SU1243730A1

SU1243730A1 - Способ выделени иммунодепрессора из тканей млекопитающих

Info

Publication number: SU1243730A1
Application number: SU843811502A
Authority: SU
Inventors: Симон Моисеевич Гринберг; Вера Георгиевна Пухальская; Виктор Андреевич Бабичев; Лилиана Станиславовна Толвинская; Инна Борисовна Жукова
Original assignee: Харьковский Научно-Исследовательский Институт Медицинской Радиологии
Priority date: 1984-11-13
Filing date: 1984-11-13
Publication date: 1986-07-15

Description

I

Изобретение относитс -к фармацев- тической промьппленности и касаетс получени биологически активных веществ , обпадаюш фармакологическим действием.

Целью Изобретени вл етс упро- П1;ение способа получени иммунодепрес сора из животного сырь .

Способ осуществл ют следующим обра з.ом.

Исходное сырье (печень, селезенка , тимус, сыворотка крови) гомогенизируют в физиологическом растворе, центрифугируют и супернатант нагревают до 65-80 С дл удалени термола- бильньк белков. Просветленный фильт- рочанием раствор высаливают сульфатом аммони при 60-80% насыщени , преципитат раствор ю г в воде и обезвоживают ацетоном. Полученный на этом этапе норошок-сырец можно хранить продолжительное врем при (+) - (+15)°С. I

На следующем этапе порошок-сырец раствор ют и очищают методом ионно- обменной хроматографии.

Пример, кг печени быка гомогенизируют в 2000 мл физиологического раствора, центрифугируют при lOOOg 15 мин при . Полученный супернатант при перемешивании нагревают до 75°С5 охлаждают до и денатурированные белки отдел ют фильтрованием, К фильтрату добавл ют сульфат аммони до конечной концентрации 50%-ного насыщени и выдержи-. вают на холоде 1 ч. Далее центрифугированием при lOOOg 20 мин удал ют образовавшийс осадок, а к супер- натанту вновь добавл ют сульфат аммо ки до 75%-ного насыщени и оставл ют на холоде 1 ч. Образовавшийс преципитат собирают центрифугированием , раствор ют в 300 мл воды и смешивают с 10 объемами охлажденного до -15°С ацетона. Через ч обрг1- зо вавшийс пре1щпитат отдел ют от растворител фильтрованием под ва- куумоы. Осадок промывают на фильтре в 500 мл охлажденного ацетона. Получают 1,8 г сухого порошка кремо- .вого цвета. Содержание белка (по Лоу ри) 86%, Методом электрофореза на бумаге при стандартных услови х разделени белков сыворотки крови определ ют состав образца. Препарат содержит 5% г альбумин 42,7; альфа- - . rno6yHtJH 8,5f альфа 2-глобулин 10,6

437302

14,8% бела-глобулин 14,8; гамма-глобулин 23,4.

На втором этапе 300 мг препарата (порошка-сырца) раствор ют в 20 мл

5 0,,01М фосфатного буфера, рН 8,15. Полученный раствор нанос т на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной тем же буфером. Размер колонки 20x1,5 см. Колонку про мывают 0,2м фосфатным буфером,

рН 8j, 15, затем 1М раствором NaCi и затем активную фракцию элюируют OjlH.NaOH. Выход белков регистрируют на проточном денситометре.

5 Активную фракцию обессоливают на колонке с сефадексом G-25 и при необходимости лиофильно высушивают. Испытание биологической активности пр епарата провод т методом кального гемолиза в геле на модели первичного иммунного ответа животных . ,Цп этого мьшгам линии СВА ввод т исследуемый препарат внутрибрю- шинно в физиологическом растворе

-5 за сутки до иммунизации. В качестве антиг ена используют 5%-ную взвесь эритроцитов барана. Контрольна группа животных получает объем физиолоческого раствора. На 5-е сут30 ки животных забивают, извлекают селезенки и готов т из них взвесь клеток .

Взвесь клеток от каждой мыши помещают в отдельную пробирку и добав35 л ют туда эритроциты барана до конечной концентрации 5% и 1%-ный раствор агара, приготовленного на солевом растворе Хэнкса и нагретого до 48 С, Содержимое пробирки аеремеши 0 вают и равномерно распредел ют по

поверхности чашки Петри. После застывани агаровой смеси чашки перенос т в термостат на 1,5 ч. Далее в каждую чаишу добавл ют по 2 мл комплемента

ЯР

- морской свинки, разведенного в

10 раз физиологическим раствором, и снова инкубируют в термостате 40 мин. Затем чашки извлекают и подсчитывают зонь лизиса на их поверхности.

50 Перва зона лизиса образуетс одной антителообразующей клеткой (АОК), Общее число антителообразугощих клеток в селезенке к-аждой мьшJИ подсчитываетс с учетом разведени клеточ55 ной взвеси. Например, селезенку мьши гомогенизировали в 2 мл физиологического раствора и в omiT вз ли О, 1 мл, т.е. 1/20 ч. Следовательно, число

3.1243730 .4

зон лизиса на чашке Петри необходи- Результаты нммунодепрессивной ак- мо умножить на 20. Полученные данные тивности образцов пр-иввдены в табли- обрабатьшают статистически.це.

Конт- Физиологичес- 0,5 мл роль кий раствор

пыт 1 Сырец

пыт 2 Препарат

после

i ионнообмен- ной хроматографии

: 2 мг в

0,5 мл физиологического раствора

0,008 мг в 0,5 мл физиологического раствора

Примечание: ЯСК - число дросодержащих клеток

в селезенке, подсчитываетс в камере Гор ева.

35

В предложенном способе сокращение временных и трудовых затрат обусловлено применением низкоскоростного центрифугировани , что. позвол ет использовать роторы с большим рабочим объемом и меньшим временем разгона и остановки, а также отсуствием длительного процесса диализа и возможностью накоплени больших количеств

40

промежуточного продукта-сы в свою очередь позвол ет п хроматографические колонки емкостью и приводит к сокр дозатрат при очистке препа кроме того, заменой гельфи на ионнообменную хроматогр дающую большей емкостью и разделени .

Редактор М. Келемеш

Составитель Л.Шилина Техред М.Моргентал

3735/5

Тираж 660Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г.Ужгород ул.Проектна , 4

41500+ 108+7

+2400.

8000+ 103+8 +210

87±9

4500± 98+11 + 1700

промежуточного продукта-сырца, что в свою очередь позвол ет примен ть хроматографические колонки большей емкостью и приводит к сокращению трудозатрат при очистке препарата, и кроме того, заменой гельфильтрации на ионнообменную хроматографию, обладающую большей емкостью и скоростью разделени .

Корректор М.Максимишинец

Claims

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНОДЕПРЕССОРА ИЗ ТКАНЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ путем гомогенизации ткани с последующим центрифигурованием гомогената, солевым фракционированием супернатанта, хроматографией осадка и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, перед фракционированием супернатант нагревают до. 65-80°С, осаждают ацетоном, а солевое фракционирование проводят при 60-80%.насыщения и хроматографию на ионообменнике.