CS250631B1 - Method of fraction 5 thymosin's immunomodulating peptides' preparation - Google Patents
Method of fraction 5 thymosin's immunomodulating peptides' preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CS250631B1 CS250631B1 CS866685A CS866685A CS250631B1 CS 250631 B1 CS250631 B1 CS 250631B1 CS 866685 A CS866685 A CS 866685A CS 866685 A CS866685 A CS 866685A CS 250631 B1 CS250631 B1 CS 250631B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- thymosin
- fraction
- peptides
- thymus
- immunomodulatory
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řeší se příprava imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 zjednodušením jejich izolace, která spočívá v současném odstranění zbytků brzlíkovó tkáně a balastních bílkovin zahřátím homogenizátu z telecích brfclíků. Tím se umožní snadná flltrovatelnost získané suspenze, načež se ve filtrátu přímo provede vysolení síranem amonným. Z izolovaného thymosinu frakce 5 se odstraní neúčinný polypeptid /5 χ zachycením na slabě kyselém katexu v prostředí těkavého pufru. Získané biologicky aktivní peptidy lze přímo lyofilizovat. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5 slouží k obnově a úpravě imunitní odpovědi organismu.Immunomodulatory preparation thymosin peptides of fraction 5 by simplification their isolation, which lies in the present removing thymus tissue residues a ballast proteins by heating the homogenate from veal brothers. This makes it easy filterability of the obtained suspension, whereupon the filtrate is directly salted with sulfate ammonium. Isolated thymosin fraction 5 removes the inactive polypeptide / 5 χ capture on weakly acidic cation exchanger in a buffered medium. Obtained biologically the active peptides can be lyophilized directly. Thymosin immunomodulatory peptides Fraction 5 serves to restore and modify immune organism response.
Description
Způsob přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5Method for the preparation of thymosin fraction 5 immunomodulatory peptides
Řeší se příprava imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 zjednodušením jejich izolace, která spočívá v současném odstranění zbytků brzlíkovó tkáně a balastních bílkovin zahřátím homogenizátu z telecích brfclíků. Tím se umožní snadná flltrovatelnost získané suspenze, načež se ve filtrátu přímo provede vysolení síranem amonným. Z izolovaného thymosinu frakce 5 se odstraní neúčinný polypeptid /5 χ zachycením na slabě kyselém katexu v prostředí těkavého pufru. Získané biologicky aktivní peptidy lze přímo lyofilizovat. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5 slouží k obnově a úpravě imunitní odpovědi organismu.The preparation of immunomodulatory peptides of thymosin fraction 5 by simplifying their isolation, which consists in simultaneous removal of thymus residues and ballast proteins, by heating of the homogenate from calf broths is solved. This makes it easy to filter the suspension obtained, and then the saline is directly salted out in the filtrate. From the isolated thymosin fraction 5, the inactive β 5 β polypeptide is removed by capture on a weakly acid cation exchanger in a volatile buffer medium. The obtained biologically active peptides can be directly lyophilized. Immunomodulatory peptides of thymosin fraction 5 serve to restore and adjust the immune response of the organism.
(51) Int. Cl.*(52) Int. Cl. *
C 07 K 1/14C 07 K 1/14
250 631250 631
250 031250 031
Vynález se týká způsobu přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5.The invention relates to a process for the preparation of thymosin fraction 5 immunomodulatory peptides.
Brzlík (thymus) vylučuje skupinu peptidů - thymových hormonů - které umožňují dozrávání a diferenciaci T lymfocytů v imunokompetentní buňky a tím zodpovídá za správnou funkci imunitního systému. V posledních patnácti letech byla izolována a chemicky definována řada individuálních hormonů thymu a u některých z nich byl určen i mechanismus účinku. Bylo zjištěno, že na komplikovaný proces diferenciace T lymfocytů nepůsobí jediný hormon, ale že je pro terapeutickou aplikaci výhodné používat celou skupinu biologicky aktivních peptidů z thymu. Jen tak je možné obnovit porušenou imunitní funkci organismu.The thymus secretes a group of peptides - thymic hormones - that allow the maturation and differentiation of T lymphocytes into immunocompetent cells and thus are responsible for the proper functioning of the immune system. Over the past fifteen years, a number of individual thymic hormones have been isolated and chemically defined, and some have been identified as having a mechanism of action. It has been found that the complicated process of T cell differentiation is not affected by a single hormone, but that it is advantageous for therapeutic application to use a whole group of biologically active peptides from the thymus. This is the only way to restore impaired immune function.
