CS264100B1 - Process for preparing immunomodulation peptides of thymosine fraction 5 - Google Patents
Process for preparing immunomodulation peptides of thymosine fraction 5 Download PDFInfo
- Publication number
- CS264100B1 CS264100B1 CS881616A CS161688A CS264100B1 CS 264100 B1 CS264100 B1 CS 264100B1 CS 881616 A CS881616 A CS 881616A CS 161688 A CS161688 A CS 161688A CS 264100 B1 CS264100 B1 CS 264100B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- thymosin
- peptides
- fraction
- salted out
- acetone
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 title abstract description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 claims abstract description 23
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 claims abstract description 20
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 13
- 108700016958 thymosin fraction 5 Proteins 0.000 claims description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 4
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 abstract description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 abstract description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 abstract 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282988 Capreolus Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010793 Steam injection (oil industry) Methods 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- AHFHMGFBODNOJT-UHFFFAOYSA-N azane;ethane Chemical compound N.CC AHFHMGFBODNOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řešení se týká výroby imunomodulačních peptidů thymosir.u frakce > zjed.nodušeným*po□tupen, který spočívá v tom, že se extrakt z telecích brzlíků po tepelné denaturaci balastních bílkovin a jejich současném odstranění e brzlíkovou tkání delípiduje extrakcí do octanu ethylnatého nebo nižšího alkanolu. Z vyěeřené vodné fáze ae vy3olx balastní bílkoviny spolu se zbytky rozpouštědla a oddělí se jako vrchní kapalná fáze. ^aliím vysolení:.-. se z?'.nká surový thymosin, ktorý se čistí ultrafiltrucí a z ultrafiltrá- : '' tu ae po zahuštění a okyselení opětovně vynráží částečně odaolený thymosin frakt ‘ ce 5. Ten se převede promytím acetonem 1' na stabilizován,'/ suchý meziprodukt, zpracovatelný dále podle potřeby po odg solení gelovou filtrací, chron.r.tografií na měniči kationtů a lyofilizací na finální produkt. Peptidy thymosinu frakce 5 se používají k léčbě poruch imunitního systému.The solution relates to the production of immunomodulatory thymosulfate peptide peptides> simplified which lies in that with veal thymus extract after heat denaturing ballast proteins and their simultaneous removal of the thymus tissue it is separated by extraction into ethyl acetate or a lower alkanol. Out of water phase ae vy3olx ballast protein together with solvent residues and separated as the upper liquid phase. Other salons: .-. is the raw raw thymosin that ultrafiltration and ultrafiltration Here again, after concentration and acidification the thymosin fraction is partially recovered 5. This was washed with acetone 1 'for stabilized, dry intermediate, workable further as needed for the odg gel filtration salting, chronography on the cation exchanger and lyophilization to final product. Thymosin fraction peptides 5 are used to treat immune disorders system.
Description
Vynález se týká způsobu výroby imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 z telecích brzlíků.The invention relates to a process for the production of fraction 5 immunomodulatory peptides from calf thymus.
Thymosin frakce 5 je komplex peptlaických hormonů, vylučovaných brzlíkem ( thymem ), které umožňují dozrávání a diferenciaci 2 lymfocytů v imunokompetentní buňky a podílejí se na správné funkci imunitního systému.Thymosin fraction 5 is a complex of peptlaic hormones secreted by the thymus that allow the maturation and differentiation of 2 lymphocytes into immunocompetent cells and contribute to the proper functioning of the immune system.
Z celé řady imunomodulačních peptidů brzlíku je thymosin frakce 5 v současné dobo nejlépe prostudován a ve světe též klinicky používán. Je připravován, extrakcí zmražených telecích, brzlíků a jeho složení je dáno jednak způsobem extrakce, jednak následnými izolačními a čistícími stupni.Of the many thymosin thymosin peptides, fraction 5 thymosin is currently best studied and clinically used worldwide. It is prepared by extraction of frozen calves, thymus glands and its composition is given both by the extraction method and subsequent isolation and purification steps.
