CS264100B1 - Zpimob výroby imunomodulaěnxoh peptidů thymosinu frakce 5 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká výroby imunomodulačních peptidů thymosir.u frakce > zjed.nodušeným*po□tupen, který spočívá v tom, že se extrakt z telecích brzlíků po tepelné denaturaci balastních bílkovin a jejich současném odstranění e brzlíkovou tkání delípiduje extrakcí do octanu ethylnatého nebo nižšího alkanolu. Z vyěeřené vodné fáze ae vy3olx balastní bílkoviny spolu se zbytky rozpouštědla a oddělí se jako vrchní kapalná fáze. ^aliím vysolení:.-. se z?'.nká surový thymosin, ktorý se čistí ultrafiltrucí a z ultrafiltrá- : '' tu ae po zahuštění a okyselení opětovně vynráží částečně odaolený thymosin frakt ‘ ce 5. Ten se převede promytím acetonem 1' na stabilizován,'/ suchý meziprodukt, zpracovatelný dále podle potřeby po odg solení gelovou filtrací, chron.r.tografií na měniči kationtů a lyofilizací na finální produkt. Peptidy thymosinu frakce 5 se používají k léčbě poruch imunitního systému.

Description

Vynález se týká způsobu výroby imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 z telecích brzlíků.

Thymosin frakce 5 je komplex peptlaických hormonů, vylučovaných brzlíkem ( thymem ), které umožňují dozrávání a diferenciaci 2 lymfocytů v imunokompetentní buňky a podílejí se na správné funkci imunitního systému.

Z celé řady imunomodulačních peptidů brzlíku je thymosin frakce 5 v současné dobo nejlépe prostudován a ve světe též klinicky používán. Je připravován, extrakcí zmražených telecích, brzlíků a jeho složení je dáno jednak způsobem extrakce, jednak následnými izolačními a čistícími stupni.

*l

Původní způsob přípravy ( A.L. Goldstein se sp., Proč. Hati. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972 ) byl dále propracován ( J.A. Kooper se sp., Ann. Η.Ϊ. Acad. Sci. 24§, 125, 1975 ). Podle tohoto postupu so homogenizát telecího brzlíku ve 3 dílech 0,15 M roztoku chloridu sodného odstředí, supernatant se zahřeje na teplotu 80 °C po dobu 15 minut a sražený denaturát balastních bílkovin se odfiltruje. Filtrát se sráží vkapáním do čtyřnásobného objemu acetonu zchlazeného na teplotu -10 °G, odfiltrované sraženina promytá acetonem se vysuší na prášek a tento se rozpustí v 10 dílech 0,1 M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0. Nerozpuštěný zbytek se odstředí a ze supernatantu se nejprve vysolí další balastní bílkoviny síranem amonným přidaným do dosažení 25 % nasycení. Po odstředění vysolených bílkovin se upraví pH supernatantu na hodnotu 4,0 a surový thymo-,, sin se vysolí dalším přídavkem síranu amonného do dosažení 50 % nasycení. Odstředěný sediment aktivních peptidů se rozpustí v 0,01 M tris(hydroxymethyl)-aminomethanovéra pufru ( dále TRIS-pufru ) při hodnotě pH 6,0 na.koncentraci 10 mg peptidů / ml

- 2 264 ICO a po vyčeření se roztok ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10.800. Ultrafiltrát obsahující thymosiny frakce 5 se odsolí na dextranovém gelu a požadovaná frakce, eluovaná v oblasti V_Q, se lyofilizuje. Ve snaze převést izolaci thymosinu frakce 5 do výrobního měřítka byl popsaný postup dále modifikován. Podle patentového spisu USA č. 4128637 se bílkoviny v extraktu denaturují vháněním páry, další patentový spis USA č. 4082737 popisuje odstranění endotoxinů a pyrogenů ultrafiltrací.

