CS89491A3 - Hybrid calcitonin - Google Patents

Description

ls«W ·νι.?· .-

. ,<·. . ··««»·- ;ΐ -1- Ξ;

~ I

Hybridní kaleitónin .

TJZO

í> O: o < o»í S> '< 7> |1 <— j> tΓΠ >‘D

N -< rors} '

Oblast?techniky Předložený vynález se týká nových analogů kalcitoni-nu, majících biologickou účinnost.

Dosavadní stav techniky U kalcitoninu je znám jeho přirozený výskyt v úho-řích, - lososech, kuřatech, u~hovězího, vepřového, skopovéhodobytka, u krys a u lidí. Ze kteréhokoliv zdroje je při-rozeně se vyskytující kalcitonin složen ze 32 aminokyse-lin. Například lidský kalcitonin má následující pepti-dovcu strukturu: . ;r. >" 7 H-C ys-Gly-Asn-Leu-Se r-Thr-^ys-Met- Le u-Gly- 1.2 3 4 5 6 7,8 9 10

Thř-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-11 12 13 14 15 16. 1718 19 20

Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Ala-Pro-N^ 31 32 ÍL ' 1 -a - '

Uhoří kalcitonin má následující peptidovou strukturu: r——----——:--y , . H-^ys-^er-Asn—Leu-Ser-Thr-Gys-Val-Leu-Gly- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ířl íb ti j \ys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-11 12 13 14 15 16 17’ 18 19 20 •λ; ' ,J - -2-

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Thr.-Pro-NH,31 32 K-alcitonity přirozeně se vyskytující u lidí a zvířatje dále společně označován jako "přirozený kalcitonin". ‘•'aponské zveřejněné popisy patentů Č. 277698/1988,2841:98/1988, 287800/1988, J.Biochem.Vol. 159, str.125(1986), Endocrinology, sv.117, str.80 (1987) a J.Biochem,,sv.162, str.399 (1987) uvádějí analogy přirozených kalci-toninů. Analogy přirozených kalcitoninů zahrnují: analogy,·mající alespoň jeden z aminokyselinových zbytků přirozenéhokalcitoninů nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem (sub-stituční typ); analogy, mající nejméně jeden z ami.nokyse-línových zbytků přirozeného kalcitoninuj (typ s vynecháním);analogy, mající nejméně jeden aminokyselinový zbytek na-víc mezi aminokyselinovými zbytky nebo na konci přirozenéhokalcitoninů (adiční typ); a analogy, mající.dvě nebo vícesubstitucí, vynechání a adicí kombinovaných vzájemně.«Jestliže dva nebo více aminokyselinových zbytků je nahra-zeno, vynecháno nebo přidáno, mohou tyto zbytky na sebenavazovat nebo mohou být umístěný tak, že jsou od .sebe :odděleny v peptidové struktuře, ^yto typy nepřirozenýchkalcitoninů jsou dále označovány jako "analogy kalcitoninů", Přirozený lidský kalcitonin, vyskytující se přirozeněu lidí, však vykazuje nízkou biologickou účinnost.pro člo-věka. Na druhé straně, přirozené kalcitoniny živočišnéhopůvodu jiné než lidský, jako lososí, úhoří ‘a kuřecí kal-citonin, mají vysoké biologické účinnosti pro člověkaa jsou pokládány za nadějná terapeutika pro léčení osteo-poróz, neoplastické hyperkalcemie a Pagetovy choroby. Mimo-to byly již pro terapeutické účely vyrobeny obchodně dostup-

ř j -3- né úhoří kalcitóninové analogy. Bohužel přirozené kalcí- toniny-živočišného původu jiného než lidského a jejichanalogy^mají u'lidí:nežádoucí účinky"jako je těžká nevol-nost,*poruchy funkcí trávící soustavy a antigenicita.

i i

Nevolnost způsobená přirozenými kalčitoniny živočišné-ho původy jiného než lidského a jejich analogy je popsé-, ná v následujících publikacích: > ; 1) K.Takahashi a spol., "Gan to Kagaku Ryoho (Cancer and

Chemotherapy)", sv.12,č.1O, 2004-201 0(1985); ..,_2 ..)- J, Bgawa a spol·.^- "Gan- no Rinsho "(Clihi^al^Áspects of

Cancer)", sv.30, S. 3, 251-258 (1984) a 3)· G.F.ňíazzuoli a spol., Calcif. Tissue Int., 38, 3-8 (1986).

Potuchy funkcí trávící soustavy, vyvolané'přiroze- nými kalčitoniny živočišného původu jiného než lidského 'a jejich analogy, jsou popsány v' následujících publika-cích.: 1.) K.Jonderko, Gut- (England),. 30, 430-435 (1989),, 2) K.Jonderko a spol., J.Clin.Gastroenterol., 12,22-28 '···: (1990)· a ‘ : 3) J.Hotz a spol., Digestion, 20, 180-1.89 (1980). Λ íí

Antigenicita přirozených kalcitoninů živočišného pů-vodu jiného než lidského a jejich analogů, je popsána vnásledujících publikacích: 1) F.R.Singer a spol., J.Ciinical Invest., 51, 2331-2338 (1978), 2) J.G.Haddad a spol., J.Ciinical Invest., 51, 3133-3141(1972) a_ _ 3) . A.Graúer á spol., J.Bone and Minerál Res., 5. 387-3.91 (1990).

I ií ři

Q >1 u i: (í V; ů t ·*;/ ť! Γί J · .1 - - &amp; w ϊ -Φ

Podstata vynálezu

' - I ’ <.· 'Předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí no-vých analogů.kalcitóninu, které dosud v oboru nebyly.zná-my. Stručně řečeno,. tento vynález poskytuje kalcitónin,který, má biologické účinky u lidí a který má u lidí jenmalé vedlejší účinky. Tento kalcitónin podle vynálezu jehybridem lidského kalcitoninu a kalcitoninu živočišného .původu jiného než lidského, tedy hybridní kalcitonin slo-žený z peptidového segmentu lidského kalcitoninu a pepti-dového segmentu živočišného kalcitoninu jiného původunež lidského.

Autoři předloženého vynálezu zjistili, že působnostvedlejších účinků vyvolaných u lidí kalcitoninem živočiš-ného původu jiného než lidského je lokalizována předevšímna aminokonec, zejména v peptidovém segmentu, obsahují-cím 1—16 koncových aminokyselinových zbytků. Také bylozjištěno, že i když všech těchto 16 koncových aminokyseli-nových zbytků lze nahradit, nežádoucí účinky lze elimino-vat', náhradou nejméně 10 těchtoaminokyselinových zbytků.

Pro hlavní biologické účinky kalcitoninu lidskéhopůvodu a živočišného původu jiného než lidského, je dů-ležitý sled aminokyselin na koncové karboxylové skupině,jak je popsáno v následující literatuře” 1) René Maier a spol., FEBS Letters, 48, 68 (1974), 2) René Maier a spol., Clinical Endocřinology, 5, 3275 (1976), ' . , 3) : R.M. Epand a spol., Eur.J.Brochom., 159, 125 (1986) a ';. ' 4) D.M.Findlay a spol., Endocřinology, 117, 399 (1987).

Autoři vynáfezu zjistili, že peptidový segment speci-fikovaný výše, tedy peptidový segment na koncové kařbo-§xylové kyselině, mající hlavní biologickou ,účinnost, nemá ;j žádné., aktivní místa, které by mohla, vyvolávat nežádoucí— iúčihky^u^lidí'a-vyvinuli hybrid--kalcitoninu založený na" tom- . Jto’ poznatku, roto z hlediska snížení nežádoucích účinků,peptidóvý segment, obsahující aminokyselinové zbytky v. 11 .· a dalších polohách směrem k terminální karboxylové .kyselině, můžé tvořit buá lidský kalcitonin nebo kalci- ítonin živočišného původu jiného než lidského. i ' ^a druhé straně, z hlediska biologické účinnosti je však?______’______výhodný kalci tonin,. mající vyšší biologickou účinnost než - - lidský kalcitonin. ^roto peptidóvý segment bližší karbo-xylcvému konci je výhodně segment živočišného původu jiné-ho než, lidského, který má vyšší biologickou účinnost u li-di než lidský kalcitonin. 'í> tohoto hlediska, peptido_v.ý_ ' -——s^gment-^o—kteř ý-s e~je ďné—má-naŤjmé n'ě~4-aminokys e 1’inov é" zbytky a výhodně nejméně 10 aminokyselinových zbytků. Z hlediska výše popsaného, je hybrid kalcitoninu podle i předloženého vynálezu složen ze. dvou peptidových segmen- tů, kde jeden obsahuje 1 .až 10. aminokyselinový zbytek odaminokonce a tento segment' je kalci tóninových segmentem lidského původu a druhý obsahuje 29. až. 32..aminokyselino-vý zbytek směrem ke karboxylovému konci a tento segment je kale itóninovým segmentem živočišného původu jiného nežlidského,, se středním peptidovým segmentem, obsahujícím 1 1 . až 28. ‘aminokyselinový zbytek, mající sled aminokyse- { lin jakéhokoli typu kalcitoninu. Je-li to žádoucí, může I* * 1 , · .přechod sledu aminokyselin lidského kalcitoninu na sekvenci; nehumánního typu kalcitoninu být proveden v jakékoliv po- loze peptidového segmentu mezi 11. a 28. aminokyselinovým _ ' ' —zbytkem’. , ' a- f •Ϊ f