*l* l
Původní způsob přípravy ( A.L. Goldstein se sp., Proč. Hati. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972 ) byl dále propracován ( J.A. Kooper se sp., Ann. Η.Ϊ. Acad. Sci. 24§, 125, 1975 ). Podle tohoto postupu so homogenizát telecího brzlíku ve 3 dílech 0,15 M roztoku chloridu sodného odstředí, supernatant se zahřeje na teplotu 80 °C po dobu 15 minut a sražený denaturát balastních bílkovin se odfiltruje. Filtrát se sráží vkapáním do čtyřnásobného objemu acetonu zchlazeného na teplotu -10 °G, odfiltrované sraženina promytá acetonem se vysuší na prášek a tento se rozpustí v 10 dílech 0,1 M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0. Nerozpuštěný zbytek se odstředí a ze supernatantu se nejprve vysolí další balastní bílkoviny síranem amonným přidaným do dosažení 25 % nasycení. Po odstředění vysolených bílkovin se upraví pH supernatantu na hodnotu 4,0 a surový thymo-,, sin se vysolí dalším přídavkem síranu amonného do dosažení 50 % nasycení. Odstředěný sediment aktivních peptidů se rozpustí v 0,01 M tris(hydroxymethyl)-aminomethanovéra pufru ( dále TRIS-pufru ) při hodnotě pH 6,0 na.koncentraci 10 mg peptidů / mlThe original preparation method (AL Goldstein et al., Proc. Hati. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972) was further elaborated (JA Kooper et al., Ann. Η.Η. Acad. Sci. 24§, 125, 1975). According to this procedure, the calf thymus homogenate is centrifuged in 3 parts of 0.15 M sodium chloride solution, the supernatant is heated to 80 ° C for 15 minutes, and the precipitated ballast denaturate is filtered off. The filtrate is precipitated by dripping into a quadruple volume of acetone cooled to -10 DEG C., the filtered precipitate washed with acetone is dried to a powder and dissolved in 10 parts of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0. The undissolved residue is centrifuged and additional ballast proteins are first salted out of the supernatant with ammonium sulfate added to 25% saturation. After centrifugation of the salted proteins, the pH of the supernatant is adjusted to 4.0 and the crude thymosin is salted out by further addition of ammonium sulfate until 50% saturation is achieved. The centrifuged sediment of the active peptides is dissolved in 0.01 M tris (hydroxymethyl) -aminomethane buffer (hereinafter TRIS buffer) at pH 6.0 to a concentration of 10 mg peptides / ml.
- 2 264 ICO a po vyčeření se roztok ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10.800. Ultrafiltrát obsahující thymosiny frakce 5 se odsolí na dextranovém gelu a požadovaná frakce, eluovaná v oblasti VQ, se lyofilizuje. Ve snaze převést izolaci thymosinu frakce 5 do výrobního měřítka byl popsaný postup dále modifikován. Podle patentového spisu USA č. 4128637 se bílkoviny v extraktu denaturují vháněním páry, další patentový spis USA č. 4082737 popisuje odstranění endotoxinů a pyrogenů ultrafiltrací.- 2 264 ICO and after clarification, the solution is ultrafiltered through a membrane with an exclusion limit of 10,800. The ultrafiltrate containing 5 thymosins fraction was desalted on a dextran gel and the desired fractions eluted in zone V Q lyophilized. In an effort to convert the isolation of thymosin fraction 5 to production scale, the process described was further modified. According to U.S. Pat. No. 4128637, proteins in the extract are denatured by steam injection, another U.S. Pat. No. 4,082,737 describes the removal of endotoxins and pyrogens by ultrafiltration.
