SU745478A1 - Способ получени протеинов из ичного белка - Google Patents

Description

Изобретение относится к комплексному получению протеинов из яичного белка, например лизоцима, овальбумина, овоглобулина, используемых как сырье для получения аминокислот в медицине, косметике, микробиологической и пищевой промышленности. ^{5 * * * *}

Известен способ получения протеинов из яичного белка путем последовательного осаждения содержащихся в нем фракций лизоцима,, овоглобулина, овальбумина с последующей их очисткой кристаллизацией [1]. ^{10 * * * *}

Однако недостатками известного способа являются низкая активность препарата лизоцима, недостаточная чистота овоглобулина и овальбумина, сложность и длительность процесса, связанная с многократностью перекристаллизацией ¹⁵ и стадий очистки.

Целью изобретения является повышение активности препарата лизоцима, чистоты овоглобулина и овальбумина, упрощение процесса получения протеинов и обеспечение высокого Их выхода.

Поставленная цель достигается тем, что перед осаждением фракций яичный белок выдер2 живают при pH 4,8-5,3, температуре 17—22° в течение 48-72 ч, и отделяют выделившийся побочный белок - овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществляют из раствора, отделенного от осажденного овомуцина.

Предлагаемый способ обеспечивает активность лизоцима 25000—30000 ед/мг белка, чистоту овоглобулина — 100%, чистота овальбумина — 100%, с высокими выходами и упрощение процесса.

Увеличение активности лизоцима достигается за счет того, что в процессе выдерживания яичного белка при pH 4,8-5,3 и температуре 17-22° С в течение 48—72 ч происходит (активация исходного сырья, что приводит в итоге к разложению фермент-белкового комплекса и освобождения лизоцима.

В исходном сырье лизоцим связан с другими белками, что ведет к обратимой потере его активности. В процессе выдерживания исходного сырья происходит освобождение фермента от белка. Кислая среда pH 4,8-5,3 разрушает связь лизоцима с другими белками. Тем самым создаются условия для восстановления, активности лизоцима.

В процессе выдерживания яичного белка происходит освобождение активного центра лизоцима, который в исходном сырье частично блокирован неактивной частью фермента, так как фермент находится в виде агрегатов друг с другом.

Предлагаемое изобретение обеспечивает также получение овоглобулина и овальбумина высокой чистоты вследствие того, что в процессе активации сырья происходит осаждение побочных белков, включая овомуцнн. Переход овомуцина в твердую фазу способствует его удалению. Дальнейшему фракционированию подвергают жидкую фазу, не содержащую примесей побочных белков, что повышает чистоту выделяемых протеинов.

Осаждение овомуцинов в процессе активации сырья одновременно обеспечивает упрощение процесса очистки, т.е. за счет сокращения количества перекристаллизаций овоглобулина и овальбумина с 5-ти до 2-х раз и количество перекристаллизаций лизоцима с 3-х до 2-х раз.

Пример 1. К 60 л яичного белка при перемешивании добавляют 1н раствор соляной кислоты до значения pH 5,0.

Смесь оставляют при 20° С. Осаждается слизистый осадок, состоящий в основном из овомуцина. Кристаллизация лизоцима.

Через 72 ч осадок удаляют декантацией, а к жидкости при перемешивании добавляют NaCI до получения 5%-ного раствора и раствор едкого натрия до pH 9,5. Перемешивание продолжают до полного растворения соли. К приготовленному раствору для кристаллизации лизоцима прибавляют 10-25 мл суспензии кристаллов лизоцима и оставляют при 5° С.

Раствор каждый день- 2—3 раза перемешивают. Кристаллизация лизоцима заканчивается в течение 6 сут. Кристаллы лизоцима собирают центрифугированием и перекристаллизовывают, а центрифугат используют для получения овоглобулина и овальбумина.