-6- §Χ"f . ϊ“· <r * . * A\ Κ dosažení dalšího snížení nežádoucích účinků je pepti-dový·segment na terminálním aminokonci výhodně složen F J ’ ' -ž ’1 , 'až’ 13. aminokyselinového zbytku lidského kalcitoninu. K dosažení dalšího zvýšení biologické účinnosti je pep-tidový. segment ve 22. až 32.' poloze výhodně tvořen peptido-·vým segmentem živočišného původu jiného než lidského. Pep-tidový.segment ve 14. až 21. poloze terminálního aminokon-ce může mít aminokyselinovou sekvenci jakéhokoliv typu kal-citoninu a může tvořit přechod sěkvence aminokyselin lidské-ho . kalcitoninu na nehumánní kalcitonin v jakékoliv polo-ze tohoto přechodového segmentu. V nejvýhodnějším provede-ní je hybridní kalcitonin podle předloženého vynálezu slo-žen z peptidového segmentu humánního kalcitoninu v poloze 1. až 16. terminálního aminokoŘce a z peptidového segmen-,tu nehumónního kalcitoninu v poloze 17. až 32.. kl

Stručný popis obrázků

Na obr. 1 je graf znázorňující časovou závislost hladiny . vápníku v krevní plasmě po podání různých typůkalcitoninů, . na obr.2 je graf, znázorňující Časovou závislost hodnoťprahové stimulace, získaných po podání různýchtypů kalcitoninů, na obr. 3 je graf, znázorňující změny tělesné hmotnostikrys po podání různých typů kalcitoninů, .na obr* 4 je graf, znázorňující příjem potravy krysami popodání různých typů kalcitoninů, na obr. 5 je graf, znázorňující vztah mezi koncentracíi lososího kalcitoninu a vazbou protilátky a na obr. 6-9 jsou grafy , znázorňující účinnost vazby lo-sosího kalcitoninu a dvou hybridních kalcitoninůha anti-lososí kalcitonin lidského séra. -7- ^ΐ··· . l·,, Výraz "humánní ^lidský) kalcitonin" v tomto popise - ’v .·: znamená-jak přirozený lidský kalcitonin tak přirozeně se...... ; nevyskytující analogy lidského kalcitoninu. Obdobně vý- 'ra’z " nehuménní kalcitonin" nebo kalcitonin živočišného · ί původu jiného než lidského", znamená jak přirozeně se ' i

vyskytující kalcitonin živočišného původu jiného než lidské- J ho, tak přirozeně se nevyskytující analogy tohoto nehumán- j . . ního kalcitoninu. Živočichové jiní než člověk jsou výhod- ; 1 - ně losos, úhoř a kuře, výběr však není na ně omezen. Po- ί ..... čet vyměněných , vynechaných nebo přidaných aminokyseli- - — - j nových zbytků u obou typů kalcitóninových analogů není | omezen na nějakou určitou hodnotu, ale výhodně není 1 větší než 5. Jestliže peptidový segment, o který se jedná,

_neobsahuje více než 5 aminokyselinových zbytků, pak po- _J “čá-t—vymehéhých-T-výh-ěokaiíýoh^^bď^prTdaňých amiňóky se iinčFvých zbytků, není výhodně větší než jeden a jestliže ten- í to peptidový segment neobsahuje více než 10 aminokyseli- | nových zbytků, tak odpovídající počet vyměněných, vynechá- . | . ných nebo přidaných .aminokyselinových zbytků není větší j .... než 3. . .. , . č H il V případě pc-ptidového segmentu humánního kalcitoni- s nu je výhodně sekvence aminokyselinových zbytků od termi- j 1 nálního aminokonce stejná jako u přirozeného humánního kal- ji citoninu nebo tento segment může tvořit peptidový segment £ £ analogů humánního kalcitoninu, majícího stejnou sekvenci f. aminokyselin jako přirozený humánní kalcitonin s tou vý- . ; jimkou, že methicninový zbytek v poloze 8 je nahrazen va-L . ' i] línovým zbytkem, Pokud jde o celý peptidový segment hu- . . mánního kalcitoninu, je výhodný takový analog, kde ne více í než dva aminokyselinové zbytky.v humánním kalcitoninu | jsou nahrazeny, vynechány nebo přidány. Nejvýhodnější' ana- í *! log je takový peptidový segment, který jako celek se liší l od přirozeného typu pouze substitucí methioninového zbytku ; v poláze* 8. í 4»! 1*-·* I* , > -8- V případě peptidového segmentu kalcitoninu živočišnéhopůvodu jiného než lidského, je výhodně tento peptidovýsegment stejný jako přirozený kalcitonin, nebo jím mů-že být peptidový segment nebumánního kalcitoninového ana-logu, kde ne více než 3 aminokyselinové zbytky přirozeného-typu jsou nahrazeny, vynechány nebo přidány. Ještě vý- .hodnější analog je takový peptidový segment, který jakocelek má takovou sekvenci jako přirozený typ, kde pouzejeden aminokyselinový zbytek je nahrazen nebo vynechán. Výhodnými živočichy odlišnými od člověka jsou ti,jejichž kalcitonin má pro člověka vyšší biologické účin-ky. Příklady těchto živočichů zahrnují ryby, jako je lo-'V-sos nebo úhoř, a ptáky jako je kuře. Losos a úhoř je ještěvýhodnější, přičemž je zvláště výhodný losos. *ri zvážení těchto skutečností, m^. hybridní kalcito-nin podle předl o zeného vynálezu následující aminokyseli- /'novou sekvenci: " H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met(nebo Val)-Leu-Gly- 1 2 3 4 5 .6 7 8 '9 10

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp(nebo Glu)-Phe(nebo Leu)-Asn(nefc>o His)-11 12 13. 14 15 16 17

Lys-Phe(nebo Leu nebo Des)-His(nebo Gln)-Thr-Tyr-Pro-Arg-18 19 20 21 22 23 24

Thr-Asn(nebo Asp)-Thr{nebo Val)-Gly-Ser(nebo Ala)-Gly-Thr-25 26 27 28 29 30 3© 32

Pro-NH2

-9- Λ-

*. Λ .hybridním kalcitoninu podle předloženého vynálezuz; jě^fai^část struktury. celého kale i ťoni nu ř-živočišného pů-- vodu'jiného než lidského, jako-lososího,"úhořího nebo ku-řecího," která při podání-člověku.vyvolává nežádoucí účinky ·. (například nevolnost, poruchy funkcí třévécího traktu a I* antigenicitu) nahrazena odpovídajícím segmentem humenníhokalcitoninu, nevyvolávajícím tyto nežádoucí účinky, čímžnežádoucí účinky, vyvolávané částí„nehumánního kalcitoni-nu jsou snížena nebo zcela eliminovány. Ekvivalentně lze říci, že hybridní kalcitonin podlé vynálezu má farmakolo- ______, gicky aktivní místa humánního kalcitoninu nahrazena od-povídajícím segmentem nehumánního kalcitoninu tak, aby sezvýšila žádoucí fyziologická účinnost humánního kalcitoninu... ==i===Hy-b-ri-dní=k-alzeá-tonin=p:odlre=vy-nálre-zti—1-zé—s-y-nWt-i-žovat^^^syntézami v pevné fázi za použití polymerních pryskyřic ne-bo syntézami v kapalné fázi, obecně používanými v oblastiorganických syntéz. Použití syntéz v pevné fázi je výhod-né- v případě syntézy poměrně.malého, množství peptidu- ^aopakpoužití syntéz v kapalné fázi je výhodné při syntéze velké-ho množství peptidu. V příkladech dále uvedených v tomtopopise byly. peptidy syntetizovány syntézami ,v pevné fázi. ..Nicméně jestliže hybridní kalcitonin podle vynálezu mábýt vyroben ve velkém množství, je výhodné použití syn- .téz v kapalné fázi, které jsou velmi dobře známy v oborusyntézy peptidů. .

Obvyklý postup syntézy v kapalné fázi začíná synte-tizováním nejméně dvou dílčích peptidů, z nichž každý jesložen zet dvou nebo více aminokyselinových zbytků, postup-ným spojením’těchto~dílčích peptidů_se závěrečným získá-ním požadovaného peptidu, majícího výše specifikovanou ami-nokyselinovou sekvenci (pro případ tohoto vynálezu je tím-to požadovaným peptidem hybridní kalcitonin, jak je popsá- -10- í' t. no'výše)*. Syntéza v kapalné fázi je dále charakterizována“ prováděním reakce péptidové syntézy v kapalném mediu, zvláš- . Jtě' v; takovém mediu jako je dimethylformamid nebo tetrahydro-' furan..Dílčí peptid je^obvykle složen ze 2 až 20, výhodně - '- .'.'3-15 aminokyselinových zbytků. Ve výhodném provedení se';'syntetizuje asi 2 až 20 těchto dílčích peptidů, které sepak postupně spojují dokončením syntézy požadovaného pep-tidu. ' V péptidové syntéze popsané výše se jako výchozí látkyobvykle použijí reaktivní deriváty aminokyselin. Jestliževýchozí aminokyselina obsahuje aktivní funkční skupiny ji-né než skupiny, tvořící péptidové vazby, je výhodné tytoaktivní funkční skupiny chránit chránícími skupinami,které se odstraní po ukončení syntézy peptidu. Peptid, kte-rý má být vyroben podle vynálezu má disulfidickou vazbu vpoloze 1-7, kterou lze vytvořit v· jakémkoliv vhodném stupninásledujícím po syntéze dílčího peptidu, majícího'sek-venci 1-7· Nicméně tato disulfidická vazba má nízkou stabi- , litu a je,výhodné ji vytvořit až po.ukončení péptidové syn-tézy. Tyto podmínký pro chránění skupin, odstraňování chrá-nících skupin a tvorbu disulfidické v# z by je'také výhodnépřijmout pro syntézy v pevné fázi, které jsou dále popsány.

