CS399591A3

CS399591A3 - Preparation of enzyme-coated carrier material

Info

Publication number: CS399591A3
Application number: CS913995A
Authority: CS
Inventors: Klaus Dr Sauber
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-12-24
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1992-11-18
Also published as: JPH04365484A; US5599702A; AU660438B2; AU8989591A; EP0492495A2; MX9102792A; CA2058194A1; TW198064B; NZ241116A; ZA9110119B; EP0492495A3; CZ284454B6; KR920012449A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká enzymy potaženého nosičovéhomateriálu, který obsahuje oxidázu D-aminokyselin na po-rézním perličkovém nosném materiálu, způsobu výroby to-hoto materiálu a jeho použití pro přípravu léčiv.

Dosavadní stav techniky D-aminokyselinová oxidáza (dále DAO) katalý-zu je oxidativní desaminaci D-aminokyselin na odpovídají-cí alfa-ketokyseliny, amoniak a peroxid vodíku.

Kromě komerčně dostupné DAO z vepřových led-vin se enzym syntetisuje z bakterií, kvasinek a hub. Z nich vyniká jako výkonný producent DAO Trigonopsisvariabilis. Kromě použití tohoto enzymu ke štěpení race-mátu D,L-aminokyselin v různých roztocích je obzvláštěvýznamná schopnost oxidativní desaminace cefalosporinuC . Tato katalytická vlastnost se využívá k přípravěkyseliny alfa-ketoadipinyl-7-aminocefalosporanové a kyse-liny glutaryl-7-aminocefalosporanové, které se mohoupotom převést pomocí acylázy na kyselinu 7-aminocefalo-sporanovou. 1a V DE-DOS 22 19 454 (US patent 3 801 458) jepopsána reakce derivátů cefalosporinu C pomocí aktivo-vaných buněk Trigonopsis variabilis CBS 4095 . Pojem"aktivovanný" zde znamená, že buňky kvasinek byly podro-beny fyzikálnímu a/nebo chemickému procesu, takže DAO,obsažená v buňkách, ačkoliv je v podstatě neuvolněná,získala schopnost katalyzovat oxidaci cefalosporinu C. V PCT přihlášce WO/86 04087 je popsáno čiště-ní a imobilizace DAO z Trigonopsis variabilis a jejípoužití k oxidativní desaminaci cefalosporinu C . Nejsouzde však uvedeny žádné údaje o operační stabilitě a jeudávána výtěžnost vazby 40 % .

Podstat*vynálezu Úkolem předloženého vynálezu je zlepšení stabi-lity D-aminokyselinové oxidázy. Nyní bylo s překvapenímzjištěno, že navázáním D-aminokyselinové oxidázy na no-sičový materiál ze zesítovaného kopolymeru, který je vpodstatě tvořen jednotkami vinylacetátu a/nebo vinylal-koholu a jednotkami sítovadla, se vytvoří komplex, v němž si enzym DAO dlouhou dobu udržuje svou enzymatickou aktivitu.

Vynález se proto týká nosičového materiálu opatřeného vrstvou enzymů, který zahrnuje D-aminokyselinovou oxidázu a poréznínosičový materiál ve tvaru perliček, kde materiál nosiče je tvo-řen zesítovaným kopolymerisátem, sestávajícím v podstatě z vinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednotek a jednotek sítovadla, kde jednotky sítovadla jsou zabudované sloučeniny obecnýchvzorců I a/nebo II 0 R« - N - i - N - Ro /1/ - B /11/ 2 kde , R2 ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenajívinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2-acyloxyallyl, A představujedvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B ve vzor-ci II znamená dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlí-ku a X znamená acyloxyskupinu, kde acyloxyskupina je zbytek se2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek sítovadla činí 1 až 60 % hmot., vztaženo na polymer, a acyloxyskupiňy vinylacylátovýchjífko -trikové.' ηξ&ο jednotek, jsou přítomny,''! 3sou částečně nebo zcela zmýdelněnyna hydroxyskupiny, střední velikost perel činí 20 až 800 ^um astřední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm.

