CN117511910A - 一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶学技术领域，公开了一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，包括以下步骤：步骤一，从家畜小肠粘膜中获取原始提取物，并进行清洗和消毒处理；步骤二，在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的原始提取物样品与提取缓冲液混合，然后进行匀浆处理。通过清洗和消毒处理，可以有效地去除样品中的杂质和细菌，保证提取物的纯度和安全性，在冰浴条件下进行匀浆处理，可以保持样品的活性，避免高温对酶的影响，酸碱调整可以保证提取物的稳定性，使其适用于不同的实验条件和需求，采用离心、微滤、超滤和混合使用的分离和过滤方法，可以有效地去除悬浮物，提高提取物的纯度和质量。
Description
技术领域
本发明涉及酶学技术领域，具体为一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法。
背景技术
家畜小肠粘膜是指动物的小肠内壁的一层黏膜组织。它具有重要的生理功能，包括吸收营养物质、分泌消化液和调节肠道菌群，在实验室研究中，家畜小肠粘膜可以作为一种生物材料来提取和分析其中的酶类物质。例如，碱性磷酸酶就是一种常见的家畜小肠粘膜酶类物质，它参与了钙离子的代谢和骨骼的形成等生理过程。因此，通过提取和纯化家畜小肠粘膜中的碱性磷酸酶，可以用于研究其结构、功能和调控机制等方面的问题。
碱性磷酸酶是一种广泛存在于人体各种组织中的酶类，主要分布在肝脏、骨骼、肾脏、肠道等部位。它是一种重要的生物标志物，可用于诊断和监测多种疾病，如肝胆疾病、骨代谢疾病、肿瘤等，碱性磷酸酶的催化作用是在碱性环境下将磷酸基团从磷酸酯键上转移至另一个分子上，产生游离的磷酸根离子和新的酯化产物。在生物学中，它参与了多种重要的代谢过程，如细胞信号传导、DNA修复、骨骼形成等。
目前，碱性磷酸酶的提取方法主要包括物理法、化学法和生物法等。其中，物理法主要是通过破碎组织样品来释放其中的碱性磷酸酶；化学法则是通过加入沉淀剂使碱性磷酸酶沉淀下来；生物法则是利用特定的微生物或植物提取物来提取碱性磷酸酶。不同的提取方法具有不同的特点和适用范围，需要根据具体的实验目的和条件进行选择。
目前比较常用的碱性磷酸酶提取技术路线如下：新鲜猪(牛)小肠→刮取肠粘膜→加水，匀质→加正丁醇，匀质→离心(9000r/min，20min)→静置分层，取水相上清液→调pH4.9→离心(9000r/min，20min)→取上清液，加NaOH调pH6.5，加5％硫酸铵，加丙酮→静置40min(4℃)，离心(9000r/min，20min)→取上清液加丙酮→静置40min(4℃)，离心(9000r/min，20min)→沉淀→冻干。现有方法需要大量的有机溶剂，在利用正丁醇提取脂肪的过程中碱性磷酸酶还会部分残留在有机溶剂中，提取效果欠佳。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，解决了现有方法需要大量的有机溶剂，在利用正丁醇提取脂肪的过程中碱性磷酸酶还会部分残留在有机溶剂中，提取效果欠佳的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，包括以下步骤：
步骤一，从家畜小肠粘膜中获取原始提取物，并进行清洗和消毒处理；
步骤二，在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的原始提取物样品与提取缓冲液混合，然后进行匀浆处理，将匀浆后的样品离心，收集上清液并采用分离和过滤的方法去除脂肪和其他杂质；
步骤三，将步骤二中的产物进行酸碱调整，使其达到适宜的酸碱度范围；
步骤四，采用离心或过滤的方法，分离和去除悬浮物；
步骤五，将经过酸碱调整和分离的提取物进行浓缩，以得到浓缩提取物；
步骤六，对浓缩提取物进行细提纯，采用柱层析、离子交换层析或逆渗透等方法；
步骤七，对细提纯的提取物进行干燥或冻干处理，以得到最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物。
优选的，步骤二中，所述提取缓冲液包含以下成分：0.05-0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.4-8.0，0.1-0.5MNaCl，0.01-0.1％TritonX-100。
优选的，步骤二中，所述匀浆处理是在冰浴条件下进行，所述离心是在4℃下进行的，离心速度为10000-15000g。
优选的，步骤三中，所述酸碱调整是通过添加酸或碱来实现的，并将酸碱度调整至pH7-9。
优选的，步骤四中，所述分离和过滤的方法包括离心、微滤、超滤和混合使用。
优选的，步骤五中，所述浓缩提取物的方法包括蒸发、超滤、萃取、反渗透、和冷冻干燥。