Dosud popsané postupy mají dvě společné nevýhody. Z koloidního brzlíkového homogenizátu je nutno oddělovat extrakt odstředěním při vysokých hodnotách tíhového zrychlení, dále postupy vyžadují značné objemy zchlazeného acetonu pro srážení a delipidaci surového thymosinu. Tyto technologické operace velmi znesnadňují průmyslové využití postupů. Uvedené nevýhody jsou odstraněny postupem uvedeným v δη» AO č.250631, podle nějž se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní současně filtrací za horka po zahřátí homogenizátu, ze zchlazeného filtrátu se oddělí vrstva lipidů a z roztoku se vysolí síranem amonným přímo peptidy thymosinu. Dále se odstraní neúčinný polypeptid /3 -j 0 hodnotě isoelektrického bodu pl 6,7 chromatografií na sloupci slabě kyselého měniče kationtů v těkavém pufru o hodnotě pH 5,0 až 7,0. Přesto však současný postup přináší ještě obtíže, jako zákaly roztoků po oddělení lipidů, poměrně vysokou spotřebu síranu amonného, nutnost dvojího odstředění při vysolování a obtížné skladování meziproduktů v případě přerušení výroby.The processes described so far have two common disadvantages. It is necessary to separate the extract from the colloid thymus homogenate by centrifugation at high values of gravity acceleration. Furthermore, the processes require considerable volumes of chilled acetone to precipitate and delipidate the crude thymosin. These technological operations make the industrial use of processes very difficult. These drawbacks are overcome by the procedure of AO No. 250631, according to which thymus residues and ballast proteins are removed simultaneously by hot filtration after heating the homogenate, a layer of lipids is separated from the cooled filtrate and the thymosin peptides are salted out of solution. Next, remove inactive polypeptide / 3 0 -j pl value of isoelectric point of 6.7 by column chromatography on a weakly acidic cation exchange resin in a volatile buffer, pH 5.0 to 7.0. However, the present process still presents difficulties such as turbidity of solutions after lipid separation, a relatively high consumption of ammonium sulfate, the need for double centrifugation during salting-out and the difficult storage of intermediates in case of production interruption.
Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5, získané z homogenizátu telecích brzlíků po tepelné denaturaci, podle vy —'lezu, jehož podstata spočívá v tom, že se z teplého filtrátu'vyextrahují lipidy octanem ethylnatým nebo alkanolem o počtu uhlíkových atomů 3 až 5. Po ochlazení se v oddělené vodné fázi vysolí síra- . nem amonným balastní bílkoviny a organické rozpouštědlo, které jsou v horní fázi. Čirá spodní fáze se následně vysolí opět síranem amonným a získaný surový thymosin se oddělí a ultra- 3 264 100 filtruje. Zahuštěním a okyselením ultrafíltrátu na hodnotu pH 3,8 až 4,2 se zpět vysolí předtištěny částečně odsolený thymosin, který se převede acetonem na stabilní práakovitý mo« ziprodukl'.. Ten se gelovou filtrací a chromátografií na měniči kat iontů zpracuje přímo na konečný komplex imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5· Způsob podle vynálezu se výhodně provádí, tak, že se lipidy vyextrahují 2«propanolem nebo 1-butanolem a okyselení ultrafiltrátu se provede kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0. Autory vynálezu bylo takto zjištěno, že je možno při využívání a zachování podstaty čs. AO č.The above disadvantages are overcome by the process for the preparation of thymosin fraction 5 immunomodulatory peptides obtained from calf thymus homogenate after thermal denaturation according to the invention, which consists in extracting lipids from ethyl acetate or an alkanol having a carbon number of 3 to 3 from the warm filtrate. 5. After cooling, sulfur is salted out in a separate aqueous phase. I have no ammonium ballast proteins and organic solvents that are in the upper phase. The clear bottom phase is then salted out again with ammonium sulfate and the crude thymosin obtained is separated and ultra-filtered. By concentrating and acidifying the ultrafiltrate to a pH of 3.8 to 4.2, the pre-printed partially desalted thymosin is salted back, which is converted by acetone into a stable powdered product. This is processed directly into the final complex by gel filtration and chromatography on a cation exchange resin. The method of the invention is preferably performed by extracting the lipids with 2-propanol or 1-butanol and acidifying the ultrafiltrate with acetic acid to a pH of 4.0. The inventors have thus found that it is possible to use and preserve the essence of Czechoslovakia. AO č.
