CS264100B1 - Zpimob výroby imunomodulaěnxoh peptidů thymosinu frakce 5 - Google Patents
Zpimob výroby imunomodulaěnxoh peptidů thymosinu frakce 5 Download PDFInfo
- Publication number
- CS264100B1 CS264100B1 CS881616A CS161688A CS264100B1 CS 264100 B1 CS264100 B1 CS 264100B1 CS 881616 A CS881616 A CS 881616A CS 161688 A CS161688 A CS 161688A CS 264100 B1 CS264100 B1 CS 264100B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- thymosin
- peptides
- fraction
- salted out
- acetone
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 title abstract description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 claims abstract description 23
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 claims abstract description 20
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 13
- 108700016958 thymosin fraction 5 Proteins 0.000 claims description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 4
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 abstract description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 abstract description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 abstract 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282988 Capreolus Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010793 Steam injection (oil industry) Methods 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- AHFHMGFBODNOJT-UHFFFAOYSA-N azane;ethane Chemical compound N.CC AHFHMGFBODNOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řešení se týká výroby imunomodulačních
peptidů thymosir.u frakce > zjed.nodušeným*po□tupen,
který spočívá v tom, že
se extrakt z telecích brzlíků po tepelné
denaturaci balastních bílkovin a jejich
současném odstranění e brzlíkovou tkání
delípiduje extrakcí do octanu ethylnatého
nebo nižšího alkanolu. Z vyěeřené vodné
fáze ae vy3olx balastní bílkoviny
spolu se zbytky rozpouštědla a oddělí se
jako vrchní kapalná fáze. ^aliím vysolení:.-.
se z?'.nká surový thymosin, ktorý
se čistí ultrafiltrucí a z ultrafiltrá-
: '' tu ae po zahuštění a okyselení opětovně
vynráží částečně odaolený thymosin frakt
‘ ce 5. Ten se převede promytím acetonem
1' na stabilizován,'/ suchý meziprodukt,
zpracovatelný dále podle potřeby po odg
solení gelovou filtrací, chron.r.tografií
na měniči kationtů a lyofilizací na finální
produkt. Peptidy thymosinu frakce
5 se používají k léčbě poruch imunitního
systému.
Description
Vynález se týká způsobu výroby imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 z telecích brzlíků.
Thymosin frakce 5 je komplex peptlaických hormonů, vylučovaných brzlíkem ( thymem ), které umožňují dozrávání a diferenciaci 2 lymfocytů v imunokompetentní buňky a podílejí se na správné funkci imunitního systému.
Z celé řady imunomodulačních peptidů brzlíku je thymosin frakce 5 v současné dobo nejlépe prostudován a ve světe též klinicky používán. Je připravován, extrakcí zmražených telecích, brzlíků a jeho složení je dáno jednak způsobem extrakce, jednak následnými izolačními a čistícími stupni.
*l
Původní způsob přípravy ( A.L. Goldstein se sp., Proč. Hati. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972 ) byl dále propracován ( J.A. Kooper se sp., Ann. Η.Ϊ. Acad. Sci. 24§, 125, 1975 ). Podle tohoto postupu so homogenizát telecího brzlíku ve 3 dílech 0,15 M roztoku chloridu sodného odstředí, supernatant se zahřeje na teplotu 80 °C po dobu 15 minut a sražený denaturát balastních bílkovin se odfiltruje. Filtrát se sráží vkapáním do čtyřnásobného objemu acetonu zchlazeného na teplotu -10 °G, odfiltrované sraženina promytá acetonem se vysuší na prášek a tento se rozpustí v 10 dílech 0,1 M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0. Nerozpuštěný zbytek se odstředí a ze supernatantu se nejprve vysolí další balastní bílkoviny síranem amonným přidaným do dosažení 25 % nasycení. Po odstředění vysolených bílkovin se upraví pH supernatantu na hodnotu 4,0 a surový thymo-,, sin se vysolí dalším přídavkem síranu amonného do dosažení 50 % nasycení. Odstředěný sediment aktivních peptidů se rozpustí v 0,01 M tris(hydroxymethyl)-aminomethanovéra pufru ( dále TRIS-pufru ) při hodnotě pH 6,0 na.koncentraci 10 mg peptidů / ml
- 2 264 ICO a po vyčeření se roztok ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10.800. Ultrafiltrát obsahující thymosiny frakce 5 se odsolí na dextranovém gelu a požadovaná frakce, eluovaná v oblasti VQ, se lyofilizuje. Ve snaze převést izolaci thymosinu frakce 5 do výrobního měřítka byl popsaný postup dále modifikován. Podle patentového spisu USA č. 4128637 se bílkoviny v extraktu denaturují vháněním páry, další patentový spis USA č. 4082737 popisuje odstranění endotoxinů a pyrogenů ultrafiltrací.