Nejlépe prostudovanou a klinicky nejvíce používanou skupinou thymových hormonů je thymosin frakce 5. Pojmem ” thymosin frakce 5 ” se rozumí skupina biologicky aktivních peptidů, získaná z telecích brzlíků pěti návaznými izolačními stupni. Poprvé připravil tento preparát Goldstein se spolupracovníky (A.L. Goldstein se sp., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972).The best studied and clinically most commonly used group of thymic hormones is thymosin fraction 5. The term "thymosin fraction 5" refers to a group of biologically active peptides derived from calf thymus by five consecutive isolation steps. For the first time, this preparation was prepared by Goldstein and colleagues (A.L. Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972).
V současné klinické praxi se nejčastěji používá thymosin frakce 5, připravovaná postupem dle Hdopera a spolupracovníků (J.A. Hooper, se sp., Ann. N.Y. Acad. Sci. 249. 125, 1975). Podle tohoto postupu se 1,0 kg telecího brzlíku, homogenizovaného ve 3 litrech 0,15 M roztoku chloridu sodného, odstředí při 15000 g a supernatant se za míchání zahřeje na teplotu 80 °C po dobu 15 minut. Sraženina se odfiltruje a filtrát ochlazený na teplotu 4 °C se vkape do 12 litrů acetonu při teplotě -10 °C. Precipitát se zachytí na nuči, promyje zchlazeným acetonem a suší za sníženého tlaku. Získaný bílý prášek se rozpustí v 10 dílech 0,1 M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0 a za teploty 20 až 30 °G se míchá 1 hodinu. Nerozpuštěný zbytek se odstředí při 15000 g a koncentrace bílkovin v supernatantu se upraví fosfátovým pufrem naIn current clinical practice, thymosin fraction 5, prepared by the method of Hdoper and co-workers (J.A. Hooper, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 249. 125, 1975), is most commonly used. According to this procedure, 1.0 kg of calf thymus homogenized in 3 liters of 0.15 M sodium chloride solution is centrifuged at 15000 g and the supernatant is heated to 80 ° C with stirring for 15 minutes. The precipitate was filtered off and the filtrate cooled to 4 ° C was added dropwise to 12 liters of acetone at -10 ° C. The precipitate is collected on suction, washed with cooled acetone and dried under reduced pressure. The white powder obtained was dissolved in 10 parts of 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 and stirred at 20-30 ° C for 1 hour. The undissolved residue is centrifuged at 15000 g and the protein concentration in the supernatant is adjusted to phosphate buffer to
- 2 - 250 831 hodnotu 25 mg/ml. Na každých 100 ml roztoku se přidá 33,3 ml nasyceného roztoku síranu amonného a směs se míchá při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny. Vzniklá sraženina se odstředí při 15000 g, pH supernatantu se upraví kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0 a na každých 100 ml roztoku se přidá ještě 14,6 g pevného síranu amonného. Směs se opět míchá při 4 °C po dobu 1 hodiny. Sraženina se odstředí při 15000 g a sediment aktivních peptidů se rozpustí v 0,01 M tris(hydroxymethyl)-aminomethanovém pufru (dále TRIS-pufru) o hodnotě pH 8,0 na koncentraci 10 mg/ ml. Roztok se ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10000, zahustí odpařením za sníženého tlaku a odsolí na dextranovém gelu. Aktivní peptidy, které se eluují v oblasti V , se koncentrují částečným odpařením a lyofilizují.- 2 - 250 831 25 mg / ml. For each 100 ml of the solution, 33.3 ml of saturated ammonium sulfate solution is added and the mixture is stirred at 4 ° C for 1 hour. The precipitate formed is centrifuged at 15000 g, the pH of the supernatant is adjusted to pH 4.0 with acetic acid and 14.6 g of solid ammonium sulfate are added for each 100 ml of solution. The mixture was again stirred at 4 ° C for 1 hour. The precipitate is centrifuged at 15,000 g and the sediment of active peptides is dissolved in 0.01 M Tris (hydroxymethyl) -aminomethane buffer (TRIS buffer) pH 8.0 to a concentration of 10 mg / ml. The solution is ultrafiltered through a 10000 elimination membrane, concentrated by evaporation under reduced pressure, and desalted on a dextran gel. Active peptides that elute in the V region are concentrated by partial evaporation and lyophilized.
