CN1055540A - 杂种降钙素 - Google Patents

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Abstract

由一个人降钙素肽片段和一个动物源，如鳝鱼， 鲑鱼和鸡的降钙素肽片段构成的改进的杂种降钙 素。人降钙素或人降钙素类似物以及动物源降钙素 可以是天然降钙素或其类似物。杂种降钙素具有同 鳝鱼，鲑鱼和鸡降钙素一样强的生物活性，它不引起 包括恶心，消化道功能紊乱或抗原性等副作用。

Description

本发明涉及新的，具有生物活性的降钙素类似物。
已知鳝鱼，鲑鱼，鸡，猪，人，牛，羊和鼠的体内天然存在降钙素，这些天然存在的降钙素由32个氨基酸组成。例如，人类降钙素具有下述肽结构：
Figure 911021272_IMG5
鳝鱼的降钙素具有下述的肽结构：
Figure 911021272_IMG6
上述的人类和动物中固有的降钙素以下集中称为“天然降钙素”。
日本特许公开No.277698/1988，284198/1988，287800/1988，以及生物化学杂志第159卷，125页（1986），（J.Biochem.Vol  159，p.125（1986），内分泌学杂志第117卷第80页（1987），（Endocrinology，Vol  117  p.80（1987）），以及生物化学杂志第162卷，第399页（1987），公开了天然降钙素的类似物。天然降钙素的类似物包括：经其它氨基酸残基替代天然降钙素中至少一个氨基酸残基的类似物（替代型）;天然降钙素中删除至少一个氨基酸残基的类似物（删除型）;天然降钙素或在其末端中的氨基酸残基间中加入至少一个氨基酸残基的类似物（加成型）以及具有两个或多个替代型，删除型和加成型组合的类似物。当两个或多个氨基酸残基被替代，删除或加成时，它们可以使得肽结构发生联接或切断。这种类型的非天然的降钙素在下文中被称作“降钙素类似物”。
天然人类降钙素生来即存在于人类体内，但是它被证明在人体内的生物活性很低。另外，天然动物源例如鲑鱼，鳝鱼和鸡降钙素，不是人源的，对人类却具有高的生物活性，并且可以用来治疗骨质疏松，肿瘤性高血钙和佩吉特氏病。另外，鳝鱼降钙素类似物已经是商品化的治疗用产品。然而，动物源降钙素和它们的类似物引起人类的副作用，例如严重的恶心，消化道功能紊乱，以及抗原性。人类的降钙素几乎不引起这些副作用。
由天然动物源降钙素和其类似物，而不是人类的降钙素和其类似物引起的恶心见于下述参考文献：
1）.K.Takahashi，et  al.，“Gan  to  Kagaku  Ryoho（Cancer  and  Chemotherapy）”，Vol.12，No.10，2004-2010（1985）;
2）.J.Egawa  et  al.，“Gan  no  Rinsho（Clinical  As-pects  of  Cancer）”，Vol.30，No.3，251-258（1984）;and
3）.G.F.Mazzuoli  et  al.，Calicif.Tissue  Int.，38，3-8（1986）.
由天然动物源降钙素和其类似物引起的消化道功能紊乱见于下述参考文献：
1）K.Jonderko，Gut（England），30，430-435（1989）;
2）K.Jonderko，et  al.，J.Clin.Gastroenterol.，12，22-28（1990）and
3）J.Hotz  et  al.，Digestion，20，180-189（1980）.
天然动物源降钙素和其类似物的抗原性见下述参考文献：
1）F.R.Singer  et  al.，J.Clinical  Invest.，51，2331-2338（1972）;
2）J.G.Haddad  et  al.，J.Clinical  Invest.，51，3133-3141（1972）;and
3）A.Grauer  et  al.，J.Bone  and  Mineral  Res.，5，387-391（1990）.
本发明的目的在于提供现有技术中未涉及到的新的降钙素类似物。简言之，本发明提供具有对人体高生物活性，而且几乎不引起人体副作用的降钙素。本发明的降钙素为一种人降钙素同动物源，而非人源的降钙素的杂种，即由人源钙素肽片段和动物源而非人源降钙素的肽片段组成的一种杂种降钙素。
本发明人发现，动物源降钙素引起人体副作用的活性，大多数在氨基末端，特别是在由1至16位末端氨基酸残基构成的肽片段中。也发现，当所有这些16个末端氨基酸残基可被替代时，经过替代至少10个这些氨基酸残基能消除那些不需要的副作用。
对于人源和动物源降钙素的主要生物活性而言，羧酸末端的氨基酸序列很重要。该序列可参见下述文献：
1）Rene  Maier  et  al.，FEBS  Letters，48，68（1974）;
2）Rene  Maier  et  al.，Clinical  Endocrinology，5，3275（1976）;
3）R.M.Epand  et  al.，Eur.J.Brochom.，159，125（1986）;and
4）D.M.Findlay  et  al.，Endocrinology，117，399（1987）.