Dosud popsané postupy mají dvě společné nevýhody. Z koloidního brzlíkového homogenizátu je nutno oddělovat extrakt odstředěním při vysokých hodnotách tíhového zrychlení, dále postupy vyžadují značné objemy zchlazeného acetonu pro srážení a delipidaci surového thymosinu. Tyto technologické operace velmi znesnadňují průmyslové využití postupů. Uvedené nevýhody jsou odstraněny postupem uvedeným v δη» AO č.250631, podle nějž se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní současně filtrací za horka po zahřátí homogenizátu, ze zchlazeného filtrátu se oddělí vrstva lipidů a z roztoku se vysolí síranem amonným přímo peptidy thymosinu. Dále se odstraní neúčinný polypeptid /3 -j 0 hodnotě isoelektrického bodu pl 6,7 chromatografií na sloupci slabě kyselého měniče kationtů v těkavém pufru o hodnotě pH 5,0 až 7,0. Přesto však současný postup přináší ještě obtíže, jako zákaly roztoků po oddělení lipidů, poměrně vysokou spotřebu síranu amonného, nutnost dvojího odstředění při vysolování a obtížné skladování meziproduktů v případě přerušení výroby.
Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5, získané z homogenizátu telecích brzlíků po tepelné denaturaci, podle vy —'lezu, jehož podstata spočívá v tom, že se z teplého filtrátu'vyextrahují lipidy octanem ethylnatým nebo alkanolem o počtu uhlíkových atomů 3 až 5. Po ochlazení se v oddělené vodné fázi vysolí síra- . nem amonným balastní bílkoviny a organické rozpouštědlo, které jsou v horní fázi. Čirá spodní fáze se následně vysolí opět síranem amonným a získaný surový thymosin se oddělí a ultra- 3 264 100 filtruje. Zahuštěním a okyselením ultrafíltrátu na hodnotu pH 3,8 až 4,2 se zpět vysolí předtištěny částečně odsolený thymosin, který se převede acetonem na stabilní práakovitý mo« ziprodukl'.. Ten se gelovou filtrací a chromátografií na měniči kat iontů zpracuje přímo na konečný komplex imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5· Způsob podle vynálezu se výhodně provádí, tak, že se lipidy vyextrahují 2«propanolem nebo 1-butanolem a okyselení ultrafiltrátu se provede kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0. Autory vynálezu bylo takto zjištěno, že je možno při využívání a zachování podstaty čs. AO č.
250631 zjednodušit a zvýhodnit výrobu thymosinu frakce 5, jak vystihuje Schéma I.