250631 zjednodušit a zvýhodnit výrobu thymosinu frakce 5, jak vystihuje Schéma I.250631 to simplify and favor the production of thymosin fraction 5 as depicted in Scheme I.
Způsob poule vynálezu se provádí tak, že se zhomogenizovaaá gelovitá suspenze brzlíková tkáně v 0,15 M roztoku chloridu sodného zahřeje na teplotu SO °C, denaturát balastních bílkovin spolu se sraženou brzlíkovou drví se za horka odfiltruje a k extraktu se ještě při teplotě kolem 50 cC přidá za míchání octnu ethylnatý nebo nižší alkanol, s výhodou 2-propanol nebo 1-butanol. Po zchladnutí se oddělí odtučněná vodná fáze, ze které se vysolí další balastní bílkoviny a rozpuštěné organické rozpouštědlo přídavkem síranu amonného do 25 % nasycení roztoku. Vytvoří se vrchní kapalná fáze, obsahující též sraženinu bílkovin s částí nežádoucích peptidů a zbytky lipidů. Spodní čirá fáze obsahující thymosin se dá velmi snadno oddělit na rozdíl od dosavadního postupu, kdy bylo nutno vysolené balasty odstředit na průtokovém separátoru. Z vodné dokonale delipidované fáze se dále vysolí surový thymosin při hodnotě pH 4,0 přídavkem síranu amonného do dosažení 40 až 45 % nasycení roztoku. Sraženina tentokrát sedimentuje a oddělí se odstředěním na průtokovém separátoru. Surový thymosin se po rozpuštění v pufru o hodnotě pH 8,0 zbaví vysokomolekulamích příměsí ultrafiltrací přes membránu s vylučovacím limitem 10,000 a ultrafiltrát, obsahující, ještě značné množství, soli, se s výhodou přečistí a zároveň převede na stabilní mezi produkt tak, že se zahustí a okyselí na. hodnotu p.H 4,0. Tím se opětovně vysolí thymosin, .který lze snadno odfiltrovat a promýt zchlazeným acetonem. Promyti má další čistící účinek,The process of the invention is carried out by heating the homogenized gelled suspension of thymus tissue in 0.15 M sodium chloride solution to a temperature of SO C, the denaturate of the ballast proteins together with the thickened thymus is filtered hot and extracted to a temperature of about 50 c. C, with stirring, add ethyl or lower alkanol, preferably 2-propanol or 1-butanol. After cooling, the defatted aqueous phase is separated from which additional ballast proteins and dissolved organic solvent are salted out by adding ammonium sulfate to 25% saturation of the solution. An upper liquid phase is formed, also containing a protein precipitate with some undesired peptides and lipid residues. The lower clear thymosin-containing phase can be separated very easily, as opposed to the prior art, when the salted ballasts had to be centrifuged on a flow separator. Crude thymosin is further salted out of the aqueous perfectly delipidated phase at pH 4.0 by addition of ammonium sulfate until the solution is saturated to 40-45%. This time the precipitate sedimented and was collected by centrifugation on a flow separator. The crude thymosin, after dissolution in a pH 8.0 buffer, is freed from high molecular weight impurities by ultrafiltration through a 10,000 elimination membrane and the ultrafiltrate containing a significant amount of salt is preferably purified and at the same time converted to stable between products by concentration and acidify to. pH 4.0. This re-salinizes thymosin, which can be easily filtered off and washed with chilled acetone. Washing has another cleaning effect,
- 4 264 χΟΟ neboť do acetonu přejdou barevné příměsi. Získaný práškovitý meziprodukt obsahuje asi 4x méně soli než odstředěná sraženina. Po odsolení gelovou filtrací se efluent z kolony molekulového síta zbaví neúčinného polypeptidu fb podle postupu uvedeného v čs. AO č. 250631 průtokem přes sloupec slabě kyselého měniče kationtů v prostředí těkavého pufru o hodnotě pH 5,0 až 7j0, např. octanu amonného. Aktivní peptidy thymosinu frakce 5 procházejí kolonou a mohou být přímo lyofilizovány, zachycený polypeptid ý3 se vymyje z iontoměniče zvýšením hodnoty pH elučního roztoku a tím se zároveň iontoměnič regeneruje,- 4,264 χΟΟ as color