Осадок технического лизоцима растворяют в 3 л 0,05 раствора уксусной кислоты, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием и еще раз растворяют в 1 л 0,05 растворе уксусной кислоты и опять центрифугируют. Осадок отбрасывают, а центрифуга™ объединяют. К центрифугатам добавляют натрий хлористый из расчета, чтобы получить 5%-ный раствор и 1 н раствор едкого натрия до pH 9,5. Раствор оставляют при 5° С и в течение 3 сут заканчивается перекристаллизация. Выпавший осадок перекристаллизовывают еще 1 раз как описано. Сырой осадок лизоцима после второй перекристаллизации собирают на нутч-фильтре и высушивают лиофильно. Активность лизоцима 30 000 ед/мг, выход - 150 г. Затем к раствору яичного белка (объем около 60 л) после отделения лизоцима при перемешивании постепенно добавляют насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1,06. Образуется осадок, состоящий из овоглобулина. Суспензию оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Осадок собирают центрифугированием и подвергают дальнейшей очистке для получения овоглобулина, а центрйфугат используют для получения овальбумина. Осадок технического овоглобулина растворяют в 2,0 л деминерализованной воды. К раствору добавляют при перемешивании 2,0 л насыщенного раствора сульфата аммония для переосаждения овоглобулина. Суспензию оставляют при комнатной температуре и через 6—12 ч центрифугируют. Полученный продукт растворяют и осаждают подобным же образом еще 2 раза. После трехкратного осаждения осадки овоглобулина растворяют в минимальном количестве воды, диализируют через целлофан против деминерализованной воды 72—96 ч. Во время диализа образуется осадок овоглобулин, который собирают центрифугированием. Осадок растворяют в минимальном количестве 5%-ного раствора сульфата аммония. Вы\од - 60 г овоглобулина. Чистота - 100% по хроматографическим данным. К центрифугату после отделения овоглобулина при перемешивании добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до тех пор, пока раствор не приобретает устойчивое помутнение. В этот момент прибавляют 0,2 н раствор серной кислоты до pH 5,1. Суспензию оставляют при 20° С. Кристаллизация овальбумина завершается в течение 24-48 ч. Кристаллы овальбумина собирают центрифугированием. Жидкость отбрасывают, а осадок перекристаллизовывают. Кристаллы овальбумина растворяют в 5 л деминерализованной воды. К раствору добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (4;5 + 0,5 л) до. тех пор, пока жидкость не приобретет интенсивную и устойчивую опалесценцию, в раствор вносят кристаллическую затравку и оставляют при 20° С. Через 48 ч кристаллизация заканчивается. Полученный продукт перекристаллизовывают таким же образом еще раз. После перекристаллизации овальбумин, растворяют в минимальном количестве воды и подвергают диализу через целлофан до отсутствия сульфата аммония. Обессоленный раствор овальбумина высушивают лиофильно. Выход 650 г овальбумина. Чистота — 100% по хроматографическим данным.

Пример 2. 60л яичного белка вливают в стеклянный реактор. Активность лизоцима в исходном сырье 22000 ед/мл. К белку при перемешивании механической мешалкой медленно добавляют 1 н раствор соляной кислош до pH 5,3. Смесь оставляют при 22° С на 48 ч. В течение указанного времени активность лизо цима в яичном белке повышается до 48000 ед/мл и одновременно осаждаются побочные белки. Осадок удаляют декантацией, а жидкую фазу используют для получения лизоцима, овоглобулина и овальбумина, как описано в предыдущем ₅ примере. Выход лизоцима 155 г. Активность Лизоцима 26400 ед/мг белка. Выход овоглобулина — 62 г.

Содержание основного вещества - 100%. Выход овальбумина 700 г. л о

Чистота препарата — хроматографически чис тый.

ПримерЗ. До обработки яичного белка определяют активность лизоцима, которая соответствует 23500 ед/мл. 15

К 70 л яичного белка при перемешивании механической мешалкой добавляют 1 н раствор соляной кислоты до pH 4,8 и смесь оставляют при 18° С. Через несколько часов яичный белок мутнеет за счет осаждения побочных белков. ₂₀ Через 72 ч осадок удаляют декантацией и отбрасывают, в жидкой фазе определяют активность лизоцима, которая равна 46500 ед/мл.

. Обработанный яичный белок при pH 4,8 и 18° С в течение 72 ч используют в качестве ₂₅ сырья для получения лизоцима, овоглобулина и овальбумина по способу, изложенному в примере 1. Выход лизоцима 170 г или 75% от теоретического содержания. Активность лизоцима 28000 ед/мг белка. 30

Выход овоглобулина 65 г.

Чистота овоглобулина - хроматографически чистый.

Выход овальбумина 800 г или 60% от теоретического содержания.

Чистота овальбумина - содержание основного вещества 100% по хроматографическим данным.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество биохимпрепаратов: лизоцима, овоглобулина, овальбумина.

Активация сырья и отделение побочных белков обеспечивают увеличение активности лизоцима в 1,5—2 раза, повышение чистоты овоглобулина с 95—97% до 100%_г чистоты овальбумина с 95-98% до 100%.