Bylo překvapující, že enzym v imobilizované formě vykazujepo navázání na uvedený nosič stabilitu při skladování nejméně6 měsíců. Na rozdíl od jiných známých nosičů enzymů, jako např.^Eupergit /R8hm/, Vinyl-^epharo se /Kem-en-tec/, BrCN-aktivova-ná ^epharose /Pharmacia/, projevuje nosič s DAO podle vynálezu překvapivě vysoký výtěžek vazeb, jakož i delší operativní stabi

litu. Zvlášt výhodně jsou nasazovány vinylácetát-epoxy-nosičeR od Riedel de Haen, například VA-Epoxy- Biosynth. Příprava použitých porézních perlových nosičových materiálů, které se potom potahují, je známá z DE-OS 33 44 912.

Ukotvovací reakce mezi enzymy použitými podle vynálezu amateriálem nosiče se provádí známým způsobem, jak je popsánonapř. v DE-OS 24 07 340 nebo v DE-P 22 15 687, 24 21 789 a25 52 510.

Vynález se týká také použití nosičových materiálů podlevynálezu pro oxidativní desaminaci derivátů cefalosporinu C.

Výrazem deriváty cefalosporinu C se rozumí například sloučeniny vzorce I

COOH

COOH ve kterém X znamená acetátovou skupinu, zbytek nukleofilního činidla, heterocyklus, hydroxyskupinu nebo vodík, jakož i jejichsoli.

Cefalosporin C představuje sloučeninu vzorce 7V~

CH2OAc kde R znamená skupinu COOH 0

I II HON - C - /CIL·/-, - G -2 j 2 3

H «< -Ketoadipinyl-7-aminocefalosporanová kyselina je sloučeninavzorce 35C, kde R znamená skupinu 0 0

II II HOOC - C - /CH2/, - C -

Glutaryl-7-aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorceΙΓ, kde R znamená skupinu 0

II HOOC - /CH,/3 " 0 " 7-Aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorce '3T, kde Rznamená vodík.

Dále se vynález týká způsobu přípravy potažených nosičovýchmateriálů, který spočívá v tom, že roztok obsahující D-aminokyse-linovou oxidázu se inkubuje s porézním nosičovým materiálem.vetvaru perel, tvořeným zesííovaným kopolymerisátem, sestávajícímv podstatě z vinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednoteka z jednotek sítovadla, kde jednotky sítovadla jsou zabudovanésloučeniny obecných vzorců I a/nebo II

O

II R. - N - C - N - Ro /1/ \./

A

/11/ - 5 - kde R^, R2 ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenajívinyl, 1 -acyloxyvinyl, allyl nebo 2-acyloxyallyl, A představujedvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B ve vzor-ci II znamená dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlí-ku a X znamená acyloxy, kde acyloxyskupina je zbytek se 2 až 18atomy uhlíku, množství jednotek sítovadla činí 1 až 60 % hmot.,vztaženo na polymer,acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek jako t&kotse! jsou- přítomny,>jsou částečně nebo zcela zmýdelněny na hydroxy·skupiny, a střední velikost částic perel činí 20 až 800 yum astřední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm.

Vinylacetátové jednotky nosičového polymerisátu obsahujív acylátovém zbytku výhodně 2 až 18 atomů uhlíku, zvláště pak2 až 6 atomů uhlíku. Přednostně je to acetátový nebo propionáto-vý zbytek. V polymerisátu mohou být také různé acylátové zbytky,t.zn., že mohou být k přípravě použity také směsi odpovídajícíchvinylacylátů. V sítovadle vzorce I představuje A s výhodou rozvětvenýnebo nerozvětvený alifatický uhlovodíkový zbytek se 2 až 5 atomyuhlíku, zejména se 2 nebo 3 atomy uhlíku. Zvlášt výhodně je toethylenový nebo propylenový zbytek. Jestliže Rj/R2 ve vzorci Iznamenají 1-acyloxyvinyl nebo 2-acyloxyallyl, pak obsahuje ta-to acyloxyskupina přednostně 2 až 18 atomů uhlíku, zvláště pak 2 až 6 atomů uhlíku. Přednostně znamená acyloxyskupina acetáto-vý nebo propionátový zbytek. Výhodným významem zbytků R^/R2 jevinyl. Výhodná jednotka sítovadla v použitém polymerizátu podlevynálezu se odvozuje z příslušné N,N*-divinylethylenmočoviny.