本发明人发现，上述的肽片段，即具有主要生物活性的，位于羧酸末端的肽片段，不具有引起人体不需要的副作用的活性部位，基于这一发现本发明人开发出一种杂种降钙素。因此，从减轻副作用的观点考虑，由第11位和向羧酸端依次部位的氨基酸残基组成的肽片段可以包括人降钙素或动物源降钙素。
另外，从生物活性方面考虑，比人源降钙素生物活性还高的降钙素为优选。因此，较邻近羧基端的肽片段优选为非人源的动物源的，并且比人降钙素生物活性还高的肽片段。在这方面，考虑中的肽片段要有至少4个氨基酸残基，优选为有至少10个氨基酸残基。
根据上述观点，本发明的杂种降钙素由两个肽片段组成，其一包括人降钙素片段从氨基端开始第1至第10位氨基酸残基，其二包括非人源的动物源降钙素片段向羧基端的第29位至第32位氨基酸残基，并带有由第11位至第28位氨基酸残基组成的，具有人或动物源降钙素氨基酸序列的中间肽片段。倘若需要的话，可以在第11至第28位氨基酸残基间的肽片段的任何部位，将人降钙素的氨基酸序列转移至非人源降钙素的氨基酸序列。
为了达到进一步减轻副作用的目的，氨基末端的肽片段优选由人降钙素的第1至第13位氨基酸残基构成。为了达到进一步增加生物活性的目的，第22至第32位的肽片段优选由动物源的肽片段，而非人源的肽片段来构成。氨基末端从第14至21位的肽片段可以具有任一类型降钙素的氨基酸序列，在那个中间片段的任何部位，均可以将人降钙素的氨基酸序列转移至非人源的氨基酸序列。在最优选的情况下，本发明的杂种降钙素由一个来自人源降钙素其氨基末端第1至第16位的肽片段和一个来自非人源降钙素从第17至第32位的肽片段组成。
附图说明
图1是在用各种类型的降钙素治疗中，血浆中钙浓度的时间关系图。
图2是随着各种类型的降钙素的给药，刺激阈值的时间关系图。
图3是各种类型降钙素给药后，大鼠的体重变化图。
图4是各种类型降钙素给药后，大鼠的食物吸收图。
图5是鲑鱼降钙素和抗体结合浓度之间的关系图。
图6至9为说明鲑鱼降钙素和两种杂种降钙素同抗鲑鱼降钙素人类血清结合效果。
本发明所用的“人降钙素”（human  Calcitonin）是指天然人降钙素和非天然人降钙素类似物。同理，“非人源降钙素”（non-human  calcitonin）或者动物源而非人源降钙素（calcitonin  derived  from  animals  other  than  humans）是指动物源而非人源的天然降钙素和非人源降钙素的非天然类似物。优选的但非限定的动物包括，鲑鱼、鳝鱼和鸡。在这两种类型的降钙素类似物中，替代，删除或加成氨基酸残基的数目不限定于任何特定的值，但优选是它少于5。假如该肽片段含有少于5个氨基酸残基，其替代、删除或加成的氨基酸残基数，优选为不超过1，假如该肽片段含有不超过10个氨基酸残基，相应的替代，删除或加成的氨基酸残基数优选为少于3。
关于人降钙素的肽片段，其氨基末端的第一个10个氨基酸残基序列优选是与天然人降钙素的序列相同，或者也可以是人降钙素类似物的肽片段具有与天然人降钙素相同的氨基酸序列，不同的只是位置8上的蛋氨酸残基被缬氨酸残基所替代。对于所有的人降钙素的肽片段来说，优选的类似物为少于两个氨基酸残基替代，删除或者加成天然降钙素，最优选的类似物是全部肽片段同天然型的不同仅仅是位置8处的蛋氨酸残基发生替代。
关于动物源降钙素的肽片段，它优选是同相应的天然降钙素的肽片段相同，或者它也可以是非人源降钙素类似物的肽片段，该类似物肽片段是少于3个氨基酸残基替代，删除或加成所述的天然型肽片段。较优选的类似物为其中仅一个氨基酸序列替代或删除天然型肽片段。
优选的动物源降钙素应为对人体具有较高生物活性的衍生的降钙素。这些动物包括鱼类，如鲑鱼，鳝鱼和鸟类，如鸡。较优选的是鲑鱼和鳝鱼，特别优选的是鲑鱼。
根据这些事实，本发明之杂种降钙素优选地具有下列
Figure 911021272_IMG7
Figure 911021272_IMG8
本发明的杂种降钙素中，例如鲑鱼，鳝鱼和鸡这类动物源的全部降钙素的部分结构均由其相应的人降钙素片段来替代，所述动物源降钙素结构部分当人体服用时，会引起副作用，如恶心，消化道功能紊乱和抗原性，而所述的人降钙素片段不引起任何副作用。因此;上述的结构部分引起的副作用会被减轻或者完全消除。这就等于说本发明之杂种降钙素具有经过相应的非人源降钙素替代的人降钙素的药理活性部位，以增强人降钙素的理想的生理活性。
用固相合成法如用聚合树脂，或者经液相合成法等有机合成领域中常用方法可以合成本发明的杂种降钙素。合成相对少量的肽时，优选采用固相合成。而合成大量肽时，优选采用液相合成。在本说明书后续的例子中，采用固相合成法来合成肽。然而，假如需大量合成本发明的杂种降钙素，优选采用液相合成法，这也是已知的肽合成技术。
通常的液相合成步骤的合成至少从两个肽片段开始，每一个片段都含有两个或多个氨基酸残基，然后连续地联接这些肽片段，最后获得所需的带有以上特殊的氨基酸序列的肽（在本发明中，所需的肽是上述的杂种降钙素）。液相合成的进一步特征是使肽合成反应在液态介质中进行，特别是在如二甲基甲酰胺（DMF）或四氢呋喃等介质中进行。一个部分肽典型地含有2-20，优选为3-15个氨基酸残基。在优选的情况下，能合成这些部分肽的大约2-10单位，然后再连续联接合成所需的肽。
