH 7,4) obsahujícího 280 mM manitu (finální koncentrace 20 mg/ml) a resuspenduje pomocí tuberkulínové stříkačky s jehlou kalibru 27. Získané vesikuly membrán s kartáčkovým lemem se bud bezprostředně po jejich získání použijí k inhibičnímu testu anebo se přechovávají při teplotě -196 °C pod kapalným dusíkem ve 4 mg porcích.

2. Inhibice na Na⁺—závislé absorpce /³H/-taurocholátu ve vesikulách membrány s kartáčkovým lemem kyčelníku

Absorpce substrátu ve výše popsaných vesikulách membrán s kartáčkovým lemem se stanoví tzv. membránofiltrační technikou. 10/Ul vesikulární suspenze (lOO^ug proteinu) se odpipetuje ve formě kapky na stěnu polystyrénové inkubační trubičky (11 x 70 mm), která obsahuje inkubační prostředí (90/Ul) s odpovídajícími ligandy. Toto inkubační prostředí obsahuje 0,75/Ul (=0,75/UCi /³H(G)/-taurocholátu (specifická aktivita 2,1 Ci/mMol), 0,5/Ul 1 OmM taurocholátu, 8,75/Ul Natrium-transport-pufru (10 mM Tris/Hepes (pH 7,4), 100 mM manitu, 100 mM NaCl) (Na-T-P), popřípadě 8,75/Ul Kalium-transport -pufru (10 mM Tris/Hepes (pH 7,4),

100 mM manitu, 100 mM KC1) (K-T-P) a 80/U příslušného inhibičního roztoku, ve kterém je inhibitor rozpuštěn podle charakteru· experimentu v Na-T-pufru, popřípadě K-T-pufru. Toto inkubační prostředí se zfiltruje přes polyvinylidenfluoridový membránový filtr (SYHV LO 4NS, 0,45/Um, 4 mm 0, Millipore, Eáchborn SRN). Smíšením vesikul s inkubačním prostředím je zahájeno měření transportu. Koncentrace taurocholátu na počátku inkubace činí 50/UM. Po uplynutí požadované inkubační doby (obvykle 1 minuta) se transport zastaví přidáním 1 ml ledově chladného přerušovacího roztoku (10 mM Tris/Hepes (pH 7,4), 150 mM KC1). Vzniklá směs se rychle odsaje za vakua 2,5 až 3,5 kPa přes membránový filtr z nitrátu celulózy (ME 25, 0,45/Um, 25 mm průměr, Schleicher u. Schuell, Dassell, SRN). Filtr se potom promyje 5 ml.ledově chladného přerušovacího roztoku.

Za účelem změření absorpce radioaktivně značeného taurocnolátu se membránový filtr rozpustí ve 4 ml scintilátoru Quickszint 361 (Zinsser Analytik GmbH, Frankfurt, SRN) a radioakti vita se změří kapalinově-scintilačním měřením v měřícím přístroji TriCarb 2500 (Canberra Packard GmbH, Frankfurt, SRN).. Naměřené hodnoty se po kalibraci přístroje pomocí standardních vzorků a po korekci na případnou chemiluminiscenci získají jako rpm (rozpady za minutu).

Kontrolní hodnoty se stanoví jak v Na-T-P, tak i v K-T-P. Rozdíl mezi absorpcí v Na-T-P a K-T-P odpovídá Na⁺-závislému podílu transportu. Jako hodnota IC_5QNa⁺ se označuje taková koncentrace inhibitoru, která má za následek snížení Na⁺-závislého transportního podílu o 50 %, vztaženo na kontrolní hodnoty.

Farmakologické údaje zahrnují sérii testů, při kterých byla zkoumána interakce sloučenin podle vynálezu s intestinálním transportním systémem žlučových kyselin v tenkém střevu. Získané výsledky jsou shrnuty v dále zařazené tabulce 11 .

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 a 2

150 g (0,32 molu) methylesteru kyseliny 3-acetylcholové, 500 ml dimethylformamidu, 125 ml N-ethyldiisopropylaminu a 70 ml allylbromidu se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Vždy po dvou hodinách se přidá nový podíl allylbromidu (25 ml). Reakční roztok se potom zahustí v rotační odparce a zbytek se rozdělí mezi vodu a methylenchlorid. Organická fáze se oddělí a vysuší nad síranem hořečnatým. Po chromatografii na sloupci silikagelu s velikostí částic 70 až

200/Um za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a cyklohexanu v objemovém poměru 1:2 se frakce s obsahem požadovaného produktu zahustí v rotační odparce.