Toto sítovadlo působí spojení zvlášt odolné vůči hydrolýze. Dal-ším výhodným zástupcem je N,N -divinylpropylenmočovina. V sítovacím prostředku vzorce II má B výhodně význam dvoj-vazného uhlovodíkového zbytku, zejména rozvětveného nebo neroz-větveného alkylenového zbytku se 2 až 6 atomy uhlíku, přednost-ně má stejný význam, který byl shora popsán pro zbytky R^ a R2ve vzorci I. Výhodným sítovadlem tohoto druhu je příkladně 3,3--dimethylpentadien-2,4-diacetát, který se zvlášt snadno kopolyme- ruje s vinylacetátem.

Množství jednotek sítovadla /11/ činí obecně 0 až 100 %,obzvlášt 0 až oO %, vztaženo na celkové množství jednotek síto-vadla v polymerizátu.

Celkové množství jednotek sítovadla v nosičovém polymerizá-tu leží v uvedených rozmezích a závisí na požadované hustotě zesítění pro určitý účel použití. Tak například pro použití jako no-sičového materiálu pro enzymatickou reakci v kotli s míchadlemnebo pro diagnostiku je výhodná relativně menší hustota zesítění,čehož předpokladem je nižší obsah zesítěných monomerních jedno-tek. Obsahy sítovadla pod 0,1 hmot.% vedou v některých případechk nežádoucím produktům. Jako spodní hranici je proto obecně mož-no uvést asi 1 hmot.%. Obsahy sítovadla nad 60 hmot.% jsou v zá-sadě možné, ale nepřinášejí zpravidla žádné další výhody.

Podle účelu použití jě množství jednotek sítovadla před-nostně 1 až 50 hmot.% a zvláště pak 1 až 40 hmot.%, vztaženo napolymer. Při použití jako nosičového materiálu pro DAO podle vy-nálezu, je spodní hranice výhodně 2,5 hmot.% a zvlášt výhodně10 hmot.%. V případě, že se používají jen jednotky sítovadla vzorce II, činí tato spodní hranice přednostně 2,5 hmot.%. Může být výhodné, když nosičový polymerizát obsahuje pří-datně ještě monomerní jednotky monomeru schopného kopolymeraces vinylacetátem, přičemž jejich množství obecně nepřekračuje 10hmot.%, vztaženo na celkový polymer, a přednostně je mezi 0,1 a5 hmot.%. Příklady takových monomerů, které se mohou popřípaděnasazovat ve směsi jsou: N-vinylpyrrolidon, vinylenkarbonát,/meth/akrylová kyselina, /meth/akrylnitrii, /meth/akrylamid, al-kylester kyseliny /meth/akrylové se 2 až 12 atomy uhlíku, výhod-ně se 2 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, hydroxyalkylesterkyseliny /meth/akrylové se 2 až 6 atomy uhlíku v alkylové skupi-ně, N-vinyl-N-alkylacetamid, styrol, <<-methylstyrol apod.

Zesítovaný nosičový polymerizát se přednostně používá ve - 7 - formě perel, majících převážně kulovitý tvar, jejichž střednívelikost částic činí v suchém, nenabohtnaném stavu 20 až 800 yuma výhodně 50 až 300 yum a výhodně vykazuje úzký rozptyl velikos-ti částic. Optimum velikosti částic závisí přitom především naspeciálním oboru nasazení. Při sloupcovém způsobu probíhajícímbez tlaku se příkladně velikost částic bude volit uvnitř dříveuvedených hranic příslušně větší než při způsobu probíhajícímza tlaku. Perly nasazených polymerizátů podle vynálezu jsou pře-vážně makroporézní. Střední průměr pórů je obecně v rozmezí 2 až10 000 nm, výhodně 5 až 200 nm a zvláště 20 až 200 nm.