优选的，步骤六中，所述细提纯方法包括柱层析、逆渗透、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
优选的，步骤七中，所述干燥或冻干处理方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。
优选的，步骤二中，所述的杂质包括蛋白质、核酸、多糖、有机物和无机盐。
本发明提供了一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法。具备以下有益效果：
1、本发明通过清洗和消毒处理，可以有效地去除样品中的杂质和细菌，保证提取物的纯度和安全性。
2、本发明通过在冰浴条件下进行匀浆处理，可以保持样品的活性，避免高温对酶的影响。
3、本发明通过酸碱调整，可以保证提取物的稳定性，使其适用于不同的实验条件和需求。
4、本发明通过采用离心、微滤、超滤和混合使用的分离和过滤方法，可以有效地去除悬浮物，提高提取物的纯度和质量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明实施例提供一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，包括以下步骤：
步骤一，从家畜小肠粘膜中获取原始提取物，并进行清洗和消毒处理；
步骤二，在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的原始提取物样品与提取缓冲液混合，然后进行匀浆处理，将匀浆后的样品离心，收集上清液并采用分离和过滤的方法去除脂肪和其他杂质；
步骤三，将步骤二中的产物进行酸碱调整，使其达到适宜的酸碱度范围；
步骤四，采用离心或过滤的方法，分离和去除悬浮物；
步骤五，将经过酸碱调整和分离的提取物进行浓缩，以得到浓缩提取物；
步骤六，对浓缩提取物进行细提纯，采用柱层析、离子交换层析或逆渗透等方法；
步骤七，对细提纯的提取物进行干燥或冻干处理，以得到最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物。
步骤二中，提取缓冲液包含以下成分：0.05-0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.4-8.0，0.1-0.5MNaCl，0.01-0.1％TritonX-100。
步骤二中，匀浆处理是在冰浴条件下进行，离心是在4℃下进行的，离心速度为10000-15000g。
步骤三中，酸碱调整是通过添加酸或碱来实现的，并将酸碱度调整至pH7-9。
步骤四中，分离和过滤的方法包括离心、微滤、超滤和混合使用。
步骤五中，浓缩提取物的方法包括蒸发、超滤、萃取、反渗透、和冷冻干燥。
步骤六中，细提纯方法包括柱层析、逆渗透、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
步骤七中，干燥或冻干处理方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。
步骤二中，的杂质包括蛋白质、核酸、多糖、有机物和无机盐。
实施例二：
本发明实施例提供一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，包括以下步骤：
步骤一，从家畜小肠粘膜中获取原始提取物，并进行清洗和消毒处理；
步骤二，将原始提取物进行酸碱调整，使其达到适宜的酸碱度范围；
步骤三，采用离心或过滤的方法，分离和去除悬浮物；
步骤四，将经过酸碱调整和分离的提取物进行浓缩，以得到浓缩提取物；
步骤五，对浓缩提取物进行细提纯，采用柱层析、离子交换层析或逆渗透等方法；
步骤六，对细提纯的提取物进行干燥或冻干处理，以得到最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物。
步骤二中，酸碱调整是通过添加酸或碱来实现的，并将酸碱度调整至pH7-9。
步骤三中，分离和过滤的方法包括离心、微滤、超滤和混合使用。
步骤四中，浓缩提取物的方法包括蒸发、超滤、萃取、反渗透、和冷冻干燥。
步骤五中，细提纯方法包括柱层析、逆渗透、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
步骤六中，干燥或冻干处理方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。
实施例三：
本发明实施例提供一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，包括以下步骤：
步骤一，从家畜小肠粘膜中获取原始提取物，并进行清洗和消毒处理；
步骤二，在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的原始提取物样品与提取缓冲液混合，然后进行匀浆处理，将匀浆后的样品离心，收集上清液并采用分离和过滤的方法去除脂肪和其他杂质；