Dosud popsané postupy mají dvě společné nevýhody. Z koloidního brzlíkového homogenizátu je nutno oddělovat extrakt odstředěním při vysokých hodnotách tíhového zrychlení, dále postupy vyžadují značné objemy zchlazeného acetonu pro srážení a delipidaci surového thymosinu. Tyto technologické operace velmi znesnadňují průmyslové využití postupů. Uvedené nevýhody jsou odstraněny postupem uvedeným v δη» AO č.250631, podle nějž se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní současně filtrací za horka po zahřátí homogenizátu, ze zchlazeného filtrátu se oddělí vrstva lipidů a z roztoku se vysolí síranem amonným přímo peptidy thymosinu. Dále se odstraní neúčinný polypeptid /3 -j ⁰ hodnotě isoelektrického bodu pl 6,7 chromatografií na sloupci slabě kyselého měniče kationtů v těkavém pufru o hodnotě pH 5,0 až 7,0. Přesto však současný postup přináší ještě obtíže, jako zákaly roztoků po oddělení lipidů, poměrně vysokou spotřebu síranu amonného, nutnost dvojího odstředění při vysolování a obtížné skladování meziproduktů v případě přerušení výroby.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5, získané z homogenizátu telecích brzlíků po tepelné denaturaci, podle vy —'lezu, jehož podstata spočívá v tom, že se z teplého filtrátu'vyextrahují lipidy octanem ethylnatým nebo alkanolem o počtu uhlíkových atomů 3 až 5. Po ochlazení se v oddělené vodné fázi vysolí síra- . nem amonným balastní bílkoviny a organické rozpouštědlo, které jsou v horní fázi. Čirá spodní fáze se následně vysolí opět síranem amonným a získaný surový thymosin se oddělí a ultra- 3 264 100 filtruje. Zahuštěním a okyselením ultrafíltrátu na hodnotu pH 3,8 až 4,2 se zpět vysolí předtištěny částečně odsolený thymosin, který se převede acetonem na stabilní práakovitý mo« ziprodukl'.. Ten se gelovou filtrací a chromátografií na měniči kat iontů zpracuje přímo na konečný komplex imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5· Způsob podle vynálezu se výhodně provádí, tak, že se lipidy vyextrahují 2«propanolem nebo 1-butanolem a okyselení ultrafiltrátu se provede kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0. Autory vynálezu bylo takto zjištěno, že je možno při využívání a zachování podstaty čs. AO č.

250631 zjednodušit a zvýhodnit výrobu thymosinu frakce 5, jak vystihuje Schéma I.

Způsob poule vynálezu se provádí tak, že se zhomogenizovaaá gelovitá suspenze brzlíková tkáně v 0,15 M roztoku chloridu sodného zahřeje na teplotu SO °C, denaturát balastních bílkovin spolu se sraženou brzlíkovou drví se za horka odfiltruje a k extraktu se ještě při teplotě kolem 50 ^cC přidá za míchání octnu ethylnatý nebo nižší alkanol, s výhodou 2-propanol nebo 1-butanol. Po zchladnutí se oddělí odtučněná vodná fáze, ze které se vysolí další balastní bílkoviny a rozpuštěné organické rozpouštědlo přídavkem síranu amonného do 25 % nasycení roztoku. Vytvoří se vrchní kapalná fáze, obsahující též sraženinu bílkovin s částí nežádoucích peptidů a zbytky lipidů. Spodní čirá fáze obsahující thymosin se dá velmi snadno oddělit na rozdíl od dosavadního postupu, kdy bylo nutno vysolené balasty odstředit na průtokovém separátoru. Z vodné dokonale delipidované fáze se dále vysolí surový thymosin při hodnotě pH 4,0 přídavkem síranu amonného do dosažení 40 až 45 % nasycení roztoku. Sraženina tentokrát sedimentuje a oddělí se odstředěním na průtokovém separátoru. Surový thymosin se po rozpuštění v pufru o hodnotě pH 8,0 zbaví vysokomolekulamích příměsí ultrafiltrací přes membránu s vylučovacím limitem 10,000 a ultrafiltrát, obsahující, ještě značné množství, soli, se s výhodou přečistí a zároveň převede na stabilní mezi produkt tak, že se zahustí a okyselí na. hodnotu p.H 4,0. Tím se opětovně vysolí thymosin, .který lze snadno odfiltrovat a promýt zchlazeným acetonem. Promyti má další čistící účinek,

- 4 264 χΟΟ neboť do acetonu přejdou barevné příměsi. Získaný práškovitý meziprodukt obsahuje asi 4x méně soli než odstředěná sraženina. Po odsolení gelovou filtrací se efluent z kolony molekulového síta zbaví neúčinného polypeptidu fb podle postupu uvedeného v čs. AO č. 250631 průtokem přes sloupec slabě kyselého měniče kationtů v prostředí těkavého pufru o hodnotě pH 5,0 až 7j0, např. octanu amonného. Aktivní peptidy thymosinu frakce 5 procházejí kolonou a mohou být přímo lyofilizovány, zachycený polypeptid ý3 se vymyje z iontoměniče zvýšením hodnoty pH elučního roztoku a tím se zároveň iontoměnič regeneruje,

