CS250631B1

CS250631B1 - Způsob přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5

Info

Publication number: CS250631B1
Application number: CS866685A
Authority: CS
Inventors: Jan Rahm; Jirina Dlouha; Josef Richter; Vladimir Prochazka
Original assignee: Jan Rahm; Jirina Dlouha; Josef Richter; Vladimir Prochazka
Priority date: 1985-11-29
Filing date: 1985-11-29
Publication date: 1987-04-16

Abstract

Řeší se příprava imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 zjednodušením jejich izolace, která spočívá v současném odstranění zbytků brzlíkovó tkáně a balastních bílkovin zahřátím homogenizátu z telecích brfclíků. Tím se umožní snadná flltrovatelnost získané suspenze, načež se ve filtrátu přímo provede vysolení síranem amonným. Z izolovaného thymosinu frakce 5 se odstraní neúčinný polypeptid /5 χ zachycením na slabě kyselém katexu v prostředí těkavého pufru. Získané biologicky aktivní peptidy lze přímo lyofilizovat. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5 slouží k obnově a úpravě imunitní odpovědi organismu.

Description

Způsob přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5

(51) Int. Cl.*

C 07 K 1/14

250 631

250 031

Vynález se týká způsobu přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5.

Brzlík (thymus) vylučuje skupinu peptidů - thymových hormonů - které umožňují dozrávání a diferenciaci T lymfocytů v imunokompetentní buňky a tím zodpovídá za správnou funkci imunitního systému. V posledních patnácti letech byla izolována a chemicky definována řada individuálních hormonů thymu a u některých z nich byl určen i mechanismus účinku. Bylo zjištěno, že na komplikovaný proces diferenciace T lymfocytů nepůsobí jediný hormon, ale že je pro terapeutickou aplikaci výhodné používat celou skupinu biologicky aktivních peptidů z thymu. Jen tak je možné obnovit porušenou imunitní funkci organismu.

Nejlépe prostudovanou a klinicky nejvíce používanou skupinou thymových hormonů je thymosin frakce 5. Pojmem ” thymosin frakce 5 ” se rozumí skupina biologicky aktivních peptidů, získaná z telecích brzlíků pěti návaznými izolačními stupni. Poprvé připravil tento preparát Goldstein se spolupracovníky (A.L. Goldstein se sp., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972).

V současné klinické praxi se nejčastěji používá thymosin frakce 5, připravovaná postupem dle Hdopera a spolupracovníků (J.A. Hooper, se sp., Ann. N.Y. Acad. Sci. 249. 125, 1975). Podle tohoto postupu se 1,0 kg telecího brzlíku, homogenizovaného ve 3 litrech 0,15 M roztoku chloridu sodného, odstředí při 15000 g a supernatant se za míchání zahřeje na teplotu 80 °C po dobu 15 minut. Sraženina se odfiltruje a filtrát ochlazený na teplotu 4 °C se vkape do 12 litrů acetonu při teplotě -10 °C. Precipitát se zachytí na nuči, promyje zchlazeným acetonem a suší za sníženého tlaku. Získaný bílý prášek se rozpustí v 10 dílech 0,1 M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0 a za teploty 20 až 30 °G se míchá 1 hodinu. Nerozpuštěný zbytek se odstředí při 15000 g a koncentrace bílkovin v supernatantu se upraví fosfátovým pufrem na

- 2 - ^{250 831}hodnotu 25 mg/ml. Na každých 100 ml roztoku se přidá 33,3 ml nasyceného roztoku síranu amonného a směs se míchá při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny. Vzniklá sraženina se odstředí při 15000 g, pH supernatantu se upraví kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0 a na každých 100 ml roztoku se přidá ještě 14,6 g pevného síranu amonného. Směs se opět míchá při 4 °C po dobu 1 hodiny. Sraženina se odstředí při 15000 g a sediment aktivních peptidů se rozpustí v 0,01 M tris(hydroxymethyl)-aminomethanovém pufru (dále TRIS-pufru) o hodnotě pH 8,0 na koncentraci 10 mg/ ml. Roztok se ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10000, zahustí odpařením za sníženého tlaku a odsolí na dextranovém gelu. Aktivní peptidy, které se eluují v oblasti V , se koncentrují částečným odpařením a lyofilizují.

Ve snaze převést izolaci thymosinu frakce 5 do výrobního měřítka byl postup dle Hoopera upraven ve fázi tepelné denaturace balastních bílkovin. Podle patentového spisu USA č.· 4128637 je rozemletý brzlík extrahoval roztokem chloridu sodného a po oddělení rozdrcené tkáně jsou balastní bílkoviny v extraktu sráženy vháněním páry. Další patentový spis USA č. 4082737 se týká odstraňování endotoxinů a pyrogenů z thymosinu frakce 5 ultrafiltraci přes membránu s vylučovacím limitem 10000.