Syntézy v pevné fázi představují postup syntetizová-ní peptidu, myjícího požadovanou aminokyselinovou sekvenci, postupnou vyzboii aminokyselinových zbytků na pryskyřicovýnosič. Tento postup lze provést automaticky za použitíautomatického syntetizátoru. ...Pryskyřice, které lze použít při syntézách v pevnéfázi, zahrnují chlormethylové pryskyřice, oxymethylovépryskyřice, 4-(oxymethyl)fenylacetamidomethylové pryskyři-ce ,benžhydrylaminové pryskyřice a polyakrylamidové prysky-řice.

i -11- ^''Aminokyseliny použité při těchto syntézách jsou, jak je. . vyžadováno,..chráněnými .aminokyselinami. Příklady- W^-amino- - 'chránících skupin zahrnují karbobenzoxyskupinu (Z), ter-ciární butyloxykarbonylovou skupinu (Boc), 9-fluorenylmethyl-oxykarbonylskupinu (Fmoc), formylovců skupinu (HOG) a acety-lovou skupinu (Ac). Příklady ^-karboxylovýeh chránícíchskupin zahrnují benzylovou skupinu (Bzl), terč.butylovou • skupinu (Bu*'), methylovou skupinu (Me), ethylovou skupi-nu (Et) a fenacylovou skupinu (Pac). Skupiny, které mohou 1 . .111... 1 být použity pro chránění funkčních skupin v am inoky seli. no- vých řetězcích zahrnují: benzylovou skupinu (Bzl), p-to-luensulfonylovou skupinu (Tos), p-nitrofenolovou skupinu (N0?), benzhydrylovou skupinu (Bzh)acetamidomethylovou.. t skupinu (Acm), terč.butylovou skupinu (Bu ), terc.butyl- , --------------o-x-yk:-a-r-bony-l-ov-ou=s-ku-p-i-nu=::(-Boč-)=7—cykd=ohexyí-ovOU=skupi-nu=(-GHe-x-)== a 4-methoxy-2,3J6-trimethylbenzensulfonylovou skupinu (Mtr).Může být použita jedna nebo více takových chránících sku-pin v závisl.osti na účelu, kterého má být dosaženo., ...

Sekvenční adiční reakci aminokyselin lze provést de-hydrata,ční.'kondenzací za použití karbodiimidů nebo pomo- cí aktivních esterů. Vhodné karbodiimidy zahrnují dicyklo-hexylkarbodiimidy a 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)kar-bodiimid a vhodné aktivní estery zahrnují N-hydroxysukcini-mid ester (-OSu),' pentafluorfenolester (-OPfpú a dihydro-xobenztriazinester (-ODhbt). fy i: í‘ fe>: Cí % 5 li , Katalyzátory reakce, které lze použít zahrnují: DMF,r THF, dichlormethan, chloroform, ethylacetát, dioxan, í DMSO, K-methylpyrrolidin, pyridin a vodu. "K odstranění chránících skupin lze použít-různá činid-la v závislosti na druhu chránící skupiny, která má býtodstraněna a účelu, kterého má být dosaženo, příklady vhod-ných činidel zahrnují: fluorovodík, kyselinu trifluoro.cto-vou, trifluormethansulfonovou kyselinu, amoniak/methanol,bromovodík/kyselinu octovou, vodík/palladium na uhlí, octan K•J:Jí i? d' v -12- rtuínatý, kyselinu octovou/préškový zinek, á alkalii/vodu- ' T- ·>. · . , měthanol. A · λ· ϊ* ť’ ' Během Jyntézy nebo po ní lze použít různých čistícíchpostupů jako je chromatografie s reverzními fázemi, chro-mát ografie s normálními fázemi, chromatografie na ionto-měničích, gelová filtrační chromatografie a rekrystali-zace. Disulfidické vazby lze vytvořit oxidací atmosféric-kým vzduchem nebo kyanidem želežitým*

Nesledující příklady jsou uvedeny pro další, ilustra- I \ ci tohoto vynálezu, ale žádným způsobem jej neomezují. Příklady 1-6 představují syntézy vzorků hybridního -kalcitoninu podle vynálezu, příklad 7 uvádí výsledky ana-lýzy složení aminokyselin u vzorků kalcitoninu vyrobenýchv příkladech 1-6· Příklady 8-10 uvádějí pokusy provedená,k hodnocení hlavních účinností hybridního kalcitoninupodle vynálezu* Příklady 11-14 popisují pokusy provedenék prokázání eliminace vedlejších účinků kalcitoninu. Příklady provedeni vynálezu Příklad 1

Syntéza (1-16)lidského/(17-32)lososího hybridního kalcito-ninu H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Me t-Le u-Gly-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Thr-^yr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-1112 13 14 15 16 17 18 19 20

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-G3ý-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

-13 } í .

Thr-Pro-NHg - 31 32 ; .

Syntéza byla provedena reakcí v pevné fázi za po-užití automatického syntetizátoru. (1) ^vedení prolinu na benzhydrylaminovou (BHA) prysky-řici

Deset gramů BHA pryskyřice (-NHgí 0,38 mmol/g) bylosuspendováno a ponecháno nabotnat ve 100 ml DMF. Po odstra-něni supernatantu bylo přidáno dalších 100 ml DMF a paknásledoval přídavek BoéProOH (15 wmol), DCC (20 mmol) aHOBT (20 mmol). Směs byla třepána přes noc při teplotě míst-nosti. Po filtraci přes skleněný filtr byla výsledná prys- ~kyři~c'eΞpromv-ťa~]^ťlϊv-l·éϊϊč1ílori"d~eln. - - ------—- -------------------

J ^otom bylo předáno 200 ml methylenchloridového rozto- ί ku, který obsahoval 10 % obj./obj. anhydridu kyseliny’octo- j vé a směs byla třepána 1 hodinu při teplotě místnosti k za- |

ó I blokováni zbývajících aminoskupin. o ukončení reakce byla |

pryskyřice, promyta methylenchloridem a vysušena pod vakuem. J > ·; - · ' ' . .. i

Po vysušení bylo přidáno 50 ml methylenchloridového s roztoku, obsahujícího 50 % obj./obj. kyseliny trifluor- í octové a směs byla míchána 1 hodinu při teplotě místnosti. t

Po filtraci skleněným filtrem byla takto zpracovaná prysky- § řiče postupně promyta methylenchloridem, methanolem a tri- * «' 1 ·. · í ethylaminem a vysušena pod vakuem. &amp; . - . $ϊ

(2) Sekvenční adiční reakce aminokyselin S - deden gram pryskyřice získané postupem uvedeným v bo-^ % dě 1 byl . vpraven do kolony automatického synte_tizétoru a * aminokyseliny byly sekvenčně adovány za následujících pod- | míněk: i) reakce: 30 min při teplotě místnosti v DMF jako roz- ž pouštědle í -14- X Jť '·? ii) promývání: 10 ain při teplotě místnosti v DMF \ iii) odstranění Fmoc: 10 min při teplotě místnosti s 20 %obj./obj. piperidinu v DMF jako rozpouštědle

iv) . promývání: 10 min při teplotě místnosti v DMF

Opakováním stupňů (1) - (4) bylo po Pro přidáno31 aminokyselin. Použité aminokyseliny jsou uvedeny v tab^ul-ce 1 uvedené dále. . . -15-

Tabulka 1 y -Mj. 1;Λ ·· íFmbc -.V* : γΐΑ ^Pmotl·

FmOC*

Fmoc·

Fmoc·

Fmoc-

Fmoc· . Fmoc·^Fmbc·

Fmoc·

Fmoc·

Fmoc· —Fmoc·

Ii-Thr (But)-

Gly-OPfp -L-Ser (But)- •Gly-OPfp L-Thr (But)· -L-Asn-OPfp -L-Thr (But) - -L-Arg(Mtr)- •L-Pro-OPfp •L-Tyr(But)- L-Thr(But)· L-Gln-OPfp ODhbt ODhbt ODhbt ODhbt OPfp OPfp ODhbt 0,430 g0,3670,4190,3670,4300,412.0,4300,6410,4000,4950,430'0,423

Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0,503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0,510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0,438 Fmo c-L-Asp(OBut)-OPfp 0,457 Fmo c-L-Gln-OPfp 0,423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt . 0,430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0,495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Met-OPfp 0,426 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0,595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0,419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmo c -L-As n -OPfp -^=: — .. =^0,412 __ Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0,595 / . : r -16-

Po-ukončení reakce byly chránící skupiny a pryskyřice’2il>eŘtiďú odstraněny fluorovodíkem a peptid;byl promyt,etherem. Sraženina byla rozpuštěna;,v 50 % obj./obj. vodnémroztoku kyseliny octové a nerozpustný podíl byl odfiltro-ván. Filtrát byl lyofilizován za tvorby asi 600 mg surové-ho peptidu. ] (3) čištění a tvorba disulfidových vazeb.

Podíl (asi 500 mg) surového peptidu byl rozpuštěn vevodě, obsahující 0,1 % obj./obj. TFA a roztok byl zpraco-ván vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na koloněODS.

Eluce kolony byla provedena použitím roztoku A (ace-tonitril, obsahující 0,1 % obj.Obj. TFA) a roztoku B (vo-da obsahující 0,1 % obj./obj. TFA) při postupném gradientu(A/B v % obj./obj.) zvyšovaném od 20 přes 30 až 40 %, kdyfrakce při 30% eluční fázi bylý izolovány #-lyofilizovány.

Dyofilizovaný peptid (46 mg) byl rpzpuŠtěn v 50 ml0,05 % obj./obj. roztoku kyseliny octové a pH roztoku byloupraveno na 8,5 3M vodným roztokem amoniaku. Potom bylopřidáno 1,5 ml OjM roztoku KýFe(CN)g a směs byla míchánapo dobu 30 minut při ^teplotě místnosti ke tvorbě disulfido-vých vazebr Po úpravě pH na hodnotu 5,0 pomocí 50% kyse-liny octové byla přidána anexová pryskyřice (v Cl" formě),směs byla míchána po dobu 20 minut a pak byla pryskyřiceodfiltrována.