Ve snaze převést izolaci thymosinu frakce 5 do výrobního měřítka byl postup dle Hoopera upraven ve fázi tepelné denaturace balastních bílkovin. Podle patentového spisu USA č.· 4128637 je rozemletý brzlík extrahoval roztokem chloridu sodného a po oddělení rozdrcené tkáně jsou balastní bílkoviny v extraktu sráženy vháněním páry. Další patentový spis USA č. 4082737 se týká odstraňování endotoxinů a pyrogenů z thymosinu frakce 5 ultrafiltraci přes membránu s vylučovacím limitem 10000.In an attempt to convert the isolation of thymosin fraction 5 to production scale, the Hooper procedure was modified in the thermal denaturation phase of ballast proteins. According to US Patent No. 4128637, the ground thymus is extracted with sodium chloride solution, and after separation of the crushed tissue, the ballast proteins in the extract are precipitated by steam injection. Another U.S. Pat. No. 4,082,737 relates to the removal of endotoxins and pyrogens from thymosin fraction 5 by ultrafiltration through a membrane with an exclusion limit of 10,000.
Popsané izolační postupy (viz Schéma I) charakterizují současný stav techniky přípravy thymosinu frakce 5. Jejich společnou nevýhodou je obtížná realizace ve výrobě. Již v první fázi je nutné oddělovat rozrušenou brzlíkovou tkáň od roztoku odstředěním za vysokých hodnot tíhového zrychlení nebo filtrací, která je vždy velmi obtížná. Dále je nezbytné používat velkého objemu acetonu - až 15 litrů na 1 kg brzlíku - a navíc je nutno srážet aktivní peptidy při nízké teplotě, minimálně - 10 °G. Též oddělování acetonové sraženiny filtrací bývá obtz V z ízne,The isolation procedures described (see Scheme I) characterize the current state of the art for the preparation of thymosin fraction 5. Their common disadvantage is their difficult implementation in production. Already in the first phase, it is necessary to separate the disturbed thymus tissue from the solution by centrifugation at high gravity acceleration values or by filtration, which is always very difficult. Furthermore, it is necessary to use a large volume of acetone - up to 15 liters per 1 kg of thymus - and in addition it is necessary to precipitate active peptides at a low temperature of at least -10 ° C. Separation of the acetone precipitate by filtration is also difficult to
Thymosin frakce 5 připravený popsanými způsoby obsahuje vedle malého množství'štěpů nukleových kyselin kolem 30 peptidů (thymosinů) o molekulové hmotnosti do 15000 s isoelektrickými body v rozmezí hodnot pH 3,5 až 7,5, působících v různém stádiu diferenciace T lymfocytů, a jednu neúčinnou složku s isoelektrickým bodem o hodnotě pH 6,7, nazvanou polypeptid/3^.Thymosin fraction 5 prepared by the disclosed methods comprises, in addition to a small amount of nucleic acid grafts, about 30 peptides (thymosins) of molecular weight up to 15000 with isoelectric points in the pH range of 3.5 to 7.5 acting at different stages of T cell differentiation, and one an inactive component with an isoelectric point having a pH of 6.7, called the β 3 polypeptide.