Popsané izolační postupy (viz Schéma I) charakterizují současný stav techniky přípravy thymosinu frakce 5. Jejich společnou nevýhodou je obtížná realizace ve výrobě. Již v první fázi je nutné oddělovat rozrušenou brzlíkovou tkáň od roztoku odstředěním za vysokých hodnot tíhového zrychlení nebo filtrací, která je vždy velmi obtížná. Dále je nezbytné používat velkého objemu acetonu - až 15 litrů na 1 kg brzlíku - a navíc je nutno srážet aktivní peptidy při nízké teplotě, minimálně - 10 °G. Též oddělování acetonové sraženiny filtrací bývá obtz V z ízne,

Thymosin frakce 5 připravený popsanými způsoby obsahuje vedle malého množství'štěpů nukleových kyselin kolem 30 peptidů (thymosinů) o molekulové hmotnosti do 15000 s isoelektrickými body v rozmezí hodnot pH 3,5 až 7,5, působících v různém stádiu diferenciace T lymfocytů, a jednu neúčinnou složku s isoelektrickým bodem o hodnotě pH 6,7, nazvanou polypeptid/3^.

250 031

- 3 Uvedené nevýhody odstraňuje způsob přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní současně. Poté se přímým vysolením filtrátu síranem amonným izolují imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5, přičemž se neúčinný polypeptid /3^ zachytí na slabě kyselém katexu v prostředí těkavého pufru a takto získaný roztok imunomodulační ch peptidů thymosinu frakce 5 se přímo lyofilizuje.

Způsob podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní filtrací po zahřátí homogenizátu.

Způsob podle vynálezu se ještě vyznačuje tím, že se zachycení neúčinného polypeptidu/3^ provede v těkavém pufru při hodnotě pH 5,0 až 7,0.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že-se balastní bílkoviny denaturují zahřátím zhomogenizované suspenze brzlíkové tkáně v roztoku chloridu sodného. Tím se eliminuje první nesnadný krok, představovaný vysokootáčkovým odstředěním nebo filtrací rozrušené brzlíkové tkáně od solného extraktu. Zbytky brzlíku jsou totiž gelovité konzistence a špatně se oddělují od kapalné fáze. Postupem podle vynálezu se vysrážené bílkoviny i tepelně zpracovaná brzlíková tkáň získají v jednom izolačním kroku ve velmi snadno filtrovatelné formě.

Biologicky aktivní peptidy přítomné ve filtrátu, získaném po odstranění denáturováných balastních bílkovin a brzlíkové tkáně, se přímo vysolí síranem amonným s výhodou ve dvou stupních, to jest při 25% a 50% nasycení roztoku. Tím se vyloučí srážení aktivních složek acetonem, aniž by se změnilo složení konečného produktu.

Neúčinný polypeptid /3^, přítomný vždy v produktech připravených dosud popsanými postupy, snižuje účinnost thymosinu frakce 5. Postupem podle vynálezu se odstraní tato neúčinná složka průtokem odsoleného ultrafiltrátu, upraveného octanem amonným nebo jiným těkavým pufrem na hodnotu pH 5,0 až 7,0, přes sloupec Sephadexu CM 25 nebo jiného slabě kyselého katexu který je v rovnováze s uvedeným pufrem. V tomto procesu procházejí aktivní peptidy frakce 5 kolonou a mohou být přímo

250 B31

- 4 lyófilizovány. Polypeptid/3^ se na katexu zachytí a je možno jej vymýt zvýšením hodnoty pH elučního roztoku.

Hlavní výhody postupu podle vynálezu spočívají ve zjednodušení techniky izolace peptidů thymosinové frakce 5. Tepelné zpracování brzlíkového homogenizátu se současnou koagulací zbytků tkáně a balastních bílkovin umožňuje na rozdíl od dosavadních postupů filtraci na běžném zařízení. Přímé vysolení imunomodulačních peptidů z filtrátu získaného po oddělení brzlíkové tkáně a denaturátu odstraňuje nutnost srážení značnými objemy zchlazeného acetonu při teplotách - 10 až - 20 °C. Tato zjednodušení podstatně usnadňují převedení izolačníhů postupu do výrobního měřítka po technologické stránce, přinášejí úsporu surovin a energií a v neposlední řadě též zvyšují bezpečnost práce. Dále se získá účinnější produkt, který je zbaven inaktivního polypept idu/3^.

V dalším je vynález blíže objasněn jednak příklady provedení, aniž by se jimi omezoval, a jednak Schématem II.