在上述的肽合成中，氨基酸的反应衍生物典型地被用作起始物质。假如起始氨基酸含有活性官能团，而不是那些形成肽键的官能团，这些活性官能团被优先用保护基团保护，这些保护基团在肽合成结束后再去掉。本发明中欲生产的肽具有1-7个二硫键，随着1-7个序列的部分肽的合成，可以在任何阶段形成。然而，这个二硫键稳定性差，在肽合成结束后被优先形成。在下述的固相合成法中也优选采用保护和去保护步骤和形成二硫键的各种条件。
固相合成法是一种通过将氨基酸残基键合到载体树脂上来合成具有所需氨基酸序列的肽的方法。用自动合成器可以自动完成该方法。
那些被用于固相合成中的树脂包括氯甲基树脂，羟甲基树脂，4-（羟甲基）苯乙酰氨基甲基树脂（4-（oxymethyl）phenylacetamidomethyl  resins），二苯甲基胺树脂和聚丙烯酰胺树脂。
如需要的话，用于这些合成中的氨基酸保护一些氨基酸，例如α-氨基保护基团包括苄氧甲基基团（Z），四丁基羟基基团（Boc）（tertiary  butyl-oxycarbonyl  group），9-芴甲氧羰基基团（9-fluorenylmethyl-oxycarbonylgroup（Fmoc），）甲酰基团（HOC）和乙酰基团（Ac）。α-羧基保护基团包括苄基基团（Bzl），四丁基团（But）甲基基团（Me），乙基基团（Et）和苯甲酰甲基基团（Pac）。那些能用来保护氨基酸侧链的基团包括苄基基团（Bzl），p-甲苯磺酰基团（Tos），P-硝基苯酚基团（NO），二苯甲基基团（Bzh），乙酰氨基甲基基团（Acm）（acetamidomethyl group），四丁基基团（But），四丁基羟基羰基基团（Boc），环己基基团（CHex）和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基基团（Mtr）。这些保护基团的一个或多个基团可按不同目的加以使用。
采用碳化二亚胺，或在活性酯的帮助下，经过脱氢缩合可以进行氨基酸序列加成反应。所用的碳化二亚胺包括二环己基碳化二亚胺和1-乙基3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺，采用的活性酯（active  esters）包括N-羟基丁二酰胺酯（-OSu），五氟苯酚酯（-OPfp）（pentafluorophenol  ester）以及二羟基苯基三嗪酯（-ODhbt），（dihydroxobenztriazine  ester）
可采用的反应催化剂包括：DMF，THF，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，二恶烷，DMSO，N-甲基吡咯烷酮（N-methylpyrrolidone.），吡啶和水。
根据要消除的保护基团的类型以及所要完成的目的，可以使用各种脱保护剂。这些试剂包括氟化氢，三氟乙酸，三氟甲烷磺酸，氨水/甲醇，溴化氢/乙酸，碳载氢/钯（hydrogen/palladium  on  carbon），乙酸汞，乙酸/锌粉和碱/水-甲醇。
在合成过程中或合成后，可采用各种纯化技术，如反相色谱法，正相色谱法，离子交换色谱法以及凝胶过滤色谱法等再结晶。通过大气或铁氰化钾的氧化作用可以形成二硫链。
以下的实施例用来进一步说明本发明，但不仅限于此。
实施例1至6说明本发明的杂种降钙素样品的合成，实施例7描述经实例1至6合成的降钙素样品的氨基酸组成分析结果。实施例8至10描述评估本发明杂种降钙素主要活性实验。
实施例1人（1-16）/鲑鱼（17-32）杂种降钙素的合成
Figure 911021272_IMG9
用自动合成器通过固相合成法进行合成。
（1）将脯氨酸装入二苯甲基胺脂树（BHA）
取10克BHA树脂（-NH2：0.38mmol/g）使其在100ml DMF中悬浮溶胀。去掉上清液后，再加入100ml的DMF，随后加入BocProOH（15mmol），DCC（20mmol）和HOBT（20mmol），摇动该混合物室温过夜。用玻璃过滤器过滤后，用二氯甲烷清洗得到的树脂。
随后，加入200ml的含10V/V%乙酸酐的二氯甲烷溶液，室温下摇动该混合物1个小时以封塞残余的氨基基团。反应完成后，用二氯甲烷清洗所述的树脂，并真空干燥。
干燥后，加入50ml的含50V/V%三氟乙酸的二氯甲烷溶液，室温下摇动该混合物1小时，连续用二氯甲烷，甲醇，二氯甲烷和三乙胺溶液冲洗得到的树脂，真空干燥。
（2）氨基酸的接续加成反应
将步骤1中得到的1克树脂装入自动合成器的反应柱中，在下述条件下，连续加入氨基酸。
Ⅰ反应：DMF溶剂内室温反应30分钟，
Ⅱ清洗：用DMF室温下清洗10分钟，
Ⅲ去掉Fmoc：用20v/v%哌啶，在DMF溶剂中，室温，10分钟。
Ⅳ清洗：用DMF室温清洗10分钟，经反复（1）-（4）的步骤，接着脯氨酸（Pro）被加成31个氨基酸，采用的氨基酸见表1.