250 031250 031
- 3 Uvedené nevýhody odstraňuje způsob přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní současně. Poté se přímým vysolením filtrátu síranem amonným izolují imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5, přičemž se neúčinný polypeptid /3^ zachytí na slabě kyselém katexu v prostředí těkavého pufru a takto získaný roztok imunomodulační ch peptidů thymosinu frakce 5 se přímo lyofilizuje.The above disadvantages are overcome by the process for the preparation of the immunomodulatory peptides of thymosin fraction 5 by the method according to the invention, which consists in the removal of thymus tissue residues and ballast proteins simultaneously. Thereafter, the immunomodulatory peptides of thymosin fraction 5 are isolated by direct salting out of the filtrate with ammonium sulfate, whereby the inactive polypeptide (33) is captured on a weakly acid cation exchange resin in a volatile buffer medium and the thus obtained thymosin thymosin peptide fraction 5 solution is directly lyophilized.
Způsob podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní filtrací po zahřátí homogenizátu.The method according to the invention is further characterized in that thymus residues and ballast proteins are removed by filtration after heating the homogenate.
Způsob podle vynálezu se ještě vyznačuje tím, že se zachycení neúčinného polypeptidu/3^ provede v těkavém pufru při hodnotě pH 5,0 až 7,0.The method of the invention is further characterized in that capture of the inactive polypeptide (3) is carried out in a volatile buffer at a pH of 5.0 to 7.0.
Způsob podle vynálezu se provádí tak, že-se balastní bílkoviny denaturují zahřátím zhomogenizované suspenze brzlíkové tkáně v roztoku chloridu sodného. Tím se eliminuje první nesnadný krok, představovaný vysokootáčkovým odstředěním nebo filtrací rozrušené brzlíkové tkáně od solného extraktu. Zbytky brzlíku jsou totiž gelovité konzistence a špatně se oddělují od kapalné fáze. Postupem podle vynálezu se vysrážené bílkoviny i tepelně zpracovaná brzlíková tkáň získají v jednom izolačním kroku ve velmi snadno filtrovatelné formě.The process according to the invention is carried out by denaturing ballast proteins by heating the homogenized thymus suspension in sodium chloride solution. This eliminates the first difficult step of high-speed centrifugation or filtration of disrupted thymus tissue from the saline extract. The thymus residues are of gel-like consistency and are difficult to separate from the liquid phase. In the process according to the invention, the precipitated proteins and the heat-treated thymus tissue are obtained in a single isolation step in a very easily filterable form.
Biologicky aktivní peptidy přítomné ve filtrátu, získaném po odstranění denáturováných balastních bílkovin a brzlíkové tkáně, se přímo vysolí síranem amonným s výhodou ve dvou stupních, to jest při 25% a 50% nasycení roztoku. Tím se vyloučí srážení aktivních složek acetonem, aniž by se změnilo složení konečného produktu.The biologically active peptides present in the filtrate obtained after removal of denatured ballast proteins and thymus tissue are directly salted out with ammonium sulfate, preferably in two stages, i.e. at 25% and 50% saturation of the solution. This avoids precipitation of the active ingredients with acetone without changing the composition of the final product.
Neúčinný polypeptid /3^, přítomný vždy v produktech připravených dosud popsanými postupy, snižuje účinnost thymosinu frakce 5. Postupem podle vynálezu se odstraní tato neúčinná složka průtokem odsoleného ultrafiltrátu, upraveného octanem amonným nebo jiným těkavým pufrem na hodnotu pH 5,0 až 7,0, přes sloupec Sephadexu CM 25 nebo jiného slabě kyselého katexu který je v rovnováze s uvedeným pufrem. V tomto procesu procházejí aktivní peptidy frakce 5 kolonou a mohou být přímoThe inactive polypeptide (?), Always present in the products prepared by the previously described methods, reduces the efficacy of thymosin fraction 5. In accordance with the invention, this inactive component is removed by flow-through desalted ultrafiltrate treated with ammonium acetate or other volatile buffer to pH 5.0 to 7.0 through a column of Sephadex CM 25 or another weakly acid cation exchanger that is in equilibrium with said buffer. In this process, the active peptides of fraction 5 pass through the column and can be directly
250 B31250 B31
- 4 lyófilizovány. Polypeptid/3^ se na katexu zachytí a je možno jej vymýt zvýšením hodnoty pH elučního roztoku.- 4 lyophilized. The [beta] 3 polypeptide is retained on the cation exchanger and can be eluted by increasing the pH of the elution solution.