步骤三，采用离心或过滤的方法，分离和去除悬浮物；
步骤四，将经过酸碱调整和分离的提取物进行浓缩，以得到浓缩提取物；
步骤五，对浓缩提取物进行细提纯，采用柱层析、离子交换层析或逆渗透等方法；
步骤六，对细提纯的提取物进行干燥或冻干处理，以得到最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物。
步骤二中，提取缓冲液包含以下成分：0.05-0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.4-8.0，0.1-0.5MNaCl，0.01-0.1％TritonX-100。
步骤二中，匀浆处理是在冰浴条件下进行，离心是在4℃下进行的，离心速度为10000-15000g。
步骤三中，分离和过滤的方法包括离心、微滤、超滤和混合使用。
步骤四中，浓缩提取物的方法包括蒸发、超滤、萃取、反渗透、和冷冻干燥。
步骤五中，细提纯方法包括柱层析、逆渗透、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
步骤六中，干燥或冻干处理方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。
步骤二中，的杂质包括蛋白质、核酸、多糖、有机物和无机盐。
实施例四：
本发明实施例提供一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，包括以下步骤：
步骤一，从家畜小肠粘膜中获取原始提取物，并进行清洗和消毒处理；
步骤二，在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的原始提取物样品与提取缓冲液混合，然后进行匀浆处理，将匀浆后的样品离心，收集上清液并采用分离和过滤的方法去除脂肪和其他杂质；
步骤三，将步骤二中的产物进行酸碱调整，使其达到适宜的酸碱度范围；
步骤四，将经过酸碱调整和分离的提取物进行浓缩，以得到浓缩提取物；
步骤五，对浓缩提取物进行细提纯，采用柱层析、离子交换层析或逆渗透等方法；
步骤六，对细提纯的提取物进行干燥或冻干处理，以得到最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物。
步骤二中，提取缓冲液包含以下成分：0.05-0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.4-8.0，0.1-0.5MNaCl，0.01-0.1％TritonX-100。
步骤二中，匀浆处理是在冰浴条件下进行，离心是在4℃下进行的，离心速度为10000-15000g。
步骤三中，酸碱调整是通过添加酸或碱来实现的，并将酸碱度调整至pH7-9。
步骤五中，浓缩提取物的方法包括蒸发、超滤、萃取、反渗透、和冷冻干燥。
步骤六中，细提纯方法包括柱层析、逆渗透、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
步骤七中，干燥或冻干处理方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。
步骤二中，的杂质包括蛋白质、核酸、多糖、有机物和无机盐。
实施例五：
本发明提供了一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，具体步骤如下：
将50克家畜小肠粘膜样品进行清洗和消毒处理，使用无菌水冲洗3次，然后用70％的酒精浸泡10分钟，最后用无菌水冲洗3次；
在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的家畜小肠粘膜样品与250毫升提取缓冲液混合，提取缓冲液的成分为0.05MTris-HCl缓冲液，pH 7.4，0.1MNaCl，0.05％ Triton X-100。然后将混合物在冰浴条件下匀浆处理30分钟；
将匀浆后的样品在4℃下以12,000g的速度离心20分钟，收集上清液；
对上清液进行透析处理，使用分子量为4,000的透析袋在4℃下透析2小时，以去除杂质；
将透析后的上清液通过超滤进行浓缩，得到碱性磷酸酶提取物。
实施例六：
本发明提供了一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，具体步骤如下：
将100克家畜小肠粘膜样品进行清洗和消毒处理，使用无菌水冲洗5次，然后用75％的酒精浸泡15分钟，最后用无菌水冲洗5次；
在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的家畜小肠粘膜样品与500毫升提取缓冲液混合，提取缓冲液的成分为0.1M Tris-HCl缓冲液，pH 8.0，0.5MNaCl，0.1％ Triton X-100。然后将混合物在冰浴条件下匀浆处理60分钟；