Claims (1)

1. Изебретение относитс  к комплексному получению протеинов из  ичного белка, например лизоцима, овальбумина, овоглобулина, использу емых как сырье дл  получени  аминокислот в медицине, косметике, микробиологической и пищевой промышленности. Известен способ получени  протеинов из  ичного белка путем последовательного осаждени  содержащихс  в нем фракщ1Й лизодима,. овоглобулина, овальбумина с последующей их очисткой кристаллизацией 1. Оцнако недостатками известного способа  вл ютс  низка  активность препарата лизоцим недостаточна  чистота овоглобулина и овальбумина , сложность и длительность процесса, св занна  с многократностью перекристаллизацией и стадий очистки. Целью изобретени   вл етс  повышение активности препарата лизоцима, чистоты овоглобу лина и овальбумина, упрощение процесса получени  протеинов и обеспечение, высокого Их вы хода. Поставленна  цель достигаетс  тем, что перед осаждением фракций  ичный белок вьщерживают при рН 4,8-5,3, температуре 17-22 в течение 48-72 ч, и отдел ют выделившийс  побочный белок - овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществл ют из раствора , отделенного от осажденного овомуцина. Предлагаемый способ обеспечивает активность лизоцима 25000-30000 ед/мг белка, чистоту овоглобулина - 100%, чистота овальбумина - 100%, с высокими вьтходами и упрощение процесса. Увеличение активности лизоцима достигаетс  за счет того, что в процессе выдерживани   ичного белка при рН 4,8-5,3 и температуре 17-22С в течение 48-72 ч происходит (активаци  исходного сырь , что приводит в итоге к разложению фермент-белкового комплекса и освобождени  лизоцима. В исходном сырье лизоцим св зан с другими белками, что ведет к обратимой потере его активности. В процессе выдерживани  исходного сырь  происходит освобождение фермента от белка. Кисла  среда рН 4,8-5,3 разрущает св зь лизоцима с другими белками. Тем создаютс  услови  дл  восстановлени , активности лизоцима. 3.7 В процессе выдерживани   ичного белка происходит освобожденне активного центра лизоцима , который в исходном сьфье частично блокирован неактивной, частью фермента, так как фермент находитс  в виде агрегатов друг с другом. Предлагаемое изобретение обеспечивает также получение овоглобулина и овальбумина высокой чистоты вследствие того, что в процессе активации сырь  происходит осаждение побочных белков, включа  овомуцин. Переход овомуцина в твердую фазу способствует его удалению . Дальнейшему фракционированию подвер гают жидкую фазу, не содержащую примес«й побочных белков, что повышает чистоту выдел емых протеинов. Осаждение овомуцинов в процессе активации сырь  одновременно обеспечивает упрощеmie процесса очистки, т.е. за счет сокращени  количества перекристаллизации овоглобулина и овальбумина с 5-ти до 2-х раз и количество перекристаллизации лизоцима с 3-х до 2-х раз. Пример 1.К60л  ичного белка при перемешивании добавл ют 1н раствор сол ной кислоты до значе ш  рН 5,0. Смесь оставл ют при 20° С. Осаждаетс  слизистый осадок, состо щий в основном из овомуцина. Кристаллизаци  лизоциШ. Через 72 ч осадок удал ют декантацией, а к жидкости при перемешивании добавл ют NaCI до получени  5%-ного раствора и раствор едкого натри  до рН 9,5. Перемешивание продолжают до полного растворени  соли. К приготовленному раствору дл  кристаллизации лизоцима прибавл ют 10-25 мл суспензии кри сталлов лизоцима и оставл ют при 5° С. Раствор каждый день- 2-3 раза перемешивают . Кристаллизаци  лизоцима заканчиваетс  в течение 6 сут. Кристаллы лизоцима собирают центрифугированием и перекристаллизовывают, а центрифугат используют дл  получений овоглобулнна и овальбумина. Осадок технического лизоцима раствор ют в 3 л 0,05 раствора уксусной кислоты, нерастворившийс  осадок отдел ют центрифугированием и еще раз раствор ют в 1 л 0,05 растворе уксусной кислоты и оп ть центрифугируют. Осадок отбрасывают, а центрифугаты объедин ют . К центрифугатам добавл ют натрий хлористый из расчета, чтобы получить 5%-ньш раст вор и 1 н раствор едкого натри  до рН 9,5. Раствор оставл ют при 5° С ив течение 3 сут заканчиваетс  перекристаллизаци . Вьшавший осадок перекристаллнзовывают еще 1 раз как описано- Сырой осадок лизоцима после второй перекристаллизации собирают на нутч-фильтре и высушивают лиофильно. Активность лизоцима 30 ОШ ёд/мг, выход - 150 г. Затем к раствору  ичного белка {объем около 60 л) после отделени  лизоцима при перемешивании постепенно дoбaвл юt насыщенный раствор сульфата аммони  в соотношении 1:1,06. Образуетс  осадок, состо щий из овоглобулина. Суспензию оставл ют при комнатной температуре на 24 ч. Осадок собирают центрифугированием и подвергают дальнейшей очистке дл  нолучеш  