Hlavní výhody postupu podle vynálezu spočívají ve zjednodušení techniky izolace peptidů thymosinové frakce 5. Tepelné zpracování brzlíkového homogenizátu se současnou koagulací zbytků tkáně a balastních bílkovin umožňuje na rozdíl od dosavadních postupů filtraci na běžném zařízení. Přímé vysolení imunomodulačních peptidů z filtrátu získaného po oddělení brzlíkové tkáně a denaturátu odstraňuje nutnost srážení značnými objemy zchlazeného acetonu při teplotách - 10 až - 20 °C. Tato zjednodušení podstatně usnadňují převedení izolačníhů postupu do výrobního měřítka po technologické stránce, přinášejí úsporu surovin a energií a v neposlední řadě též zvyšují bezpečnost práce. Dále se získá účinnější produkt, který je zbaven inaktivního polypept idu/3^.The main advantages of the process according to the invention reside in the simplification of the technique for the isolation of the thymosin fraction 5 peptides. The heat treatment of the thymus homogenate with the coagulation of tissue residues and ballast proteins allows filtration on a conventional device. Direct salting out of immunomodulatory peptides from the filtrate obtained after separation of the thymus tissue and denaturate eliminates the need for coagulation with significant volumes of chilled acetone at temperatures of - 10 to - 20 ° C. These simplifications make it much easier to translate the insulation process to production scale in terms of technology, saving raw materials and energy and, last but not least, increasing work safety. Further, a more efficient product is obtained which is devoid of the inactive [beta] 3 polypeptide.
V dalším je vynález blíže objasněn jednak příklady provedení, aniž by se jimi omezoval, a jednak Schématem II.In the following, the invention is illustrated in more detail by way of non-limiting examples and by Scheme II.
Příklad 1Example 1
Navážka 1,0 kg telecího brzlíku se zhomogenizuje ve 3,0 litrech 0,15 14 roztoku-chloridu sodného. Suspenze se vloží do vroucí vodní lázně a za míchání se udržuje při vnitřní teplotě 80 °G po dobu 15 minut. Vzniklá voluminézní sraženina se zfiltruje přes papírový filtr, Filtrát ochlazený na teplotu 4 °G se vkape za vydatného míchání do 12,0 litrů acetonu, chlazeného na teplotu - 10 °C. Sraženina se odsaje na nuči přes papír, promyje 4x 250 ml zchlazeného acetonu a vysuší se ve vakuu. Vysušená sraženina se rozpustí v 10 dílech 0,01 M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0 za míchání při teplotě 20 až 25 °C po dobu 1 hodiny. Nerozpuštěný zbytek se odstředí při 10000 g a koncentrace bílkovin v supernatantu se upraví fosfátovým pufrem na 25 mg/ml. Poté se na každých 100 ml roztoku přidá 33,3 ml nasyceného roztoku síranu amonného a směs se míchá při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny. Po odstředění vzniklé sraženiny při 10000 g se kyselost supernatantu upraví na hodnotu pH 4,0 10% kyselinou octovou. Na každých 100 ml roztoku se přidá ještě 14,6 g pevného síranu amonného a suspenze se opět míchá při teplotě 4 °G po dobu 1 hodiny. Sraženina se odstředí při 10000 g a sediment se rozpustí v 0,01 M TRIS-pufru o hodnotěWeigh 1.0 kg of calf thymus and homogenize in 3.0 liters of 0.15 l sodium chloride solution. The suspension is placed in a boiling water bath and kept under stirring at an internal temperature of 80 ° C for 15 minutes. The resulting voluminous precipitate was filtered through a paper filter. The filtrate cooled to 4 ° C was added dropwise with vigorous stirring to 12.0 liters of acetone cooled to -10 ° C. The precipitate is suction filtered on paper, washed 4 times with 250 ml of cooled acetone and dried under vacuum. The dried precipitate was dissolved in 10 parts of 0.01 M phosphate buffer pH 7.0 with stirring at 20-25 ° C for 1 hour. The undissolved residue is centrifuged at 10,000 g and the protein concentration in the supernatant is adjusted to 25 mg / ml with phosphate buffer. Then, for each 100 ml of the solution, 33.3 ml of saturated ammonium sulfate solution are added and the mixture is stirred at 4 ° C for 1 hour. After centrifugation of the resulting precipitate at 10,000 g, the acidity of the supernatant was adjusted to pH 4.0 with 10% acetic acid. 14.6 g of solid ammonium sulfate are added for each 100 ml of solution and the suspension is again stirred at 4 DEG C. for 1 hour. The precipitate is centrifuged at 10,000 g and the sediment is dissolved in 0.01 M TRIS-buffer
250 831250 831
- 5 pH 8,0 na koncentraci bílkovin 10 mg/ml. Roztok se ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10000, zahustí lyofilizací a odsolí na dextranovém gelu. Imunomodulační peptidy, které se eluují v oblasti VQ, se lyofilizují.- 5 pH 8.0 to a protein concentration of 10 mg / ml. The solution is ultrafiltered through a 10000 exclusion membrane, concentrated by lyophilization and desalted on a dextran gel. Immunomodulatory peptides which elute in V Q lyophilized.