Filtrát byl zahuštěn a přečištěn vysokoúčinnou kapali-novou chromatografií na koloně ODS znovu stejným výše popsa-ným způsobem. Frakce z 30% eluční fáze byly shromážděny alyofilizovány za získání 28 mg požadovaného peptidu. í: -17 Příklad 2

••E“-:--—-—-- * 1 -1 • H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-1 2 3 4 5 67 8 9 10

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-11. 12 13. 14 15 16 17 18 19 20

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 -Thr-»Er.o«NH> :-: 31 32 (1) Sekvenční adiSní reakce aminokyselin

Jeden gram BHA pryskyřice se zavedeným prolinem, při- pravené podle stupňů (1) 'přikladu. 1 byl naplněn do kolony,automatického syntetizátoru a aminokyseliny byly přidává-ny za stejných podmínek reakce, jaké byly použity ve stup-ni (2) příkladu 1.Použité aminokyseliny jsou uvedeny v, · .· ·» ' .tabulce" 2 dále. i ,< i* . · 1 -18'

Tabulka 2

Fmó c-L-Thr(But)-ODhbt .0,430 g Fmoc-Gly-OPfp i k ** "t 0,367 Fmoc-L-Ala-OFfp 0,378 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Val-OPfp 0,400 Fmoc-L-Asp4OBut)-OPfp 0,457 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp . 0,641 Fmoc-L-Pro-OFfp 0,400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0,495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Gln-OPfp’ 0,423 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0,503 Fmo c-L-Hi s(Bo c)-OPfp 0,510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0,438 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0,457 Fmo c-L-Gln-OPfp 0,423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,4.30 Fmoc-L-Tyr(But)-CPfp 0,495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt .0,430 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Met-OPfp 0,426 Fmoc-L-Cys(Tri)-OPfp 0,595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt 0,419 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Ásn-OPfp 0,412 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0,595 -19- t . 1 l, * . - Po ukončení reakce byla pryskyřice s obsaženým pep- 7--tidesiizpracovéna stejným způsobem jak je: uvedeno ve stup-''{'.'.S* " T··□·..· _ -. .· ni ; (2) příkladu 1 za získání asi 510 mg surového produktu»peptidu. (2) Čištění a tvorba disulfidových vazeb

Podíl surového peptidu (asi 450 mg) byl podroben přečištěni a tvorbě disulfidových vazeb za použití stej-ných postupů, které byly použity ve stupni (3) příkladu -..... 1. za.získání 32 mg přečištěného produktu - peptidu. Příklad 3

Syntéza (1-16, Met8 >Val8)lidského analogu/(17-32)úhořího hybridního kalcitoninu (---1 H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly- 1 2-3 4 5-6789 10

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-1 1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 .

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Thr-Pro-NH2 ? \ 31 32 : ť s í J · ' t i- (1) Sekvenční adiční reakce aminokyselin l ' ’ í v I y ’ Jeden gram BHA pryskyřice se zavedeným prolinem, připravené podle stupně (1) příkladu 1 byl naplněn do._ , kolony automatického syntetizátoru a aminokyseliny byly přidávány za stejných podmínek reakce, jaké byly použityve stupni (2) příkladu 1. Použité aminokyseliny jsou uvede-ny v tabulce 3 dále. íj

•v. 20-

Tabulka 3

Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt a---f4 · 0,430 Fmoé-Glý-OPfp 0,367 Fmoc-L-Ala-OPfp 0,378 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Val-OPfp 0,400 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0,457 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430; Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp 0,641 Fmoc-L-Pro-OPfp 0,400 Fmo c-L-Tyr(But)-OPfp 0,495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Gln-OPfp 0,423 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0,503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0,510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0,438 Fmoc-L-Asp40but)-OPfp 0,457 Fmoc-L-Gln-OPfp 0,423 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmob-L-Tyr(But)-OPfp 0,495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-Gly-OPfp . 0,367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Val-OPfp 0,400 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0,595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Ser4But)-ODhbt 0,419 Fmoc-L-Leu-ÓPfp 0,411 Fmoc-L-Asn-OPfp 0,412 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0,595

f i 7 : Po ukončení reakce byly pryskyřice;s navázaným pep- • t ** j '· · i. ’ " ·:'·’ 1<I '"“k * 1 11 j *" ’·^ .* j 4 * ' / ' **’ tidem?zpracována stejným způsobem jak^je . uvedeno·, ve;stup-ni(2jfpříkladu 1 za získání asi 580 mg surového peptidu# (2) Čištění a tvorba disulfidových vazeb1 Podíl surového peptidu (asi 500 mg) byl podroben pře- čištění a tvorbě disulfidových vazeb za použití stejnýchpostupů/ které byly použity ve stupni (3) příkladu 1 abylo získáno 35 mg přečištěného peptidu. Příklad 4

Syntéza.(1-16)lidského/(17-31»Pes Leu^) analogu úhoříhohybridního kalcitoninu H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly- .1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Hi s-Lys-Gln-Thr- 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 í

Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Pro-NH2 31 ' i - · · - i t (1) Sekvenční adiční reakce aminokyselin

Jeden gram HHA pryskyřice se zavedeným prolinem, při- ’. ‘i . t · , ' ' pravené podle stupně (1) příkladu 1, bylo naplněno dokolony automatického syntetizátoru a aminokyseliny bylypřidávány za stejných podmínek reakce, jaké byly použity =ve stupni"(2) příkladu’1."Použité aminokyseliny, jsou uve-deny dále v tabulce 4. f -22- tabulka 4 Fmoc-L-Thr (But) -ODhbt 0,430 g Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Ála-OPfp . 0,378 Fmoc-Gly-OPfp - ' 0,367 Fmoc-L-Val-OPfp 0,400 Fmoc-L-Ásp40But)-OPfp 0,457 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp 0,641 Fmoc-L-Pro-OPfp 0,400 Fmoc-L-Tyr(But)-OPf p 0,495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Gln-OPfp 0,423 Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp 0,503 Fmoc-L-His(Boc)-OPfp 0,510 Fmoc-L-Phe-OPfp 0,438 Fmoc-L-Asp(OBut)-OPfp 0,457 Fmoc-L-Gln-OPfp. 0,423 Fmo c-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-L-Tyr(But)-OPfp 0,495 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Met-Opfp 0,426 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0,595 Fmoc-L-Thr(But)-ODhbt 0,430 Fmo c-L-S er{But)-ODhbt 0,419 Fmóc-L-Leu-OPfp 0,411 Fmoc-L-Asn-OPfp ; 0,412 Fmoc-Gly-OPfp 0,367 Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp 0,595

•I 7. 'i -23- 'k_ .

Λν · ϊ-yťÍ’\s * l· ι. /’

Po ukončení reakce byla pryskyřice s obsaženým pepti-.>Stejným způsobem jak/je^ uvedeno ve stupni )Épříkíadu-1 za -získání--asi; 520 mg~suřévého peptidu. " “*-’'·· - ' ' ·· t -.--- ', > -·;>γϊ ' i ; ·..·/", · . · --,··· ; ' Í ·! < /i1 [ : Γ (2)'Čištění a tvorba disulfidóvých vazeb

Podíl surového'peptidu (asi 450 mg) byl podrobenpřečištění a tvorbě disulfidóvých vazeb za použití stejnýchpostupů, které byly použity ve stupni (3) přikladu 1 a bylozískáno 23 mg přečištěného peptidu. Příklad 5 ........ ______________________

Syntéza (1-13) lidského/(14-32) lososího hybridního kal-citoninu H-Čýs -Gly-As n-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-___ * * * *· =-1==2-3^4=5=6=7=θ=^==ρθ--— — , !

Thr-Tyr-Thr-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Lěu-Gln- | 1 í 12 13' 14 15 16 . 17 18 19 20

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- j 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 j í Thr-Pro-NH ..

· . 2 J | 31 32 ' *· ř ‘ *-· · · . r

Syntéza byla provedena reakcí v pevné fázi při použití<· automatického syntetizátoru.

. * I . I (1) Zavečlení prolinu na benzhydrýlaminovou (BHA) pryskyři-ci __ D«set gramů BHA pryskyřice (-NH2: θ»38 mmol/g) bylo suspendováno a ponecháno nabotnat ve Í00 ml DMF. Po odstra-nění supernatantu bylo přidáno dalších 100 ml DMF a paknásledoval přídavek BocProOH (19 mmol), DCC (10 mmol) aHOBT (19 mmol). Směs byla třepána přes noc při teplotěmístnosti. Po filtraci přes skleněný filtr byla výsledná

-24- .ί!Γ pryskyřice promyta methylenchloridem. ^otom bylo přidá- ' v" íď'» ... i ‘ no|200. ml methylenchloridového roztoku, obsahujícíhoj Ί0Ύ%' obj./obj. anhydridu kyseliny octové a směs byla mí-s chána 1 hodinu při teplotě místnosti k zablokování zbýva- jících aminoskupiň. Po zakončení reakce byla směs promytamethylenchloridem a vysušena za vakua.

Po vysušení bylo přidáno 50 ml methylenchloridové-ho roztoku, obsahujícího 50 % obj./obj. kyseliny trifluor-octové a tato směs byla míchána 1 hodinu při teplotě míst-nosti. Po filtraci skleněným filtrem byla takto zpraco-vaná pryskyřice postupně promyta methylenchloridem, metha-nolem, methylenchloridem a triethylaminem a vysušena podvakuem.