Postup podle vynálezu má tyto hlavní výhody; delipidace octanera ethylnatým nebo alkanolem přidaným ke zfiltrovanérau extraktu hned po tepelné denaturaoi je velmi rychlá a účinná. Použití uvedených organických rozpouštědel má za následek změnu měrné hmotnosti sraženiny balastnich bílkovin oproti stávajícím postupům a umožňuje jejich oddělení s_vrchní kapalnou fází, čímž se eliminuje z technologického procesu jedno odstředění na průtokovém seporátoru. Surový thymosin se vysóluje z dokonale čirého roztoku a to usnadňuje .rozpouštění odstředěné sraženiny i předběžné čeření před ultrafiltrací. Organické rozpouštědlo má příznivý vliv na vysolování balastních látek a thymosinu. Projevuje se to zmenšením potřebného množství síranu amonného a dále tím, že finální produkt obsahuje méně neúčinných peptidů. Přesrážení thymosinu frakce 5 20 zahuštěného ultraf ilt rútu a jeho převedení na acetonový prášek umožňuje shromažďovat stabilní meziprodukt z jednotlivých várek s ohledem na potřeby při následné gelové filtraci a lyofilizaci. Převedení na acetonový prášek má další rafinační účinek při minimální spotřebě acetonu oproti předchozím postupům. Při částečném odsolení ultrafiltrátu se několikanásobně sníží poměr soli k thymosinu a tím se snižují nároky na zařízení pro gelovou filtraci. Způsob podle vynálezu zrychluje podstatně výrobní proces, snižuje nároky.na zařízení i na spotřebu energií. Snižuje též spotřebu surovin, jako síranu amonného a dextranového gelu. Z toho vyplývají i ekonomické úspory. .

264 ICO

V dalším je vynález blíže objasněn jednak příklady provedení, aniž by se jimi omezoval, jednak Schématem I.

Příklad 1

Navážka 50 kg zmražených telecích brzlíků se rozemele a zhomogenizuje vc 125 litrech. 0,15 M roztoku chloridu, sodného při teplotě 15 až 20 °C. Suspenze se míchá v kotli opatřeném topným pláštěm při této teplotě po dobu 1 hodiny. Poté se za míchání zahřeje na teplotu 80 ^UC během 30 minut. Pří této teplotě se míchá 10 minut a neprodleně se za tepla zfiltruje při redukovaném tlaku přes plachetku. Sraženina se promyje 20 litry vody. Teplý filtrát se přečerpá do zásobníku opatřeného výkonným míchadlem a ihned za tepla se za míchání přidá 1/4 objemu, t.j. kolem 30 litrů octanu ethylnatého. Po ustavení eztrakční rovnováhy se kapalné fáze přečerpají do skleněného zásobníku opatřeného spodn.í výpustí. Po zchladnutí na teplotu do 20 -°C se oddělí vodná delipidovaná fáze, k níž se za míchání přidá takové množství pevného síranu amonného, aby bylo dosazeno zp /i? nasyceni ζ 2zo / livr a srnec se nmcha po uoou, 30 minut. Vzniklá suspenze se přečerpá opět do skloněného zásobníku, kde se oddělí jako vrchní fáze vrstva vysoleného rozpouštědla spolu s balústními bílkovinami. Oddělená čirá vodná fáze se okyselí ledovou kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0 a dalším přídavkem síranu amonného do 40 až 45 % nasycení ( 185 g / litr ) se za stejných podmínek jako při prvním vysolování vyloučí surový thymosin. Sraženina tentokrát šedimentuje a odstředí se při 5.000 až 10.000 g na průtokovém separátoru.