表1
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430g
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Arg（Mtr）-OPfp  0.641
Fmoc-L-Pro-OPfp  0.400
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Lys（Boc）-OPfp  0.503
Fmoc-L-His（Boc）-OPfp  0.510
Fmoc-L-Phe-OPfp  0.438
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Met-OPfp  0.426
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
反应后，用氟化氢从肽上去掉保护基团和所述的树脂，用乙醚冲洗所述的肽。沉淀物被溶于50V/V%的乙酸水溶液内，滤掉不溶物质。过滤液被冷冻干燥，得约600mg的粗肽。
（3）纯化和形成二硫键
将部分（约500mg）的粗肽溶于含0.1V/V%TFA的水内，将所述的溶液装入高效液相色谱的ODS柱中。
用溶液A（含0.1V/V%TFA的乙腈）和溶液B（含0.1V/V%TFA的水），用从20%经30%至40%的递增方式的阶式梯度（A/BV/V%）洗脱所述的柱子，收集30%洗脱处的馏分，冷冻干燥。
冷冻干燥后的46mg肽溶于50ml0.05V/V%的乙酸中，用3M的氨水将其溶液的pH调节至8.5。接着，加入1.5ml的0.1M的K3Fe（CN）6，并室温下搅拌该混合物30分钟，以形成二硫键。用50%的乙酸将pH调至5.0后，加入阴离子树脂（Cl-型），搅拌该混合物20分钟，随后滤掉树脂。
浓缩滤液，并装入高效液相色谱的ODS柱中用上述相同的步骤再次纯化。收集30%洗脱处的馏分，冷冻干燥得所需的肽28mg。
实施例2
人（1-16）/鳝鱼（17-32）杂种降钙素的合成
Figure 911021272_IMG10
（1）氨基酸的接续加成反应
将按实例1中步骤（1）制备的1克脯氨酸结合BHA树脂装入自动合成器的反应柱中，以实例1中步骤（2）的相同反应条件加入氨基酸。所用的氨基酸列入表2中。
表2
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430g
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Ala-OPfp  0.378
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Val-OPfp  0.400
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Arg（Mtr）-OPfp  0.641
Fmoc-L-Pro-OPfp  0.400
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Lys（Boc）-OPfp  0.503
Fmoc-L-His（Boc）-OPfp  0.510
Fmoc-L-Phe-OPfp  0.438
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Met-OPfp  0.426
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
反应结束后，用实例1中步骤（2）所述的同样方法处理肽-树脂，得约510mg粗肽。
（2）纯化和形成二硫键
用实例1中步骤（3）的相同步骤处理部分（约450mg）的粗肽，以纯化和形成二硫键。从而得到32mg纯化后的肽。
实施例3
人类似物（1-16，Met8→Val8）/鳝鱼（17-32）杂种降钙素的合成。
Figure 911021272_IMG11
（1）氨基酸的接续加成反应
将按实例1中步骤（1）制备的1克脯氢酸结合BHA树脂装入自动合成器的反应柱中，以实例1中步骤（2）的相同反应条件加入氨基酸。所用的氨基酸见表3
表3
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430g
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Ala-OPfp  0.378
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Val-OPfp  0.400
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Arg（Mtr）-OPfp  0.641
Fmoc-L-Pro-OPfp  0.400
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Lys（Boc）-OPfp  0.503
Fmoc-L-His（Boc）-OPfp  0.510
Fmoc-L-Phe-OPfp  0.438
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Val-OPfp  0.400
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
反应结束后，用实例1中步骤（2）所述的同样方法处理肽-树脂，得约580mg的粗肽。
（2）纯化和形成二硫键
用实例1中步骤（3）的相同步骤处理部分（约500mg）的粗肽，以纯化和形成二硫键。从而，得到35mg纯化后的肽。
实施例4
人（1-16）/鳝鱼（17-31，Des Leu19）杂种降钙素类似物的合成。
（1）氨基酸的接续加成反应
将按实例1中步骤（1）制备的1克脯氨酸结合BHA树脂装入自动合成器的柱中，以实例1中步骤（2）的相同反应条件加入氨基酸。所用的氨基酸例入表4。
表4
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430g
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Ala-OPfp  0.378
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Val-OPfp  0.400
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Arg（Mtr）-OPfp  0.641
Fmoc-L-Pro-OPfp  0.400
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Lys（Boc）-OPfp  0.503
Fmoc-L-His（Boc）-OPfp  0.510
Fmoc-L-Phe-OPfp  0.438
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Met-OPfp  0.426
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
反应结束后，用实例1中步骤（2）所述的同样方法处理所述的肽-树脂，得约520mg的粗肽。
（2）纯化和形成二硫键
用实例1中步骤（3）的相同步骤处理部分（约450mg）粗肽，以纯化和形成二硫键，从而，得到23mg的纯化后的肽。
实施例5
人（1-13）/鲑鱼（14-32）杂种降钙素的合成
Figure 911021272_IMG14
采用自动合成器，以固相合成方法进行合成。
（1）将脯氨酸装入二苯甲基胺（BHA）树脂
取10克BHA树脂（-NH2：0.38mmol/g），使其在100ml的DMF中悬浮溶胀。去掉上清液后，另外加入100ml的DMF，随后加入19mmol BocProOH，19mmol DCC，和19mmol HOBT。摇动该混合物室温过夜。用玻璃过滤器过滤，用二氯甲烷冲洗得到的树脂。接着，加入200ml含10V/V%乙酸酐的二氯甲烷溶液，室温下搅拌该混合物1小时，以封塞残余的氨基基团。反应完成后，用二氯甲烷冲洗所述的混合物，并真空干燥。
干燥后，加入50ml的含50V/V%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，并在室温下搅拌该混合物1小时。用玻璃滤器过滤后，得到的树脂用二氯甲烷，甲醇，二氯甲烷和三乙胺连续冲洗，然后真空干燥。
用氨基酸分析仪分析部分得到的树脂发现每克树脂被结合入0.31mmol的脯氨酸。
（2）氨基酸的接续加成反应
将步骤（1）中得到的1克树脂装入自动合成器的柱子中，随后按下列条件加入氨基酸。
（Ⅰ）加成反应：DMF溶剂，室温下反应30分钟;
（Ⅱ）冲洗：用DMF，室温下冲洗10分钟;
（Ⅲ）去掉Fmoc：用20%V/V哌啶，在DMF溶剂中，室温下10分钟;
（Ⅳ）冲洗：用DMF，室温冲洗10分钟。
反复步骤（1）-（4），接的脯氨酸（Pro）加入31个氨基酸。所用的氨基酸列入表5.