Způsob poule vynálezu se provádí tak, že se zhomogenizovaaá gelovitá suspenze brzlíková tkáně v 0,15 M roztoku chloridu sodného zahřeje na teplotu SO °C, denaturát balastních bílkovin spolu se sraženou brzlíkovou drví se za horka odfiltruje a k extraktu se ještě při teplotě kolem 50 cC přidá za míchání octnu ethylnatý nebo nižší alkanol, s výhodou 2-propanol nebo 1-butanol. Po zchladnutí se oddělí odtučněná vodná fáze, ze které se vysolí další balastní bílkoviny a rozpuštěné organické rozpouštědlo přídavkem síranu amonného do 25 % nasycení roztoku. Vytvoří se vrchní kapalná fáze, obsahující též sraženinu bílkovin s částí nežádoucích peptidů a zbytky lipidů. Spodní čirá fáze obsahující thymosin se dá velmi snadno oddělit na rozdíl od dosavadního postupu, kdy bylo nutno vysolené balasty odstředit na průtokovém separátoru. Z vodné dokonale delipidované fáze se dále vysolí surový thymosin při hodnotě pH 4,0 přídavkem síranu amonného do dosažení 40 až 45 % nasycení roztoku. Sraženina tentokrát sedimentuje a oddělí se odstředěním na průtokovém separátoru. Surový thymosin se po rozpuštění v pufru o hodnotě pH 8,0 zbaví vysokomolekulamích příměsí ultrafiltrací přes membránu s vylučovacím limitem 10,000 a ultrafiltrát, obsahující, ještě značné množství, soli, se s výhodou přečistí a zároveň převede na stabilní mezi produkt tak, že se zahustí a okyselí na. hodnotu p.H 4,0. Tím se opětovně vysolí thymosin, .který lze snadno odfiltrovat a promýt zchlazeným acetonem. Promyti má další čistící účinek,
- 4 264 χΟΟ neboť do acetonu přejdou barevné příměsi. Získaný práškovitý meziprodukt obsahuje asi 4x méně soli než odstředěná sraženina. Po odsolení gelovou filtrací se efluent z kolony molekulového síta zbaví neúčinného polypeptidu fb podle postupu uvedeného v čs. AO č. 250631 průtokem přes sloupec slabě kyselého měniče kationtů v prostředí těkavého pufru o hodnotě pH 5,0 až 7j0, např. octanu amonného. Aktivní peptidy thymosinu frakce 5 procházejí kolonou a mohou být přímo lyofilizovány, zachycený polypeptid ý3 se vymyje z iontoměniče zvýšením hodnoty pH elučního roztoku a tím se zároveň iontoměnič regeneruje,
Postup podle vynálezu má tyto hlavní výhody; delipidace octanera ethylnatým nebo alkanolem přidaným ke zfiltrovanérau extraktu hned po tepelné denaturaoi je velmi rychlá a účinná. Použití uvedených organických rozpouštědel má za následek změnu měrné hmotnosti sraženiny balastnich bílkovin oproti stávajícím postupům a umožňuje jejich oddělení s_vrchní kapalnou fází, čímž se eliminuje z technologického procesu jedno odstředění na průtokovém seporátoru. Surový thymosin se vysóluje z dokonale čirého roztoku a to usnadňuje .rozpouštění odstředěné sraženiny i předběžné čeření před ultrafiltrací. Organické rozpouštědlo má příznivý vliv na vysolování balastních látek a thymosinu. Projevuje se to zmenšením potřebného množství síranu amonného a dále tím, že finální produkt obsahuje méně neúčinných peptidů. Přesrážení thymosinu frakce 5 20 zahuštěného ultraf ilt rútu a jeho převedení na acetonový prášek umožňuje shromažďovat stabilní meziprodukt z jednotlivých várek s ohledem na potřeby při následné gelové filtraci a lyofilizaci. Převedení na acetonový prášek má další rafinační účinek při minimální spotřebě acetonu oproti předchozím postupům. Při částečném odsolení ultrafiltrátu se několikanásobně sníží poměr soli k thymosinu a tím se snižují nároky na zařízení pro gelovou filtraci. Způsob podle vynálezu zrychluje podstatně výrobní proces, snižuje nároky.na zařízení i na spotřebu energií. Snižuje též spotřebu surovin, jako síranu amonného a dextranového gelu. Z toho vyplývají i ekonomické úspory. .
264 ICO
V dalším je vynález blíže objasněn jednak příklady provedení, aniž by se jimi omezoval, jednak Schématem I.