Acylátové skupiny vinylacylátových jednotek v nasazenémpolymerizátů podle vynálezu jsou jako takové, nebo jsou výhodněčástečně nebo zcela zmýdelněny na OH-skupiny. Přitom je nejméně10 hmot.% acyloxyskupin převedeno na hydroxyskupiny. Stupeňzmýdelnění činí však obecně více než 50 %, s výhodou více než70 % a zvlášt pak 90 až 100 %.V zesítovaném polymeru /polyvinyl-alkoholu/ získaném zmýdelněním je výhodně alespoň část OH-sku-pin obsazena takzvanými "spacer" skupinami /příslušný "spacer"viz dále/.

Kopolymerizát ve formě polyvinylacetátového gelu není hyd-rofilní, pro použití ve vodě se musí esterová skupina hydrolyzo-vat. To se může provádět známým způsobem alkalicky, nabobtnánímproduktů v alkoholu, např. methanolu a přidáním vodné zásady, jako hydroxidu sodného, nebo přeesterifikováním produktů nabobtna-ných v alkoholu katalytickým množstvím kyseliny nebo zásady připrůběžném odstraňování vytvořených esterů např. destilací /vizDE-PS 15 17 935/. Zmýdelnění se může v libovolném stupni přeru-šit, takže podle účelu použití se může upravit stupeň hydrofil-nosti gelu. Při nasazení perlovitého zesítovaného polyvinylalkoholové-ho gelu jako nosiče DAO, která se na nosič fixuje kovalentní vazbou, je v mnoha případech účelné gel nejprve modifikovat t.zv."spacery". "Spacerem" se přitom rozumí sloučeniny, které reagují jak s nosičovým polymerem tak s biologicky aktivní látkou a me-zi oběma tvoří jakési mosty. Reakce perlového polymerizátu sespacerem může nastat buá přímo nebo s výhodou po předcnozím zmý-delnění acylátových skupin. Stupeň reakce závisí přitom mimo ji- né na zablokování spaceru a dostupnosti acylátové skupiny, po-případě z toho vzniklé sekundární hydroxyskupiny. Jako spacerypodle vynálezu přicházejí v úvahu k tomuto účelu známé mono- aheterobifunkční sloučeniny jejichž druhá funkční skupina přebí-rá vazbu s připojovanou aktivní látkou /srovnej DE-PS 24 21 789a 25 52 510, jakož i Ullmanns Encyclopádie der technischen Chemie, 4. vydání, díl 10, str. 540 a "Characterization of ImmobilizedBiocatalysts", Verlag Chemie, Weinheim, 1979, S.53/. U nasazených spacerů se jedná příkladně o sloučeniny, kte-ré zavádějí dáleuvedené skupiny: /CH2Zn “ NH2/CH2/n - CH “ CH2

NH /CHO/ - CH2 n CH, /GH2/n - c;

n = 2-12 η = 1 - 8 n - 1 - 8 n = 1 - 8

X = H, OH, halogenNp OR n = 1 - 6 R = alkylový zbytek s1 až 6 atomy uhlíku

Y = nh2, n2, NCO Výhodné spacery jsou takové, které nastolují chemické pod- -9 - minky odolné vůči nydrolýze, jako epichlorhydrin nebo jeho homo-logy /*<,/3 -epoxy-ω-halogene lkaný/. .Reakce polyvinylalkoholu/polyvinylacylátu/ se provádí přitom bez rozpouštědla nebo v pro-středí rozpouštědla, přednostně v přítomnosti katalyzátoru. Reak-cní doba je, v závislosti na teplotě, která může být mezi teplo-tou místnosti a teplotou zpětného toku epichlorhydrinu /113 až115 °C/, obecně mezi 30 minatami a 24 hodinami.Jako katalyzátorypřicházejí v úvahu např. NaOH /v práškové formě/ nebo vodné roz-toky zásad, dimethylformamid, triethylamin a jiné akceptory kyse-lin.