Vzorek výsledné směsi pryskyřice byl analyzován na analyzétoru aminokyselin a bylo zjištěno, Že do jednohogramu pryskyřice bylo včleněno 0,31 mmol prolinu. (2) Sekvenční adiční reakce aminokyselin ^eden gram pryskyřice získané postupem uvedeným ve *stupni (1) byl vpraven do kolony automatického syntetizé-toru a aminokyseliny byly postupně přidávány za následu-jících podmínek: (i) adiční reakce: 30 min při teplotě místnosti v DMFjako rozpouštědle

(ii) promývání: 10 min při teplotě místnosti s DMF (iii) odstraněni Fmoc: 10 min při teplotě místnosti s 20 obj./obj.% piperidinu v DMF jako rozpouštědle

(iv) promývání: 10 min při teplotě místnosti s DMF

Opakováním stupňů (1)-(4) bylo po Pro přidáno 31aminokyselin. Použité aminokyseliny jsou uvedeny v tabulce5 dále. -25-

Tabulka 5 •Á

-i#'-.. - ' r A * >- ' : Fmoc-L-Thr (But )-ODhbt- '< *-’ ·* · ‘ > ·* .

Fmoc-Gly-OPfpFmoc-L-Ser(But)-ODhbtFmoc-Gly-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-Asn-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-Arg(Mtr)-OPfpFmoc-L-Pro~OFfpFmoc-L-Tyr(But)-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-Gln-OPfp —„i — -Pmoc-L-L eu-OPf-p-------- ~

Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfpFmoc-L-His(Boc)-OPfpFmoc-L. Leu-OPfpFmoc-L-Glu(OBut)-OPfpFmoc-L-Gln-OPfpFmoc-L-Thr(ButJ-ODhbtFmbc-L-Tyr(But)-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-Glý-OPfpFmoc-L-Leu-OPfpFmoc-L-Met-Opfp ; Γ Fmoc-L-Cys(Trt)-OHJ. i Fmoc-L-Thr(But)-Odhbt i / Fmoc-L-Ser(But)-ODhbt ? Fmoc-L-Leu-OPfp

: ;"Fmoč-L-Ásn-OPfpFmoc-Gly-OPfpFmoc-L-Cys(Trt)-OH 0,430 g 0,367 0,419 0,367 0,430 0,412 0,430 0,641 0,400 0,495 0,430 0,-423 ____ 074ΪΓ' ·'-···-— 0,503 0,510 0,411 0,468 | 0,423 0,430 0,495 0,430 0,367 0,411 0,426 0,464 0,430 0,419 0,411 0,412 0,367 0,464 fí • v -26- .- .VlPo ukončení reakce byly chránící skupiny a prysky-?.->řice/z. peptidu" odstraněny; fluorovodíkem-a peptid byl. prómýt;Vétherem. Sraženina byla rozpuštěna?ve vodném 50% obj./obj. roztoku kyseliny octové a nerozpustný podíl byl odfiltro-: ván. Filtrát byl lyofilizovén za získání asi 720 mg suro- vého peptidu. (3) Čištění a tvorba disulfidových vazeb ^odíl (asi 700 mg) surového peptidu byl rozpuštěn ve vodě, obsahující 0,1 % obj./obj. TFA a roztok byl. zpracován vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na koloně ODS.

Eluce kolony byla provedena za použití mobilní fáze,obsahující vodu a acetonitril, obsahující 0,1 % TFA spostupným gradientem acetonitrilu, zvyšujícím se od 20 %obj./obj. přes 30 % obj./obj. až na 40 % obj./obj., kdyfrakce při použití 30 % obj./obj. eluční fáze byly izolo-vány a lyofilizovény (primární přečištění). ísýofi li z ováný peptid (asi 80 mg) byl rozpuštěn v 80ml 0,05 % obj./obj. roztoku kyseliny octové a pH roztokubylo upraveno na 8,5 3M vodným roztokem amoniaku. Potombylo přidáno 1,5 ml Ó,1M roztoku K^FetCN)^ a směs bylamíchána po dobu 30 minut při teplotě místnosti ke tvorbědisulfidových vazeb. Po úpravě pH na hodnotu 5,0 pomocí50 % obj./obj. kyseliny octové byla přidána anexová prysky-řice (v Cl“ formě), směs byla míchána po dobu 20 min a pákbyla pryskyřice odfiltrována·

Filtrát byl zahuštěn,a opět zpracován vysokoúčinnoukapalinovou chromatografií na koloně ODS, přičemž elucekolony byla provedena stejnou mobilní fází jako při pri-márním přečištění při postupném gradientu acetonitrilu od25, 27 přes 30 až 35 % obj./obj. (sekundární přečištění). ty -/

•3#* “7 .·. ^<3# -27-

•|F , Frakce získané při eluění fázi 30 % obj./obj. byly.shro-7jtážděny a iy°^ilÍ20vány za získání 53 mg uvedeného pep-tidu. . > Příklad 6

Syntéza {1-21)lidského/(22-32)lososího hybridního kalci-toninu 1 --1 H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly- 1 2 3 4 5 6 7 8 9--10

Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-11 12 13 14 15 16 17 18 ,19 20 Ťhr^Ťyí^Přo^Ař^Thř^Asn-TKř^Gly^S er-Gly-21 22 23,.24 25 26 27 28 29 20

Thr-Pro-NH2. 31 32 6eden gram BHA pryskyřice se zavedeným prolínem podlestupně (1) příkladu 5 byl naplněn do kolony automatickéhosyntetizátoru a byly přidévány aminokyseliny za stejnýchpodmínek reakce, jaké byly použity ve stupni Í2). příkla»du 5* Použité aminokyseliny jsou uvedeny v tabulce 6 dá-le. í 1 í -28-

Tabulka 6

Fmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-Gly-OPfpFmoc-L-Ser(But)-ODhbtFmoc-Gly-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-Asn-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-Arg(Mtr)-OPf pFmoc-L-Pro-OPfpFmoc-L-Tyr(But)-OPfpFmo c-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-His(Boc)-OPfpFmoc-L-Phe-OPfpFmoc-L-Lys(Boc)-OPfpFmo c-L-Asn-QPfpFmoc-L-Phe-OPfpFmoc-L-Asp(OBut)-OPfpFmo c-L-Gln-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-Tyr(But)-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-Gly-OPfpFmoc-L-Leu-OPfpFmoc-L-Met-OpfpFmoc-L-Cys(Trt)-OPfpFmoc-L-Thr(But)-ODhbtFmoc-L-Ser(But)-ODhbtFmoc-L-Leu-OPfpFmo c-L-Asη-OPfpFmoc-Gly-OPfpFmoc-L-Cys(Trt)-OPfp t θ,430 « , „ ! 0,367 · ' · ' | 0,419

0,367 J • 0,430 ξ 0,412 0,430 i 0,641 - ’j 0,400 ‘ 0,495 0,430 j 0,510 " 0,438 { 0,503 ’ 5 ' 0,412 t 0,438' 1

0,457 J

0,423 J 0,430 |

0,495 J 0,430 0,367 0,411 1 0,426 . | 0,595 l 0,430 0,419 g 0,411 j 0,412 | 0,367 . 0,595 j íí

I -29

P ro ukončení reakce byla pryskyřice s.obsaženým pep-tidem zpracována stejným způsobem jak je uvedeno ve stup-ni (2) příkladu 5 za získání asi 860 mg surového peptidu·r ’(2) Čištění a tvorba disulfidových vazeb χ-

Podíl surového peptidu (asi 850 mg) byl podroben.pře-čištění a tvorbě disulfidových vazeb za použití stejnýchpostupů, které byly použity ve stupni (3) příkladu 5. Výsledný filtrát byl zahuštěn a opět zpracován vysoko-účinnou kapalinovou chromátografií na koloně ODS, přičemželuce kolony byla peovedena stejnou mobilní fází jakopři primárním přečištění při postupném gradientu aceto-nitrilu od 24 do 35 % obj./obj. přes 26, 28 a 30 % obji/obj.—(-sekwd^n-í^č-iš-t-ění-)v77FrakceTzfs:kané~při~elučni~fá~zi~287%7~7?obj./obj. byly shromážděny a lyofilizovány za získání 66mg požadovaného peptidu. Příklad 7

Analýza složení aminokyselin Všechny přečištěné hybridní kalcitoniny připravenév příkladech 1-6 byly hydrolyzovány při 150 °C po dobu1 h v prostředí-6N HC1 a složení aminokyselin bylo stano-veno pomocí analyzátoru aminokyselin. Výsledky jsou uvede-ny v tabulce 7. řj

v. Λ: -30- oznémka: teoretická.hodnoty jsou uvedeny v závorkách T3 ’> r “ T ·~3 Γ z < > . o o 05 > P >i-»· B . 3 m· • · «< 3 Π o << η· qr k; O o ts f—« P p o tr. w 0 <*3 . ω ω Ό ' o c rt P c? ·< X o o .x ' O PV V ω" <9 .. *r·

P P P p P - tO co o • o. ' *< o. Ji ' to' P CD CD . •Ό h< co · o, ó- O O ,O P co p ' co -q P P Η» q P ;Ci to ..p to oi -4 ji a CO 1 CO Ji ’ K s—* P j"* z—x •x-x. x-·. P to ' p p P . P /. to co . H> O o Ji- to to P w : .» .' - Qj '' u , ·< * P z ’.-. T3 P P I-1 P p to co o P P £>. to o Ol co ** P CD o o O O o P CD o O to to oo co P řf to o Ji Có CD. 05 p- oo ~q P . o CD Ol to to P Z-\ z—< Z“X z—\ Z—S Z“X Z“X z-x Z“X z—x z*x z*> z-x. Z-X, z-x (0 w P P. P P. to co P P Ji to P 03' co o, Sw'„ **** **** XZ *—*· x—z **.' to P. o H* P to co o to P P .' to ' o Ol CO co co o P o O M' o o F-1 CO 00 . Ji P oi co to to P to ó P to Ji Ol to Ji to z-x z-x z—% Z“X z—·» z—X Z"X Z“X z~x z“x z“x Z“X z—X to P P P P to co o to —1 Ji to P 05 co X.Z Xrf* •^z X_Z X^Z X-Z XrfZ X^· *c Η» X-

H 0?