impurities will pass into acetone. The powdered intermediate obtained contains about 4 times less salt than the centrifuged precipitate. After desalting by gel filtration, the effluent from the molecular sieve column is deprived of the inactive fb polypeptide according to the procedure disclosed in U.S. Pat. AO No. 250631 by flowing through a column of a weakly acidic cation exchanger in a volatile buffer medium having a pH of 5.0 to 70, e.g., ammonium acetate. The active peptides of thymosin fraction 5 pass through the column and can be directly lyophilized, the captured γ3 polypeptide is washed out of the ion exchanger by increasing the pH of the elution solution, thereby regenerating the ion exchanger,
Postup podle vynálezu má tyto hlavní výhody; delipidace octanera ethylnatým nebo alkanolem přidaným ke zfiltrovanérau extraktu hned po tepelné denaturaoi je velmi rychlá a účinná. Použití uvedených organických rozpouštědel má za následek změnu měrné hmotnosti sraženiny balastnich bílkovin oproti stávajícím postupům a umožňuje jejich oddělení s_vrchní kapalnou fází, čímž se eliminuje z technologického procesu jedno odstředění na průtokovém seporátoru. Surový thymosin se vysóluje z dokonale čirého roztoku a to usnadňuje .rozpouštění odstředěné sraženiny i předběžné čeření před ultrafiltrací. Organické rozpouštědlo má příznivý vliv na vysolování balastních látek a thymosinu. Projevuje se to zmenšením potřebného množství síranu amonného a dále tím, že finální produkt obsahuje méně neúčinných peptidů. Přesrážení thymosinu frakce 5 20 zahuštěného ultraf ilt rútu a jeho převedení na acetonový prášek umožňuje shromažďovat stabilní meziprodukt z jednotlivých várek s ohledem na potřeby při následné gelové filtraci a lyofilizaci. Převedení na acetonový prášek má další rafinační účinek při minimální spotřebě acetonu oproti předchozím postupům. Při částečném odsolení ultrafiltrátu se několikanásobně sníží poměr soli k thymosinu a tím se snižují nároky na zařízení pro gelovou filtraci. Způsob podle vynálezu zrychluje podstatně výrobní proces, snižuje nároky.na zařízení i na spotřebu energií. Snižuje též spotřebu surovin, jako síranu amonného a dextranového gelu. Z toho vyplývají i ekonomické úspory. .The process of the invention has these main advantages; delipidation of ethyl acetate or alkanol added to the filtered extract immediately after the thermal denaturation is very fast and efficient. The use of said organic solvents results in a change in the specific gravity of the ballast protein precipitate compared to the existing processes and allows their separation with the top liquid phase, thereby eliminating one centrifugation from the process process on a flow separator. The crude thymosin is polarized from a perfectly clear solution and this facilitates the dissolution of the centrifuged precipitate and pre-clarification prior to ultrafiltration. The organic solvent has a beneficial effect on the salting out of ballasts and thymosin. This is manifested by a reduction in the amount of ammonium sulfate required and that the final product contains less inactive peptides. The precipitation of thymosin fraction 5 of the concentrated ultrafiltrate ruthenium and its conversion into acetone powder allows the collection of a stable intermediate product from individual batches with respect to the needs for subsequent gel filtration and lyophilization. Converting to acetone powder has an additional refining effect with minimal acetone consumption over previous processes. When the ultrafiltrate is partially desalted, the salt to thymosin ratio is reduced several times and thus the demands on the gel filtration device are reduced. The process according to the invention significantly speeds up the production process, reduces the equipment and energy consumption. It also reduces the consumption of raw materials such as ammonium sulfate and dextran gel. This results in economic savings. .