Výtěžek: 92,2 g 7-/12-allyl-směsi. \ ^30^H48°6 (504) , hmotové spektrum: 511 (M+Li⁺).

Tato směs se rozdělí frakční krystalizaci z n-heptanu. \

Příklad 1

Příklad 2

Příklad 3

Za intenzivního míchání se smísí 50 g (0,1 molu) sloučeniny z příkladu 1, 250 ml diethyletheru a 250 ml vody. K získané směsi se přidá 503 mg (0,002 molu) oxidu osmičelého. Směs se míchá po dobu 15 minut při okolní teplotě. V průběhu jedné hodiny se potom po částech přidá 53 g (0,25 molu) jodistanu ; draselného a získaná směs se intenzivně míchá ještě 8 hodin. Etherová fáze se oddělí, vysuší nad síranem hořečnatým a zahustí k suchu v rotační odparce.

Výtěžek: 47 g surového produktu.

^C29^H46°7 (506), hmotové spektrum: 513 (M+Li⁺).

Sloučenina z příkladu 3 se použije v následujícím příkladu bez dalšího čistění.

Příklad 4

Ke 47 g (0,093 molu) sloučeniny z příkladu 3 a 250 ml methanolu se při teplotě 0 °C po částech přidá 4,2 g (0,11 molu) natriumborohydridu. Po dvou hodinách při teplotě 0 °C se reakční směs nalije na nasycený roztok chloridu amonného, načež se směs třikrát extrahuje ethylacetátem a sloučené organické fáze se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří v rotační odparce.

Po chromatografií na sloupci silikagelu s velikostí částic 35 až 70/Um za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a cyklohexanu v objemovém poměru 1,5:1 se frakce s obsahem požadovaného produktu odpaří v rotační odparce a ponechají vykrystalizovat z diisopropyletheru.

Výtěžek: 25 g, £29^Η48°7 (508), hmotové spektrum: 515 (M+Li⁺).

Příklad 5

Při okolní teplotě se smísí 10 g (0,02 molu) sloučeniny z příkladu 1a 40 ml (0,04 molu) boran-tetrahydrof uraniového komplexu. Směs se míchá při okolní teplotě ještě po dobu dvou hodin, načež se ke směsi po kapkách přidá 25 ml vody, 25 ml 2n louhu sodného a 25 ml 35% roztoku peroxidu vodíku. Směs se míchá ještě po dobu 15 minut při okolní teplotě. Reakční směs, se nalije do vody a směs se třikrát extrahuje diethyletherem. Sloučené organické fáze se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří v rotační odparce.

Výtěžek: 8,5 g , ^C30^H50°7 (522), hmotové spektrum: 529 (M+Li⁺).

Sloučenina z příkladu 5 se použije dále bez dalšího čistění.

Příklad 6

Při teplotě 0 °C se smísí 10 g (0,02 molu) sloučeniny z příkladu 4 a 100 ml pyridinu. K získané směsi se při teplotě 0 °C po kapkách přidá 1,7 ml (0,022 molu) chloridu kyseliny methansulfonová a směs se míchá ještě 30 minut při teplotě 0 °C a potom ještě 2 hodiny při okolní teplotě. Získaný reakční roztok se nalije na vodu a směs se třikrát extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické fáze se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří v rotační odparce. Zbytek se rozpustí ve 100 ml dimethylformamidu, načež se k získanému roztoku přidá

1,4 g (0,022 molu) azidu sodného a směs se potom míchá po dobu dvou hodin při teplotě 80 °C. Reakční roztok se nalije do vody a směs se zpracuje výše uvedeným způsobem. Zbytek se rozpustí ve 100 ml methanolu a k získanému roztoku se přidá 100 mg paladia na uhlí (10%), načež se získaná směs hydrogenuje po dobu 2 hodin při normálním tlaku. Hydrogenační katalyzátor se odfiltruje a filtrát se odpaří v rotační odparce. Po chromatografii na sloupci silikagelu s velikostí částic 70 až 200/Um za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu , methanolu a Et^N v objemovém poměru 10:1:1 se získá sloučenina z příkladu 6.

Výtěžek: 7,3 g, ^C29^H49^NO6 (507), hmotové spektrum: 514 (M+Li⁺).

Příklad 7

K 500 mg (0,001 molu) amino-sloučeniny, 20 ml tetrahydrofuranu a 4 ml triethylaminu se při okolní teplotě přidá 98,6 mg (0,001 molu) anhydridů kyseliny jantarové. Směs se míchá po dobu jedné hodiny při okolní teplotě. Reakční roztok se nalije do 25% roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného a směs se třikrát extrahuje ethylacetátem. Organická fáze se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří v rotační odparce.