(P co

Tabulka 7 i* i/Λ t P o p.. P P to to o . . P : o . Ji to : o ui ,·ω cd’ co o 6' Ό. o o,. co P . ω ó·. to oo CD. . P CO co CD oo -q CD CO o to o cc . oo P cn . s <X .—.', . x-*. ' I*-*. Z—v Z—v ' Z*S' to P . M P p ' to to P P . 1—1 P to H*· . CD co- X—z x_z x-X x_z X_Z v-* X-Z <p. ' " '. > .•σ κ

PV Η £0 Ρ· . P o P o to P P o o P CO' P CD to 1 ' 00 có- o o' P CO . o o P co P P CD cn tn to . cn P P to P Ό P Z“ z^. • Z“*\ Z“b Z“-· í“·.' /—v. *—' to P P P O to P H o o P CO to -q. to

£P

Ol *}

' to o o o to to. to o P P. P CD P . P3 o o t' . o co CD cn: o- o o CD Ol o o 00 cn xr CD Ol tO : o -q P o CO •q ,o P . 05 o . P z-*s z**x z**\ z-*» Z^i z—s z-^ z^i z-x z-\ z—X - P to P P P to to to P o o P P to -q P o. \_z b_Z b_Z IluZ ^-Z · v^z *sZ * CD -31- Příklad 8

Stanovení biologické účinnosti, ’ ·" 1 šest nových kalcitoninů připravených v příkladech1-6 bylo rozpuStěno v 0,1M pufru octanu sodného (pH 4,2), 'r který obsahoval 0,1 % BSA (hovězí sérový albumin) a injekč-ně podány SD krysím samcům (4 týdny starým) podrobeným hladovění (24 h) do ocasní žíly. řo jedné hodině byla sta-novena koncentrace sérového .kalcia metodou OCPC ( ^al-cium G - Test tfako of tfako Pure Chemical Industries, Ltd·). 4 Účinnost kalcitoninů, která způsobila 10% sníženíkoncentrace sérového kalcia byla zvolena jako 10 mJ a po-čet jednotek v jednom miligramu kalcitoninů byl označen ___.:___^_^jako-JÍ-specií,-i7čká_účinnos-t!i._Výsleďky_jsou_uv-e.deiiy±_v_ta6uIíL___- ce 8.

Tabulka 8 i r

Nový kalcitonin specifická aktivita (J/mg) příklad 1 2106x / 2 2639 í 3 2262 -i 4 2611 1 í 5 2575 - 6 1792 Ί; ti *’ xPrůměr ze dvou měření -32-

Tir.**'**· a&amp;'Ž2Mí ;B* Příklad 9 ;J§r, ;·- účinnost kalcitoninú vůči hyperkalcemii

Postup: ' . . 5 týdnů starým SD krysím samcům byl 4 dny po Soběorálně podáván vitamin D-^ (5 mg/kg) tak, aby se vytvořilexperimentální model hyperkalcemických krys. Pátý den byl - subkutánní injekcí podán (1-16)lidský/(17-31Jlososi hyb- ridní kalcítonin (hybridní kalcitonin 1), lososí kalcitonin » a lidský kalcitonin, každý v množství 4 IU/kg. v daných . Z" časových intervalech byly odebírány vzorky krve a byla ,stanovena koncentrace kalcia v plasmě. Výsledky a diskuse: Časové závislosti hladin kalcia v plasmě pro zkoušené

I kalcitoniny jsou znázorněny na obr. 1.. Jak je zřejmé z* obr.1 všechny testované kalcitoniny, tj., hybrid kalcitoni-nu 1, lososí kalcitonin a lidský kalcitonin vyvolaly rychlésnížení zvýšené hladiny krevního kalcia. Je proto zřejmé,že hybridní kalcitonin podle vynálezu je stejně účinnývůči hyperkalcemii, jako lososí kalcitoninja lidský kal·»citonin. ?. . Příklad 10 Ánalgetický účinek kalcitoninú i) zvířata ts Bylo použito deset králičích samců (Kbl:JW) o hmot- nos ti 2,7-3,2 kg. ii) Implantace-zaváděcí kanyly pro intraventríkulárnípodání

Králíci byli fixováni ve stereotaxickém zařízení pod

• ii..· i

f pentobarbitalovou anestezí (30 mg/kg i.v.). Po .naříznu-, tí -kůže byla vodící kanyla , pro intraventrikulární* podání ' * i , i r. j. - zavedena u každého zvířete;do levého laterálního ventri-kulu a fixována dentélním cementem (stereotaxické souřad-nice- od bregma: posteriorně 4,0 mm, laterélně 5,5 mm,ventrálně 5,5 mm). Po jednotýdenní rekonvalescenci bylikrálíci podrobeni pokusu popsanému níže. ^o pokusu bylainjektována methylenová modř k ověření umístění kanyly. iii) Zkouška antinocicepce králíci byli fixováni v kleci a do obou laterálních stran horního hlavního řezáku byly vyvrtány díry o prů-měru 1 mm a do. hloubky 1 mm pomocí zubolékařské.: vrtačky..

Do každé díry byla upevněna, stimulační elektroda a.byla...ap-l-i-ko v-éna—el-ek^-r-i-ck-á-s-t-i-mulače—(-5-α8γ^5-ΗζγΛάοΒβ-Βρ-11-:£ΰ:^kace 3 s) při různých napětích pomocí elektrického stimu-látoru ( Nihon Kohden Corp.) ke stanovení stimulace mez-ních hodnot (V), vyvolávajících u pokusných zvířat oli-zování (olizování a pohyb pysků, snižování čelisti). Měření byla prováděna jednu hodinu před podáním léčiva,bezprostředně po podání léčiva, rovněž jako 0,5 h,. 1 ,'0.h, 1,5 h, 2,0 h, 3,0 h a 4,0 h po podání léčiva. I. , í - · -

Testovanými léčivy byl (1-16)lidský/(17-32) lososíhybridní kalcitonin (hybridní kalcitonih 1), lososí kal-citonin a lidský kalcitonin, z nichž každý byl podán intra-veritrikulárně v množství ekvivalentním 8 IV/kg. V kon-trolním pokuse byl použit fyziologický solný roztok. Výsledky a diskuse: Časové závislosti stimulace prahových hodnot pro —testované kale i tóniny jsou uvedeny na obr. 2. u'ak lzevidět z obr. 2, uvedené tři kalcitoniny vyvolaly srovná- -34- .telné zvýšení prahových hodnot, které dosáhly maxima 0,5·. ’ϊν /;·βΐ^5ί1ι\ρο- jejich.podání» Lze proto usuzovat, že hybridní J;.,i kaťcitonin*podle vynálezu mé stejnou analgetickou účin-j í ' riost jako lososí a lidský kalcitonin. ‘ ;·' řříklad 11 . ' i ^Činky.kalcitoninů na inhibici hmotnostního přírůstkua apetitu ! ' z · ^ostup: ‘

Krysám byl intramuskulérní injekcí podán (1-16)lidský/(17-32) lososí hybridní kalcitonin (hybridní kalcitonin1), lidský kalcitonin a úhoří kalcitonin a po 24 h byla ř:sstanovena jejich tělesná hmotnost a spotřeba krmivá. Výsledky i

Změny tělesné hmotnosti krys po podání' různých kálci-toninů jsou uvedeny na obr. 3 a změny spotřeby krmivá naobr. 4. Kagdý z kalcitonínů byl podán ve třech různýchdávkách: 12,5 Ul/kg, 50 Ul/kg a 200 IU/kg. U změn těkes-né hmotnosti jsou uvedené hodnoty průměrem pro 5 krys, uspotřeby krmivá se jedná o spotřebu pro.5 krys.

Diskuse:

Vak je zřejmé z obr. 3 a 4, lososí a úhoří kalci-í tónin vykazuje dávkově závislé účinky na inhibici hmot- nostního přírůstku a apetit, zatímco hybridní kalcitonin»1 . 1 a lidský kalcitonin nevyvolávají žádné diference tělesnéhmotnosti a spotřeby potravin. Lze proto konstatovat, žehybrid kalcitoninu podle vynálezu vyvolává jen tak maléúčinky na tělesnou hmotnost a apetit jako lidský kalci- tónin. -35- Příklad 12 ^činky kalcitoninů na dobu vyprázdnování žaludku r ' - «i.' , í . ··.->·· *

Postup:

Fenám beaglů, od předcházejícího dne hladověných, bylinjekčně podán jednou vénou cephalica (1-16)lidský/(17-32)lososí hybridní kalcitonin (hybridní kalcitonih 1), loso-sí kalcitonin, lidský kalcitonin a fyziologický solný roz-tok. 0 hodinu později byly orálně podány enterosolventnítablety),aspirinu (obsahující 200 mg účinné látky) společ-ně se 25 ml vody* Fotom byly v daných časových intervalechodebrány z další vény cephalica vzorKy krve a plasma získa-ná obvyklým způsobem byla až do rozboru vzorku uchovávánapři -20 °C. - - - Př-i-pr-ůchodu-stř-evni~stěnou~je—v-ě-tšina-pojáži-tého·-. — aspirinu metabolizovéna a dostává se do krevního řečištěve formě kyseliny salicylové. ^roto byla stanovována kyse-lina salicylová jako markér aspirinu*.K 50 /Ul plasmy bylopřidáno 200 ^ul ethanolu, směs byla. odstřelována 1 min přifrekvenci otáčení 10000 min-a získaný supernatant bylzpracován HPLC. / Výsledky:

Zpožáující účinky všech zkoušených kalcitoninů na v dobu vyprázdnování žaludku jsou shrnuty v tabulce 9* U kaž-dého pokusného zvířete byl vypočten rozdíl mezi dobou odpodání kalcitoninů k absorpci aspirinu a dobou od podánífyziologického solného roztoku k absorpci aspirinu k ur- v čení doby zpoždění vyprázdnování žaludku. e

-36-

fe

Tabulka 9 " . 7 «7 . ^alcitonin dávka doba zpoždění rozdíl zpoždění , yng(IU)/kg _h__h_ hybridní i kalcitonin 0,6 (1,2) 1,9 4,8 7,7 0,0 3,2 6,6 1 10· (21 ,0) 5J 18,0 21,4 3,3 16,3 20,3 0,1 (0,4) 2,0 2,0 0,3 0,7 lososí 0,3 '(1,2) 2,7 4,5 11,1 0,0 3,9 10,0 kalcitonin 0,6 (2,4) 22,0 30,0 45,0 .z 19,4 29,4 43,1 lidský 6 (1,2) 3,0 3,9 4,0 1,3 2,6 2,9’ kalcitonin 100 (20,0) 5,0 6,9 4,4 5,0

Poznámka1

Doba zpoždění: doba od podání aspirinu k jeho absorpciRozdíl zpoždění: rozdíl v dobách absorpce aspirinu při podání kalcitoninu a fyziologického solného roz-toku.

Diskuse: ífak je zřejmé z tabulky 9, lososí kalcitonin má vel-mi silné zpožáující účinky na dobu vyprazdňování žaludku,zatímco lidský kalcitonin má tyto účinky slabé. Zpožáujícíúčinky na vyprazdňování žaludku hybridu kalcitoninu 1byly podobnější lidskému kalcitoninu než lososímu kalcito-ninu. ^ze proto učinit závěr, že hybridní kalcitonin Ipodle vynálezu lze podávat ve vyšších hladinách jednotekúčinnosti než lososí kalcitonin. -37-

W ’ . ! I, r, f : . J í ' 2Příklad 13 · y-» ·;:·'' -4<*učinky kalcitoninů na gastrointestinální motilitu psů r ,· · · V* . £ - -..1.1 : vědomí | ’ . , 1 -; Postup: '· ! ,^draví psi beagle o hmotnosti asi 10 kg byly aneste- í zováni i.v. injekcí pentobarbitalu sodného a za aseptic- i *' .. " 'kých podmínek jim byla otevřena břišní dutina.

Do serozní blány antra žaludku, duodena a lačníkubyly všity speciální hliníkové převodníky síly, slouží- s cí.ke sledování kruhových svalových kontrakcí způsobem í dříve popsaným (Itoh.a spol., Gastroenterol Jpn. 12, 275 1977). Přívodní dráty těchto převodníků, vycházející z břiš-ní dutinyίbyly vyvedeny kožním řezem mezi lopatkami,

Po této břišní operaci byl na prevé přední straněkrku proveden 5 cm podélný kožní řez k vystavení, vnějšíjugulérní žíly. i'

Touto žílou byla do horní duté žíly zavedena trubi-ce ze Silastikiu (Prench size 8,5, Dow corning, Midland, MI) a všita do přilehlé kůže pro i.v. injekční podánízkoušených léčiv. ’ í . “ '*· _ r

Pq operaci byl psovi nasazen korzetový chránič k fi-xaci vodících drátů a silastikové trubice. řes byl umístěn do individuální experimentální kle-ce a byla mu v 17 h podávána konvenční psí strava, přičemžbyla voda poskytována bez omezení.

-38- ” Gastrointestináiní motorická aktivita byla zazname-\bávána.pomocí , zapisovače s termickým záznamem (WR-3101, Graph-•^^^^rc^TeTiqro^-.^aponskoú/přo připojení vodících drátů, pře- '4?Λ4&amp;Φ4£ίίΑ'**&amp; připojující, kabel zesilovače (UG-5, Nihon Koh-’ den; Tokyo, Japonsko). .-'i | ř t] il i

Asi dva týdny po operaci mohla být gastrointestinál-. ní kontraktilní aktivita rozdělena na dva typy aktivity, - b :interdigestivní stav a digestivní stav. V interdigestivním stavu byly pozorovány IMC (inter-

• I digestivní migrační motorický komplex) v pravidelných in-tervalech 100 až 120 min v antru Žaludku, migrující doduodena a lačníků konstantní rychlostí. í í

I

4 .. · ί··

všech pokusných zvířat krmení přerušovalo pravi-delnost. BJC. Pokusy byly provedeny v intradigestivním sta-vu. Léčivo bylo rozpuštěno v 0,9% solném roztoku a podáno zavedenou Silastikovou trubičkou během asi 10 sekund v dév-- ·*!. ce 0,3 ml/kg 15 minut po skončení IMC v antru žaludku snásledným promytím 0,9% solným roztokem. . * Ϊ ; Byla měřena doba do dalšího výskytů IMC po podáníléčiva a použita jako index in. hibiční aktivity léčivana gastrointestinální motilitu.. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10. ϊ1 i' 4 -39- ^abulka 10 ·» *r *

I L lososí i- . kalcitonin dávka, /Ug/kg(U/kg) ’ IMC zpoždění 0,1 (0,4) 0 0,3 (1,2) 1 1,0 (4,0) 2 lidský dávka, /Ug/kg 100 300 1000 kalcitonin (U/kg) (20) (60) (200) IMC zpoždění 0 0,5 0,5 hybridní dávka, /Ug/kg 0,03 0,1 1,0 kalcitonin (U/kg) (0,06) (0,21) (2,1) 1 IMC zpoždění 0 0,5 1 3 (12) 3 3,0 100(6,3) (210) 1 1 hybridní—dávka,—^ug/kg— 0TQ31tg_—3y0—10—30—100— kalcitonin (U/kg) (0,5) (1,8) (5,4)(18)(54)(180) 2 . IMC zpoždění 0 0,5 1111

Poznámka: 1. Udaje ’'IMC-zpoždění" znamenají následující: 0... příští IMC se objevilo do 180 minut popodání . ’0,5... příští IMG se objevilo v době více než 180 minut po podání, ale do 300 minut po podáni |1 ... příští IMC se objevilo jeden den po podání ř 2 ... příští IMC se objevilo dva dny po podání í , ’3 ... příští IMC se objevilo 3 dny po podání 2. hybridní kalcitonin 1 byl (1-16)lidský/(17-32)lososí kal-citonin a hybridní kalcitonin 2 byl (1-21)lidský/(22-32)lososí kalcitonin.

Diskuse: uak je uvedeno v tabulce 10, lososí kalcitonin podanýi.v. vyvolává závislou inhibici dalšího výskytu IMC u psůpři vědomí.

-40- IMG 3 '.Xy%ŠL·;· V -dávce 3 /Ug/kg bylo zpoždění výskytu příští ‘ ‘ \j" Λ 'i , řt* . H / fsí^^i^/dny^Ná*druhé straně lidský kalcitonin měl pouze malývliv. ;na·' IMG. .. Ačkoliv hybridní kalcitoniny také inhibovaly "IMC,tyto látky zpožáovaly výskyt příští IMC pouze o jeden dena to i při nejvyšších zkoušených dávkách (100 ^ug/kg). ^aše výsledky konečně prokázaly, že hybridní kalcito-niny mají slabší jíčinky na gastrointestinální motilitupsů při vědomí, než lososí kalcitonin.

Tyto výsledky také nasvědčují tomu, že hybridní kal-citoniny budou pravděpodobně působit méně nežádoucích účinků na gastrointestinální systém než lososí kalcito-nin. Příklad 14 Křížová reakce mezi lidskou protilátkou anti-lososího kali-cí tóninu a hybridního kalcitoninu .

Postup:

Lososi kalcitonin byl syntetizován běžným postupem125

syntézy v pevné fázi. ^ososí kalcitonin značený I byl připraven postupem podle Tejedora (Tejedor F, a Balles- ta J.P.G., Analytical Biochemistry, 127, 143-149 (1982)), Čtyři druhy lidského séra, u kterých bylo ověřeno,že obsahují protilátky po podání lososího kalcitoninu by-ly získány ód Dr. Fredericka R.Singera (Ceders-Sinai Me-dical Center). Titry protilátek těchto sér vůči lososímukalcitoninu byly následující: v i, · -

I -41- 4?*· Y *'**'*.->' č.1 1:4000 č.2 1:8000 č.3.. 1:8000 č.4 1:2000 .. ’ ί r 1) Stanovení stupně ředění séra ^ako tlumivý roztok pro reakci byl použit Ο,ΊΜ roztok borátového pufru {pH 8,0), obsahující 0,5 % BSA, 0,9 % ^aci, o,1 % NaN^ a 0,05 %. Tweenu 20. Tento tlumi-vý.roztok, lidské sérum obsahující anti-lososí kalcitonin(ředěné tlumívým roztokem na konečné ředěni 100 - 6400) aroztok značeného kaleitóninu byly vneseny do zkušební zku-mavky (typ Spitz, Salschted Inc«, o rozměrech 12 x 75 mm)v objemech uvedených níže, směs byla intenzívně míchéna aponechána stát přes noc při teplotě místnosti. 4 s ' t.·'. ‘ &amp; - .4 ?—..... βϊ~~~ i) reakční tlumívý roztok 300 ^ul 400 ^ul ii) lídské sérum s antilososím kal- citoninem 100 /ul 0 ^ul iii) roztok značeného, kal- citoninu (Q/20000 cpm) 100 yul 100 ^ul x Celková vazba (B) x Nespecifická vazba (NSB) £