Příklad 1
Navážka 50 kg zmražených telecích brzlíků se rozemele a zhomogenizuje vc 125 litrech. 0,15 M roztoku chloridu, sodného při teplotě 15 až 20 °C. Suspenze se míchá v kotli opatřeném topným pláštěm při této teplotě po dobu 1 hodiny. Poté se za míchání zahřeje na teplotu 80 UC během 30 minut. Pří této teplotě se míchá 10 minut a neprodleně se za tepla zfiltruje při redukovaném tlaku přes plachetku. Sraženina se promyje 20 litry vody. Teplý filtrát se přečerpá do zásobníku opatřeného výkonným míchadlem a ihned za tepla se za míchání přidá 1/4 objemu, t.j. kolem 30 litrů octanu ethylnatého. Po ustavení eztrakční rovnováhy se kapalné fáze přečerpají do skleněného zásobníku opatřeného spodn.í výpustí. Po zchladnutí na teplotu do 20 -°C se oddělí vodná delipidovaná fáze, k níž se za míchání přidá takové množství pevného síranu amonného, aby bylo dosazeno zp /i? nasyceni ζ 2zo / livr a srnec se nmcha po uoou, 30 minut. Vzniklá suspenze se přečerpá opět do skloněného zásobníku, kde se oddělí jako vrchní fáze vrstva vysoleného rozpouštědla spolu s balústními bílkovinami. Oddělená čirá vodná fáze se okyselí ledovou kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0 a dalším přídavkem síranu amonného do 40 až 45 % nasycení ( 185 g / litr ) se za stejných podmínek jako při prvním vysolování vyloučí surový thymosin. Sraženina tentokrát šedimentuje a odstředí se při 5.000 až 10.000 g na průtokovém separátoru.
Odstředěná sraženina surového thymosinu o hmotností kolem 800 g a sušině kolem 49 % se rozpustí ve 2.500 ml 0,01 M TKIS-pufru o hodnotě pH 8,0, přičemž se pH udržuje při uvedené hodnotě přídavky 25% vodného amoniaku. Vzniklý kalný roztok se zhruba zfiltruje přes sintr, poté se vyčeří na asbestocelu-. losovém filtru a ultrafiltruje'přes membránu s vylučovacím limitem 10.0U0. XJltrafiltrát se zahustí ve vakuu při vnější teplotě do 50 °C na obsah kolem 10 % sušiny a. odsolí se chroΜ»
264 ΐΟΟ matografií na dextranovém gelu. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5» eluované v oblasti νθ, se bučí. přímo lyofilizují, nebo se zbaví polypeptidu /3^ předběžnou filtrací eluátu přes sloupec slabě kyselého měniče kationtů. Výtěžek je 5,0 až 7,5 g thymosinu frakce 5.
Příklad 2
Ultrafiltrát thymosinu frakce 5 připravený postupem podle příkladu 1 se zahustí na 1/15 objemu, čímž se docílí koncentrace síranu amonného potřebné k opětovnému vysolení peptidů thymosinu. Ty se vyloučí, úpravou pH na hodnotu 4,0, odsají na fíintru a promyjí acetonem zchlazeným na teplotu -10 °C. Získaný stabilizovaný a částečně odsolený prášek obsahuje kolem 35 % účinných peptidů. Po rozpuštění v těkavém pufru, např. v roztoku o etanu amonného při hodnotě pH 8,0 se odsoluje a dále zpracovává postupem popsaným v příkladu 1,
Příklad 3
Delipidaci extraktu lze provést za stejných podmínek jako v příkladu 1 s tím, že se použije namísto octanu ethylnatého nižší alkohol, s výhodou 2-propanol nebo 1-butanol.
Čistotec získaných imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 byla ověřena analytickou metodou isoelektrické fokusace v rozmezí hodnot pH 3,5 až 9,5 a ultrafialovou spektroskopií při 200 až 300 nm.
Schéma I telecí brzlík homogenizace, extrakce |~~~h omo q en i z & t ] zahřátí na 80 °C, filtrace sraženina -}· tkáň brzlíku
-j filtrát vyražena extrakce org.rozpouštědlem za tepla, ochlazení vrchní fáze s lipidy vyrašena ____E vysolení do 25 % nasycení s oddělení fází.
| spodní fázej vyražena pH 4,0, vysolení do 40 až 45 % nasyc., odetredě dění vrchní fáze se sraženinou
| ____n___'..... ...______.— < | |
| j šedi | ment J |
| rozp | |
| pH 8 |
sunernatant vyražen ultrařiltrát vyražen postup 1 odsolení na dextran.
postup 2 zahuštění, vysrážení při pK 4,0, filtrace, promytí acetonem efluent acetonový prášek odstranění pólypeptidu , iyoíili:
;aée rozpuštění, odsolení na dextran. gelu thymosin frakce 5
JTflixentJ odstraň vn.í polypeptidu /3-j, lyXXlisace thymosín frakce 5
Výtěžek thyfiiosinu frakce 5: kolem 0,01 % hmotnosti brzlíku.