表5
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430g
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Arg（Mtr）-OPfp  0.641
Fmoc-L-Pro-OPfp  0.400
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Lys（Boc）-OPfp  0.503
Fmoc-L-His（Boc）-OPfp  0.510
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Glu（OBut）-OPfp  0.468
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Met-OPfp  0.426
Fmoc-L-Cys（Trt）-OH  0.464
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Cys（Trt）-OH  0.464
反应后，用氟化氢去掉肽上的保护基团，用乙醚冲洗所述的肽。沉淀物溶于50%V/V乙酸水溶液，滤掉不溶物质。冷冻干燥滤液得约720mg的粗肽。
（3）纯化和形成二硫键
将部分（约700mg）的粗肽溶于含0.1V/V%TFA的水中，将所述溶液装入高效液相色谱的ODS柱内。
采用由含0.1V/V%TFA的乙腈和水组成的溶剂体系，用乙腈阶式梯度从20%（V/V）至30%到40%递增的方式来洗脱所述的柱子，收集30%V/V洗脱处的馏分，并冷冻干燥（初级纯化）。
冷冻干燥后的肽（约80mg）溶于80ml的0.05%V/V乙酸中，用3M氨水将其pH调至8.5。随后，加入1.5ml0.1MK3Fe（CN）6并在室温下搅拌混合物30分钟，形成二硫键。用50%V/V的乙酸将pH调至5.0后，加入阴离子交换树脂（Cl-型），搅拌该混合物20分钟，随后滤掉树脂。
浓缩滤液，再上ODS柱，用初级纯化中采用的同样的溶剂体系，以乙腈阶式梯度的方式，从25，27，至30到35%V/V洗脱该柱（次级纯化）。收集30%洗脱处的馏分，冷冻干燥得53mg所述的肽。
实施例6
人（1-21）/鲑鱼（22-32）杂种降钙素的合成：
Figure 911021272_IMG15
将按实例5中步骤（1）制备的1克脯氨酸结合BHA树脂装入自动合成器的柱子，与实例5中步骤（2）的相同条件下加入氨基酸。所用的氨基酸见表6
表6
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430g
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Ser（but）-ODhbt  0.419
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Arg（Mtr）-OPfp  0.641
Fmoc-L-Pro-OPfp  0.400
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-His（Boc）-OPfp  0.510
Fmoc-L-Phe-OPfp  0.438
Fmoc-L-Lys（Boc）-OPfp  0.503
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-L-Phe-OPfp  0.438
Fmoc-L-Asp（OBut）-OPfp  0.457
Fmoc-L-Gln-OPfp  0.423
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Tyr（But）-OPfp  0.495
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Met-OPfp  0.426
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
Fmoc-L-Thr（But）-ODhbt  0.430
Fmoc-L-Ser（But）-ODhbt  0.419
Fmoc-L-Leu-OPfp  0.411
Fmoc-L-Asn-OPfp  0.412
Fmoc-Gly-OPfp  0.367
Fmoc-L-Cys（Trt）-OPfp  0.595
反应后，按实例5中步骤（2）采用的同样方法处理肽-树脂，得约860mg粗肽。
（2）纯化和形成二硫键
以实例5中步骤（3）相同的步骤处理部分（约850mg）的粗肽，以纯化和形成二硫键，浓缩得到的滤液，再次上色谱ODS柱，然后用初级纯化中采用的相同溶剂体系，用乙腈阶式梯度从24，经26，28至30一直到35V/V%来洗脱所述的柱子（次级纯化）。收集28V/V%洗脱处的馏分，冷冻干燥得66mg所需的肽。
实例7
氨基酸组分的分析
每一份经实例1-6制备的纯化后杂种降钙素，在6N  HCl中150℃水解1小时，用氨基酸分析仪分析所述的氨基酸组分，其结果见表7。
Figure 911021272_IMG17
实施例8
检定生物活性
由实例1-6中制备的6份新的降钙素溶于含0.1%BSA（小牛血清）的0.1M乙酸钠缓冲液中，将其经尾静脉注入（4周令）已禁食24小时的雄性大鼠1小时后，用OCPC方法（Calcium  C-Test  Wako  of  Wako  Pure  Chemical  Industries，Ltd.）测量血清钙浓度。能引起血清钙浓度下10%的降钙素活性定为10ml，每毫克单位的降钙素的数值称之为“特定活性”。其结果见表8。
表8
新降钙素  特定活性（U/mg）
例 1 2106＊
2  2639
3  2262
4  2611
5  2575
6  1792
其中＊为两次测量的平均值
实施例9
降钙素对高血钙的效果
方法：
给5周令SD雄性大鼠连续4天口服维生素D3（5mg/kg），建立高血钙大鼠实验模型。第5天时，分别皮下注射入（1-16）/鲑（17-32）杂种降钙素（杂种降钙素1），鲑鱼降钙素和人降钙素，每种用量4IU/kg.在给定的时间间隔内取血样，测血浆中的钙浓度。
结果和讨论：
试验降钙素的血浆钙浓度的时间关系图见附图1。由图1所知，所有的杂种降钙素1，鲑鱼降钙素和人降钙素试验，均引起高血钙浓度的降低，因此很清楚本发明的杂种降钙素同鲑鱼降钙素和人降钙素对治疗高血钙具有同样的效果。
实施例10
降钙素的止痛效果
方法：
（Ⅰ）动物
采用10只体重为2.7-3.2kg的雄性家兔（Kbl：JW）.
