CS260264B1 - Mouse lymphocytar hybridome producing monocline antitoxins neutralizing virus of newcastle disease - Google Patents

Description

2S Í1284

Vynález sa týká myšieho lymfocytárnehohybridómu produkujúceho monoklonálneprotilátky neutralizujúce virus Newcastles-kej choroby.

Doposial' sa protilátky proti virusu New-castleskej choroby pripravujú tak, že virussa injikuje pokusným zvieratám, najma krá-likom a ovciam. Vzhladom na to, že nestačíjedna dávka virusu pre vyvolanie dostateč-né vysokej protilátkovej odpovede, je po-třebné ho injikovať viackrát opakované vrůzných dávkách a Ďasových intervalech.Sérum takto imunizovaných zvierut slúžiako zdroj protilátok najma pri diagnostic-kom vyšetřovaní chovov hydiny. Zmienenýpostup imunizácie má niekolko nevýhod.(Získává sa heterogénna zmes protilátok,ktorej rozloženie sa v organizme producen-ta mění, je velmi různorodé, kvalitativně a(kvantitativné kolíše od jedného odběru podruhý a je neopakovatelné. Okrem toho sé-rum obsahuje vela protilátok proti nežiadú-cim prímesiam, ktoré sa nachádzajú vo ví-rusovom materiáli použitom pre imunizá-fciu. V důsledku toho je potřebné séra upra-vovat zložitými postupmi, čím získávámeheterogénne a nestandardně preparáty. Vy-užitelnost takto připraveného diagnostic-kého séra je znížená aj tým, že jeho špeci-ífické polyklonálne protilátky sú z hlediskainterakcie s vírusom velmi různorodé. Na-viac příprava virusu pre imunizačné účelyje nákladná.

