4 281508
Vynález sa týká myšieho lymfqjcyt^rij^hq ihybridómu produkujúqehf?] itrrbsokidnálnu’zprotilátku, rozpoznávajúcu špecif.ický nádo-rový antigén lymfoblastoidnéj bunkoVe]·' li-nie označenej skratkou MSB1.
Doposial' sa protilátky proti lymfoblasto-idnej bunkovej linii MSB1, ktorá nesie nasvojom povrchu diagnostický antigén „MAT-SA“ připravovali tak, že sa pokusným zvie- ,rátám (králík, ovca] aplikovali živé MSB1buňky. VzhTadom na to, že nestačí jednadávka buniek pre vyvolanie dostatočne vy-sokej protilátkovej odpovede, je potřebnéich injikovať viackrát opakované v různýchdávkách a časových intervaloch. Sérum tak-to imunizovaných zvierat slúži ako zdrojprotilátek, najma pri diagnostickom vyšet-řovaní chovov hydiny. Zmienený postup i-munizácie má niekoíko nevýhod. Získávása heterogénna zmes protilátok, ktorýchrozloženie sa v organizme producenta mě-ní, je velmi různorodé, kvalitativně a kvan-titativné kolíše od jedného odběru po dru-hý a je neopakovatelné. Okrem toho sérumobsahuje hlavně·,·jiežiadúce protilátky proti .povrchovým antigénom, ktoré sa vyskytujúaj na normálnych buňkách. V důsledku toho je potřebné séra upra-vovat zložitými postupmi vysýtenia pomo-cou normálnych slezinových buniek tak, abysérum obsahovalo protilátky len proti spe-cifickému nádorovému antigénu. Touto ú-pravou dochádza k velkým stratám na sé-re a výraznému zníženiu titra specifickýchprotilátok. Pochopitelné proces vysýtenianie je možné standardizovat, v důsledkučoho sa i tak vysoká heterogenita konven-čných sér ešte prehíbi. Okrem toho využi-telnost takto připravených diagnostickýchsér je znížená aj tým, že ich specifické po-lyklonálne protilátky sú z hladiska inter-akcie s povrchovými buňkovými antigén-mi velmi různorodé. Navlac příprava do-statočného množstva lymfoblastoidných bu-niek MSB1 pre imunizačné účely je nároč-ná na technické vybavenie pracoviska, kva-lifikovaný personál a finančně prostriedky.
Hybridům MSB-NTP-1 bol připravený zná-mým spůsobom, klonováním skupiny hybri-dómov v mákkom agare, vzniklých fúzioubuniek myšej 2-am!no-hydroxy-8-azapurín(8-azaguanín) rezistentnej myelómovej li-nie označenej NSO a slezinových buniek in-brednej linie myší BALB/c, imunizovanýchlymfoblastoidnou buňkovou Jíniou MSB1 (G.Kůhler, C. Milstein, G. W. Butecher, J. C.Howard: Nátuře 286, 550 (1977]].
Uvedené nevýhody v podstatnej miere od-straňuje vynález, ktorého podstata spočíváv myšom lymfocytárnom hybridóme MSB--NTP-1, produkujúcom monoklonálnu proti-látku podtriedy IgGl, kappa, rozpoznáva-júcu specifický nádorový antigén lymfob-lastoidnej bunkovej linie označenej skrat-kou MSB1. Tento hybridům je uložený voVirologickom ústave SAV, Mlýnská dolina1, 817 03 Bratislava. Výhodou hybridómu ^je, že produkuje izo-typovo homogéníuWprotilátku, tzv. meno-klonálnu protilátku, ktorá rozpoznává Spe-cifický; jjnádůřovy antigén lymfoblastoidnejbunkovej linie označenej skratkou MSB1 atým je ju možné použit na ídentifikáciu spe-cifického nádorového antigénu pri diferen-ciálnej diagnostike nádorových ochoreníhydiny. Jednobunkový lymfocytárny hybri-dům MSB-NTP-1 rastie in vivo v peritoneál-nej dutině BALB/c myší za súčasnej tvorbyascites. Rastie aj in vitro v kultivačných mé-diách vhodných pre živočišné buňky. Tak-tiež po zmrazení a uložení v tekutom dusí-ku a po opátovnom rozmražení si zachová-vá svoju schopnost produkovat monoklo-nálnu protilátku rozpoznávajúcu specifickýnádorový antigén lymfoblastoidnej bunko-vej linie označenej skratkou MSB1. Neob-sahuje na rozdiel od konvenčných aníisérnevhodné, nešpecifické, balastné protilátky. Příklad 1
Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sapoužije 2.107 buniek myšej 2-amíno>-hyd-roxy-8-azapurín (8-azaguaninj rezistentnejbunkovej linie, ktorá sa pomocou 1 ml 50pere. hmot. polyetylénglykolu spoja s 1.108slezinových lymfoidných buniek myši imu-nizované]' 3.108 MSB1 lymfoblastoidnýchbuniek. V priebehu 14 dní vyrastú pod se-lektívnym tlakom kyseliny 4-amíno pteroyl-glutámovej (amínopterínu] hybridně buň-kové linie, ktoré produkujú monoklonálneprotilátky rozpoznávajúce specifický nádo-rový antigén lymfoblastoidnej bunkovej li-nie označenej skratkou MSB1. Tieto buňkysa potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 %hmot. agaru s 5 .10e až 10.106 myších sle-zinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoréobsahuje 100 mg. ml-1 tetrahydrátu dusičnatu vápe-natého, 2 000 mg . ml-1 D-glukózy, 100 mg. ml-1 heptahydrátu síranu horečna-tého, 400 mg . ml-1 chloridu draselného, 1512 mg.ml~J hydrogenfosforečnanu sod-ného, 6 000 mg . ml"1 monohydrátu dihydrogenfos-forečnanu sodného, 100 mg . ml"1 kyseliny 2-amíno-5-guanidíno-valérovej (arginínu), 50 mg. ml-1 kyseliny 2-amínosukcinamovej (asparagínu], 20 mg . ml 1 kyseliny 2-ainínojantárovej (ky-seliny asparágovej), s 2 S 1 a 3 50 mg.ml“1 kyseliny 3‘,3‘-ditiobis(2-aim'no-propánovej) (cystínu), 20 mg.ml“1 kyseliny 2-amínoglutárovej(kyseliny glutamovej), 300 mg. ml"1 kyseliny 2-amínoglutarámovej(glutamínu), 1 mg. ml-1 kyseliny 2-amínogIutaraminyl 2--merkaptopropionyl-aroínooctovej (gluta-tionu t. j. glutamínyl-cysteinyl-glycínu), 10 mg.ml“1 kyseliny amínooctovej (glycí-nu), 15 mg.ml“1 kyseliny -amíno-l-iroidaz:l-4--propiónovej (histidínu), 50 mg. ml“1 kyseliny 2-amíno-3-metylvalé-rovej (izoleucínu), 50 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-4-metylvaIé-rovej (leucínu), 40 mg .ml“1 kyseliny 2,6-diamínohexánovej(lyzínu), 15 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-4-(metyltio)-maslovej (metionínu), 15 mg .ml“1 kyseliny 2-amíno-3-fenylpropió-novej (fenylalanínu), 20 mg.ml“1 kyseliny 2-pyrolidínkarboxylo-vej (prolinu), 30 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-3-hydroxypro-plónovej (serínu), 20 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-3-hydroxy-maslovej (treonínu), 5 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-3-hydroxypro-piónovej (serínu), 20 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-3-hydroxy-maslovej (treonínu), 5 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-3-(3-indolylj-propiónovej (tryptofánu), 20 mg.ml“1 kyseliny 2-amíno-3-(4-hydroxy-fenyl) -propiónovej (týrozínu), 20 mg. ml“1 kyseliny 2-amíno-3-me tyl máslo-vé) (valínu), 0,2 mg.ml“1 kyseliny 5-(2-oxoimidazolidí-no/4,5-c/tioI-2-yl)pentánovej (biotínu), 0,005 mg.ml“1 kobalt[-(5,6-dimetylbenzimi-dazolyl) ]-kobalt-kyanokobamid vitamínuBl2> 0,250 mg.ml“1 D-N-(2,4-dihydroxy-3,3-diine- 8 tylbutyryl) -2-amínopropionát vápenatý (pantotenát vápenatý), 3 mg . ml"1 í-hydroxyetyltrimetylamóni-nn-chl orid (cbolínchlorid ], 1 mg.ml“1 kyseliny N-(2-aniíno-4-bydroxy-pteridín-6-./Imetyl) -p amínotenzoovej(kyseliny listové)), 35 mg . mV1 (1,2.3,5,/4,6/cyklobexóndex.d)(myonozítolu), 1 mg.ml“1 pyridin-3-karboxyaiuidu (ui?-o-tínamidu), 1 mg.ml"1 kyseliny 4-amínobenzoovej (ky-seliny p-amínobenzoovej), 1 mg .ml”1 3-hydroxy-4,5-bis(hydroxymetyl)--2-metylpyridinehloridu (pyridoxínchlori-du), 0,2 mg.ml“’ 7,8-dimetyl-10-(l‘-D-ribityl/izo-aloxažínu) (riboí lavinu), 1 mg . rol“1 3-(4-amíno-2-metyl-pyrimidyl-5--metyl )-5-( 2-hydr oxy etyl) -4-metyltiazolu(tiamínchloridu), 2 000 mg.ml'1 hydrogenuhličitanu sodnéhodoplnenom s 2 mmólmi kyseliny 2-amíno-glutarámovej (glutamínu), 5.10-5 mólov 2-merkaptoetanolu, 100 g.g.ml“1 O-L-2-deoxy-2-(metylanúno)--glukopyranozyl- (1-2)-0 -L-deoxy-3-C--f ormyllyxof uranozyl- (1-4-) -l,3-deoxy-l,3--diguanidoscyloinozytsulfátu (streptomy-cínsulfátu), 100 jednotiek na mílimeter kyseliny x-(N--ífinylacetaamidoj-penicilánovej (penici-línu G), 1 mmól kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín--N‘-2-etán sulfónovej (Hepesu) sa rozpustí v třikrát redestilovenej vodě adoplní třikrát redestilovanou vodou na ob-jem. 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 mlnormálného ínaktivova n ého koňského sé-ra. Výsledné pH takto připraveného kultivač-ného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa navrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 byb-ridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po10 dňoch vyrastú kolonie, ktoré sa pomno-žia v médie RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmól-mi kyseliny 2-amínoglutarámovej (glutamí-nu), 5.10“5 mólov 2-merkaptoetanolu, 100,ug . ml“1 O- -L-2-deoxy-2-(metylamíno)-glu-kopyranozyl-(l-2)-O- -L-deoxy-3-C-formyl-lyxofuranozyl- (1-4-1,3-deoxy-l,4-diguanido-scylolnozitsulfátu (streptomycínsulfátu), 100