Výtěžek: 580 mg, ^C33^H53^NO9 (507), hmotové spektrum: 614 (M+Li⁺).

Sloučenina z příkladu 7 se dále použije bez dalšího čištění.

Analogicky jako v příkladech 3 až 7 se připraví sloučeniny z příkladů 8 až 12.

Příklady 8 až 12

Příklad	R¹¹	Hmotové spektrum
8	-ch₂cho	513 (M + Li ⁺ )
9	-ch₂ch₂oh	515 (M + Li ⁺ )
10	-ch₂ch₂ch₂oh	529 (M + Li ⁺ )
11	-ch₂ch₂nh₂	514 (M + Li ⁺ )
12	-ch₂ch₂nhcoch₂ch₂cooh	614 (M + Li ⁺ )

Příklad 13

300 mg (0,73 mmolu) kyseliny cholové, 330 mg (0,78 mmolu) methylesteru kyseliny 7beta-amino-3alfa,12alfa-dihydroxy-5-betacholanové (Redel, Bull.Soc.Chim.Fr.,str.877, 1949), 240 mg (0,97 mmolu) EEDQ a 0,25 ml diisopropylethylaminu se míchá ve 20 ml dimethylformamidu po dobu 4 hodin při teplotě 90 °C. Po ochlazení se reakční směs zahustí a zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a methanolu v objemovém poměru 8:2.

C_4gH₈₁NOg (812), hmotové spektrum: 819 (M+Li⁺).

Navázání obou derivátů žlučových kyselin může být také provedeno působením triethylaminu v dichlormethanu nebo dicyklohexylkarbodiimidu, hydroxybenzotriazolu nebo triethylaminu v tetrahydrofuranu.

Analogicky jako v příkladu 13 se připraví sloučeniny uvedené v tabulce 1

Tabulka 1

Příklad	R¹²	_R13	R^u	MS (FAB, 3-NBA/LiCl)⁺
14	σ-ΟΗ	Η	-OH	^C49^H81^NO7 <⁷⁹⁶> ⁸⁰³ (M + Li ⁺ )
15	β-ΟΗ	Η	-OH	^C49^H81^NO7 <⁷⁹⁶> ⁸⁰³ (M + Li ⁺ )
16	Η	Η	-OCHO	^C5O^H81^N°7 (808.5) 809.5 (M + H ⁺ )

+) MS (FAB, 3-NBA/LiCl) = hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl).

Analogicky jako v příkladu 13 se ze sloučenin z příkladů 7 a 8 připraví sloučeniny uvedené v tabulce 2.

CM

Tabulka

WT

X

Rovněž analogicky jako v příkladu 13 se připraví sloučeniny uvedené v tabulkách 3 a 4.

Tabulka 3

Příklad	R¹⁶	MS (FAB, 3-NBA/LiCl)
21	AcO _h	^C62^H1OO^N2°14 <¹⁰⁹⁷) ¹¹⁰⁴ ÍM + Lř)
22	^H-° γ-Aue r4r H	^C6O^H98^N2°13 (1055) 1062 (M + Lr )

Tabulka 4

Příklad	R¹⁷	MS (FAB, 3-NBA/LiC!)
23			^H° Ύ	0	^C53^H87^N010 <^{89S) 905} Í^M + Li ⁺ )
			fHT'	]
	H	H	ťX/ ^ZOH
24	0	H		0	^C62^H1OO^N2°14 (¹⁰⁹⁷> ¹¹⁰⁴ (M + Li ⁺ )
	u	,N^	^0 V	^OMe
	0		46
	A c 0^Ý>		Clv ^ZOH
			H

Příklad	R¹⁷	MS (FAB, 3-NBA/LiCl)
25	0 H0 Y^OU. 0 H	C₆o^H98^N013 (1055) 1062 (M +	Li ⁺ )

Příklad 26

250 mg (0,31 mmolu) sloučeniny z příkladu 13 se rozpustí ve 20 ml ethanolu, načež se k získanému roztoku přidají 2 ml 1N roztoku hydroxidu sodného a směs se míchá po dobu 16 hodin při okolní teplotě. Za účelem zpracování reakční směsi se směs zahustí, zbytek se rozpustí ve vodě, načež se pH směsi nastaví na hodnotu 1 až 2 2N kyselinou chlorovodíkovou a směs se znovu zahustí. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí chloroformu a methanolu v objemovém poměru 8:2. Z odpovídajících frakcí eluátu se získá 220 mg volné kyseliny (90 %).

Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): (:_4θΗ_7θΝΟ_θ ( 798) 805 (M+Li ⁺ ) .

Analogicky jako v příkladu 26 se získají sloučeniny uvedené v tabulkách 5 až 8.

Tabulka 5

Příklad	R¹²	R¹³	Hmotové spektrum
27	σ-ΟΗ	Η	^C48^H79^NO7 <^7θ2> ⁷⁸⁹ (M + Li ⁺ )
28	β-ΟΗ	Η	^C48^H79^NO7 <^{782! 789} (M + L' ⁺ )
29	Η	Η	^C48^H79^NO7 <⁷⁶⁶) ⁷⁷³ (M + U ⁺ )

c·.;.

Tabulka

Tabulka 7

Přiklaď	_r16	Hmotové spektrum
34			0	^C56^H92^N2°12 <⁹⁸⁵> ⁹⁹² (M + LÍ ⁺ )
		^H^Y	γγ
		.m
	H 0^	H	H _XN-
35		^HY	0	^C58^H96^N2°12 í⁹⁸⁸) ⁹⁹² (M + LÍ ⁺ )
		Yí'	3
	H -Ν^χ-	^q\\^x\x^Y ''/q H

Tabulka 8

OH

Příklad	R¹⁷	MS (FAB, 3-NBA/LiCl)
36	0 HO Jl/ H H H	C₅₀H₈₃NO₉ (842) 849 (M + Li ⁺ )
37	⁰ H 0 Η 0^^T^^7/0 H H	^C56^H92^N2°12 (⁹⁸⁵> ⁹⁹² (M + Lň

příklad	R¹⁷	MS (FAB, 3-NBA/LiCI)
38	0 HO Ύ^^ΌΗ 0 H	^C56^H92^N2°12 (^θθ5) 2 (M + Li ⁺ )

Postupem, který je analogický se způsobem syntézy, který již byl popsán (EP 489 423), se získají následující glycinové a taurinové konjugáty.

σ)

Tabulka

Tabulka 10

- 36 Příklad 47

MS (FAB, 3-NBA/LiCl) CggH^Q^NgO^S (1092) 1099 (M + Li )

Příklad 48

V následující tabulce 11 jsou uvedeny namerene hodnoty inhi3 biče absorpce / H/-taurocholatu ve vesikulach membrán s kartáčkovitým lemem králičího kyčelníku. V tabulce jsou uvedeny podíly hodnot IC,-₀, popřípadě získané pro taurochenodesoxycholát (TCDC), který zde byl použit jako standardní inhibitor, a pro jednotlivé testované sloučeniny podle vynálezu.

Tabulka 11

Sloučenina z příkladu	/C^-rCDC{pmo/]	^5°«« TCDC\\s.mot[
/ Ccq “skučenina (μ mol\	/ £50^, “SlcLČadra [ μ mo\
20	0,00	0,12
26	0,00	0,29
27	0,64	0,44
28	0,54	0,43
29	0,23	0,17
30	0,93	0,85
32	1,00	0,80
39	0,92	1,05
40	0,54	0,52
43	1,18	0,96
47	0,35	0,26
48	0,75	0,71

-r/

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

Deriváty žlučových kyselin obecného vzorce I

G1-X-G2 (I) ve kterém

G1 znamená zbytek obecného vzorce II (II) ve kterém

Y znamená OKa, kde Ka znamená ion alkalického kovu, ion kovu alkalických zemin nebo kvarterní amoniový ion, skupinu -OL, skupinu -NHL, skupinu Nl^r přes aminovou skupinu vázanou aminokyselinu nebo aminosulfonovou kyselinu, jako například

-nhch₂cooh, -nhch₂ch₂so₃h, -nch₂cooh, -nch₂ch₂so₃h

CH.

CH.

a jejich alkylestery, ve kterých alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, soli alkalických kovů a soli kovů alkalických zemin, jakož i kvartérní amoniové soli, přičemž

L znamená atom vodíku, alkylovou nebo alkenylovou skupinu obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, která je rozvětvena nebo nerozvětvena, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, fenylovou nebo benzylovou skupinu, která je nesubstituována nebo jednou až třikrát substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující atom fluoru, atom chloru, atom bromu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a alkoxylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, i