Reakce mezi DAO a nosičem se provádí při teplotě mezi 0 a+40 °C, s výhodou při teplotě místnosti. Ukotvovací reakce seprovádí s výhodou v blízkosti neutrální hodnoty pH, příkladněpři hodnotách pH 5 až 9, výhodně v prostředí fosfátového pufruo iontové síle 0,5 až 1,5 M. D-aminokyselinová oxidáza se může získat například z prase-čích ledvin, bakterií, kvasinek nebo hub. Výhodně se k získáníDAO používá kvasinek Trigonopsis variabilis CBS 4095. Pro vazbuna nosič enzymu se mohou užít vyčištěný, částečně vyčištěný nebosurový buněčný extrakty obsahující DAO. Čištění DAO se může prová-dět klasickým způsobem, např. srážením síranem amonným, iontoměničovou nebo gelovou permeační chromatografií. Přednostně se použí-vají roztoky enzymu obsahující DAO, které se získají iontoměni-čovou chromatografií na ¾EAE-Cellulose. Dále se může na nosič spolu s DAO navázat také kataláza.Kataláza se může získat například ze zvířat, bakterií, kvasineknebo hub. Přednostně se kataláza získává z kvasinky Trigonopsisvariabilis CBS 4095. Pro navázání na nosič enzymu mohou být pou-žity čištěné, částečně čištěné nebo surové buněčné extrakty obsa-hující katalázu. Kataláza se může navázat na enzymový nosič sou-časně s DAO, před nebo po navázání DAO. Enzymové nosiče, na nichžje navrštvena pouze DAO nebo pouze kataláza se mohou smísit.

Vynález bude blíže vysvětlen na základě příkladů. Údaje o 1 o procentech se vztahují na hmotnost. Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Kultury Trigonopsis variabilis CBS 4095 byly nejprve vnese·ny do třepané baňky a potom do míchaného fermentoru, obsahující-ho medium, které popsali Sentheshanmuganathan a Nickerson /J.Gen. Microbiol. 27, 465, 1962/, buď s methioninem nebo s alani-nem jako zdrojem dusíku.

Ke stanovení DAO se 0,4 g buněk zmrazí, následně se rozta-ví při kyselém pH, např. asi při pH 3 až 4, zmrazení může probí-hat při teplotě pod -10 °C, např. asi při -20 °C. Musí se mra-zit dostatečně dlouho, aby se vyvolala permeabilita buněk, např.alespoň 1 hodinu při -20 °C.

Aktivita se určí s následující násadou fotometričky: roztoky: 1/ pufr 2/ o-fenylendiamin 3/ peroxidáza 4/ enzym nebo permeabili- zované buňky5/ substrát 100 mM KPP, pH 7,3, sycený vzduchem0,02 % v H201 mg/ml v pufru optimálně: 0,5 - 1,0 jednotek/ml150 mM Na - CPC /100 %/ v pufru

Průběh testu: Λ = 405 nm /maximum/£ = 4020 1/mol x cm

= 30 °C

Objemy: 1/ 2,00 ml2/ 0,50 ml

Konečná koncentrace: 83 mM0,0034 % 1 1 3/ 0,10 ml4/ 0,05 ml 0,034 mg/ml 2 minuty čekat 5/ 0,30 ml

15,25 mM 2,95 ml Výpočet: .jednotky _ Ξ x zředěni x celkový objem ml min x e x d x objem vzorku Při shorauvedených podmínkách byla dosažena aktivita enzy-mu ve fermentoru 200 U/l. Při stanoveních aktivity s imobilizovaným enzymem bylydiskontinuálně odebírány vzorky a v odběru byla stanovena CPC-koncentrace pomocí HPLC. Mobilní fáze byla tvořena 40 mM kalium-fosfátového pufru /pH 4,3/ a 20 % MeOH s 10 mg/1 tetrabutylamo-