（Ⅱ）插入心室内给药用的导管。
用戊巴比妥（30mg/kg，i.v.）麻醉，在立体定位器上固定家兔。切开头顶皮后，将心室内给药导管（塑料制品）插入每个动物左心室，牙骨质固定（以前囱处调节固定器：后，4.0mm;侧，5.5mm，中5.5mm.）1周恢复期后，家兔供下述实验使用。实验后，注入亚甲蓝证实导管的位置。
（Ⅲ）抗损伤感受试验（Antinociception  Test）
在兔笼内饲养家兔，用牙科钻头在上主门牙的两侧开一直径为1mm，深为1mm的孔。将刺激电极插入每个孔，用电刺激器（Nihon  Kohden  Corp产品）以各种电压实施电刺激（5毫秒，5Hz，3秒长）。以测量刺激阈值（V），该阈值可诱导动物的舔食反应（舔吃和下腭和唇的运动）在给药前1小时测量，以及在给药后立即测量，而且在给药后0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0小时分别测量。
试验的药物是人（1-16）/鲑鱼（17-32）杂种降钙素（杂种降钙素1），鲑鱼降钙素和人降钙素，每种药物均经心室内给药，其剂量等于8IU/kg，用生理盐水做对照。
结果及讨论：
试验降钙素的刺激阈与时间关系见附图2。由图2所知，三种降钙素均引起阈值的相对增高，其峰值在给药后0.5-1.5小时出现。因此经计算本发明的杂种降钙素同鲑鱼降钙素和人降钙素对疼痛作用具有相同的效果。
实施例11
降钙素在抑制体重增加和食欲方面的作用。
方法：
给大鼠肌肉注射人（1-16）/鲑（17-32）杂种降钙素（杂种降钙素1），人降钙素和Elcatonin，24小时后，测量它们的体重和食物消耗情况。
结果：
肌注各种降钙素大鼠体重的变化见附图3，它们的食物消耗见附图4，每种降钙素以三种不同剂量给药：12.5IU/kg，50IU/kg和200IU/kg，对于体重的变化，测量值被平均在5只大鼠身上，对于食物消耗情况，5只大鼠的测量值被加到一起。
讨论：
附图3和4清楚的显示，鲑降钙素和Elcatonin对抑制体重增加和食欲方面效果均同剂量相关，而杂种降钙素1和人降钙素对食物消耗和体重方面未显示出差异。因此可以说本发明的杂种降钙素同人降钙素相比，几乎对体重增加和食欲不产生作用。
实例12
降钙素对胃排空时间的作用。
向禁食数天的雌性小猎兔犬经某一静脉注射人（1-16）/鲑（17-32）杂种降钙素（杂种降钙素1），鲑降钙素，人降钙素和生理盐水。1小时后，伴25ml的水口服肠溶阿匹林片（含200mg活性组分）。此后，在给定的时间间隔下，经另外的脑静脉取血样，用常规方法取得血浆保存在-20℃下，直到测量。
随着阿司匹林经过肠壁，大多数消化的阿司匹林被代谢掉，并以水杨酸的形式进入血流。因此，血浆中的水杨酸为判定阿司匹林的一种标记。200μl乙醇被加入50μl血浆中以10，000rpm速度离心该混合物1分钟，得到的上清液送HPLC测定。
结果：
每种降钙素对胃排空时间的延迟作用共汇入表9。计算降钙素给药至阿司匹林吸收的时间与注射生理盐水至阿司匹林吸收时间之间的差，以判断每个动物的胃排空时间的延迟。
表9
降钙素  剂量  Lag时间  延迟
时间
μg（IU）/kg  h  h
杂种降钙素  1  0.6（1.2）  1.9  4.8  7.7  0.0  3.2  6.6
10（21.0）  5.1  18.0  21.4  3.8  16.3  20.3
鲑鱼降钙素  0.1（0.4）  2.0  2.0  0.3  0.7
0.3（1.2）  2.7  4.5  11.1  0.0  3.9  10.0
0.6（2.4）  22.0  30.0  45.0  9.4  29.4  43.0
人降钙素  6（1.2）  3.0  3.9  4.0  1.3  2.6  2.9
100（20.0）  5.0  6.9  4.4  5.0
注：Lag时间：从服用阿司匹林至其吸收的时间，
延迟时间：降钙素和生理盐水给药至阿司匹林吸收的时间差
讨论：
如表9所示，鲑降钙素具有很强的延迟胃排空时间作用，而人降钙素这方面作用则弱。在延迟胃排空时间方面杂种降钙素1同人降钙素更相像而不是象鲑降钙素。因此可以说本发明杂种降钙素1可以较大剂量活性单位来使用，而不象鲑钙素。
实例13
降钙素对清醒狗的胃肠道运动的影响。
方法：
取体重约10kg的健的康的小猎兔犬，静脉注射戊巴比妥钠使其麻醉，在无菌条件下打开腹腔。
将转换器（Extraluminal  force  transducers）缝在胃窦部，十二指肠，空肠的浆膜上，测量环状肌肉收缩，如Itoh  et  al.所报道（Itoh  et  al.Gastroenterol  Jpn.12，275  1977）