264 ICO264 ICO
V dalším je vynález blíže objasněn jednak příklady provedení, aniž by se jimi omezoval, jednak Schématem I.In the following, the invention is illustrated in more detail by way of non-limiting examples and Scheme I.
Příklad 1Example 1
Navážka 50 kg zmražených telecích brzlíků se rozemele a zhomogenizuje vc 125 litrech. 0,15 M roztoku chloridu, sodného při teplotě 15 až 20 °C. Suspenze se míchá v kotli opatřeném topným pláštěm při této teplotě po dobu 1 hodiny. Poté se za míchání zahřeje na teplotu 80 UC během 30 minut. Pří této teplotě se míchá 10 minut a neprodleně se za tepla zfiltruje při redukovaném tlaku přes plachetku. Sraženina se promyje 20 litry vody. Teplý filtrát se přečerpá do zásobníku opatřeného výkonným míchadlem a ihned za tepla se za míchání přidá 1/4 objemu, t.j. kolem 30 litrů octanu ethylnatého. Po ustavení eztrakční rovnováhy se kapalné fáze přečerpají do skleněného zásobníku opatřeného spodn.í výpustí. Po zchladnutí na teplotu do 20 -°C se oddělí vodná delipidovaná fáze, k níž se za míchání přidá takové množství pevného síranu amonného, aby bylo dosazeno zp /i? nasyceni ζ 2zo / livr a srnec se nmcha po uoou, 30 minut. Vzniklá suspenze se přečerpá opět do skloněného zásobníku, kde se oddělí jako vrchní fáze vrstva vysoleného rozpouštědla spolu s balústními bílkovinami. Oddělená čirá vodná fáze se okyselí ledovou kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0 a dalším přídavkem síranu amonného do 40 až 45 % nasycení ( 185 g / litr ) se za stejných podmínek jako při prvním vysolování vyloučí surový thymosin. Sraženina tentokrát šedimentuje a odstředí se při 5.000 až 10.000 g na průtokovém separátoru.The 50 kg frozen veal thymus is weighed and homogenized in 125 liters. 0.15 M sodium chloride solution at 15-20 ° C. The suspension is stirred in a heating jacketed boiler at this temperature for 1 hour. Is then heated with stirring at 80 C. For 30 minutes. It is stirred at this temperature for 10 minutes and immediately filtered under reduced pressure through a cloth under reduced pressure. The precipitate was washed with 20 liters of water. The warm filtrate is pumped into a tank equipped with a high-performance stirrer and 1/4 volume, i.e. about 30 liters of ethyl acetate, is added immediately while stirring. After establishing the equilibrium equilibrium, the liquid phases are pumped into a glass container provided with a lower outlet. After cooling to a temperature of up to 20 ° C, the aqueous delipidated phase is separated, to which, while stirring, an amount of solid ammonium sulphate is added in order to obtain from the reaction mixture. saturation ζ2o / livr and roe deer are allowed to wait for 30 minutes. The resulting slurry is pumped back to the inclined container, where a layer of salted solvent together with balust proteins is separated as the upper phase. The separated clear aqueous phase was acidified with glacial acetic acid to pH 4.0 and crude thymosine precipitated by the further addition of ammonium sulfate to 40-45% saturation (185 g / liter) under the same conditions as for the first salting out. This time the precipitate is grayed and centrifuged at 5,000-10,000 g on a flow separator.
