CS236206B1 - Průmyslový bakteriální kmen Brevibacterium sp. CCM 3632 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká průmyslového bakteriálního kmene Brevibacterium sp. M27/P28 produkujícího L-Lysin, uloženého v Československé sbírce mikroorganismů University J.E. Purkyně tř. Obránců míru 10, Brno, pod označením CCM číslo 3632. Vyznačuje se zvýšenou produkcí esenciální aminokyseliny prpťiífvýchozíma rodičovskému kmeni Brevibacterium sp.

Description

Vynález se týká nového průmyslového bakteriálního kmene Brevibacterium sp, (LCrTMTroduku j i ci ho L-lysin ve zvýšeném výtěžku. Kultivace probíhá v tekutých fermentačních mediích, která obsahuji jako hlavni zdroj uhlíku pro růst a produkci esenciální aminokyseliny» sacharidy Zsacharosu nebo jiné cukry/ a jako zdroj dusíku kukuřičný extrakt» hydrolysát arašídové mouky a další růstové faktory včetně minerálních soli.

Podstatou vynálezu je nový průmyslový kmen Brevibacterium sp. M27/P 28 produkující L-lysin» uložený v Československé sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyně, tř. Obránců míru 10» Brno» pod označením CCM čislo 3632.

Způsob přípravy nového produkčního kmene Brevibacterium sp. je založen na aplikaci mutagenního faktoru N-methyl-N*-nitro-N-nitrosoguanidinu, který indukuje nové mutantni kmeny charakterizované jiným typem pigmentace. Ziskant chromogenni mutanti se dále vyznačuji zvýšenou produkcí esenciální aminokyseliny proti výchozímu rodičovskému kmeni Brevibacterium sp.

Tímto způsobem byl připraven chromogenni mutant s okrovou pigmentaci. Jako výchozí materiál pro mutagenesi byl použit kmen Brevibacterium sp. M27 hora“AEC^r světle žluté pigmentace, produkující v průměru 30,5 g/l L-lysinu po 96 hod. kultivaci.

Dále je uvedena morfologická a fyziologická charakteristika kmene podle vynálezu označeného jako Brevibacterium sp. M27/P28.

— 2 —

263 206

Morfologie kmene: a/ kolonie na kompletní agarové půdě po 72 hod. kultivace při 29 °C:

tvar okrouhlý okraje rovné povrch lesklý profil konvexní s mírně vyvýšeným středem barva žlutookrová velí kost 2 Φ 3 mm b/ mikroskopicky:

tyčinky krátké silné, ojediněle delší velikost: šířka 1,0 1,2 yU délka 2,0 « 3,6 yU barvení podle Grama pqjtitívni

Genetická charakteristíka: kmen je dependentni na homoserin a resistentni k AEC.

U rodičovského kmene Brevibacterium sp. M27 a u mutantniho kmene se změněnou pigmentovou charakteristikou bylo provedeno testováni utilisace některých zdrojů C a N a stanoveny další jejich biochemické vlastnosti.

Substrát Kontrola Testovaný produkční mutantní kmen

M27 M27/P28 360glukosa + laktosa sacharosa + indol sirovodík močovina + red. NOj + citrát + manit pohyblivost

Z tabulky vyplývá, že základní biochemická charakteristika mutantniho kmene a rodičovského kmene Brevibacterium sp. M27 je totožná.

Postup získání mutantnich kmenů ^ZUb

Za účelem získáni mutantnich kmenu Brevibacterium sp. N27 se změněnou pigmentaci a zvýšenou produkci esenciální aminokyseliny bylo pro šlechtěni rodičovského kmene použito mutačního procesu. Jako mutagen byla zvolena účinná chemická látka N-methyl-N*-nitrosn-N-nitroguanidin /Kooh-Light, England/.

Suspense bakterii z exponenciální fáze růstu byla připravena kultivaci v tekuté kompletní půdě po dobu 24 hod. při 29 °C. Po promytí a resuspendováni buněk v 0,2 H tris-maleinovém pufru o pH 6,0 byl stanoven výchozí počet buněk vyočkovánim různých ředění kultury na sďrii Petriho misek s kompletní agaroyou půdou. K odměřené části suspense byl přidán mutagen rozpuštěný v pufru v takovém množství, aby konečná koncentrace byla 1 mg/ml. Reakční směs byla inkubována ve vodní lázni při 29 ^C. Zastaveni působeni mutagenu bylo provedeno přidáním desetinásobného množstvi 4 °C chladného tris-maleinového pufru a zcentrifugovánim. Bylo zvoleno několik dob působení mutagenu, aby přežití buněk bylo v rozmezí od 10 do 0,1 %. Po působeni mutagenu byla suspense vyočkována na kompletní agarovou půdu a inkubována 72 hod. při 29 °C. Potoiwbyly isolovány a dále hodnoceny kolonie se změněnou pigmentaci.

Fermentační hodnocení chromogenniho mutanta Brevibacterium sp. M27 bylo prováděno na tekutých živných půdách v baňkách v laboratorním měřítku na rotačni třepačce při teplotě 29 °C po dobu 96 hod. kultivace.

Způsob fermentace a produkce lysinu mutantnim kmenem uvádí následující příklad.

Příklad

Kulturou produkčního mutanta Brevibacterium sp. M27/P28 se zaočkuje 50 ml inokulačniho media ve varné baňce o obsahu S00 ml. Složení m/dia: sacharosa těch. 20 g , octan sodný kryst 40 g, kukuřičný exktrakt /60 % hm. suš./ 30 g, voda dest. ad 1000 ml. Zaočkovaná kultura se kultivuje na rotačni třepačce /240 ot.min^/ při 29 °C po dobu 18 až 24 hod. Vyrostlou kulturou v množstvi 10 % objemu je zaočkováno 20 ml fermentačni ho media /ve varné baňce o obsahu 500 ml/ nás ledujicího složeni:

- 4 283 206 sacharosa těch. 180 g, hydrolysát arašídové mouky 200 ml, cornsteep /60 X suš·/ 10 g, hydrogenfosforečnan draselný 1 g, síran hořečnatý kryst. 0,1 g, uhličitan vápenatý mletý 30 g, voda dest. ad 1000 mt, pH fermentačniho média po sterilizaci 6,8 až 7,0. Kultivace se provádí na rotační třepačce při 29 °C po dobu 96 hod. V průběhu fermentace se upravuje pH 10 X roztokem amoniaku na hodnotu 7,0. Produkce lysinu u chromogenniho mutanta Brevibacterium sp. H27/P28 čini 50,1 g Lysinu/l fermentačniho média/96 hod. fermentace.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   263 206

   Průmyslový bakteriální kmen Brevibacterium sp. CCM 3632, produkující L—lysin.