这些转换器的导线伸出腹腔之外，然后通过肩胛骨之间的皮肤切口。
腹部手术之后，在右前颈处做一5cm长的纵向切口暴露颈外静脉。
用一Silastic管（French  size  8.5，Dow  corning  Midland，MI），将其经静脉插入上腔静脉，并将其缝在邻近的皮肤上，作为试验药物的静脉注射通道。
手术后，用一套式保护器固定狗，以保护导线和Silastic管。
分别把狗圈在各自的狗笼内每天下午5点自由饲市售狗饲料和水。用热笔书写记录仪（WR-3101，Graphtic，Tokyo，Japan）通过将转换器的导线连接在放大器（UG-5，Nibon  Kohden，Tokyo，Japan）接线上记录胃肠道运动活动。
术后约两周，胃肠道收缩能力可分为两个主要活动型，消化间和消化状态型。
在消化间状态型，在胃窦部可见IMC（Interdigestive  migrating  motor  complex）出现100至120分钟的规律性间隔，并以恒定的速度移动通过十二指肠和空肠。
在所有的动物中，进食则破坏了规律性的IMC型。在消化间状态过程中，进行所有试验。将药物溶于0.9%的生理盐水中，经Silastic管给药，给药量为约每10秒中为0.3ml/kg。
胃窦部的IMC结束后的10分钟，随后用0.90%的生理盐水冲洗胃窦部。
一直到给药出现的下一个IMC才测量时间，并将该时间作为药物对胃肠道运动的抑制活性的指标。
其结果见表10。
表10
鲑降钙素  剂量，μg/kg  0.1  0.3  1.0  3
（U/kg）  （0.4）  （1.2）  （4.0）  （12）
IMC延迟  0  1  2  3
人降钙素  剂量  μg/kg  100  300  1000
（U/kg）  （20）  （60）  （200）
IMC延迟  0  0.5  0.5
杂种降钙素1  剂量  μg/kg  0.03  0.1  1.0  3.0  100
（U/kg）  （0.06）  （0.21）  （2.1）  （6.3）  （210）
IMC延迟  0  0.5  1  1  1
杂种降钙素2  剂量μg/kg  0.3  1.0  3.0  10  30  100
（U/kg）  （0.5）  （1.8）  （5.4）  （18）  （54）  （180）
IMC延迟  0  0.5  1  1  1  1
注：1“IMC延迟”是指：
0………给药后180分钟内出现的下一个IMC
0.5………给药后300分钟内，180分钟以上出现的下一个IMC
1………给药后一天出现的下一个IMC
2………给药后两天出现的IMC
3………给药后三天出现的IMC
2.杂种降钙素1是人（1-16）/鲑（17-32）降钙素，而杂种降钙素2是人（1-21）/鲑（22-32）降钙素。
讨论：
如表10所见，根据静脉给药剂量鲑降钙素抑制清醒狗的下一个IMC的出现。
在3μg/kg剂量下，它延迟3天出现下一个IMC，另外，人降钙素仅对IMC有轻微的作用。
虽然杂种降钙素也抑制IMC，这些组合物仅延迟一天出现下个IMC，尽管是在最大的剂量时（100μg/kg）。
这些结果清楚地显示杂种降钙素对清醒狗胃肠道运动具有比鲑降钙素较弱的作用。
这些结果也表明杂种降钙素比鲑降钙素可能很少会引起对胃肠道的反作用。
实例14
抗鲑降钙素人类抗体同杂种降钙素之间的交叉反应。
方法：
通过固相合成的常规步骤合成鲑降钙素。经过Tejedor方法（Tejedor，F.and Ballesta，J.P.G;Analytical Biochemistry，127，143-149（1982））用碘125标记鲑降钙素。
由Dr.Frederick  R.Singer（CEDERS-SINAIMEDI-CAL  CENTER）提供被证明鲑降钙素给药后，其中含抗体的4种人血清。这些血清对鲑钙素的抗体滴度如下：
NO.1  1∶4000  NO.2  1∶8000
NO.3  1∶8000  NO.4  1∶2000
1）测定血清稀释比
用0.1M硼酸盐缓冲液做为反应缓冲液，该溶液含有0.5%BSA，0.9%NaCl，0.1%NaN3和0.05%吐温20（Tween 20）。将该反应缓冲液，抗鲑降钙素人类血清（用反应缓冲液稀释到100-6400倍）以及标记后的降钙素溶液以下述各自的量一道装入一个辅助管（Spitz type of Salschted Inc.大小为12×75mm）
（Ⅰ）反应缓冲液  ★1  ★2
300μl  400μl