Výtěžek s 100 až 150 mg peptidů thymosinu frakce 5.Yield with 100-150 mg thymosin peptides of fraction 5.
Příklad 2Example 2
Navážka 1,0 kg telecího brzlíku se zhomogenizuje ve 3,0 litrech 0,15 M roztoku chloridu sodného. Suspenze se odstře dí při 15000 g a supernatant, oddělený od zbytků brzlíkové tkáně, se zahřeje na 80 °C po dobu 15 minut. Vzniklá sraženina se zfiltruje přes papírový filtr. K filtrátu se přidá takové množství pevného síranu amonného, aby bylo dosaženo 25 % nasycení, a míchá se při 4 °G po dobu 1 hodiny. Po odstředění vzniklé sraženiny při 10000 g se supernatant okyselí 10% kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0. K zakalenému roztoku se přidá další pevný síran amonný do dosažení 50 % nasycení a suspenze se opět míchá 1 hodinu při teplotě 4 °G. Sraženina získaná odstředěním při 10000 g se rozpustí v 10 dílech 0,01 M TRIS-pufru o hodnotě pH 8,0 a ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10000. Ultrafiltrát se zahustí lyofilizací a odsolí na dextranovém gelu. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5, eluované v oblasti VQ, se lyofilizují.The 1.0 kg portion of the calf thymus is homogenized in 3.0 liters of 0.15 M sodium chloride solution. The suspension is centrifuged at 15,000 g and the supernatant, separated from thymus residues, is heated to 80 ° C for 15 minutes. The resulting precipitate was filtered through a paper filter. To the filtrate was added solid ammonium sulfate to 25% saturation and stirred at 4 ° C for 1 hour. After centrifuging the resulting precipitate at 10,000 g, the supernatant was acidified with 10% acetic acid to pH 4.0. Additional solid ammonium sulfate was added to the cloudy solution to 50% saturation and the suspension was again stirred at 4 ° C for 1 hour. The precipitate obtained by centrifugation at 10000 g is dissolved in 10 parts of 0.01 M TRIS buffer, pH 8.0, and ultrafiltered through a membrane with an exclusion limit of 10000. The ultrafiltrate is concentrated by lyophilization and desalted on a dextran gel. Immunomodulatory peptides, thymosin fraction 5 eluted in zone V Q lyophilized.
Výtěžek : 100 až 150 mg peptidů thymosinu frakce 5.Yield: 100 to 150 mg of thymosin peptides of fraction 5.