Odstředěná sraženina surového thymosinu o hmotností kolem 800 g a sušině kolem 49 % se rozpustí ve 2.500 ml 0,01 M TKIS-pufru o hodnotě pH 8,0, přičemž se pH udržuje při uvedené hodnotě přídavky 25% vodného amoniaku. Vzniklý kalný roztok se zhruba zfiltruje přes sintr, poté se vyčeří na asbestocelu-. losovém filtru a ultrafiltruje'přes membránu s vylučovacím limitem 10.0U0. XJltrafiltrát se zahustí ve vakuu při vnější teplotě do 50 °C na obsah kolem 10 % sušiny a. odsolí se chroΜ»A centrifuged precipitate of crude thymosin weighing about 800 g and a solids content of about 49% is dissolved in 2,500 ml of 0.01 M TKIS buffer pH 8.0, maintaining the pH at the addition value of 25% aqueous ammonia. The resulting cloudy solution is roughly filtered through a sinter, then clarified on asbestocell. a lot filter and ultrafiltered through a membrane with an exclusion limit of 10.0U0. The filtrate is concentrated in vacuo at an external temperature of up to 50 ° C to a content of about 10% dry matter and desalted.
264 ΐΟΟ matografií na dextranovém gelu. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5» eluované v oblasti νθ, se bučí. přímo lyofilizují, nebo se zbaví polypeptidu /3^ předběžnou filtrací eluátu přes sloupec slabě kyselého měniče kationtů. Výtěžek je 5,0 až 7,5 g thymosinu frakce 5.264 d dextran gel mathography. Immunomodulatory peptides of thymosin fraction 5 »eluted in the νθ region were excised. directly lyophilized, or freed from the [beta] 3 polypeptide by pre-filtering the eluate through a weakly acidic cation exchange column. The yield is 5.0 to 7.5 g of thymosin fraction 5.
Příklad 2Example 2
Ultrafiltrát thymosinu frakce 5 připravený postupem podle příkladu 1 se zahustí na 1/15 objemu, čímž se docílí koncentrace síranu amonného potřebné k opětovnému vysolení peptidů thymosinu. Ty se vyloučí, úpravou pH na hodnotu 4,0, odsají na fíintru a promyjí acetonem zchlazeným na teplotu -10 °C. Získaný stabilizovaný a částečně odsolený prášek obsahuje kolem 35 % účinných peptidů. Po rozpuštění v těkavém pufru, např. v roztoku o etanu amonného při hodnotě pH 8,0 se odsoluje a dále zpracovává postupem popsaným v příkladu 1,The thymosin ultrafiltrate of fraction 5, prepared as described in Example 1, is concentrated to 1/15 volume to give the ammonium sulfate concentration required to re-salinate the thymosin peptides. These were precipitated by adjusting the pH to 4.0, aspirated on the filter and washed with acetone cooled to -10 ° C. The stabilized and partially desalted powder obtained contains about 35% active peptides. After dissolution in a volatile buffer, e.g. in ammonium ethane solution at pH 8.0, it is desalted and further processed as described in Example 1,
Příklad 3Example 3
Delipidaci extraktu lze provést za stejných podmínek jako v příkladu 1 s tím, že se použije namísto octanu ethylnatého nižší alkohol, s výhodou 2-propanol nebo 1-butanol.Delipidation of the extract can be carried out under the same conditions as in Example 1 except that a lower alcohol, preferably 2-propanol or 1-butanol, is used instead of ethyl acetate.
Čistotec získaných imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 byla ověřena analytickou metodou isoelektrické fokusace v rozmezí hodnot pH 3,5 až 9,5 a ultrafialovou spektroskopií při 200 až 300 nm.The purity of the obtained thymosin fraction 5 immunomodulatory peptides was verified by an isoelectric focusing analytical method in the pH range of 3.5 to 9.5 and by ultraviolet spectroscopy at 200-300 nm.
Schéma I telecí brzlík homogenizace, extrakce |~~~h omo q en i z & t ] zahřátí na 80 °C, filtrace sraženina -}· tkáň brzlíkuScheme I calf thymus homogenization, extraction | heating to 80 ° C, filtration clot -} · thymus tissue
-j filtrát vyražena extrakce org.rozpouštědlem za tepla, ochlazení vrchní fáze s lipidy vyrašena ____E vysolení do 25 % nasycení s oddělení fází.-j filtrate punched by extraction of organic solvent by heat, cooling the top phase with lipids punched ____E salting out to 25% saturation with phase separation.