（Ⅱ）抗鲑降钙素人类血清  100μl  0μl
（Ⅲ）标记后的降钙素溶液
（≈20，000cpm）  100μl  100μl
★1完全结合（B）★2非特异性结合（NSB）
用500μl的0.2%BGG（小牛γ-球蛋白，Sigma）与反应液充分混合，再用1ml25%PEG  6000进一步混合，充分搅拌后，使其置室温下15分钟。然后用斗式离心机（05RP-22，Hitachi）离心反应10分钟，温度为4℃，转速为3000rpm。吸出去掉不清液，用珈玛计数器测量残余物的放射性活性水平。其结果见附图5
2）碘125标记的鲑降钙素同鲑降钙素或杂种降钙素之间的竞争反应。
将反应缓冲液，各种类型的降钙素，抗鲑降钙素人类血清以及标记后的降钙素溶液以下述各自的量加入一个辅助管（an  assist  tube），以同样的方法处理来测定血清稀释度。
Ⅰ）反应缓冲液  ★1  ★2  ★3
200μl  400μl  300μl
Ⅱ）降钙素  100μl  0μl  0μl
Ⅲ）抗鲑降钙素人血清  100μl  0μl  100μl
Ⅳ）标记后的降钙杂溶液
（≈20，000cpm）  100μl  100μl  100μl
（B'）  （NSB）  （BO'）
所有的两种杂种降钙素为：1，人（1-16）/鲑（7-32）降钙素;2，人（1-21）/鲑（22-32）降钙素。
结果和讨论：
检查对于抗鲑降钙素人血清1号（附图5）碘125标记的鲑降钙素是否能同鲑降钙素发生竞争。当用抗鲑降钙素人血清2-4号时，得相同的曲线。这些结果表明在用量为至少1ng/ml时，鲑降钙素开始同标记的鲑降钙素竞争。
四种血清试验提出抗鲑降钙素人类血清（附图6-9）均不识别杂种降钙素1和2。
从而得出本发明的杂种降钙素可能被做为一种用于那些产生抗鲑降钙素抗体的病人有效的药物。
本发明的杂种降钙素具有突出的优点，它同鲑鱼，鳝鱼和鸡降钙素一样具有很强的生物活性，而且不引起任何副作用，包括如恶心，消化道功能紊乱和抗原性。同时通过将人降钙素中的Met8变成Val8可以防止在合成中遇到的副反应问题。

Claims (13)

1、一种由两个肽片组成的杂种降钙素，其一为位于较靠近氨基末端侧的人降钙素或人降钙素类似物的肽片段，其二为位于较靠近羧基末端侧的动物源而非人源降钙素的肽片段。
2、如权利要求1所述的杂种降钙素，其中较靠近氨基末端侧的肽片段含有至少10个人源降钙素的氨基酸残基，较靠近羧基末端侧的肽片段含有至少6个动物源而非人源降钙素的氨基酸残基。
3、如权利要求1所述的杂种降钙素，其中人降钙素是天然人降钙素或者其类似物，动物源而非人源降钙素是天然动物源降钙素或其类似物。
4、如权利要求1所述的杂种降钙素，其中非人源降钙素是来自鳝鱼、鲑鱼或鸡。
5、一种由人降钙素的肽片段和动物源而非人源降钙素的肽片段组成的杂种降钙素，其第一个肽片段包括从氨基末端起第1位至第n位（n＝10-28）氨基酸残基，第二个肽片段包括向羧基末端接续的氨基酸残基。
6、如权利要求1所述的杂种降钙素，其中第一个肽片段包括从氨基末端起的第一位至第n位（n＝13-21）氨基酸残基，并是天然人降钙素的一个肽片段，或者是一个天然人降钙素肽片段中少于两个氨基酸残基被替代，删除或加成后的人降钙素类似物的肽片段。
7、如权利要求6所述的杂种降钙素，其中人降钙素类似物的肽片段中的缬氨酸残基代替天然人降钙素第8位蛋氨酸残基。
8、如权利要求5所述的杂种降钙素，其中第二个肽片段包括鳝鱼，鲑鱼或鸡降钙素从氨基末端第n位（n＝14-22）和接续的氨基酸残基，并是天然鳝鱼，鲑鱼或鸡降钙素的一个肽片段，或是一个天然鳝鱼，鲑鱼或鸡降钙素中少于三个氨基酸残基被替代，删除或加成的降钙素类似物的肽片段。
9、如权利要求8所述的杂种降钙素，其中第二个肽片段是天然鳝鱼，鲑鱼降钙素的肽片段，或者是天然鳝鱼或鲑鱼降钙素的肽片段中一个氨基酸残基被替代，或删除的降钙素类似物的肽片段。
10、一种杂种降钙素，其中从氨基末端起第1到第16位氨基酸残基序列同天然人降钙素的第1至第16位氨基酸残基的序列相同，第17至第32位氨基酸基残基序列同天然鳝鱼或鲑鱼或鲑鱼降钙素的第17至32位氨基酸残基序列相同。
11、一种具有下列结构式的杂种降钙素：
12、如权利要求11所述的杂种降钙素，它具有下列结构式：
Figure 911021272_IMG2
13、如权利要求11所述的杂种降钙素，它具有下列一种的结构式：
Figure 911021272_IMG3
Figure 911021272_IMG4
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