Příklad 3Example 3
Ultrafiltrát obsahující thymosin frakci 5, připravený postupem podle příkladu 1 nebo 2, se po odsolení na dextranovém gelu ještě dále přečistí. Jeho pH se upraví octanem amonným na hodnotu pH 5,0 až 7,0 a roztok se přivede na sloupec slabě kyselého katexu na dextranové basi, promytého předtím 0,1 M roztokem octanu amonného stejné hodnoty pH. Biologicky aktivní peptidy (thymosiny) se eluují z kolony v oblasti VQ jako jediný pík a lze je přímo lyofilizovat. Polypeptid/3^ a látky s isoélektrickým bodem nad hodnotu pH 7,0 se za těchto podmínek na katexu zachytí a mohou být eluovány zvýšením hodnoty pH pufru na hodnotu 8,0 až 9,0. Tím se zároveň katex regeneruje.The thymosin-containing ultrafiltrate fraction 5, prepared as in Example 1 or 2, is further purified after desalting on a dextran gel. Its pH is adjusted to pH 5.0 to 7.0 with ammonium acetate, and the solution is fed to a weakly acidic cation exchange column on a dextran base, previously washed with 0.1 M ammonium acetate solution of the same pH. Biologically active peptides (thymosins) elute from the column in the V Q region as a single peak and can be directly lyophilized. The polypeptide (3) and substances with an iso-electric point above pH 7.0 are trapped on the cation exchanger under these conditions and can be eluted by increasing the pH of the buffer to 8.0 to 9.0. This also regenerates the cation exchanger.
Čistota získaných imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 byla ověřena a potvrzena analytickou metodou isoelektrické fokusace v rozmezí hodnot pH 3,5 až 9,5 a ultrafialovouThe purity of the obtained fraction 5 thymosin immunomodulatory peptides was verified and confirmed by an isoelectric focusing method in the pH range of 3.5 to 9.5 and ultraviolet
- 6 spektroskopií při 200 až 300 nm.- 6 spectroscopies at 200-300 nm.
250 631250 631
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS866685A CS250631B1 (en) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | Method of fraction 5 thymosin's immunomodulating peptides' preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS866685A CS250631B1 (en) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | Method of fraction 5 thymosin's immunomodulating peptides' preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS250631B1 true CS250631B1 (en) | 1987-04-16 |
Family
ID=5437535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS866685A CS250631B1 (en) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | Method of fraction 5 thymosin's immunomodulating peptides' preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS250631B1 (en) |
-
1985
- 1985-11-29 CS CS866685A patent/CS250631B1/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4619989A (en) | Bone morphogenetic protein composition | |
| US4761471A (en) | Bone morphogenetic protein composition | |
| FI60400C (en) | FOERFARANDE FOER UTVINNING AV ALBUMIN UR BLODPLASMA | |
| US4576696A (en) | Process for the preparation of a biologically active extract | |
| US4301064A (en) | Ubiquitary tissue protein PP8 | |
| US4115375A (en) | Method of isolation and recovery of protein hormones, deriving from pituitary tissues using polyethylene glycol | |
| KR880000465A (en) | Method of making pure albumin | |
| CA2037244C (en) | Method for purifying somatotropin monomers | |
| EP0101063A2 (en) | Polypeptide acting on the immune system, process for isolating and purifying it, its use and composition containing it | |
| SU1367837A3 (en) | Method of producing agent selectively inhibiting growth or reproduction of normal and leukemia cells of myeloids | |
| US3461205A (en) | Process of extracting proteins from potatoes | |
| US4128637A (en) | Process for producing thymosin | |
| CS250631B1 (en) | Method of fraction 5 thymosin's immunomodulating peptides' preparation | |
| US3475402A (en) | Process of extracting proteins from mistle press juice by carrier-free electrophoresis | |
| US4610815A (en) | Process for producing and obtaining anaphylatoxin- and cocytotaxin-containing leucotaxine preparations and of anaphylatoxin and cocytotaxin proteins in molecularly homogeneous, biologically active form | |
| US4430264A (en) | Process for the preparation of a selective anorexogenic substance regulating food intake | |
| JPS6157290B2 (en) | ||
| US4588685A (en) | Process for the preparation of a new-type active substance selectively inhibiting food intake | |
| Lowry et al. | Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones. | |
| SU1127525A3 (en) | Method of isolating albumin | |
| US3201382A (en) | Process for preparing a biochemically active polypeptide from sheep pituitary growthhormone | |
| KR830002718B1 (en) | How to separate and prepare albumin from plasma | |
| CS264100B1 (en) | Process for preparing immunomodulation peptides of thymosine fraction 5 | |
| CA1101331A (en) | Process for producing thymosin | |
| SU1243730A1 (en) | Method of extracting immunodepressor from tissue of mammalia |