CS262877B1 - Kmen mikroorganismu Aspergillus niger CCM 8004 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nového kmene Aspergillus niger CCM 8004, který produkuje na jednoduchém definovaném médiu kyselinu glukonovou vysokou rychlostí i stupněm konverze, s minimálním obsahem nežádoucích látek a pigmentů. Kmen. má použití při fermentační produkci kyseliny glukonové.

Description

Vynález se týká nového kmene Aspergillus niger mutant N-XI, který produkuje na jednoduchém minerálním médiu kyselinu glukónovou s vysokou rychlostí produkce i selektivitou, bez významnějších množství zbarvených látek a vykazuje zvýšenou odolnost vůči solím kyseliny glukónové ve fermentačním médiu.

Schopnost kmene Aspergillus niger produkovat kyselinu glukónovou je známá již více než 40 let (líiall, L.L1.: Organic Acids, In Irimary Iroducts of I.íetabolism, Academie Iress, kev/ York 197&). Této vlastnosti je využíváno pri fermentační výrobě kyseliny glukónové, jejich solí a glukono-«T-laktonu. literární údajo uvádějí, že konverze glukózy na kyselinu glukónovou probíhají na vícesložkovém minerálním médiu s přídavkem dalších výživových komponent (kukuřičný výluh, kvasničný autolyzát, atd.), což společně s vyšší koncentrací biomasy (3 až 5 g cuchej váhy na litr) způsobuje, že výsledný produkt obsahuje značné množství balastních látek (složky produkčního media, látky uvolněné z biomasy - pigmenty, sekundárné metabolity, atd.) a klade vyšší ekonomické nároky na získaní vysoce čistého produktu, který je potřebný např. pro farmaceutické, či potravinářské použití, katalogy kultur hub u nás (Catalogue of Cultures, Universita Karlova, Iraha 1276·, Catalogue of Cultur - Yungi Czechoslovak collection of microorganisms,

J.E. lurkyně University, Jrno 1S&2) uvádějí druh Aspergillus niger bez vlastnosti vysoce selektivně produkovat kyselinu glukónovou. U nás nejsou k dispozici vysokoprodukční kmeny hub, které by byly schopné vysoce selektivní produkce kyseliny glukónové.

- 2 282 877

Uvedený nedostatek odstraňuje vynález, kterým je nový kmen mikroorganismu Aspergillus niger mutant N-XI. Kmen je uložený v československé sbírce mikroorganismů'University J.E. Purkyně v Srně (Třída Obránců míru) pod označením CCM 8004. Nový kmen byl získaný tak, že na vodní suspenzi spor Aspergillus niger v koncentraci 10^.spor v jednom mililitru s přídavkem 1% (w/v) Tweenu 80 se působilo ^-zářením po dobu 20 až 30 minut. Suspenze spor byla pak rozlita na sladinový agar a kultivována při 25 až 30°C. Z vysporulované kultury byla připravena suspenze spor, která po vhodném naře· dění byla rozlita na sladinový agar. Jednotlivé vyrostlé kolonie kultury mikroorganismu byly hodnoceny fermentačními zlouškami, jak z hlediska produkce kyseliny glukónové, tak i tolerance na vysoké koncentrace glukonátovýeh solí a tvorby pigmentů. Takto získaný kmen Aspergillus niger eofcant h~kl byl několikrát pasážován na tekuté půdě s vysokým obsahem glukózy a dále uchováván klasickým způsobem. Mezi hlavní přednosti takto vyselektovaného. kmene Aspergillus niger mutant h-kl patří vysoká· rychlost produkce kyseliny glukónové - 1,2 až '1,6 / (hmotnost/objem) utilizovaného sacharidu za hodinu při výtěžcích 94 až 98 / teoretické hodnoty, koncentrace biomasy je však v porovnání s dostupnými literárními údaji (3 až 5g suché hmotnosti mycelia / litr media) podstaně nižší (0,5 až 1,0g na litr media). Tyto hodnoty jsou do nu 3 o cno (λιλοα^θρι definovaném minerálním médiu o asimilovatclným zdrojem uhlíku a živných solí, což společně s nižší koncentrací biomasy umožňuje získat požadovaný produkt vysoké Čistoty s minimálním obsahem balastních a pigmentujících látek. Kmen si zachovává vysokou pr.odukění schopnost i při vysokých koncentracích glu282 877 konátových solí ve fermentačním médiu (více než 430 kg.m“^).