RP 18 /5 /um/. Příklad 2

Syntéza nosiče a/ Suspenzní polymerace

Ve skleněné baňce o objemu 1,4 1 s míchadlem, zpětnýmchladičem a teploměrem byla za míchání a pod atmosférou dusíkususpendována organická fáze, tvořená roztokem 60,0 g vinylace-tátu, 40,0 g N,Nz-divinylethylenmočoviny, 80,0 g ethylhexanolu,20,0 g polyglykolu B 11/50 /Hoechst AG/ a 2,0 g azoisobutyroni-trilu Porofor N /Bayer. AG/ve vodné fázi, sestávající z 3,2 gNagHPO^, 8,0 g polyvinylpyrrolidonu /' mol. hm. ca 360 000/ a 800 ml vody. Zahřátím na 75 °C ve vyhřívané lázni byla nastar·tována polymerace. Po dvou hodinách byla teplota zvýšena na85 °C a po dalších dvou hodinách byla polymerace skončena. Zí-skaná suspenze byla ochlazena na 25 °C, odsáta a promyta čtyři- 12 - krát vždy 1 1 vody, třikrát vždy 1 1 methanolu a dvakrát vždy1 1 acetonu během 30 minut, odsáta a při 50 °C a 26,66 kPa senechala přes noc ve vakuové sušárně pod dusíkem vysušit. Výtě-žek činil 75 g, vzhledu zakalených perel s lesklým povrchem.

Sypná hmotnost činila 300 g/1. Z toho plyne sypný objem 3,3 ml/g. b/ Parciální zmýdelnění 50 g suchého produktu bylo promyto celkem 150 ml methano-lu a roztokem 17,5 g NaOH ve 150 ml vody během 3 hodin při 30 °C,odsáto, neutralizováno v 500 ml methanolu kyselinou octovou,promyto jedenkrát 500 ml methanolu a dvakrát vždy 500 ml aceto-nu, odsáto, prosáto a vysušeno. Výtěžek činil 34,4 g /=68,8hmot.%/, vztaženo na polymerizát. Perly byly zakalené a měly le-sklý povrch. Sypná hmotnost činila 353 g/1 /vypočítaný sypný ob-jem 2,8 ml/g/. Sítový rozbor:>300 /Um 19,0 g /55,2 hmot.%/, 200 až 300 ^um8,9 g /25,9 hmot.%/, 100 až 200 /um 6,1 g /17,9 hmot.%/ a 50až 100 /um 0,4 g /1,2 hmot.%/. Stupeň zmýdelnění /IR, vztaženona mol/: 73 %. c/ Adice spaceru 10,0 g suchého sítového podílu 50 až 200 ^um se nechalonabobtnat 4 hodiny ve 100 ml epichlorhydrinu při 25 °C, potomse zahřívalo 4 hodiny za mírného míchání na 115 °C a po ochla-zení na 25 °C se odsálo. Potom se promylo dvakrát, pokaždé 200ml acetonu, během 30 minut, odsálo se a uschovalo přes noc v su-šárně za sníženého tlaku při 50 °C pod dusíkovou vrstvou.

Zvážení poskytlo 9,8 g suchého produktu o sypné hmotnosti 315 ga epoxidovém ekvivalentu 350 /umol/g. Příklad 3 10 g vlhkých buněk připravených jako v příkladu 3, s akti-vitou 30 U/g bylo smíseno a suspendováno ve stejném hmotnost-ním podílu s 20 milí kaliumfosfátového pufru, pH 8,0. Směs bylaza chlazení rozemleta v Dyno-mlýně při době zdržení 3x5 min. 13

Výtěžek aktivity v supernatantu po odstředění při 13 000 g či-ní 60 až 80 %, v průměru je to 210 U. Lehce zakalený surový ex-trakt byl dialyzován proti 20 mM kaliumfosfátového pufru, pH 8,0.