Claims (2)
- PŘED M Ě T VYNÁLEZU 264 iCUZpůsob výroby iraunomodulačních peptidů peptidů thýmosinu frakce 5, získávané z homogenizátu telecích brzííků po tepelné denaturaci, vyznačující se tím, že se Ά teplého filtrátu vyextrahují lipidy oetanem ethylnatým nebo alicanolern. o počtu uhlíkových atomů 3 až 5,.po ochlazení se v oddělené vodné fázi vysolí síranem amonným balastní bílkoviny a organické rozpouštědlo, které jsou ve vrchní fázi a čirá'spodní fáze se následně vysolí opět síranem amonným, získaný surový thymosin se oddělí a ultrafiitrnje, zahuštěním a okynelením ultrafiltrátu na hodnotu pE
- 3,8 až 4>2 se apět vysolí předeištěný a částečně odsečený thymosin, který se převede acetonem na stabilní práškovitý meziprodukt a ten se gelovou filtrací a chromátugraíii. na měniči kationtů zpracuje přímo nu komplex imui;'.modulačních peptidů thýmosinu frakce 5*Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se lipidy • .A 1 - * «· O r · \ * ř*. ·*- *-· 'Λ r*, n V-. f' O I C OZpůsob podle bodu 1, vyznačující .so tím, že se okyselí ultrafiltrátu provede kyselinou octovou na hodnotu pH
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS881616A CS264100B1 (cs) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | Zpimob výroby imunomodulaěnxoh peptidů thymosinu frakce 5 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS881616A CS264100B1 (cs) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | Zpimob výroby imunomodulaěnxoh peptidů thymosinu frakce 5 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS161688A1 CS161688A1 (en) | 1988-09-16 |
| CS264100B1 true CS264100B1 (cs) | 1989-05-12 |
Family
ID=5350966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS881616A CS264100B1 (cs) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | Zpimob výroby imunomodulaěnxoh peptidů thymosinu frakce 5 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS264100B1 (cs) |
-
1988
- 1988-03-11 CS CS881616A patent/CS264100B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS161688A1 (en) | 1988-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4955363A (en) | Process of recovering lactose from whey | |
| US4576696A (en) | Process for the preparation of a biologically active extract | |
| US6893639B2 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
| CN106011207A (zh) | 从火麻仁饼粕中提取火麻仁低聚肽的方法 | |
| JPH08501688A (ja) | ベータ・カゼイン強化製品の製造方法 | |
| FI57669C (fi) | Foerfarande foer isolering och utvinning av proteinhormoner haerstammande fraon hypofysvaevnad | |
| CA2037244C (en) | Method for purifying somatotropin monomers | |
| SU1367837A3 (ru) | Способ получени средства, селективно тормоз щего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов | |
| EP0173215A2 (en) | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms | |
| US4128637A (en) | Process for producing thymosin | |
| CS264100B1 (cs) | Zpimob výroby imunomodulaěnxoh peptidů thymosinu frakce 5 | |
| Hill | The preparation of K-casein | |
| EP1071711B1 (en) | Process for the recovery and purification of a recombinant protein from a cell | |
| JPS6157290B2 (cs) | ||
| EP0085220A2 (en) | Method for purification of anterior pituitary hormones | |
| CS250631B1 (cs) | Způsob přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 | |
| US3201382A (en) | Process for preparing a biochemically active polypeptide from sheep pituitary growthhormone | |
| CA1101331A (en) | Process for producing thymosin | |
| Piskarev et al. | A novel preparative method for the isolation of avidin and riboflavin-binding glycoprotein from chicken egg-white by the use of high-performance liquid chromatography | |
| US3308026A (en) | Process for the production and recovery of the kallikrein-inacti-vator from proteinaceous hormone wastes | |
| SU467536A1 (ru) | Способ получени сывороточного альбумина | |
| EP0047149B1 (en) | A purified polypeptide, a process for its preparation, its use and pharmaceutical compositions containing it | |
| SU745478A1 (ru) | Способ получени протеинов из ичного белка | |
| US3590027A (en) | Process for preparing thyrocalcitonin using an acidic mixture of water and a water-miscible organic solvent | |
| KR830002718B1 (ko) | 혈장으로부터 알부민을 분리 제조하는 방법 |