CS268404B1 - Myši B-lymfocytárnl hybridomová produkční linie HBS - 02 AO 36/Θ6 - Google Patents

Abstract

Řešeni ee týká nové produkční myši hybrldomové linie HBS-02 vytvářející specifickou monoklonálni protilátku podtřidy IgGl proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B (HBsAg).

Description

Vynález ee týká nové produkční hybridomová linie vytvářející specifickou monoklonální protilátku proti povrchovému antigenu viru hepatitidy B /HBsAg/. Hybridom byl seetrojen fúzí buňky myéí myelomové linie a myšího lymfocytu, eenzibilizovaného antigenem HBs.

Diagnostická séra proti HBsAg jsou základní složkou souboru imunoreagencií nezbytných pro aerologickou diagnoatiku onemocněni člověka virovou hepatitidou B a pro zjišťováni přítomnosti viru hepatitidy B v krvi a krevních derivátech v transfuzní službě. Tato séra jeou součásti souprav pro detekci HBsAg /SEVATEST ELISA H BsAg-l MACRO I nebo ELISA HBsAg MICRO 1/, které jsou používány ve zdravotnictví při rutinním vyšetřování krve.

Diagnostická séra používaná pro stanovení HBsAg pomocí uvedených testů jsou hyperimuni králičí a kozí antiséra, připravovaná dosud opakovanou imunizaci zvířat purifikovaným HBsAb, připravovaným z lidských plazem nosičů HBsAg. Příprava HBsAg je značně náročná na materiální, metodické i organizační zajištění výrobního procesu. Nedostatkem tohoto způsobu přípravy hyperimuních antisér je, že některá zvířata nedostatečně reaguji na imunizaci HBsAg,čímž docházík výrobním ztrátám. Vedle žádaných protilátek proti HBsAg se v hyperimuních antisérech mohou vyskytnout i nežádoucí protilátky proti lidským sérovým bílkovinám, které je nutno ze séra odstranit vysycenim. Standardizace jednotlivých šarží diagnostických sér js při stávajícím způsobu přípravy obtížná a vždy neúplná, neboť z vlastní podstaty dosavadního způsobu přípravy imunních sér vyplývá, že nelze získat dvě výrobní ěaržs stejných vlastností.

Dalším nedostatkem vyšetřování HBsAg prováděného pomoci dosud užívaných polyklonálních sér je, že nelze vyloučit chybné výsledky, způsobené nižší citlivosti nebo neočekávanými vlastnostmi diagnostických s^ér.

Mnohé z uvedených problémů dosud používaného postupu přípravy diagnostických sér i řadu nedostatků vyplývajících z nevhodných vlastností dosud používaných polyklonálnich diagnostických sér je možné odstranit zavedením přípravy myších monoklonálních protilátek proti HBsAg produkovaných B~lymfocytárníml hybridomy. Hlavním přínosem zavedení monoklonálních protilátek je především zjednodušení a urychlení výrobního postupu, úspora purifikovaného HBs antigenu, standardizace přípravy jednotlivých šarži diagnostických sér,· zvýšeni citlivosti a specifity vyšetření i zkrácení doby nutné pro provedeni diagnostického testu. ........

Zdrojem monoklonální protilátky proti HBsAg je hybridomová linie HBS-02, uložená ve sbirce hybridomů Ústavu sér a očkovacích látek, Praha 10, W.Piecka 108 pod označením HBS - 02 AO 36/86.

Uvedený hybridom byl seetrojen způsobem známým z odborné literetury /S.Fazekas de St. Groth, D. Scheidiggsr: Production of monoclonal antibodiesi Strategy and tactics, □.Immunol. Meth. 35:1,1980^ □. Kalil, 0. Crevat, M. Fellous, □. Drouet, A.M. Courouce, C. Ropers: Production d'anticorps monoclonaux anti-HBs. Ann-lmmunol./Inst.Pasteur/ 132c,319,1981/ klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzi buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a eenzibilizovaných lymfocytů, získaných ze slezin myší kmene BALB/c, imunizovaných HBsAg.

B-lymfocytárni hybridomová linie HBS-02 produkuje zcela homogení protilátky tzv. protilátky monoklonální,¹ které specificky reagují s HBsAg a nikoliv s lidskými plasmatickými bílkovinami. Hybridom HBS - 02 je možné pěstovat v podmínkách buněčné kultury in vitro nebo in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c nebo jej dlouhodobě uchovávat při teplotě kapalného dusíku. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem HBS - 02 je specifická pro HBsAg a prostá dalších nežádoucích protilátek.

• Buňky hybridomů HBS-02 jeví ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk s volnými i na membránu vázanými polyribozomy. V podmínkách buněčné kultury rostou ja ko slaběadharujlclbuňky /poloeuspenznl kultura/ v mediu MEM nebo RPMI 1640, doplněném 2-merkaptoetenolem /5 x 10 M/, 10 % telecího séra pro tkáňové kultury a antibiotiky / 100 j. penicilinu, 100 pg streptomycinu a 40 pg gentamycinu v 1 ml/ při 37 °C· Střední generační doba produkční linie HBS - 02 činí 20 hodin. Produkovaná monoklonélní protilátka je myěi imunoglobulin třídy IgG 1, její izoelektrlcký bod je 5,6 až 6,1.

Příkled 1

Za účelem pomnožení produkční hybridomové linie HBS - 02 e zíekání monoklonélní protilátky bylo vyseto do kultiveční nádobky 1 χ 10⁵ buněk /1 ml kultivečniho médie. Po 3 dnech růstu buněk bylo z kultiveční nádoby získáno kultivační médium, obohacené o monoklonélní protilátky,· vytvořené buňkemi produkční hybridomové linie. Monoklonélní protilátky reagovaly s purifikoveným HBeAg v radiolmunologickém stanoveni až do ředěni 1 t 10⁶.

Příkled 2

Monoklonélní protilátko proti HBsAg byle získáne in vivo po inokuloci 5 x 10 buněk hybridomové produkční linie HBS - 02 do peritoneálnl dutiny myěi kmene BALB/c, které bylo 14 dní předem injikováno stejným způsobem 0,5 ml parafinového oleje. Monoklonálnl protilátky proti HBeAg byly obseženy v oscltické tekutině, získoné z peritoneálnl dutiny myěi zo 12 dni po inokuloci buněk. Monoklonálnl protilátky reagovaly s purifikoveným

Q

HBeAg v radiolmunologickém stanovení až po ředěni 1 : 10 . Bylo získáno 5 ml ascitlcké tekutiny e obsahem imunoglobulinu 12 mg/ml.

Claims (1)

1. PREDMET VYNALEZU

   Myěi B-lymfocytární hybridomové produkční linie HBS - 02 AO 36/86 produkujíc!

   monoklonálnl protilátku podtřldy IgCl proti povrchovému entigenu viru hepetitidy B.

   Opravy ve vytištěných popisech vynálezů

   Ve vytištěném popisu vynálezu k autorskému osvědčení č. 268 404 (PV 5404- 86.Z) schází titul u třetího autora vynálezu.