Odstředěná sraženina surového thymosinu o hmotností kolem 800 g a sušině kolem 49 % se rozpustí ve 2.500 ml 0,01 M TKIS-pufru o hodnotě pH 8,0, přičemž se pH udržuje při uvedené hodnotě přídavky 25% vodného amoniaku. Vzniklý kalný roztok se zhruba zfiltruje přes sintr, poté se vyčeří na asbestocelu-. losovém filtru a ultrafiltruje'přes membránu s vylučovacím limitem 10.0U0. XJltrafiltrát se zahustí ve vakuu při vnější teplotě do 50 °C na obsah kolem 10 % sušiny a. odsolí se chroΜ»

264 ΐΟΟ matografií na dextranovém gelu. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5» eluované v oblasti νθ, se bučí. přímo lyofilizují, nebo se zbaví polypeptidu /3^ předběžnou filtrací eluátu přes sloupec slabě kyselého měniče kationtů. Výtěžek je 5,0 až 7,5 g thymosinu frakce 5.

Příklad 2

Ultrafiltrát thymosinu frakce 5 připravený postupem podle příkladu 1 se zahustí na 1/15 objemu, čímž se docílí koncentrace síranu amonného potřebné k opětovnému vysolení peptidů thymosinu. Ty se vyloučí, úpravou pH na hodnotu 4,0, odsají na fíintru a promyjí acetonem zchlazeným na teplotu -10 °C. Získaný stabilizovaný a částečně odsolený prášek obsahuje kolem 35 % účinných peptidů. Po rozpuštění v těkavém pufru, např. v roztoku o etanu amonného při hodnotě pH 8,0 se odsoluje a dále zpracovává postupem popsaným v příkladu 1,

Příklad 3

Delipidaci extraktu lze provést za stejných podmínek jako v příkladu 1 s tím, že se použije namísto octanu ethylnatého nižší alkohol, s výhodou 2-propanol nebo 1-butanol.

Čistotec získaných imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 byla ověřena analytickou metodou isoelektrické fokusace v rozmezí hodnot pH 3,5 až 9,5 a ultrafialovou spektroskopií při 200 až 300 nm.

Schéma I telecí brzlík homogenizace, extrakce |~~~h omo q en i z & t ] zahřátí na 80 °C, filtrace sraženina -}· tkáň brzlíku

-j filtrát vyražena extrakce org.rozpouštědlem za tepla, ochlazení vrchní fáze s lipidy vyrašena ____E vysolení do 25 % nasycení _s oddělení fází.

| spodní fázej vyražena pH 4,0, vysolení do 40 až 45 % nasyc., odetredě dění vrchní fáze se sraženinou

____n___'..... ...______.— <
j šedi	ment J
	rozp
	pH 8

sunernatant vyražen ultrařiltrát vyražen postup 1 odsolení na dextran.

postup 2 zahuštění, vysrážení při pK 4,0, filtrace, promytí acetonem efluent acetonový prášek odstranění pólypeptidu , iyoíili:

;aée rozpuštění, odsolení na dextran. gelu thymosin frakce 5

JTflixentJ odstraň ^vn.í polypeptidu /3-j, lyXXlisace thymosín frakce 5

Výtěžek thyfiiosinu frakce 5: kolem 0,01 % hmotnosti brzlíku.

Claims (2)

1. PŘED M Ě T VYNÁLEZU 264 iCU

   Způsob výroby iraunomodulačních peptidů peptidů thýmosinu frakce 5, získávané z homogenizátu telecích brzííků po tepelné denaturaci, vyznačující se tím, že se Ά teplého filtrátu vyextrahují lipidy oetanem ethylnatým nebo alicanolern. o počtu uhlíkových atomů 3 až 5,.po ochlazení se v oddělené vodné fázi vysolí síranem amonným balastní bílkoviny a organické rozpouštědlo, které jsou ve vrchní fázi a čirá'spodní fáze se následně vysolí opět síranem amonným, získaný surový thymosin se oddělí a ultrafiitrnje, zahuštěním a okynelením ultrafiltrátu na hodnotu pE
2. 3,8 až 4>2 se apět vysolí předeištěný a částečně odsečený thymosin, který se převede acetonem na stabilní práškovitý meziprodukt a ten se gelovou filtrací a chromátugraíii. na měniči kationtů zpracuje přímo nu komplex imui;'.modulačních peptidů thýmosinu frakce 5*

   Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se lipidy • .A ¹ - * «· O _r · \ * ř*. ·*- *-· 'Λ r*, n V-. f' O I C O

   Způsob podle bodu 1, vyznačující .so tím, že se okyselí ultrafiltrátu provede kyselinou octovou na hodnotu pH