Nový kmen Aspergillus niger mutant N-kl dobře roste na běžných kultivačních médiích používaných na kultivaci mikroskopických hub (Ozapek-Doxův agar, sladinový agar, agar s glukózou a kvasničným extraktem .apod.;. Iři 28°C dosahují kolonie při lineárním růstu na Czapek-Doxovém agaru v průměru

4,3 cm za 72 hodin, na sladinovém agaru (5°Bgj 3,1 cm. Na Czapek-koxovém agaru jsou kolonie ploché, nízké, zpočátku tvořené bílým vzdušným myceliem. Při sporulaci se zbarvují od středu ze žluté na světle až tmavohnědo, na sladinovém agaru tmavolmědo až černě, kolonie je na spodní straně radiálně zvrásněná, žluto černá. K hojné sporulaci na celé kolonii dochází na 6 až 7 don, v té době se tvoří na kolonii jemné sekundární myčelium. opory jsou tmavě pigmentované, na povrchu vyrůstají jen» né výčnělky. konídiofóry jsou 1 až 2 mm vysoké, většina fruktifikaoních struktur má konídiofór vysoký 1,5 mm. Šířka konídioforu je v průměru 1Č,5/um,konidiální hlava má v průměru 230yum. Průměrná velikost konídií je 4,2/um, jejich viabilita je volmi dobrá. Životaschopnost spor při dlouhodobém skladování v suspenzi s aktivním uhlím, v parafinovém oleji či v lyofilizovaném stavu je velmi dobrá.

kmen Aspergillus niger, mutant k-kl, je možné využít na vysoce efektivní fermentační přípravu kyseliny glukónové, glukóno- óT-iaktónu, glukóno- J⁷ -laktónu či glukonátových solí, které mají široké spektrum využití (např. farmaceutický, potravinářský, chemický průmysl). Vynález ilustruje následujícií příklady provedení, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

- 4 tříklad 1

282 877

ITa vodní suspenzi spár Aspergillus niger v koncentraci 10° spór/ml s přídavkem 1 / (objcm/objem) Tweenu oO se působí

-paprsky ze zdroje ^θΟο po dobu 20 až 30 minut. Suspenze se xotom rozleje na sladinový agar a nechá se vysporulovat v termostate při 25430°C. Ξ takto v^sporulováné kultury se připraví suspenze spor v 0,9 chloridu sodného, která se ředí tak, aby po rozlití na sladinový agar vyrostly za 2<44 dny jednotlivé kolonie kultury mikroorganismu, které se hodnotí fermentačními zkouškami-na produkci kyseliny glukóno.vé i na zvýšenou odolnost vůči solím kyseliny glukónové. Takto byl vybrán kmen Aspergillus niger,· mutant h-kl.

Iřiklad 2

Připraví se 2,5 1 kultivačního média, které obsahuje v 1 litru 200g glukózy, C,39g hydrogenfosforečnanu amonného, C,l9g dihydrogenfosforeenanu draselného a 0,16g heptahydrátu síranu hořečnatého. sterilní kultivační médium se v 5 1 fermentoru zaookuje sporami s“

Aspergillus niger, mutant ϊ.-hl na koncentraci spor 0,5-1.10°/ml a kultivuje se při teplotě 30°C, za míchání při 350 otáčkách za minutu a 'za vzdušnění 1,2 objemu vzduchu na 1-objem fermentačního média za minutu. V průběhu fermentace je ph média udržováno přídavkem 48 / (hmotnost/objem) roztoku hydroxidu sodného na hodnotě 6,5. Glukóza b„la v produkční fázi transformována na kyselinu glukónovou rychlostí 1,3-i,4 g (hmotnost/objem) glukózy za I hodinu, přičemž maximální koncentrace biomasy nepřevyšuje hodnoty 0,9g suché váliy «vycélia na 1 litr fermentačního média, hédium po fermentaci obsahuje více než 233g glukonátu sodného na 1 litr, což je 96 / teoretické hodnoty. Celková doba fermentace je maximálně 29 hodin.

Příklad. 3

Izolovaný kmen má tu vlastnost,

282 877 že jeho mycelium po oddělení od fermentačního média je možné použít na fermentační přípravu kyseliny glukónové, potřebná na růst xnycelia. iřipruví se 170 g a tento sterilní roztok se v 5 1 fermentační nádob 2,5 1 tohoto roztoku smíchá' s myceliem, které se několikrát za sebou čímž se ušetří doba glukázy v 1 litru ě, obsahující získá somráci z fermentačního média po skončení formcntace, pop v příkladu 2. Podmínky fermentace jsou stojné, j_.

2. Celková doba fermentace je 13 hodin a získá se tu sodného, což je 97 h teoretické hodnoty.

Claims (1)

1. Kmen mikroorganismu Aspergillus niger CCM 8004, produkující kyselinu glukonovou.