овоглобулнна, а центрифугат нспользуют дл  получени  овальбумина. Осадок технического овоглобулина 1эаствор ют в 2,0 л деминерализованной воды. К раствору добавл ют при перемепливании 2,0 л насыщенного раствора сульфата аммони  дл  переосаждени  овоглобулина. Суспензию оставл ют при комнатной температуре и через 6-12 ч центрифугируют. Полученный продукт раствор ют и осаждают подобным же образом еще 2 раза. После трехкратного осаждени  осадки овоглобулина раствор ют в минимальном количестве воды, диализируют через целлофан против деминерализованной воды 72-96 ч. Во врем  диализа образуетс  осадок овоглобулин, который собирают центрифугированием . Осадок раствор ют в минимальном количестве 5%-ного раствора сульфата аммони . - 60 г овоглобулина. Чистота - 100% по хроматографическим данным. К центрифугату после отделени  овоглобулина при перемешивании добавл ют насьвденньш раствор сульфата аммони  до тех пор, пока раствор не приобретает устойчивое помутнение. В этот момент прибавл ют 0,2 н раствор серной кислоты до рН 5,1. Суспензию оставл ют при 20° С. Кристаллизаци  овальбумина завершаетс  в те4eiffle 24-48 ч. Кристаллы овальбумина собирают центрифугированием. НСидкость отбрасывают , а осадок перекристаллизовывают. Кристаллы овальбумина раствор ют в 5 л деминерализованной воды. К раствору добавл ют насыщенный раствор сульфата аммони  (4;5 ± 0,5 л) до. тех пор, пока жидкость не приобретет интенсивную и устойчивую опалесценцию, в раствор внос т кристаллическую затравку и оставл ют при 20° С. Через 48 ч кристаллизаци  заканчиваетс . Полученный продукт перекристаллизовывают таким же образом еще раз. После перекристаллизации овальбумнн, раствор ют в минимальном количестве воды и подвергают диализу через целлофан до отсутстви  сульфата аммони . Обессоленный раствор овальбумика высушивают лиофильно. Выход 650 г овальбумина. Чистота - 100% по хроматографическим данным. Пример 2. 60л  ичного белка вливают в стекл нный реактор. Активность лизоцима в исходном сырье 22000 ед/мл. К белку при перемещивании механической мешалкой медленно добавл ют 1 н раствор сол ной кислоты до рН 5,3. ,Смесь оставл ют при 22° С на 48 ч. В течение указанного времени активность лизо574 цима в  ичном белке повышаетс  до 48000 ед/м и одьовременно осаждаютс  побочные белки. Осадок удал ют декантацией, а хсидкую фазу используют дл  получени  лизоцима, овоглобулина и овальбумина, как описано в предьздущем примере. Выход лизоцима 155 г.. Активность Лизоцима 26400 ед/мг белка. Выход овоглобулина - 62 г. Содержание основного вещества - 100%. Выход овальбумина 700 г. Чистота препарата - хроматографически чи& Примерз. До обработки  ичного бел-, ка определ ют активность лизоцима, котора  соответствует 23500 ед/мл, К 70 л  ичного белка при перемешивании механической мещалкой добавл ют 1 н раствор сол ной кислоты до рН 4,8 и смесь оставл ют при 18° С. Через несколько часов  ичный белок мутнеет за счет осаждени  побочных белков. Через 72 ч осадок удал ют декантацией и отбрасывают, в жидкой фазе определ ют активность лизоцима, котора  равна 46500 ед/мл. . Обработанный  ичный белок при рН 4,8 и 18° С в течение 72 ч используют в качестве сырь  дл  получени  лизоцима, овоглобулина и овальбумина по способу, изложенному в примере 1. Выход лизоцима 17Q г или 75% от теоретического содержани . Активность лизоцима 28000 ед/мг белка. Выход овоглобулина 65 г. Чистота овоглобулина - хроматографически чистый. Выход овальбумина 800 г или 60% от теоретического содержани . 6 Чистота овальбумина - содержание осиовного вещества 100% по хроматографическим данным . Таким образом, предлагаемый способ позвол ет повысить качество биохимпрепаратов:  изоцима , овоглобулина, овальбумина. Активаци  съфь  и отделение побочных белков обеспечивают увеличение активности лизоцнма в 1,5-2 раза, повыщение чистоты овоглобулина с 95-97% до 100% чистоты овальбумина с 95-98% до Формула изобретени  Способ получени  протеинов из  ичного белка путем последовательного осаждени  содержащихс  в нем фракций лизо1и{ма, овоглобулина, овальбумина с последующей их очисткой кристаллизацией , отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода указанных фракций, упрощени  способа, 1}рвыщени  активности лизоцима и чистоты овоглобулина и овал бумина, перед осаждением фракций  ичный белок вьздерживают при рН 4,8-5,3, температуре 17-22° в течение 48-72 ч и отдел ют выделившийс  побочный белок - овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществл ют из раствора, овделенного от осажденного овомуцина. Источники информации, прин тые во внимание при зкспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 247703, кл. А 23 J 1/08, 1968.