Potom bylo přidáno tolik DEAE-Cellulose od Whatmana, aby bylaDAO zcela navázána. Nakonec byl navázaný enzym naplněn do sloupce kolony a DAO by3a eluovánAse' stoupající iontovou silou /0 -0,5 M NaCl/. Aktivní podíly byly spojeny, zahuštěny ultrafil-trací a pufrovány 1 M kaliumfosfátovým pufrem /pH = 8,0/. V průměru obsahuje takto přečištěný roztok DAO 25 U/ml. Příklad 4 5 ml roztoku získaného podle příkladu 3 se nanese na 1 g n VA-Epoxy Biosynth /Přede1-deHaen/ a nechá se uzavřeno stát 3 dny při teplotě místnosti. Enzym se v této době kovalentněváže na nosič obsahující oxiranové skupiny. Potom se imobili-zovaný enzym promyje 1 M roztokem NaCl. Vazebná účinnost činív průměru 0,83. Nepatrná množství jsou v promývací vodě. Imobi-lizovaný enzym má ca 32 U/g /hmotnost ve vlhkém stavu, Fgw/.Skladování se provádí ve 20 mM kaliumfosfátového pufru, kterýobsahuje 0,02 % azidu sodného, při 4 °C. Příklad 5

Postupovalo se jako v příkladu 2, avšak jako nosič bylR nasazen Eupergit , Rflhm, Darmstadt. Výsledky jsou v tabulce I. Příklad 6 2 ml roztoku DAO se dialyzovaly proti 50 mM kalinmfosfá-tového pufru /pH = 8,6/. Pufrovaný roztok s celkem 60 U se inkuboval za účelem ustálení při teplotě místnosti /R.T./ po dobu18 hodin se 2 ml suspenze vinylsepharosy /60 %/.Získalo se 1,2ml sepharosy s 22 U/ml /viz tabulka 1/, což odpovídá 43 % va-zebného výtěžku. V promývací vodě je 10 U, vypočteno podle hod-not při η 0,51. 14 - Příklad 7 1 ml roztoku DAO s 3,2 U, který byl dialyzován proti 0,5M kaliumfosfátového pufru pH 8,7, byl přidán k 0,2 g CNBr-akti-vované sepharose /Pharmacia/ při teplotě místnosti. Po 90 mi-nutách bylo navázání skončeno a podle výrobního předpisu pro-běhlo promývání. Přebytečné vazebné skupiny byly inaktivoványglycinem. Výsledek viz tabulka I. Příklad 8

Enzym imobilizovaný jako v příkladu 4 byl za podmínekuvedených v příkladu 4 uskladněn a každý měsíc byla zjištová-na aktivita. V 6 měsících neklesla aktivita více než o 5 %. Příklad 9

Sodná sůl cefalosporinu C /40 mM/ byla rozpuštěna připH 7,3 ve 20 mM kaliumfosfátového pufru a za míchání tempero-vána na 30 °C a sycena kyslíkem. K roztoku byly přidány 2 %hm./hm./ imobilizováné DAO a násada se prostřednictvím automa-tického titračního přístroje udržovala na počátečním pH. Po u-končení reakce se roztok vypustí a reaktor znovu naplní. Enzymzůstává v nádobě. Počet reakcí je 120. Reakční doba se volí tak,aby byla umožněna úplná reakce,a činí až asi 40 reakcí 1 hodi-nu, potom 1,5 až do 90 a konečně 2 h.

Tabulka I: Srovnání nosičů enzymu vazebná efekti-vita U/g /FGW/

Eupergit 0,71 29 /Rflhm/ VA-Epoxy 0,83 /Riedel-deHaen/ td při 30 °C,pH = 7,3 /'Ί / «s 20 32 > 40 15 -

Tabulka I-pokračování

Vinyl-Sepharosa 0,51 /Kem-en-tec/

BrCN-akt.