R znamená atom vodíku, alkylovou nebo alkenylovou skupinu obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, která je rozvětvena nebo nerozvětvena, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, benzylovou skupinu, bifenylmethylovou nebo trifenylmethylovou skupinu, jejichž jádra jsou nesubstituována nebo jednou až třikrát substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující atom

fluoru, hující 1 hující 1 atom chloru, atom bromu, alkylovou až 4 uhlíkové atomy a alkoxylovou skupinu skupinu obsa- obsa- až 4 uhlíkové atomy, skupinu 0 0 0 II II II s -P-OL , -S-OL nebo -C-L _t 0 II 0 kde L má výše uvedený význam,

R² a R², popřípadě R^ a R^ vždy dohromady znamenají atom kyslíku karbonylové skupiny nebo
2 5

R až R jednotlivě a nezávisle jeden na druhém znamenají c ·. ·

OL

H, -OT, -ST, -NHT, O-C-T, -S-C-T, -NH-C-T, -O-P-OT, -O-S-OT, -T ,

I! i

O O V přičemž T má význam jako L nebo má volnou valenci k vá- \ zání skupiny X, přičemž celkem z G1 vychází pouze jedna volná valence k vázání skupiny X,

X znamená jednoduchou vazbu nebo skupinu obecného vzorce III

4-(N)_s-A-N-C-{CH₂)_q-C-]_r-N-(B)_t(III)

L¹ L²

L³ ve kterém

A a B znamenají alkylenové řetězce, které jsou rozvětvené nebo nerozvětvené a které mohou být případně přerušené skupinou -0- nebo -S-,

12 3 x

L , L a L , které jsou stejné nebo odlišné, mají význam jako

L, q znamená 0 až 5, r znamená nulu nebo 1, s znamená nulu nebo 1, t znamená nulu nebo 1,

G2 znamená zbytek obecného vzorce IV

Q-γ «ί (IV) ve kterém

Z znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený pro Y,

Κθ znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený pro R ,

R az R mají významy uvedene pro R az R , přičemž celkem z G2 vychází pouze jedna volná valence ke skupině X.

2. Deriváty žlučových kyselin podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém

Gl znamená zbytek obecného vzorce II ve kterém

Y znamená

OH, 0-{C₁-C₄)-Alkyl, -NHCH₂COOH,

-nch₂cooh, -nhch₂ch₂so₃h, -nch₂ch₂so₃h _z ¹ CH

CH₃ ^ch3 r! znamená atom vodíku, benzylovou skupinu, bifenylmethylovou skupinu, formylovou skupinu nebo acetylovou skupinu,

R² a R², popřípadě R²^ a R$ vždy společně znamenají atom kys- : líku karbonylové skupiny nebo

R až R jednotlivě a nezávisle jeden na druhém znamenají 0 0

H, -OT, -NHT, -O-C-T, -NH-C-T, -T _f přičemž T znamená atom vodíku, rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo volnou valenci k mústkové skupině X, přičemž celkem z G1 vychází pouze jedna volná valence k vázání skupiny X,

X znamená vazbu,

H

-ch₂ch₂nh- _z

-ch₂ch₂ch₂nh0

-{CH₂)_n-N-C-(CH₂)_m-C-N-(CH₂)₀H H kde

n znamená 2 nebo 3, 4 m znamená 1 až 4, o znamená 2 nebo 3, G2 znamená zbytek . obecného vzorce IV

ve kterém

Z znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený výše pro Y, znamená volnou valenci ke skupině X nebo má význam uvedený výše pro R¹ a

R⁷ až rIQ mají výše uvedené významy pro R² až R^, přičemž celkem z G2 vychází pouze jedna volná valence ke skupině X.
3. Způsob přípravy derivátů žlučových kyselin obecného vzorce I podle nároku 1,vyznačený tím, že se

a) v případě, že X znamená jednoduchou vazbu, uvedou v reakci vhodné formy G1 a G2 způsobem, který je v principu znám, nebo se

b) v případě, že X znamená můstkovou skupinu, uvedou v reakci b1) reaktivní formy G1-X s G2, popřípadě b2) reaktivní formy G2-X s Gl způsobem, který je v principu znám, nebo se i

c) z G1-X1 a X2-G2 připraví sloučeniny obecného vzorce I (G1-X-G2) známým způsobem nebo, pokud tento způsob není znám, výše blíže popsaným způsobem, přičemž X vzniká z X1 a X2 vytvořením kovalentní vazby, zejména při konden- \ začni nebo substituční reakci. <
4. Léčivo, vyznačené tím, že obsahuje derivát žlučové kyseliny podle nároku 1.
5. Hypolipidemikum, vyznačené tím, že obsahuje derivát žlučové kyseliny podle nároku 1.
6. Použití derivátu žlučové kyseliny podle nároku 1 jako léčiva.