| spodní fázej vyražena pH 4,0, vysolení do 40 až 45 % nasyc., odetredě dění vrchní fáze se sraženinou| bottom phase punched to pH 4.0, saline to 40 to 45% sat.
sunernatant vyražen ultrařiltrát vyražen postup 1 odsolení na dextran.sunernatant punched ultrafiltrate punched procedure 1 desalting on dextran.
postup 2 zahuštění, vysrážení při pK 4,0, filtrace, promytí acetonem efluent acetonový prášek odstranění pólypeptidu , iyoíili:procedure 2 concentration, precipitation at pK 4.0, filtration, washing with acetone efluent acetone powder removal of the polypeptide, as follows:
;aée rozpuštění, odsolení na dextran. gelu thymosin frakce 5aée dissolution, desalting to dextran. Thymosin gel fraction 5
JTflixentJ odstraň vn.í polypeptidu /3-j, lyXXlisace thymosín frakce 5JTflixentJ remove thymosin fraction 5 in the β-β, lyXXlislation.
Výtěžek thyfiiosinu frakce 5: kolem 0,01 % hmotnosti brzlíku.Yield of thyphiouosin fraction 5: about 0.01% by weight of thymus.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS881616A CS264100B1 (en) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | Process for preparing immunomodulation peptides of thymosine fraction 5 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS881616A CS264100B1 (en) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | Process for preparing immunomodulation peptides of thymosine fraction 5 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS161688A1 CS161688A1 (en) | 1988-09-16 |
| CS264100B1 true CS264100B1 (en) | 1989-05-12 |
Family
ID=5350966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS881616A CS264100B1 (en) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | Process for preparing immunomodulation peptides of thymosine fraction 5 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS264100B1 (en) |
-
1988
- 1988-03-11 CS CS881616A patent/CS264100B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS161688A1 (en) | 1988-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4955363A (en) | Process of recovering lactose from whey | |
| US4576696A (en) | Process for the preparation of a biologically active extract | |
| US6893639B2 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
| CN106011207A (en) | Method for extracting fructus cannabis oligopeptide from fructus cannabis cake | |
| JPH08501688A (en) | Method for manufacturing beta-casein fortified products | |
| FI57669C (en) | FOLLOWING FOLDER INSULATION AND RELEASE AV PROTEIN HORMONER HAERSTAMMANDE FRAON HYPOFYSVAEVNAD | |
| CA2037244C (en) | Method for purifying somatotropin monomers | |
| SU1367837A3 (en) | Method of producing agent selectively inhibiting growth or reproduction of normal and leukemia cells of myeloids | |
| EP0173215A2 (en) | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms | |
| US4128637A (en) | Process for producing thymosin | |
| CS264100B1 (en) | Process for preparing immunomodulation peptides of thymosine fraction 5 | |
| Hill | The preparation of K-casein | |
| EP1071711B1 (en) | Process for the recovery and purification of a recombinant protein from a cell | |
| JPS6157290B2 (en) | ||
| EP0085220A2 (en) | Method for purification of anterior pituitary hormones | |
| CS250631B1 (en) | Method of fraction 5 thymosin's immunomodulating peptides' preparation | |
| US3201382A (en) | Process for preparing a biochemically active polypeptide from sheep pituitary growthhormone | |
| CA1101331A (en) | Process for producing thymosin | |
| Piskarev et al. | A novel preparative method for the isolation of avidin and riboflavin-binding glycoprotein from chicken egg-white by the use of high-performance liquid chromatography | |
| US3308026A (en) | Process for the production and recovery of the kallikrein-inacti-vator from proteinaceous hormone wastes | |
| SU467536A1 (en) | The method of obtaining serum albumin | |
| EP0047149B1 (en) | A purified polypeptide, a process for its preparation, its use and pharmaceutical compositions containing it | |
| SU745478A1 (en) | Method of producing protein from egg albumin | |
| US3590027A (en) | Process for preparing thyrocalcitonin using an acidic mixture of water and a water-miscible organic solvent | |
| KR830002718B1 (en) | How to separate and prepare albumin from plasma |