将匀浆后的样品在4℃下以15,000g的速度离心30分钟，收集上清液；
对上清液进行透析处理，使用分子量为5,000的透析袋在4℃下透析3小时，以去除杂质；
将透析后的上清液通过冷冻干燥进行浓缩，得到碱性磷酸酶提取物。
实施例七：
从猪小肠粘膜中获取原始提取物：
a)将猪小肠粘膜从猪小肠上刮下。
b)将猪小肠粘膜置于含有磷酸缓冲液的离心管中，使用搅拌器搅拌30分钟，以促进酶的释放。
c)将悬浮液离心10分钟，收集上清液作为原始提取物。
粗提纯：
a)将原始提取物通过纱布或滤纸进行过滤，去除大颗粒杂质。
b)将过滤后的提取物离心10分钟，去除悬浮的细小颗粒。
c)将离心后的上清液过滤，使用0.45微米滤膜去除细菌和微粒。
酸碱调整：
a)将粗提纯的提取物加入适量的氢氧化钠溶液，缓慢调节pH值至8。
b)用盐酸或氢氧化钠溶液进行调节，使提取物的酸碱度达到适宜的范围。
分离和去除悬浮物：
a)将酸碱调整后的提取物离心10分钟，以沉淀悬浮物。
b)将上清液转移至新的容器中，避免悬浮物的污染。
浓缩提取物：
a)将获得的上清液置于浓缩器中，进行蒸发浓缩。
b)确保温度和压力适宜，以避免酶活性的损失。
细提纯：
a)将浓缩的提取物加入柱层析柱中，使用离子交换树脂进行层析，去除杂质。
b)选择合适的洗脱缓冲液进行洗脱，收集目标酶的洗脱峰。
干燥或冻干处理：
a)将洗脱得到的目标酶溶液进行冻干处理，以得到干燥的酶粉末。
b)将酶溶液置于低温冷冻干燥机中，使水分蒸发，得到冻干的酶粉末。
最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物：
a)将冻干的酶粉末进行称量和包装，得到最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物。
b)对提取物进行质量检测，包括酶活性、纯度和稳定性等指标。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，从家畜小肠粘膜中获取原始提取物，并进行清洗和消毒处理；
步骤二，在无菌条件下，将经过清洗和消毒处理的原始提取物样品与提取缓冲液混合，然后进行匀浆处理，将匀浆后的样品离心，收集上清液并采用分离和过滤的方法去除脂肪和其他杂质；
步骤三，将步骤二中的产物进行酸碱调整，使其达到适宜的酸碱度范围；
步骤四，采用离心或过滤的方法，分离和去除悬浮物；
步骤五，将经过酸碱调整和分离的提取物进行浓缩，以得到浓缩提取物；
步骤六，对浓缩提取物进行细提纯，采用柱层析、离子交换层析或逆渗透等方法；
步骤七，对细提纯的提取物进行干燥或冻干处理，以得到最终的家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取物。
2.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤二中，所述提取缓冲液包含以下成分：0.05-0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.4-8.0，0.1-0.5MNaCl，0.01-0.1％TritonX-100。
3.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤二中，所述匀浆处理是在冰浴条件下进行，所述离心是在4℃下进行的，离心速度为10000-15000g。
4.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤三中，所述酸碱调整是通过添加酸或碱来实现的，并将酸碱度调整至pH7-9。
5.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤四中，所述分离和过滤的方法包括离心、微滤、超滤和混合使用。
6.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤五中，所述浓缩提取物的方法包括蒸发、超滤、萃取、反渗透、和冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤六中，所述细提纯方法包括柱层析、逆渗透、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
8.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤七中，所述干燥或冻干处理方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥。
9.根据权利要求1所述的一种家畜小肠粘膜碱性磷酸酶提取方法，其特征在于：步骤二中，所述的杂质包括蛋白质、核酸、多糖、有机物和无机盐。
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