CS265699B1 - Průmyslový bakteriální kmen Brevibacterium sp. CCM 4013 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká průmyslového bakteriálního kmene Brevlbacterlum sp. M27/ ZA46 produkujícího L-valin uloženého v Československá sbírce mikroorganismů univerzity J.E. Purkyně, tř. Obránců míru 10, Bmo, pod označením CCM 4013. Kmen se vyznačuje oproti výchozímu rodičovskému kmeni Brevlbacterlum sp. M27 produkcí esenciální aminokyseliny.

Description

Vynález se týká nového průmyslového bakteriálního kmene Brevibacterium sp. M27 produkujícího L-valin. Kultivace probíhá v tekutých fermentačních mediích, která obsahují jako hlavní zdroj uhlíku pro růst a produkci esenciální aminokyseliny sacharidy (sacharosu nebo jiné cukry) a jako zdroj dusíku kukuřičný extrakt, hydrolyxát arašídové mouky a další růstové faktory včetně minerálních solí.

Podstatou vynálezu je nový průmyslový kmen Brevibacterium sp. M27/A46 produkující L-valin, uložený v Československé sbírce mikroorganismů Univerzity J.E.Purkyně, tř. Obránců míru 10,

Brno, pod označením CCM číslo 4013.

Způsob přípravy nového produkčního kmene Brevibacterium sp. M27 je založen na aplikaci mutagenního faktoru N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinu, který indukuje nové mutantní kmeny charakterizované auxotrofií. Některé ze získaných auxotrofních mutantů se vyznačují produkcí esenciální aminokyseliny.

Jako výchozí materiál pro mutagenezi byl použit kmen Brevibacterium sp. M27 auxotrofní na homoserin a rezistentní na S-amino-ethyl-L-cystein (AEC^r).

Dále je uvedena morfologická a fyziologická charakteristika kmene podle vynálezu označeného jako Brevibacterium sp. M27/A46.

- 2 265 699

Morfologie kmene;

a) kolonie na kompletní agarové půdě po 72 hod. kultivace při 29 °C:

tvar okrouhlý okraje rovné povrch lesklý profil konvexní s mírně vyvýšeným středem barva sytě žlutá velikost 2 3 mm

b) mikroskopicky:

tyčinky silné krátké, ojediněle delší, občasné uspořádání ve dvojicích velikost: šířka 1,0 <2 1,2 um délka 2,0 3,6 um barvení podle Grama pozitivní

Genetická charakteristika: kmen je dependentní na homoserin a cystin a rezistentní k AEC.

U rodičovského kmene Brevibacterium sp. M27 a u mutantního kmene bylo provedeno testování utilizace některých zdrojů C a N a stanoveny další jejich biochemické vlastností.

Substrát Kontrola Testovaný produkční mutantní kmen

M27 M27/A46 sirovodík manit lysin indol ornithin

Simmons citrát urea + +

ONPG

Voges-Proskauer inosit

Tween 80 fenylalanin arginin malonát sodný’

265 699

Substrát Kontrola Testovaný produkční mutantní kmen

M27 M27/A46

adonit	-	+
celobiosa	+	+
rhamnosa	+	+
sacharosa	+	+
• sorbit	-	-
eskulin	-	-
trehalosa	+	+
dulcit	-	-
glukosa	+	+
bez substrátu	-	-

Z tabulky vyplývá, že základní biochemická charakteristika mutantního kmene a rodičovského kmene Brevibacterium sp. M27 je totožná s výjimkou schopnosti zkvašování adonitu u mutantního kmene, zatímco rodičovský kmen má reakci negativní.

Postup získání mutantního kmene

Šlechtění rodičovského kmene Brevibacterium sp. M27 s cílem získat kmeny produkující esenciální aminokyseliny bylo prováděno chemickou mutagenezí N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinem (Koch-Light, England).

Suspenze buněk z exponenciální fáze růstu byla připravena kultivací v tekuté kompletní půdě 24 hod. při 29 °C. Poian byla kultura promyta a resuspendována v Tris-maleinovém pufru pK 6

O tak, aby koncentrace buněk byla přibližně 10 buněk/ mL a přidán roztok mutagénu v témže pufru, aby jeho konečná koncentrace byla 0,5 mg/mL nebo 1 mg/mL. Reakční směs byla inkubována ve vodní lázni při 29 °C po dobu 30 nebo 20 min, aby přežití buněk se pohybovalo v rozmezí od 5 do 0,1 %. Po působení mutagénu kultura byla promyta, ředěna ve fyziologickém roztoku a vyočkována na kompletní pevnou půdu a inkubována při 29 °C po dobu 96 hod. Hodnocením růstu na pevné minimální půdě byly izolovány kolonie auxotrofních mutantů.

265 699

Fermentační hodnocení auxotrofních mutantů Brevibacterium sp. M27 bylo prováděno na tekutých živných půdách v baňkách v laboratorním měřítku na rotační třepačce při teplotě 29 °C po dobu 96 hod.

Způsob fermentace a produkce valinu mutantním kmenem uvádí následující příklad.

Příklad

Inokulum bylo připraveno kultivací produkčního mutantního kmene Brevibacterium sp. M27/A46 v 50 mL inokulačního média ve varné baňce o obsahu 500 mL. Složení inokulačního média: sacharosa těch. 20 g, octan sodný kryst. 40 g, kukuřičný extrakt (60 % hm. suš.) 30 g, voda destilovaná ad 1000 mL. Kultivace byla prováděna na rotační třepačce (240 ot. min^-1·) při 29 °C po dobu 18 45 24 hod. Narostlým inokulem v množství 10 % objemu bylo zaočkováno 20 mL fermentačního média (ve varné baňce o obsahu 500 mL) následujícího složení: sacharosa těch. 120 g, hydrolyzát arašídové mouky 120 mL, cornsteep 5 g, hydrofosforečnan draselný 1 g, síran hořečnatý kryst. 0,1 g, uhličitan vápenatý mikromletý 20 g, voda destilovaná ad 1000 mL, pH fermentačního média po sterilizaci 6,8 £ 7,0. Kultivace byla prováděna na rotační třepačce při 29 °C po dobu 96 hod. V průběhu fermentace bylo upravováno pH na hodnotu 7,0 10 % roztokem amoniaku. Produkce valinu i mutantního kmene Brevibacterium sp. M27/A46 činí 6,5 g L-valinu/L fermentačního média/96 hod. fermentace.

Claims (1)

1. Průmyslový bakteriální kmen Brevibacterium ap.

   CCM 4013, vyznačující ae tím, že produkuje L-valin.