Příklad 1

Navážka 1,0 kg telecího brzlíku se zhomogenizuje ve 3,0 litrech 0,15 14 roztoku-chloridu sodného. Suspenze se vloží do vroucí vodní lázně a za míchání se udržuje při vnitřní teplotě 80 °G po dobu 15 minut. Vzniklá voluminézní sraženina se zfiltruje přes papírový filtr, Filtrát ochlazený na teplotu 4 °G se vkape za vydatného míchání do 12,0 litrů acetonu, chlazeného na teplotu - 10 °C. Sraženina se odsaje na nuči přes papír, promyje 4x 250 ml zchlazeného acetonu a vysuší se ve vakuu. Vysušená sraženina se rozpustí v 10 dílech 0,01 M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,0 za míchání při teplotě 20 až 25 °C po dobu 1 hodiny. Nerozpuštěný zbytek se odstředí při 10000 g a koncentrace bílkovin v supernatantu se upraví fosfátovým pufrem na 25 mg/ml. Poté se na každých 100 ml roztoku přidá 33,3 ml nasyceného roztoku síranu amonného a směs se míchá při teplotě 4 °C po dobu 1 hodiny. Po odstředění vzniklé sraženiny při 10000 g se kyselost supernatantu upraví na hodnotu pH 4,0 10% kyselinou octovou. Na každých 100 ml roztoku se přidá ještě 14,6 g pevného síranu amonného a suspenze se opět míchá při teplotě 4 °G po dobu 1 hodiny. Sraženina se odstředí při 10000 g a sediment se rozpustí v 0,01 M TRIS-pufru o hodnotě

250 831

- 5 pH 8,0 na koncentraci bílkovin 10 mg/ml. Roztok se ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10000, zahustí lyofilizací a odsolí na dextranovém gelu. Imunomodulační peptidy, které se eluují v oblasti V_Q, se lyofilizují.

Výtěžek s 100 až 150 mg peptidů thymosinu frakce 5.

Příklad 2

Navážka 1,0 kg telecího brzlíku se zhomogenizuje ve 3,0 litrech 0,15 M roztoku chloridu sodného. Suspenze se odstře dí při 15000 g a supernatant, oddělený od zbytků brzlíkové tkáně, se zahřeje na 80 °C po dobu 15 minut. Vzniklá sraženina se zfiltruje přes papírový filtr. K filtrátu se přidá takové množství pevného síranu amonného, aby bylo dosaženo 25 % nasycení, a míchá se při 4 °G po dobu 1 hodiny. Po odstředění vzniklé sraženiny při 10000 g se supernatant okyselí 10% kyselinou octovou na hodnotu pH 4,0. K zakalenému roztoku se přidá další pevný síran amonný do dosažení 50 % nasycení a suspenze se opět míchá 1 hodinu při teplotě 4 °G. Sraženina získaná odstředěním při 10000 g se rozpustí v 10 dílech 0,01 M TRIS-pufru o hodnotě pH 8,0 a ultrafiltruje přes membránu s vylučovacím limitem 10000. Ultrafiltrát se zahustí lyofilizací a odsolí na dextranovém gelu. Imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5, eluované v oblasti V_Q, se lyofilizují.

Výtěžek : 100 až 150 mg peptidů thymosinu frakce 5.

Příklad 3

Ultrafiltrát obsahující thymosin frakci 5, připravený postupem podle příkladu 1 nebo 2, se po odsolení na dextranovém gelu ještě dále přečistí. Jeho pH se upraví octanem amonným na hodnotu pH 5,0 až 7,0 a roztok se přivede na sloupec slabě kyselého katexu na dextranové basi, promytého předtím 0,1 M roztokem octanu amonného stejné hodnoty pH. Biologicky aktivní peptidy (thymosiny) se eluují z kolony v oblasti V_Q jako jediný pík a lze je přímo lyofilizovat. Polypeptid/3^ a látky s isoélektrickým bodem nad hodnotu pH 7,0 se za těchto podmínek na katexu zachytí a mohou být eluovány zvýšením hodnoty pH pufru na hodnotu 8,0 až 9,0. Tím se zároveň katex regeneruje.

Čistota získaných imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 byla ověřena a potvrzena analytickou metodou isoelektrické fokusace v rozmezí hodnot pH 3,5 až 9,5 a ultrafialovou

- 6 spektroskopií při 200 až 300 nm.

250 631

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob přípravy imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5, získávané z homogenizátu telecích brzlíků po tepelné denaturaci a vysrážení balastních bílkovin další frakcionací biologicky aktivních peptidů, obsažených v od děleném extraktu, vyznačující se tím, že se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní současně, poté se přímým vysolením filtrátu síranem amonným izolují imunomodulační peptidy thymosinu frakce 5, přičemž se neúčin ný polypeptid/3^ zachytí na slabě kyselém katexu v prostředí těkavého pufru a získaný roztok imunomodulačních peptidů thymosinu frakce 5 se přímo lyofilizuje.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se zbytky brzlíkové tkáně a balastní bílkoviny odstraní filtrací po zahřátí homogenizátu.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se zachycení neúčinného polypeptidu/3-j provede v těkavém pufru při hodnotě pH 5,0 až 7,0.