Sepharosa/Pharmacia/ 22 X? 15 0,7

Claims

^®Eř.'SM’.*?572ČXAPRAHA 1, Žíná S 16 - PATENTOVÉ NÁROKY

1. Enzymy potažený nosičovy materiál, který obsahuje D-amino-kyselinovou oxidázu a porézní perličkový nosičový materiál, při- v čemž nosičový materiál je tvořen zesítovaným kopolymerizátem,který v podstatě sestává z vinylacetátových a/nebo vinylalkoho-lových jednotek a jednotek sítovadla, přičemž jednotky sítovad-la jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/nebo II CH, 0 II I - c - ) llljd \ λΛ3ί’3Ο V/1/ . ÁZ3 1\ . >Λ 3hd (___ 16 nx o ij eso a Π H 9 0 kde R^ , R^ ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenánívinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2-acyloxyallyl, A představu-je dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B vevzorci II je dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlí-ku a X znamená acyloxyskupinu, přičemž acyloxyskupina je zbytekse 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek sítovadla činí 1 až60 hmot.%, vztaženo na polymer a acyloxyskupiny vinylacylátovýchjednotek jsou přítomny jako takové, nebo jsou částečně nebo zce-la zmýdelněny na hydroxyskupiny, střední velikost částic perelčiní 20 až 800 /um a střední průměr pórů činí 2 až 1 0 000 nm.
2. Nosičový materiál podle nároku 1, vyznačujícíse t í m, že D-aminokyselinová oxidáza pochází z kvasineknebo z hub.
3. Nosičový materiál podle nároku 1 nebo 2, vyznaču jící se tím, že obsahuje D-aminokyselinovou oxidázu a katalázu. - 17 -
4. Způsob přípravy povlečeného nosičového materiálu podlenároku 1 nebo 2,vyznačující se tím, že roz-tok obsahující D-aminokyselinovou oxidázu se inkubuje s poréz-ním perličkovým nosičovým materiálem ze sítovaného kopolymeri-zátu, který je v podstatě tvořen vinylácetutovými a/nebo vinyl-alkoholovými jednotkami a jednotkami sítovadla, přičemž jednot-ky sítovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/ne-bo II ' 0 ,.L: ch2 = c /1/ /11/ kde S.j , R2 ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenajívinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2-acyloxyallyl, A představu-je dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B vevzorci II je dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlí-ku a X znamená acyloxyskupinu, přičemž acyloxyskupina je zby-tek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek sítovadla Činí1 až 60 hmot.%, vztaženo na polymer a acyloxyskupiny vinylacylá-tových jednotek jsou přítomny jako takové, nebo jsou částečněnebo zcela zmýdelněny na hydroxylové skupiny, střední velikostčástic perel činí 20 až 800 /um a střední průměr pó- rů činí 2 až 10 000 nm.
5. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím,že se používá roztok obsahující D-aminokyselinovou oxidázu zí-skanou z hub nebo kvasinek.
6. Způsob podle nároku 4 nebo 5,vyznačující setím, že se používá roztok obsahující D-aminokyselinovou oxi- 3 - % - 4-8 - dázu přečištěný iontovýměnnou chromátografií.
7. Způsob podle jednoho nebo více nároků 4 až 6, vyzna-čující se tím, že se používají roztoky obsahujícíD-aminokyselinovou oxidázu a katalázu.
8. Způsob podle jednoho nebo více nároků 3 až 7, vyzna-čující se tím, že se inkubace provádí při teplotěmezi 0 °C a +40 °C.
9. Způsob přípravy derivátů glutaryl-7-aminocefalosporanovékyseliny nebo »<-ketoadipinyl-7-aminocefalosporanové kyseliny,vyznačující se tím, že nasadí potažený nosičo-vý materiál podle jednoho nebo více nároků 1 až 3 a derivátcefalosporinu.