Hybridom NDV-NTP-2 bol připravený zná-mým spůsobom, klonováním skupiny hybri-dómov v makkom agare, vzniklých fúzioubuniek myšej 2-amíno-6-hydroxy-8-azapurín'(8-azaguanín) rezistentněj myelómovej linieoznačenej NSO a slezinových buniek inbred-inej linie myší BALB/c, imunizovaných puri-(fikovaným vírusom NDV, kmen L Kansas[G. Kohler, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C.Howard: Nátuře 286, 550 (1977] j.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere od-straňuje vynález, ktorého podstata spočíváv myšom lymfocytárnom hybridóme NDV--NTP-2, produkujúcom monoklonálnu proti-látku triedy IgM, kappa, neutralizujúcu vi-rus Newcastleskej choroby. Tento hybridůmje uložený vo Virologickom ústave SAV,(Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava. Výhodou hybridómu je, že produkuje izo-typovo a idiotypovo homogénnu špecifickúprotilátku, tzv. monoklonálnu protilátku,ktorá Specificky neutralizuje virus Newcast-leskej choroby a tým je ho možné použitmie len pre diagnostické účely, ale aj pers-pektivné pre preventivné a liečebné ciele.jednobunkový lymfocytárny hybridům NDV--NTP-2 rastie in vivo v peritoneálnej dutiněBALB/c myší za súčasnej tvorby ascites. Ras-tie aj in vitro v kultivačných médiach vhod-ných pre živočišné buňky. Taktiež po zmra-zení a uložení v tekutom dusíku a po opa-ttovnom rozmražení si zachovává svojuschopnost produkovat monoklanálnu proti-látku neutralizujúcu virus Newcastleskej choroby. Neobsahuje na rozdiel od kon-venčných antiser nevhodné, balastné proti-látky. Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sapoužije 2. IQ7 buniek myšej 2-amíno-8-hyd-roxy-3-azapurín (8-azaguanin) rezistentnejmyelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomo-cou 1 ml 50 % hmot. polyetylénglykolu spo-ja s 1. 108 slezinových lymfoidných buniekmyši imunizované] 10 ug virusu. V priebehu14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom ky-seliny 4-amíno-pteroylglutámovej (amíno-pterínu) hybridně buňkové linie, ktoré pro-dukuji! monoklonálne protilátky proti viru-su Newcastleskej choroby, ktoré sa s nímvlažu a ovplyvňujú jeho biologickú aktivi-tu. Tioto buňky sa potom klónujú tak, že satzmieša 0,5 % hmot. agaru s 5 .10® až 10.. 10® myších slezinových buniek v médiuKRMI 1 640, ktoré obsahuje 100- mg . ml'1 tetrahydrátu dusičnanu vápe-natého, 2 000 mg . ml"1 D-glukózy, 100 mg. ml-1 heptahydrátu síranu horečna-tého, 400 mg . ml"1 chloridu draselného, il 512 mg . ml"1 hydrogenfosforečnanu sod-ného, Θ 000 mg . ml"1 monohydrátu dihydrogen-íesforečnanu sodného, 100 mg . ml"1 kyseliny 2-amíno-5-guanidíno-valérovej (arginínu), 50 mg . ml"1 kyseliny 2-amínosukcínovej (asparagínu], 20 mg..ml"1 kyseliny 2-amínojant^rovej (kyseliny asparágovej), 50 mg. ml"1 kyseliny 3‘,3‘-ditiobis(2-amíno-propánovej) (cystínu), 20 mg . ml"1 kyseliny 2-amínoglutárovej (kyseliny glutárovej), 300 mg . ml"1 kyseliny 2-amínoglutárovej (glutamínu), '1 mg . ml"1 kyseliny 2-amínoglutaraminyl- -2-merkaptopropionyl-amínooctovej (glu-tationu, t. j. glutaminyl-cysteinyl-glycí-nu], 10 mg. ml"1 kyseliny amínooctovej (glycí- nu), 26 0 2 84 15 mg. ml-1 kyseliny a-amíno-l-imidazol-4--propiónovej (histidínu), 50 mí.ml“1 kyseliny 2-amíno-3-metylvalé-rovej (Ízoleucínu), 50 mg. ml"1 kyseliny 2-amíno-4-metylvalé-rovej (Lencínu), 40 mg . ml"1 kyseliny 2,6-diamínohexánovej(lyzínu), '15 mg . ml"1 kyseliny 2-amíno-4-(metyltio)--maslovej (metionínu), 15 mg. ml”1 kyseliny 2-amíno-3-fenylpro-piónovej (fenylalanínu), 20 mg . ml"1 kyseliny 2-pyřolidínkarboxy-lovej (prolinu), 30 mg. ml"1 kyseliny 2-iamíno-3-hydroxy-propiónovej (serínu), '20 mg. ml"1 kyseliny 2-amíno-3-hydroxy-maslovej (treonínu), 5 mg . ml"1 kyseliny 2-amíno-3-(3-hydroxy-maslovej (treonínu), 5 mg . ml"1 kyseliny 2-amíno-3-(3-indolyl)-propiónovej (tryptofánu), '20 mg. ml"1 kyseliny 2-amíno-3-(4-hydroxy-fenyl)-propiónovej (tyrozínu), 20 mg . ml"1 kyseliny 2-amíno-3-methylmas-love] (valínu), 0,2 mg . ml"1 kyseliny 5-(2-oxoimidazolíno-(4,5-c) tiol-2-yl)pentánovej (biotínu), 0,006 mg. ml"1 kobalt a[a-(5,6-dimetylben-zimidazol)]-kobalt /3-kyanokoibamid vita-mínu B12), 0,250 mg. ml"1 D-N-(2,4-dihydroxy-3,3-di-metylbutyryl)-/3-2-amínopropionát vápe-natý (pantotenát vápenatý), i3 mg . ml-1 2-hydroxyetyltrimetylamónium-chlorid (cholínchlorid), 1 mg. ml”1 kyseliny N-(2-emíno-4-hydroxy-pter idín-6-ylmetyl) -p-amínobenzoove j(kyseliny listovej), 35 mg . ml"1 (1,2.3,5/4,6/cyklohexándexol)(myoinozltolu), '1 mg. ml"1 pyridin-3-karboxyamidu (niko-tí namidu), 1 mg. ml”1 kyseliny 4-amínobenzoovej ky- seliny p-amínobenzoove]), 1 mg. ml"1 3-hydroxy-4,5-bis( hydroxymetyl )-2-me- tylpyridínchloridu (pyridoxínchloridu), 0,2 mg . ml"1 7,8-dimetyl-10-(l‘-D-ribytyl)-izoaloxazínu (riboflavínu), 1 mg . ml"1 3-(4-amíno-2-metyl-pyrimidyl--5-metyl) -5- (2-hydroxyetyl) -4-metylti-azolu (tiamínchloridu), 2 000 mg . ml"1 hydrogenuhličitanu sodnéhodoplnenom s 2 mmol kyseliny 2-amíno-glutarámovej (glutamínu), 5 .10"5 mol 2-merkaptoetanolu, 100 jUg . ml"1 0-a-L-2-deoxyl2-(metylamí-no) -glutapyranozyl (1-2) -O-a-L-deoxy--3-C-f ormyllyxof uranozyl- (1-4) -1,3-de-oxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu(streptomyeínsulfátuý, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-(N-fe-nylacetoamidoj-penicilánovej (penicilínu 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín--N‘-2-etán sulfónovej (Hepesu) sa rozpustív třikrát redestilovanej vodě a doplní tři-krát redestilovanou vodou na objem 900 mlroztoku, ktorý sa doplní 100 normálnehoinaktivovaného koňského séra. Výsledné pHtakto připraveného kultivačného média je7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu 0,5 %hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniekv 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňoch vyrastúkolónie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI1 640 doplnenom s 2 mmol kyselinami 2-a-mínoglutarámovej (glutamínu), 5 .10"5 mol 2-merkaptoetanolu, 100 ^g . ml"1 O-a-L-2-deoxy-2-(imetylamíno)--glukopyranozyl- (1-2) -O-a-L-deoxy-3-C--f ormyllyxof uranozyl- (1-4) -1,3-deoxy-1,3-diguanidoscyloinozitsulfátu (strepto-mycínsulfátu), 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-(n-fe-nylacetamido)-penicilánovej (penicilínuG), 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín--N‘2-etánsulfónovej (Hepesu) sa rozpustív trikrát redestilovanej vodě a doplní tři-krát redestilovanou vodou na objem 900mílilitrov roztoku, ktorý sa doplní 100 mlnormálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačné-ho média je 7,2. V 1 ml kultivačného médiasa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómovNDV-NTP-2 produkujúcich 10 až 100 ,«g mo-noklonálneho IgM, kappa protilátky. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade i s tým roz- dielom, že sa v kultivačnom médiu použije

Claims (1)

1. 260264 nepredtestované běžné telacie fetálne sé-rum. Do takto připraveného kultivačnéhoprostredia přenesené buňky po fúzii nie súschopné rásť a produkovat monoklonálneprotilátky. Myší lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-2sa kultivuje pri teplote 37° C. Stredný ge-neračný čas je 22,4 h, modálny počet chro-mozómoví je 24 meslacov po fúzii 75 chro- mozómov. Produkovaná monoklonálna pro-tilátka je myší imunoglobulín triedy IgM,kappa. Monoklonálna protilátka produkovanámyším lymfocytárnym hybridómom NDV--NTP-2 móže byť použitá vo veterinárnejpraxi pre zisťovanie virusu v chovočh hy-diny a perspektivné pre preventivné a tera-peutické účely. PREDMET Myší lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-2produkujúci monoklonálnu protilátku, neu- vynalezu tralizujúcu virus Newcastleskej choroby,triedy IgM, kappa. Severografia, n. p. závod 7, Most Cena 2,40 Kčs