Reakční roztok byl dobře prom£ihén s 500 ^ul· BGG(hovězí ^-globulin, Sigma), déle smíchén s 1 ml 25% PEG č6000)intenzivně míchán a pak ponechán stát při teplotěmístnosti po dobu 15 minut. Reakční roztok byl pak odstře-děn na nádobkové odstředivce;(typ O5RP-22, Hitachi) přifrekvenci otáčení 3000 min-^ po dobu 10 min při 4 °C. Po Λ/l O + ViO KiXv*/ «w n 4 ř* + π-ί λ A π X + «η . » T 4 λ λ 1/·+ 4 — ΜΜννχαιΐο*ΐΛ úa uoui vw vuůqvxui u,y ±α ο tCLUYV ciiw ~ χ awχναίχ νΐ" •UJ. vitá zbytku pomocí počítače gama částic/ Výsledky jsouuvedeny na obr. 5· -42- 2).p£ómpetitivní reakce mezi značeným 125 I lososím kalci- itÓninemZa/lososím kalcitoninem nebo hybridním kalei- í*77 / ~ — -· * v . i .· Iťoninem. 4. Ϊ ^eakční tlumivý roztok, různé typy kalcitoninů, lidskésérum-santilososía kalcitoninem a roztok značeného kalci-toninu. hyly vneseny do zkušební zkumavky v objemech uvede-ných níže a postupně zpracovány stejným způsobem jako přistanovení ředění séra. i) reakční tlumivý roztok ii) kalciťonin iii) lidské sérum s anti-lososím kalcitoninem iv) roztok značeného kalcito-ninu (^ 20000 cpm) x1 x2 «3 200 yul 400 zul 300 zul 100 /ul 0 zul 0 zul 100 Zul 0 zul 100 Zul 100 ,ul 100 ,ul 100 /Ul (B*) (NSB) (Bo ')

Byly zkoušeny dva hybridní kalcitoniny: 1. (1-16)lids-ký/(17-32)lososí kalcitonin, 2. (1-21)lidský/(22-32)lososikalcitonin. Výsledky jsou uvedeny na obr. 6-9· Výsledky a diskuse:

Pokus byl proveden ke zjištění, zda značený 2^I loso-sí kalcitonin je'schopný konkurovat lososímu kalcitoninůve vazbě na anti-lososí kalcitonin v lidském séru Č. T. (obr.5). podobné křivky byly získány při použití anti-loso-sích kalcitoninů lidský sér č.2-4. Tyto výsledky ukazují,že lososí kalcitonin začíná konkurovat značenému kalcitoni-nu v dávce alespoň 1 ng/ml. 1 A χ Pokusy se čtyřmi typy. sér prokázaly, že ani. hybridní*: ; ^kalcitonin 1 ani hybridní kalcitonin 2 se neúčastnily reakce s antilososím kalcitoninem lidského séra. hze proto učinit závěr, že hybridní kalcitonin podlevynálezu lze potenciálně použít jako účinné léčivo u pa-cientů, kteří produkují anti-lososí kalcitóninové proti-látky. hybridní kalcitonin podle vynálezu mé vynikající vý-hodu v tom, že vykazuje stejně silné biologické účinky jakolososí, úhoří a hovězí kalcitoniny, přičemž nemá vedlej-ší účinky, zahrnující nevolnost, potíže funkcí zaživací- ——-—ho— covéní v tom, že vedlejším reakcím, které by jinak mohly

Q vznikat během syntézy lze zabránit výměnou Met u lidské- o ho kalcitoninu za Val . * *

Claims (8)

1 -44-

λΙ5> o O < o 07 '- > Π < ~ w< Π N»'

íD zn PATENTOVÉ NÁROKY

1. Hybrid kalcitoninu složený ze dvou peptidových seg-mentů, z nichž :jeden je peptidový segment , v lidském kalcito-ninu nebo analogu lidského kalcitoninu, který je umístěn na |J místě bližším k aminoterminólnímu konci a druhý, který jepeptidovým segmenteihv kalcitoninu odvozeném od živoči-cha jiného než Člověka a je umístěn na místě bližším kar-boxyterminálnímu konci.

2. Hybridní kalcitonin podle nároku 1, kde peptidovýsegment na místě bližším aminoterminálnimu konci obsahuje,nejméně 10 aminokyselinových zbytků v lidském kalcitoninu a peptidový segment na místě bližším karboxyterminálnímukomci obsahuje nejméně 6 aminokyselinových zbytků v kal-citoninu odvozeném od Živočichů jiných než lidí.

3. Hybridní kalcitoni podle nároku 1, kde lidským kal-citoninem je přírodní lidský kalcitonin nebo jeho analog a kalcitonin živočišného původu jiného než lidského jepřírodní kalcitonin nebo jeho analog.

4. Hybridní kalcitonin podle nároku 1, kde; nehumánníkalcitoni je získán z lososa, úhoře nebo kuřete. Λ

5. Hybridní kalcitonin, složený z peptidového segmen- Λ tu v lidském kalcitoninu a peptidového segmentu v kal-citoninu živočišného původu jiného než lidského,kde prvnípeptidový segment zahrnuje první až n-tý (n= 10-28) amino-kyselinový zbytky z aminoterminálního konce a druhý pep-tidový segment obsahuje následující aminokyselinové zbytkysměrem ke karboxyterminálnímu konci.

ri -45- ťV*'· 6.,·, Hybridní kalcitonin podle nároku 5, kde první pep- ' $4': · * · J . ;tidový segment obsahuje první až n-tý (ne13-21) aminoky-selinové zbytky z aminoterminálního konce a je buS pepti-dovým segmentem v přirozeném lidském kalcitoninu nebopeptidový segment, v lidském kalcitoninuvém analogu,kterýmá nejvýše dva aminokyselinové zbytky nahrazeny, vypuštěnyz nebo přidány k peptidovému segmentu v přirozeném lidskémkalcitoninu.

7. Hybridní kalcitonin podle nároku 6, kde peptidovýsegment v analogu lidského kalcitoninu má valinový zbytekna místě methioninového zbytku v poloze 8 v přirozenémlidském kalcitoninu. -8-.-—^^^íty-bridn-t-ka-lc-i-t-oni-n-pod-l-e-nároku-5—kde-d-ruhý-pep-tidový segment obsahuje n-tý (ns14-22) a následující ami-nokyselinové zbytky od aminoterminálního konce lososího,úhořího nebo kuřecího kalcitoninu a je buá peptidovým segmen-tem v přirozeném lososím, úhořím nebo kuřecím kalcitoninunebo peptidovým segmentem v analogu kaleitóninu,který mánejvýše tři aminokyselinové zbytky nahrazeny, vypuštěny znebo přidány k peptidovému segmentu v přirozeném lososím,úhořím nebo kuřecím kalcitoninu. i f ...

9, Hybridní kalcitonin podle nároku 8, kde druhýmpeptidovým segmentem je peptidový segment v přirozenémlososím nebo úhořím kalcitoninu nebo peptidový segmentv analogu kalcitoninu, který má jeden aminokyselinový zbytekfnahrazen nebo vypuštěn z peptidového segmentu v přirozenémlososím nebo úhořím kalcitoninu. ’ -46- ί9·. Hybridní kalcitonin, ve kterém sekvence prvního , až.šestnéctého aminokyselinového zbytku od aminotermi- f hélňího konce je stejné jako sekvence prvního až šestnésté Í · ··»·;· 3 ho.?aminokyselinového zbytku v přirozeném lidském kalci-toninu a sekvence* sedmnáctého až třicátéhodruhého amino-kyselinového zbytků je stejná jako sekvence sedmnácté-ho až třicátého druhého aminokyselinového zbytku v přiro-zeném lososím nebo úhořím kalcitoriinu.

11. Hybridní kalcitonin, mající následující struk-turní vzorec H-Cys-Gly- Asfe-Leu-Ser-Thr-Cys-Met(nebo Val)-Leu-Gly-1 2 3 4 5 ’ 6 7 8 9 10 Thr-Týr-Thr-Gln-Aspínebo Glu)-Phe(nebo Leu)-Asn(nebo His)11 12 13 14 15 16 t 17 Lýs-Phe(nebo Leu nebo ^es)-His (nebo Gln)-Thr-Tyr-Pro-Arg-18 19 20 21 22 23 24 Thr-Asn(nebo Asp)-Thr(nebo Val)-Gly-Ser(nebo Ala)-Gly-Thr25 26 27 ' 28 29 30 31 Pro-NHg. 32 12» Hybridní kalcitonin podle nároku 11, který má ,následující strukturní vzorec H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-^hr-íyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lýs-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2♦ -47- t W -i, : ·*· ‘-· ·-··.*. ·.·!ZLíViv1'?·" 'r. ·’-í’-% í’' V>"’. .-‘•r - * 13· Hybridní kalcitonin podle nároku 11, který mánásledující strukturní vzorce .< i- . -5- ···.*. rrrr H-Cýs-Giy-Asn-Leu-Ser-Thr-éys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Iys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-As p-Va1-Gly -Ala-Gly-Thr-Pro-NH2, H-Cys-Gly-Asň-Leu-Ser-Thr-cíys-Val-Leu-Gly-Thr-lýr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NHOJ H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu- Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-His-Lys-Gln- ^^Thr^Týr^Pró^Árg^TKř^Ááp^Vái^Glý^Ala^GÍy^" Thr-Pro-NH 2’ H-Šys-Gly-Asn-Leu-Ser-Ťhr-Cys-Met-Leu-.Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Iý r-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser- Gly-Thr-Pro“NH2 a H-dys -Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-^ys-Me t-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Xyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2. t * ’F-· tr·· í i